Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân quang học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp hplc và ce
- 200 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
NGUYỄN ĐAN VY - KHÓA 2019 – 2021
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN ĐAN VY
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ MIRTAZAPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN ĐAN VY
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ
MIRTAZAPIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 87202010
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN
2. TS. LÊ THỊ THU CÚC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2021
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác
Người cam đoan
Nguyễn Đan Vy
.
.
Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2019– 2021
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ MIRTAZAPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
Nguyễn Đan Vy
Hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Đức Tuấn, TS. Lê Thị Thu Cúc
Từ khóa: HPLC, CE, citalopram, mirtazapin, đồng phân quang học
Mở đầu: Citalopram (CIT) là thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin thuộc dẫn
chất phthalen vòng đôi. Mirtazapin (MIR) là thuốc chống trầm cảm không điển hình
thuộc nhóm piperazinoazepin. Cả hai dược chất đều được sử dụng trong điều trị trầm
cảm. Tuy nhiên, các đồng phân quang học của CIT và MIR khác nhau về hoạt tính
sinh học và tác dụng dược lý. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào ứng dụng
phương pháp HPLC hay CE để phân tích đồng thời cả hai dược chất quang hoạt CIT
và MIR. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình phân
tích đồng thời đồng phân quang học CIT và MIR bằng phương pháp HPLC và CE.
Đối tương và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: đồng phân quang học của CIT và MIR.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện điện di để phân tách
hoàn toàn đồng phân quang học CIT và MIR, thẩm định quy trình phân tích theo
hướng dẫn ICH, áp dụng quy trình sau khi thẩm định để phân tích một số chế phẩm
trên thị trường có chứa CIT và MIR.
Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký và điều kiện điện di thích hợp để tách hoàn
toàn đồng phân quang học CIT và MIR bằng phương pháp HPLC và CE. Cả hai quy
trình đều có tính chọn lọc, độ chính xác cao (RSD ≤ 2% đối với HPLC và RSD ≤ 3%
đối với CE), độ đúng cao với tỷ lệ phục hồi 98-102% với HPLC và 97–103% đối với
CE. Với phương pháp HPLC, khoảng tuyến tính của (S)-MIR, (R)-MIR và (S)-CIT,
(R)-CIT lần lượt từ 75 – 450 µg/ml và 50 - 300 µg/ml. Với phương pháp CE, khoảng
tuyến tính của (S)-MIR, (R)-MIR và (S)-CIT, (R)-CIT lần lượt từ 4 – 188 µg/ml và
2,5 – 125 µg/ml. Đã ứng dụng quy trình HPLC để định tính phân biệt đồng phân MIR,
định lượng (S)-CIT và xác định tạp (R)-CIT trong một số chế phẩm chứa dược chất
đồng phân (S)-CIT.
Kết luận: Đã xây dựng thành công hai quy trình phân tích đồng thời đồng phân quang
học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp HPLC và CE. Cả hai quy trình đều
có tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao. Trong đó, quy trình HPLC đã được áp
dụng để phân tích một số chế phẩm trên thị trường có chứa CIT và MIR.
.
.
Master’s Thesis – Academic course: 2019 – 2021
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF TWO HPLC AND CE METHODS
FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION
OF ENANTIOMERIC CITALOPRAM AND MIRTAZAPINE
Nguyen Dan Vy
Supervisor: Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan; Dr. Le Thi Thu Cuc
Keywords: HPLC, CE, citalopram, mirtazapin, enantiomers.
Introduction: Citalopram (CIT) is a serotonin reuptake inhibitor (SSRI) and a
phthalane derivative. Mirtazapin (MIR) is an atypical antidepressant of
piperazinoazepines group. Both of them are used as antidepressants. However, the
(S) and (R) isomers of CIT and MIR have distinct pharmacological and biological
activities. There have not been studies on simultaneous determination of enantimeric
CIT and MIR by HPLC and CE so far. Therefore, this study was conducted with the
aim of application of HPLC and CE techniques for simultaneous analysis of CIT and
MIR enantiomers.
Material and methods:
Object of the study: Enantiomers of CIT and MIR.
Methods: Investigation of chromatographic and electrophoretic conditions to
completely separate enantiomers of CIT and MIR; Validation of HPLC and CE
methods based on ICH guidelines; Application of the validated methods for analysis
of several available CIT and MIR pharmaceuticals.
Results: The suitable chromatographic and electrophoresis conditions for complete
separation of CIT and MIR enantiomers by HPLC and CE were established. The
validation results showed that these methods were proven to have selectivity, high
precision (RSD ≤ 2% for HPLC and RSD ≤ 3% for CE), and high accuracy with
recovery rate from 98-102% for HPLC and 97–103% for CE. The HPLC method
showed a linear range from 75 to 450 µg.mL-1 for (S)-MIR, (R)-MIR and from 50 to
300 µg.mL-1 for (S)-CIT, (R)-CIT. The CE method showed a linear range from 4 to
188 µg.mL-1 for (S)-MIR, (R)-MIR and from 2.5 – 125µg.mL-1 for (S)-CIT, (R)-CIT.
Finally, the validated HPLC method was applied for distinct qualitative determination
of (R)-MIR and (S)-MIR, quantitative determination of (S)-CIT, and for (R)-CIT
impurity test in several available (S)-citalopram drug products.
Conclusion: Two HPLC and CE methods for simultaneous determination of
enantiomeric citalopram and mirtazapine were successfully developed. Both
procedures are selective, highly precise and accurate. In which, the HPLC method
was applied for analysis of several available CIT and MIR pharmaceuticals.
.
.
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................iiv
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. Citalopram ........................................................................................................... 3
1.2. Mirtazapin ........................................................................................................... 5
1.3. Đồng phân đối quang .......................................................................................... 8
1.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích đồng phần đối quang..................... 10
1.5. Điện di mao quản trong phân tích đồng phân đối quang .................................. 12
1.6. Một số công trình phân tích đồng phân đối quang citalopram, mirtazapin bằng
phương pháp HPLC và CE....................................................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................ 18
2.2. Nguyên vật liệu ................................................................................................. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 35
3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân đối quang citalopram và
mirtazapin bằng phương pháp HPLC....................................................................... 35
3.2. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân đối quang citalopram và
mirtazapin bằng phương pháp điện di mao quản ..................................................... 58
3.3. Ứng dụng quy trình để phân tích citalopram, mirtazapin trong một vài chế phẩm
trên thị trường ........................................................................................................... 79
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 83
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt
chữ viết tắt
ACN Acetonitrile
ALIPH Aliphtalique Hợp chất không vòng
AROM Aromatic Chất thơm
BGE Background Electrolyte Dung dịch điện ly nền
β-CD Beta-cyclodextrin
CE Capillary Eletrophoresis Điện di mao quản
CD Cyclodextrin
CIT Citalopram
CM-β-CD Carboxymethyl-β-
cyclodextrin
CorrArea Corrected Area Diện tích pic được chuẩn hóa
CPDP Cổ phần Dược phẩm
CSPs Chiral Stationary Pha tĩnh bất đối
Công ty Cổ phần Sản xuất –
CTCPSX-TM
Thương mại
Capillary Zone
CZE Điện di mao quản vùng
Electropheresis
DEA Diethylamin
EFF Electric Field Force Lực điện trường
EOF Electro-osmotic Flow Dòng điện thẩm
EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu
HPCE High Performance Capillary Điện di mao quản hiệu năng
Electrophoresis cao
ICDs Impulse Control Disorders Rối loạn kiểm soát xung động
ICH International Conference On Hội nghị hòa hợp quốc tế
Harmonization
IPA Isopropanol
.
.
iii
Ký hiệu,
Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt
chữ viết tắt
ISO International Organization for Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc
Standardization tế
LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
MIR Mirtazapin
NaSSA Noradrenaline and Specific Đối kháng thụ thể
Serotonin Antagonists noradrenalin và serotonin
PDA Photo Diode Array Dãy diod quang
(R)-CIT (R)-citalopram
(R)-MIR (R)-mirtazapin
RP-HPLC Reversed Phase – High
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
Performance Liquid
đảo
Chromatography
RSD Relative Standard Devitation Độ lệch chuẩn tương đối
(S)-CIT (S)-citalopram
S-β-CD Sulfated beta-cyclodextrin
SKĐ Sắc ký đồ
(S)-MIR (S)-mirtazapin
Selective Serotonin Reuptake Ức chế chọn lọc tái hấp thu
SSRI
Inhibitor serotonin
TRC Toronto Research Chemicals Công ty hóa chất Toronto
USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ
Viện Kiểm nghiệm thuốc
VKNT TP.HCM
Thành phố Hồ Chí Minh
.
.
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học CIT bằng
phương pháp CE .......................................................................................................15
Bảng 1.2. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học MIR bằng
phương pháp CE .......................................................................................................15
Bảng 1.3. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học CIT và MIR
bằng phương pháp HPLC .........................................................................................15
Bảng 2.1. Danh mục các chất chuẩn đối chiếu được sử dụng trong nghiên cứu .....18
Bảng 2.2. Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu .............18
Bảng 2.3. Danh mục trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ........................19
Bảng 2.4. Các chế phẩm được sử dụng trong nghiên cứu .......................................20
Bảng 2.5. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn citalopram, mirtazapin với quy trình
HPLC ........................................................................................................................24
Bảng 2.6. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn (S)-citalopram với quy trình HPLC25
Bảng 2.7. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn citalopram, mirtazapin với quy trình
CE ............................................................................................................................. 31
Bảng 2.8. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn (S)-citalopram với quy trình CE ....31
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát cột sắc ký đối với mẫu chuẩn citalopram ....................35
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động .............................................................. 37
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột sắc ký .......................................................38
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ..................................................................39
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng HPLC trên mẫu chuẩn (n=6) .........................40
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng HPLC trên mẫu thử (n=6) ............................. 40
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-MIR, (R)-MIR, (S)-CIT,
(R)-CIT và diện tích pic đối với quy trình HPLC ....................................................45
.
.
v
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-CIT và diện tích pic đối
với quy trình HPLC ..................................................................................................45
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa của
các hệ số của phương trình hồi quy đối với quy trình HPLC ..................................46
Bảng 3.10. Kết quả xác định LOD và LOQ của quy trình HPLC ........................... 46
Bảng 3.11. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
mirtazapin (đồng phân (S)-MIR) (Phụ lục 1) ........................................................... 47
Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
mirtazapin (đồng phân (R)-MIR) (Phụ lục 1) .......................................................... 48
Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
citalopram (đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 1) ............................................................ 48
Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
citalopram (đồng phân (R)-CIT) (Phụ lục 1) ........................................................... 49
Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
escitalopram ((S)-CIT) (Phụ lục 1) ..........................................................................50
Bảng 3.16. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (S)-MIR)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................50
Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (R)-MIR)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................51
Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (S)-CIT)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................52
Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (R)-CIT)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................53
Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC trên mẫu escitalopram
(đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 1) ..............................................................................54
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát pH của dung dịch điện ly nền ....................................60
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát nồng độ S-β-CD.........................................................61
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền ..................................62
.
.
vi
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng CE trên mẫu chuẩn (n = 6) ............................ 64
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng CE trên mẫu thử (n = 6) .................................64
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-MIR, (R)-MIR, (S)-
CIT, (R)-CIT và CorrArea đối với quy trình CE .....................................................68
Bảng 3.27. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-CIT và CorrArea đối
với quy trình CE .......................................................................................................69
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa
của các hệ số của phương trình hồi quy đối với quy trình CE .................................69
Bảng 3.29. Kết quả xác định LOD và LOQ của quy trình CE ................................ 69
Bảng 3.30. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử mirtazapin
(đồng phân (S)-MIR) (Phụ lục 2) .............................................................................70
Bảng 3.31. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử mirtazapin
(đồng phân (R)-MIR) (Phụ lục 2).............................................................................71
Bảng 3.32. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử citalopram
(đồng phân (R)-CIT) (Phụ lục 2) ..............................................................................71
Bảng 3.33. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử citalopram
(đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 2) ..............................................................................72
Bảng 3.34. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử
escitalopram ((S)-CIT) (Phụ lục 2) ..........................................................................72
Bảng 3.35. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (S)-MIR) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................73
Bảng 3.36. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (R)-MIR) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................73
Bảng 3.37. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (R)-CIT) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................74
Bảng 3.38. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (S)-CIT) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................74
.
.
vii
Bảng 3.39. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE trên mẫu escitalopram (đồng
phân (S)-CIT) (Phụ lục 2) ........................................................................................75
Bảng 3.40. So sánh kết quả thẩm định của quy trình HPLC và CE ........................79
Bảng 3.41. Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n = 6) ............................. 80
Bảng 3.42. Kết quả phân tích đồng phân đối quang citalopram và mirtazapin .......81
.
.
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của citalopram. ............................................................ 3
Hình 1.2. Phổ IR của citalopram HBr [44]................................................................ 4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của mirtazapin. ............................................................ 5
Hình 1.4. Phổ IR của mirtazapin [40]. ......................................................................6
Hình 3.1. SKĐ mẫu chuẩn citalopram tương ứng với các cột sắc ký khảo sát. ......36
Hình 3.2. SKĐ mẫu chuẩn mirtazapin tương ứng với các cột sắc ký khảo sát. ......36
Hình 3.3. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các hệ pha động khảo sát ...............37
Hình 3.4. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nhiệt độ cột sắc ký khảo sát. ....38
Hình 3.5. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các tốc độ dòng khảo sát ................39
Hình 3.6. Sắc ký đồ các mẫu phân tích, mẫu placebo và mẫu trắng khi thẩm định
tính đặc hiệu .............................................................................................................42
Hình 3.7. Phổ UV tại thời gian lưu của các đồng phân citalopram và mirtazapin ..43
Hình 3.8. Độ tinh khiết của các pic đồng phân citalopram và mirtazapin ..............44
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử citalopram tại LOD (A) và LOQ (B) ........................47
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thử mirtazapin tại LOD (C) và LOQ (D) ......................47
Hình 3.11. Điện di đồ mẫu chuẩn citalopram [a) β-CD, b) CM-β-CD, c) S-β-CD] và
mirtazapin [d) β-CD, e) CM-β-CD, f) S-β-CD] tương ứng với 3 tác nhân đối quang
khảo sát. ....................................................................................................................59
Hình 3.12. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các pH khảo sát. ..................60
Hình 3.13. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nồng độ S-β-CD khảo sát
..................................................................................................................................61
Hình 3.14. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nồng độ dung dịch điện ly
nền khảo sát ..............................................................................................................63
Hình 3.15. Điện di đồ hỗn hợp mẫu chuẩn (A), hỗn hợp mẫu thử (B), mẫu chuẩn
(S)-CIT (C), mẫu thử (S)-CIT (D), mẫu chuẩn (S)-MIR (E), hỗn hợp mẫu chuẩn thêm
chuẩn (S)-CIT và chuẩn (S)-MIR (F), mẫu placebo (G), mẫu trắng (H), mẫu placebo
thêm hỗn hợp chuẩn (I) ............................................................................................ 66
.
.
ix
Hình 3.16. Phổ UV tại thời gian di chuyển của các đồng phân mirtazapin và
citalopram trong hỗn hợp mẫu chuẩn.......................................................................67
Hình 3.17. Phổ UV tại thời gian di chuyển của các đồng phân mirtazapin và
citalopram trong hỗn hợp mẫu thử ...........................................................................68
Hình 3.18. Điện di đồ mẫu thử citalopram tại LOD (A) và LOQ (B) .....................70
Hình 3.19. Điện di đồ mẫu thử mirtazapin tại LOD (C) và LOQ (D) .....................70
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu chuẩn .............................................................................81
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu thử TP-MIR-I và TP-MIR-II ........................................82
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu thử TP-CIT-III và TP-CIT-IV ......................................82
.
.
1
MỞ ĐẦU
Ngày nay gần 90% các loại thuốc được bán trên thị trường dưới dạng hỗn hợp
racemic [34]. Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh
khiết thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hợp chất đem lại nhiều hiệu quả hơn
trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn của thuốc. Thuốc
đồng phân đối quang được bán trên thị trường đầu tiên vào năm 1961 là thuốc điều
trị lao ethambutol và các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đồng phân (S)-ethambutol có tác
dụng điều trị lao trong khi đó đồng phân (R)-ethambutol gây viêm dây thần kinh thị
giác [32]. Thảm họa y học Thalidomid vào thế kỷ XX gây dị tật cụt chi bẩm sinh cho
hàng ngàn trẻ em do thalidomid được sử dụng trị liệu an thần cho phụ nữ mang thai.
Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai do đồng phân (S)-thalidomid
trong hỗn hợp racemic [32]. Vì những lý do trên, nghành công nghiệp dược phẩm
thế giới chuyển từ hỗn hợp racemic sang sử dụng dạng đồng phân đối quang tinh
khiết.
Citalopram (CIT) là thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin (SSRI) thuộc
dẫn chất phthalen vòng đôi. CIT được sử dụng trong điều trị chống trầm cảm giúp
tăng khí sắc, giải lo âu và bệnh tâm thần như rối loạn ám ảm cưỡng bức, rối loạn lo
âu, rối loạn kiểm soát xung động (ICDs) và rối loạn căng thẳng sau chấn thương [47].
Giống như hầu hết các thuốc ức chế chọn lọc tái hấp thu serotonin, CIT thường được
sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic. Tuy nhiên đồng phân (R) và (S) không
cùng hoạt tính sinh học, các tác dụng dược lý liên quan chủ yếu ở dạng (S) [24]. Kết
quả của một nghiên cứu cho thấy đồng phân (S)-CIT có khả năng ức chế tái hấp thu
serotonin ở màng trước synapse gấp 100 lần so với (R)-CIT và ít nhất gấp 2 lần so
với dạng racemic [40]. Hiệu quả trị liệu của CIT thấp hơn là do sự ức chế tác dụng
dược lý của (R)-CIT [17]. (S)-CIT ít độc tính hơn khi sử dụng quá liều so với dạng
racemic, hiện tượng run rẩy, động kinh được ghi nhận khi sử dụng CIT quá liều nhiều
hơn so với (S)-CIT, co giật hầu như hiếm xảy ra khi sử dụng quá liều với (S)-CIT
[13]. Do sự khác biệt đáng kể về đặc tính dược học và độc tính giữa hai dạng đồng
phân quang học này và để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, nhiều công ty đã nghiên
.
.
2
cứu sản xuất các chế phẩm chỉ có dược chất (S)-CIT với hàm lượng bằng ½ hỗn hợp
racemic CIT và đã được đưa ra thị trường.
Tương tự, mirtazapin (MIR) là một thuốc chống trầm cảm không điển hình thuộc
nhóm piperazinoazepin [22], là một hợp chất tetracyclic có tác dụng chống trầm cảm
trên cả hai hệ thống chất dẫn truyền thần kinh noradrennergic và serotonergic
(NaSSA). Cả hai đồng phân quang học (S)-MIR và (R)-MIR đều có hoạt tính chống
trầm cảm [26], đồng phân (S)-MIR đối kháng thụ thể α2-autoreceptor, 5-HT2 giúp
tăng cường giải phóng serotonin (5-HT) và norepinerphin (NE) cao hơn dạng (R)-
MIR, trong khi đồng phân (R)-MIR đối kháng thụ thể 5-HT3 làm giảm tác dụng phụ
serotonergic (buồn nôn, nôn. ..) [19]. Bên cạnh đó, thời gian bán hủy sau khi uống
hỗn hợp racemic MIR cho thấy dạng (S)-MIR đào thải lâu hơn so với dạng (R)-MIR
[18]. Chính vì sự khác nhau giữa hai dạng đồng phân (R) và (S) của MIR mà công ty
dược phẩm Organon Hà Lan trước khi sáp nhập với Schering Plough và sau này là
MSD đã và đang nghiên cứu chế phẩm có tên Esmirtazapine (ORG 50081; SCH
900265) chỉ chứa dược chất (S)-mirtazapin để điều trị chứng mất ngủ ở người trung
niên và triệu chứng bốc hỏa liên quan đến mãn kinh ở phụ nữ [33].
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC
[10],[30],[31],[36] và phương pháp CE [27],[38],[48],[51],[28] để phân tích đồng
phân quang học CIT, MIR. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào ứng dụng
phương pháp HPLC hay CE để phân tích đồng thời cả hai dược chất quang hoạt CIT
và MIR. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình phân tích đồng
thời đồng phân quang học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp HPLC và
CE” được thực hiện với các mục tiêu sau:
- Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện điện di để phân tích đồng phân quang học
citalopram và mirtazapin.
- Thẩm định quy trình phân tích.
- Ứng dụng quy trình để phân tích một số chế phẩm trên thị trường có chứa
citalopram và mirtazapin.
.
.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CITALOPRAM
(R)-Citalopram (S)-Citalopram
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của citalopram.
Công thức phân tử: C20H21FN2O [21].
Danh pháp: (1RS)-1-[3-(Dimethylamino) propyl]-1-(4-fluorophenyl)-1,3-
dihydrobenzofuran-5-carbonitrile hydrobromide [21].
Khối lượng phân tử: 324,39 g/mol [21].
Citalopram thường được sử dụng dưới dạng muối citalopram hydrobromid có khối
lượng phân tử 405,30 g/mol [21].
1.1.1. Tính chất
Citalopram hydrobromid là chất tinh thể màu trắng, dễ tan trong ethanol tuyệt đối,
tan tốt trong nước, có bước sóng hấp thụ cực đại 239 nm (trong môi trường methanol)
[46].
1.1.2. Định tính
- Phương pháp đo năng suất quay cực: - 0,10o đến 0,10o. Đo góc quay cực của dung
dịch S (hòa tan 1,0 g mẫu trong 20 ml MeOH) [21].
- Phương pháp HPLC: trong phần định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được
trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic trong
dung dịch chuẩn [46].
- Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại: so sánh phổ hồng ngoại giữa chất
thử và citalopram HBr chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải phù hợp với phổ
hồng ngoại của citalopram HBr chuẩn [21],[46]. CIT có các đỉnh đặc trưng của
.
.
4
nhóm C-Haliphatic (2935 cm-1), C≡N (2229 cm-1), C=Carom của nhân thơm (1600 cm-
1
và 1500 cm-1), C-O- (1165 cm-1), C-F (1222,8 cm-1) [45].
Hình 1.2. Phổ IR của citalopram HBr [45]
1.1.3. Định lượng
- Phương pháp acid – base trong ethanol khan: hòa tan 0,3 g mẫu trong 50 ml dung
dịch ethanol 96%, thêm vào 0,5 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M, sử dụng
dung dịch chuẩn độ NaOH 0,1 M, phát hiện điểm tương đương bằng đo thế [21].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [46].
Điều kiện sắc ký
+ Cột sắc ký: C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm); nhiệt độ cột: 50 oC.
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1 g natri acetat trong 800 ml nước, thêm 6 ml
triethylamin, chỉnh pH đến 4,6 bằng acid acetic băng, bổ sung nước vừa đủ 1
lít.
+ Pha động: ACN - dung dịch đệm (20:80), pH pha động là 5,0 ± 0,1. Điều
chỉnh pH nếu cần.
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; bước sóng phát hiện: 239 nm.
+ Dung môi pha loãng: MeOH - H2O (50:50).
.
.
5
+ Thời gian sắc ký: không ít hơn 1,3 lần thời gian lưu của citalopram.
Chuẩn bị mẫu
+ Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Dung dịch có nồng độ
citalopram HBr 1 µg/ml và tạp D citalopram chuẩn 1 µg/ml, được pha trong
dung môi pha loãng
+ Dung dịch chuẩn citalopram HBr: Dung dịch có nồng độ citalopram
hydrobromid 0,625 mg/ml, được pha trong dung môi pha loãng.
+ Dung dịch thử: 0,625 mg hoạt chất citalopram hydrobromid của chế phẩm
trong một mililit dung môi pha loãng.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch kiểm tra tính phù
hợp của hệ thống và dung dịch chuẩn citalopram HBr. Phép thử chỉ có giá trị khi:
+ Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: độ phân giải không ít hơn
1,8 lần giữa citalopram HBr chuẩn và tạp D citalopram chuẩn.
+ Dung dịch chuẩn citalopram HBr: hiệu năng của cột phải có số đĩa lý thuyết
không được ít hơn 3000, hệ số kéo bất đối xứng của pic citalopram HBr không
được lớn hơn 3,0 và độ lệch chuẩn tương đối của sáu lần tiêm không quá 2,0%.
1.1.4. Chỉ định
Điều trị trầm cảm nặng, CIT giúp khôi phục lại sự cân bằng của serotonin trong não
giúp cải thiện năng lượng và tăng khí sắc cho người bệnh. Có thể dùng CIT để điều
trị bệnh tâm thần khác như rối loạn cưỡng chế, rối loạn hoảng sợ có hoặc không có
chứng sợ đám đông [24].
1.2. MIRTAZAPIN
(S)-Mirtazapin (R)-Mirtazapin
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của mirtazapin
.
.
6
Công thức phân tử: C17H19N3 [21].
Danh pháp: (1,2,3,4,10,14b-hexahydro-2-methylpyrazino[2,1-a] pyrido [2,3-c][2]-
benzazepine [21].
Khối lượng phân tử: 265,4 g/mol [21].
1.2.1. Tính chất
Mirtazapin là chất bột kết tinh trắng hay gần như trắng, hơi ẩm, thực tế không tan
trong nước, tan hoàn toàn trong ethanol tuyệt đối, có bước sóng hấp thụ cực đại ở
290 nm trong môi trường acetonitril [21],[46].
1.2.2. Định tính
- Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại [21],[46]: so sánh phổ hồng
ngoại giữa chất thử và mirtazapin chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải
phù hợp với phổ hồng ngoại của mirtazapin chuẩn. MIR có các đỉnh đặc trưng
của dao động biến dạng của nguyên tố N trong liên kết -NH-, cường độ yếu
(1586 cm-1), dao động co giãn của N-Carom (1255 cm-1), dao động C-Haliph
(khoảng 2930 cm-1) [38].
Hình 1.4. Phổ IR của mirtazapin [41]
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
NGUYỄN ĐAN VY - KHÓA 2019 – 2021
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN ĐAN VY
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ MIRTAZAPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN ĐAN VY
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ
MIRTAZAPIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 87202010
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. NGUYỄN ĐỨC TUẤN
2. TS. LÊ THỊ THU CÚC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2021
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày
trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác
Người cam đoan
Nguyễn Đan Vy
.
.
Luận văn Thạc sĩ – Khóa 2019– 2021
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI
ĐỒNG PHÂN QUANG HỌC CITALOPRAM VÀ MIRTAZAPIN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ CE
Nguyễn Đan Vy
Hướng dẫn khoa học: GS.TS. Nguyễn Đức Tuấn, TS. Lê Thị Thu Cúc
Từ khóa: HPLC, CE, citalopram, mirtazapin, đồng phân quang học
Mở đầu: Citalopram (CIT) là thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin thuộc dẫn
chất phthalen vòng đôi. Mirtazapin (MIR) là thuốc chống trầm cảm không điển hình
thuộc nhóm piperazinoazepin. Cả hai dược chất đều được sử dụng trong điều trị trầm
cảm. Tuy nhiên, các đồng phân quang học của CIT và MIR khác nhau về hoạt tính
sinh học và tác dụng dược lý. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào ứng dụng
phương pháp HPLC hay CE để phân tích đồng thời cả hai dược chất quang hoạt CIT
và MIR. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng quy trình phân
tích đồng thời đồng phân quang học CIT và MIR bằng phương pháp HPLC và CE.
Đối tương và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: đồng phân quang học của CIT và MIR.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện điện di để phân tách
hoàn toàn đồng phân quang học CIT và MIR, thẩm định quy trình phân tích theo
hướng dẫn ICH, áp dụng quy trình sau khi thẩm định để phân tích một số chế phẩm
trên thị trường có chứa CIT và MIR.
Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký và điều kiện điện di thích hợp để tách hoàn
toàn đồng phân quang học CIT và MIR bằng phương pháp HPLC và CE. Cả hai quy
trình đều có tính chọn lọc, độ chính xác cao (RSD ≤ 2% đối với HPLC và RSD ≤ 3%
đối với CE), độ đúng cao với tỷ lệ phục hồi 98-102% với HPLC và 97–103% đối với
CE. Với phương pháp HPLC, khoảng tuyến tính của (S)-MIR, (R)-MIR và (S)-CIT,
(R)-CIT lần lượt từ 75 – 450 µg/ml và 50 - 300 µg/ml. Với phương pháp CE, khoảng
tuyến tính của (S)-MIR, (R)-MIR và (S)-CIT, (R)-CIT lần lượt từ 4 – 188 µg/ml và
2,5 – 125 µg/ml. Đã ứng dụng quy trình HPLC để định tính phân biệt đồng phân MIR,
định lượng (S)-CIT và xác định tạp (R)-CIT trong một số chế phẩm chứa dược chất
đồng phân (S)-CIT.
Kết luận: Đã xây dựng thành công hai quy trình phân tích đồng thời đồng phân quang
học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp HPLC và CE. Cả hai quy trình đều
có tính chọn lọc, độ chính xác và độ đúng cao. Trong đó, quy trình HPLC đã được áp
dụng để phân tích một số chế phẩm trên thị trường có chứa CIT và MIR.
.
.
Master’s Thesis – Academic course: 2019 – 2021
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
DEVELOPMENT OF TWO HPLC AND CE METHODS
FOR SIMULTANEOUS DETERMINATION
OF ENANTIOMERIC CITALOPRAM AND MIRTAZAPINE
Nguyen Dan Vy
Supervisor: Prof. Dr. Nguyen Duc Tuan; Dr. Le Thi Thu Cuc
Keywords: HPLC, CE, citalopram, mirtazapin, enantiomers.
Introduction: Citalopram (CIT) is a serotonin reuptake inhibitor (SSRI) and a
phthalane derivative. Mirtazapin (MIR) is an atypical antidepressant of
piperazinoazepines group. Both of them are used as antidepressants. However, the
(S) and (R) isomers of CIT and MIR have distinct pharmacological and biological
activities. There have not been studies on simultaneous determination of enantimeric
CIT and MIR by HPLC and CE so far. Therefore, this study was conducted with the
aim of application of HPLC and CE techniques for simultaneous analysis of CIT and
MIR enantiomers.
Material and methods:
Object of the study: Enantiomers of CIT and MIR.
Methods: Investigation of chromatographic and electrophoretic conditions to
completely separate enantiomers of CIT and MIR; Validation of HPLC and CE
methods based on ICH guidelines; Application of the validated methods for analysis
of several available CIT and MIR pharmaceuticals.
Results: The suitable chromatographic and electrophoresis conditions for complete
separation of CIT and MIR enantiomers by HPLC and CE were established. The
validation results showed that these methods were proven to have selectivity, high
precision (RSD ≤ 2% for HPLC and RSD ≤ 3% for CE), and high accuracy with
recovery rate from 98-102% for HPLC and 97–103% for CE. The HPLC method
showed a linear range from 75 to 450 µg.mL-1 for (S)-MIR, (R)-MIR and from 50 to
300 µg.mL-1 for (S)-CIT, (R)-CIT. The CE method showed a linear range from 4 to
188 µg.mL-1 for (S)-MIR, (R)-MIR and from 2.5 – 125µg.mL-1 for (S)-CIT, (R)-CIT.
Finally, the validated HPLC method was applied for distinct qualitative determination
of (R)-MIR and (S)-MIR, quantitative determination of (S)-CIT, and for (R)-CIT
impurity test in several available (S)-citalopram drug products.
Conclusion: Two HPLC and CE methods for simultaneous determination of
enantiomeric citalopram and mirtazapine were successfully developed. Both
procedures are selective, highly precise and accurate. In which, the HPLC method
was applied for analysis of several available CIT and MIR pharmaceuticals.
.
.
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG.......................................................................................iiv
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1. Citalopram ........................................................................................................... 3
1.2. Mirtazapin ........................................................................................................... 5
1.3. Đồng phân đối quang .......................................................................................... 8
1.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích đồng phần đối quang..................... 10
1.5. Điện di mao quản trong phân tích đồng phân đối quang .................................. 12
1.6. Một số công trình phân tích đồng phân đối quang citalopram, mirtazapin bằng
phương pháp HPLC và CE....................................................................................... 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu........................................................................................ 18
2.2. Nguyên vật liệu ................................................................................................. 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................... 20
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................. 35
3.1. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân đối quang citalopram và
mirtazapin bằng phương pháp HPLC....................................................................... 35
3.2. Xây dựng quy trình phân tích đồng thời đồng phân đối quang citalopram và
mirtazapin bằng phương pháp điện di mao quản ..................................................... 58
3.3. Ứng dụng quy trình để phân tích citalopram, mirtazapin trong một vài chế phẩm
trên thị trường ........................................................................................................... 79
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ...................................................................................... 83
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,
Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt
chữ viết tắt
ACN Acetonitrile
ALIPH Aliphtalique Hợp chất không vòng
AROM Aromatic Chất thơm
BGE Background Electrolyte Dung dịch điện ly nền
β-CD Beta-cyclodextrin
CE Capillary Eletrophoresis Điện di mao quản
CD Cyclodextrin
CIT Citalopram
CM-β-CD Carboxymethyl-β-
cyclodextrin
CorrArea Corrected Area Diện tích pic được chuẩn hóa
CPDP Cổ phần Dược phẩm
CSPs Chiral Stationary Pha tĩnh bất đối
Công ty Cổ phần Sản xuất –
CTCPSX-TM
Thương mại
Capillary Zone
CZE Điện di mao quản vùng
Electropheresis
DEA Diethylamin
EFF Electric Field Force Lực điện trường
EOF Electro-osmotic Flow Dòng điện thẩm
EP European Pharmacopoeia Dược điển Châu Âu
HPCE High Performance Capillary Điện di mao quản hiệu năng
Electrophoresis cao
ICDs Impulse Control Disorders Rối loạn kiểm soát xung động
ICH International Conference On Hội nghị hòa hợp quốc tế
Harmonization
IPA Isopropanol
.
.
iii
Ký hiệu,
Từ nguyên Nghĩa tiếng Việt
chữ viết tắt
ISO International Organization for Tổ chức Tiêu chuẩn hóa Quốc
Standardization tế
LC Liquid Chromatography Sắc ký lỏng
LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng
MeOH Methanol
MIR Mirtazapin
NaSSA Noradrenaline and Specific Đối kháng thụ thể
Serotonin Antagonists noradrenalin và serotonin
PDA Photo Diode Array Dãy diod quang
(R)-CIT (R)-citalopram
(R)-MIR (R)-mirtazapin
RP-HPLC Reversed Phase – High
Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
Performance Liquid
đảo
Chromatography
RSD Relative Standard Devitation Độ lệch chuẩn tương đối
(S)-CIT (S)-citalopram
S-β-CD Sulfated beta-cyclodextrin
SKĐ Sắc ký đồ
(S)-MIR (S)-mirtazapin
Selective Serotonin Reuptake Ức chế chọn lọc tái hấp thu
SSRI
Inhibitor serotonin
TRC Toronto Research Chemicals Công ty hóa chất Toronto
USP United States Pharmacopoeia Dược điển Mỹ
Viện Kiểm nghiệm thuốc
VKNT TP.HCM
Thành phố Hồ Chí Minh
.
.
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học CIT bằng
phương pháp CE .......................................................................................................15
Bảng 1.2. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học MIR bằng
phương pháp CE .......................................................................................................15
Bảng 1.3. Tóm tắt một số công trình phân tích đồng phân quang học CIT và MIR
bằng phương pháp HPLC .........................................................................................15
Bảng 2.1. Danh mục các chất chuẩn đối chiếu được sử dụng trong nghiên cứu .....18
Bảng 2.2. Danh mục dung môi, hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu .............18
Bảng 2.3. Danh mục trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu ........................19
Bảng 2.4. Các chế phẩm được sử dụng trong nghiên cứu .......................................20
Bảng 2.5. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn citalopram, mirtazapin với quy trình
HPLC ........................................................................................................................24
Bảng 2.6. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn (S)-citalopram với quy trình HPLC25
Bảng 2.7. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn citalopram, mirtazapin với quy trình
CE ............................................................................................................................. 31
Bảng 2.8. Chuẩn bị các dung dịch mẫu chuẩn (S)-citalopram với quy trình CE ....31
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát cột sắc ký đối với mẫu chuẩn citalopram ....................35
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ pha động .............................................................. 37
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột sắc ký .......................................................38
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ dòng ..................................................................39
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng HPLC trên mẫu chuẩn (n=6) .........................40
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng HPLC trên mẫu thử (n=6) ............................. 40
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-MIR, (R)-MIR, (S)-CIT,
(R)-CIT và diện tích pic đối với quy trình HPLC ....................................................45
.
.
v
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-CIT và diện tích pic đối
với quy trình HPLC ..................................................................................................45
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa của
các hệ số của phương trình hồi quy đối với quy trình HPLC ..................................46
Bảng 3.10. Kết quả xác định LOD và LOQ của quy trình HPLC ........................... 46
Bảng 3.11. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
mirtazapin (đồng phân (S)-MIR) (Phụ lục 1) ........................................................... 47
Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
mirtazapin (đồng phân (R)-MIR) (Phụ lục 1) .......................................................... 48
Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
citalopram (đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 1) ............................................................ 48
Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
citalopram (đồng phân (R)-CIT) (Phụ lục 1) ........................................................... 49
Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình HPLC trên mẫu thử
escitalopram ((S)-CIT) (Phụ lục 1) ..........................................................................50
Bảng 3.16. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (S)-MIR)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................50
Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (R)-MIR)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................51
Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (S)-CIT)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................52
Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC (đồng phân (R)-CIT)
(Phụ lục 1) ................................................................................................................53
Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình HPLC trên mẫu escitalopram
(đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 1) ..............................................................................54
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát pH của dung dịch điện ly nền ....................................60
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát nồng độ S-β-CD.........................................................61
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát nồng độ dung dịch điện ly nền ..................................62
.
.
vi
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng CE trên mẫu chuẩn (n = 6) ............................ 64
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống của quy trình phân tích đồng
phân citalopram và mirtazapin bằng CE trên mẫu thử (n = 6) .................................64
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-MIR, (R)-MIR, (S)-
CIT, (R)-CIT và CorrArea đối với quy trình CE .....................................................68
Bảng 3.27. Kết quả khảo sát sự tương quan giữa nồng độ (S)-CIT và CorrArea đối
với quy trình CE .......................................................................................................69
Bảng 3.28. Kết quả đánh giá tính tương thích của phương trình hồi quy và ý nghĩa
của các hệ số của phương trình hồi quy đối với quy trình CE .................................69
Bảng 3.29. Kết quả xác định LOD và LOQ của quy trình CE ................................ 69
Bảng 3.30. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử mirtazapin
(đồng phân (S)-MIR) (Phụ lục 2) .............................................................................70
Bảng 3.31. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử mirtazapin
(đồng phân (R)-MIR) (Phụ lục 2).............................................................................71
Bảng 3.32. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử citalopram
(đồng phân (R)-CIT) (Phụ lục 2) ..............................................................................71
Bảng 3.33. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử citalopram
(đồng phân (S)-CIT) (Phụ lục 2) ..............................................................................72
Bảng 3.34. Kết quả thẩm định độ chính xác của quy trình CE trên mẫu thử
escitalopram ((S)-CIT) (Phụ lục 2) ..........................................................................72
Bảng 3.35. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (S)-MIR) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................73
Bảng 3.36. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (R)-MIR) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................73
Bảng 3.37. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (R)-CIT) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................74
Bảng 3.38. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE (đồng phân (S)-CIT) (Phụ
lục 2) .........................................................................................................................74
.
.
vii
Bảng 3.39. Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình CE trên mẫu escitalopram (đồng
phân (S)-CIT) (Phụ lục 2) ........................................................................................75
Bảng 3.40. So sánh kết quả thẩm định của quy trình HPLC và CE ........................79
Bảng 3.41. Kết quả kiểm tra tính phù hợp của hệ thống (n = 6) ............................. 80
Bảng 3.42. Kết quả phân tích đồng phân đối quang citalopram và mirtazapin .......81
.
.
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của citalopram. ............................................................ 3
Hình 1.2. Phổ IR của citalopram HBr [44]................................................................ 4
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của mirtazapin. ............................................................ 5
Hình 1.4. Phổ IR của mirtazapin [40]. ......................................................................6
Hình 3.1. SKĐ mẫu chuẩn citalopram tương ứng với các cột sắc ký khảo sát. ......36
Hình 3.2. SKĐ mẫu chuẩn mirtazapin tương ứng với các cột sắc ký khảo sát. ......36
Hình 3.3. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các hệ pha động khảo sát ...............37
Hình 3.4. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nhiệt độ cột sắc ký khảo sát. ....38
Hình 3.5. SKĐ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các tốc độ dòng khảo sát ................39
Hình 3.6. Sắc ký đồ các mẫu phân tích, mẫu placebo và mẫu trắng khi thẩm định
tính đặc hiệu .............................................................................................................42
Hình 3.7. Phổ UV tại thời gian lưu của các đồng phân citalopram và mirtazapin ..43
Hình 3.8. Độ tinh khiết của các pic đồng phân citalopram và mirtazapin ..............44
Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu thử citalopram tại LOD (A) và LOQ (B) ........................47
Hình 3.10. Sắc ký đồ mẫu thử mirtazapin tại LOD (C) và LOQ (D) ......................47
Hình 3.11. Điện di đồ mẫu chuẩn citalopram [a) β-CD, b) CM-β-CD, c) S-β-CD] và
mirtazapin [d) β-CD, e) CM-β-CD, f) S-β-CD] tương ứng với 3 tác nhân đối quang
khảo sát. ....................................................................................................................59
Hình 3.12. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các pH khảo sát. ..................60
Hình 3.13. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nồng độ S-β-CD khảo sát
..................................................................................................................................61
Hình 3.14. Điện di đồ hỗn hợp chuẩn tương ứng với các nồng độ dung dịch điện ly
nền khảo sát ..............................................................................................................63
Hình 3.15. Điện di đồ hỗn hợp mẫu chuẩn (A), hỗn hợp mẫu thử (B), mẫu chuẩn
(S)-CIT (C), mẫu thử (S)-CIT (D), mẫu chuẩn (S)-MIR (E), hỗn hợp mẫu chuẩn thêm
chuẩn (S)-CIT và chuẩn (S)-MIR (F), mẫu placebo (G), mẫu trắng (H), mẫu placebo
thêm hỗn hợp chuẩn (I) ............................................................................................ 66
.
.
ix
Hình 3.16. Phổ UV tại thời gian di chuyển của các đồng phân mirtazapin và
citalopram trong hỗn hợp mẫu chuẩn.......................................................................67
Hình 3.17. Phổ UV tại thời gian di chuyển của các đồng phân mirtazapin và
citalopram trong hỗn hợp mẫu thử ...........................................................................68
Hình 3.18. Điện di đồ mẫu thử citalopram tại LOD (A) và LOQ (B) .....................70
Hình 3.19. Điện di đồ mẫu thử mirtazapin tại LOD (C) và LOQ (D) .....................70
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu chuẩn .............................................................................81
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu thử TP-MIR-I và TP-MIR-II ........................................82
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu thử TP-CIT-III và TP-CIT-IV ......................................82
.
.
1
MỞ ĐẦU
Ngày nay gần 90% các loại thuốc được bán trên thị trường dưới dạng hỗn hợp
racemic [34]. Các nghiên cứu khoa học đã cho thấy việc sử dụng đồng phân tinh
khiết thay thế cho hỗn hợp racemic của cùng hợp chất đem lại nhiều hiệu quả hơn
trong điều trị như giảm liều dùng, giảm tác dụng không mong muốn của thuốc. Thuốc
đồng phân đối quang được bán trên thị trường đầu tiên vào năm 1961 là thuốc điều
trị lao ethambutol và các nghiên cứu đã chỉ ra rằng đồng phân (S)-ethambutol có tác
dụng điều trị lao trong khi đó đồng phân (R)-ethambutol gây viêm dây thần kinh thị
giác [32]. Thảm họa y học Thalidomid vào thế kỷ XX gây dị tật cụt chi bẩm sinh cho
hàng ngàn trẻ em do thalidomid được sử dụng trị liệu an thần cho phụ nữ mang thai.
Các nghiên cứu cho rằng nguyên nhân gây quái thai do đồng phân (S)-thalidomid
trong hỗn hợp racemic [32]. Vì những lý do trên, nghành công nghiệp dược phẩm
thế giới chuyển từ hỗn hợp racemic sang sử dụng dạng đồng phân đối quang tinh
khiết.
Citalopram (CIT) là thuốc ức chế tái hấp thu chọn lọc serotonin (SSRI) thuộc
dẫn chất phthalen vòng đôi. CIT được sử dụng trong điều trị chống trầm cảm giúp
tăng khí sắc, giải lo âu và bệnh tâm thần như rối loạn ám ảm cưỡng bức, rối loạn lo
âu, rối loạn kiểm soát xung động (ICDs) và rối loạn căng thẳng sau chấn thương [47].
Giống như hầu hết các thuốc ức chế chọn lọc tái hấp thu serotonin, CIT thường được
sử dụng trong điều trị dưới dạng racemic. Tuy nhiên đồng phân (R) và (S) không
cùng hoạt tính sinh học, các tác dụng dược lý liên quan chủ yếu ở dạng (S) [24]. Kết
quả của một nghiên cứu cho thấy đồng phân (S)-CIT có khả năng ức chế tái hấp thu
serotonin ở màng trước synapse gấp 100 lần so với (R)-CIT và ít nhất gấp 2 lần so
với dạng racemic [40]. Hiệu quả trị liệu của CIT thấp hơn là do sự ức chế tác dụng
dược lý của (R)-CIT [17]. (S)-CIT ít độc tính hơn khi sử dụng quá liều so với dạng
racemic, hiện tượng run rẩy, động kinh được ghi nhận khi sử dụng CIT quá liều nhiều
hơn so với (S)-CIT, co giật hầu như hiếm xảy ra khi sử dụng quá liều với (S)-CIT
[13]. Do sự khác biệt đáng kể về đặc tính dược học và độc tính giữa hai dạng đồng
phân quang học này và để cải thiện tính an toàn và hiệu quả, nhiều công ty đã nghiên
.
.
2
cứu sản xuất các chế phẩm chỉ có dược chất (S)-CIT với hàm lượng bằng ½ hỗn hợp
racemic CIT và đã được đưa ra thị trường.
Tương tự, mirtazapin (MIR) là một thuốc chống trầm cảm không điển hình thuộc
nhóm piperazinoazepin [22], là một hợp chất tetracyclic có tác dụng chống trầm cảm
trên cả hai hệ thống chất dẫn truyền thần kinh noradrennergic và serotonergic
(NaSSA). Cả hai đồng phân quang học (S)-MIR và (R)-MIR đều có hoạt tính chống
trầm cảm [26], đồng phân (S)-MIR đối kháng thụ thể α2-autoreceptor, 5-HT2 giúp
tăng cường giải phóng serotonin (5-HT) và norepinerphin (NE) cao hơn dạng (R)-
MIR, trong khi đồng phân (R)-MIR đối kháng thụ thể 5-HT3 làm giảm tác dụng phụ
serotonergic (buồn nôn, nôn. ..) [19]. Bên cạnh đó, thời gian bán hủy sau khi uống
hỗn hợp racemic MIR cho thấy dạng (S)-MIR đào thải lâu hơn so với dạng (R)-MIR
[18]. Chính vì sự khác nhau giữa hai dạng đồng phân (R) và (S) của MIR mà công ty
dược phẩm Organon Hà Lan trước khi sáp nhập với Schering Plough và sau này là
MSD đã và đang nghiên cứu chế phẩm có tên Esmirtazapine (ORG 50081; SCH
900265) chỉ chứa dược chất (S)-mirtazapin để điều trị chứng mất ngủ ở người trung
niên và triệu chứng bốc hỏa liên quan đến mãn kinh ở phụ nữ [33].
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC
[10],[30],[31],[36] và phương pháp CE [27],[38],[48],[51],[28] để phân tích đồng
phân quang học CIT, MIR. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào ứng dụng
phương pháp HPLC hay CE để phân tích đồng thời cả hai dược chất quang hoạt CIT
và MIR. Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Xây dựng quy trình phân tích đồng
thời đồng phân quang học citalopram và mirtazapin bằng phương pháp HPLC và
CE” được thực hiện với các mục tiêu sau:
- Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện điện di để phân tích đồng phân quang học
citalopram và mirtazapin.
- Thẩm định quy trình phân tích.
- Ứng dụng quy trình để phân tích một số chế phẩm trên thị trường có chứa
citalopram và mirtazapin.
.
.
3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CITALOPRAM
(R)-Citalopram (S)-Citalopram
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của citalopram.
Công thức phân tử: C20H21FN2O [21].
Danh pháp: (1RS)-1-[3-(Dimethylamino) propyl]-1-(4-fluorophenyl)-1,3-
dihydrobenzofuran-5-carbonitrile hydrobromide [21].
Khối lượng phân tử: 324,39 g/mol [21].
Citalopram thường được sử dụng dưới dạng muối citalopram hydrobromid có khối
lượng phân tử 405,30 g/mol [21].
1.1.1. Tính chất
Citalopram hydrobromid là chất tinh thể màu trắng, dễ tan trong ethanol tuyệt đối,
tan tốt trong nước, có bước sóng hấp thụ cực đại 239 nm (trong môi trường methanol)
[46].
1.1.2. Định tính
- Phương pháp đo năng suất quay cực: - 0,10o đến 0,10o. Đo góc quay cực của dung
dịch S (hòa tan 1,0 g mẫu trong 20 ml MeOH) [21].
- Phương pháp HPLC: trong phần định lượng, thời gian lưu của pic chính thu được
trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải tương ứng với thời gian lưu của pic trong
dung dịch chuẩn [46].
- Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại: so sánh phổ hồng ngoại giữa chất
thử và citalopram HBr chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải phù hợp với phổ
hồng ngoại của citalopram HBr chuẩn [21],[46]. CIT có các đỉnh đặc trưng của
.
.
4
nhóm C-Haliphatic (2935 cm-1), C≡N (2229 cm-1), C=Carom của nhân thơm (1600 cm-
1
và 1500 cm-1), C-O- (1165 cm-1), C-F (1222,8 cm-1) [45].
Hình 1.2. Phổ IR của citalopram HBr [45]
1.1.3. Định lượng
- Phương pháp acid – base trong ethanol khan: hòa tan 0,3 g mẫu trong 50 ml dung
dịch ethanol 96%, thêm vào 0,5 ml dung dịch acid hydrocloric 0,1 M, sử dụng
dung dịch chuẩn độ NaOH 0,1 M, phát hiện điểm tương đương bằng đo thế [21].
- Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [46].
Điều kiện sắc ký
+ Cột sắc ký: C8 (150 x 4,6 mm; 5 µm); nhiệt độ cột: 50 oC.
+ Dung dịch đệm: hòa tan 1 g natri acetat trong 800 ml nước, thêm 6 ml
triethylamin, chỉnh pH đến 4,6 bằng acid acetic băng, bổ sung nước vừa đủ 1
lít.
+ Pha động: ACN - dung dịch đệm (20:80), pH pha động là 5,0 ± 0,1. Điều
chỉnh pH nếu cần.
+ Tốc độ dòng: 1 ml/phút; thể tích tiêm: 20 µl; bước sóng phát hiện: 239 nm.
+ Dung môi pha loãng: MeOH - H2O (50:50).
.
.
5
+ Thời gian sắc ký: không ít hơn 1,3 lần thời gian lưu của citalopram.
Chuẩn bị mẫu
+ Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Dung dịch có nồng độ
citalopram HBr 1 µg/ml và tạp D citalopram chuẩn 1 µg/ml, được pha trong
dung môi pha loãng
+ Dung dịch chuẩn citalopram HBr: Dung dịch có nồng độ citalopram
hydrobromid 0,625 mg/ml, được pha trong dung môi pha loãng.
+ Dung dịch thử: 0,625 mg hoạt chất citalopram hydrobromid của chế phẩm
trong một mililit dung môi pha loãng.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch kiểm tra tính phù
hợp của hệ thống và dung dịch chuẩn citalopram HBr. Phép thử chỉ có giá trị khi:
+ Dung dịch kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: độ phân giải không ít hơn
1,8 lần giữa citalopram HBr chuẩn và tạp D citalopram chuẩn.
+ Dung dịch chuẩn citalopram HBr: hiệu năng của cột phải có số đĩa lý thuyết
không được ít hơn 3000, hệ số kéo bất đối xứng của pic citalopram HBr không
được lớn hơn 3,0 và độ lệch chuẩn tương đối của sáu lần tiêm không quá 2,0%.
1.1.4. Chỉ định
Điều trị trầm cảm nặng, CIT giúp khôi phục lại sự cân bằng của serotonin trong não
giúp cải thiện năng lượng và tăng khí sắc cho người bệnh. Có thể dùng CIT để điều
trị bệnh tâm thần khác như rối loạn cưỡng chế, rối loạn hoảng sợ có hoặc không có
chứng sợ đám đông [24].
1.2. MIRTAZAPIN
(S)-Mirtazapin (R)-Mirtazapin
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của mirtazapin
.
.
6
Công thức phân tử: C17H19N3 [21].
Danh pháp: (1,2,3,4,10,14b-hexahydro-2-methylpyrazino[2,1-a] pyrido [2,3-c][2]-
benzazepine [21].
Khối lượng phân tử: 265,4 g/mol [21].
1.2.1. Tính chất
Mirtazapin là chất bột kết tinh trắng hay gần như trắng, hơi ẩm, thực tế không tan
trong nước, tan hoàn toàn trong ethanol tuyệt đối, có bước sóng hấp thụ cực đại ở
290 nm trong môi trường acetonitril [21],[46].
1.2.2. Định tính
- Phương pháp quang phổ hấp thụ hồng ngoại [21],[46]: so sánh phổ hồng
ngoại giữa chất thử và mirtazapin chuẩn. Phổ hồng ngoại của chất thử phải
phù hợp với phổ hồng ngoại của mirtazapin chuẩn. MIR có các đỉnh đặc trưng
của dao động biến dạng của nguyên tố N trong liên kết -NH-, cường độ yếu
(1586 cm-1), dao động co giãn của N-Carom (1255 cm-1), dao động C-Haliph
(khoảng 2930 cm-1) [38].
Hình 1.4. Phổ IR của mirtazapin [41]
.