Tuyển chọn vi khuẩn dạ cỏ cừu phối hợp với vi khuẩn dạ cỏ bõ để thủy phân bã mía trong điều kiện in vitro
- 72 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TUYỂN CHỌN VI KHUẨN DẠ CỎ CỪU
PHỐI HỢP VỚI VI KHUẨN DẠ CỎ BÕ
ĐỂ THỦY PHÂN BÃ MÍA TRONG ĐIỀU KIỆN
IN VITRO
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN LƢ VŨ THẢO VI
Ts. HỒ QUẢNG ĐỒ MSSV: 2082249
Ts. TRẦN NHÂN DŨNG LỚP: CNSHTT K34
Cần Thơ, Tháng 12/2012
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)
Võ Văn Song Toàn Lư Vũ Thảo Vi
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(ký tên) (ký tên)
Hồ Quảng Đồ Trần Nhân Dũng
XÉT DUYỆT CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2012
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
-------------------
Để hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp, không chỉ có sự nổ lực, cố gắng của
bản thân, mà tôi còn luôn nhận được sự giúp đỡ rất chân thành và nhiệt tình từ gia
đình, thầy cô, bạn bè và rất nhiều người. Tôi xin gửi những lời tri ân sâu sắc đến:
Gia đình tôi, những người đã luôn theo sát, động viên và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Ts. Trần Nhân Dũng - Viện trưởng viện NC&PT CNSH, Ts. Hồ Quãng Đồ - Phó
trưởng bộ môn Chăn nuôi tiên tiến - khoa Nông và Sinh học ứng dụng, Ths. Võ Văn
Song Toàn – giảng viên phòng thí nghiệm Công nghệ và Enzyme - Viện NC&PT
CNSH - Trường ĐH Cần Thơ, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm và cho những
lời khuyên bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài về mặt lý thuyết cũng như
thực hành.
Anh Trần Văn Bé Năm – kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện
NC&PT CNSH, Võ Phương Ghil - cán bộ phòng thí nghiệm Chăn nuôi tiên tiến - khoa
Nông và Sinh học ứng dụng - trường ĐH Cần Thơ, đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ các
thiết bị giúp tôi hoàn thành đề tài.
Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 33 đã tận tình chỉ dẫn giúp tôi nắm
vững những kiến thức cơ bản trong phòng thí nghiệm.
Các bạn và các em lớp Công nghệ Sinh học khóa 34, 35 và Vi sinh vật khóa 36
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 34 đã nhiệt tình giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt những năm học qua.
Toàn thể thầy cô, cán bộ Viện NC&PT CNSH đã hết lòng quan tâm và truyền
đạt kiến thức trong suốt thời gian tôi học tập, để hôm nay tôi có thể vận dụng tốt trong
quá trình thực hiện đề tài cũng như công việc sau này.
Xin chân thành cảm ơn tất cả!
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƢỢC
Đề tài “Tuyển chọn vi khuẩn dạ cỏ cừu phối hợp với vi khuẩn dạ cỏ bò để phân
giải bã mía trong điều kiện in vitro” được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn tổ hợp
giữa các dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu và các dòng vi khuẩn được phân
lập từ dạ cỏ bò có khả năng phân giải bã mía ở điều kiện in vitro. Kết quả khảo sát
khả năng phân giải cho thấy nghiệm thức 4 với tổ hợp CD11: CD43: tổ hợp 3 dòng vi
khuẩn dạ cỏ bò (BM13, BM21 và BM49) theo tỷ lệ phối trộn là 1:1:2 cho hiệu quả cao
nhất, với tỷ lệ tiêu hoá các thành phần trong bã mía lần lượt là 13,31% DM , 7,08%
cellulose, 3,33% hemicellulose và 1,14% lignin. Dựa vào việc khảo sát trình tự
nucleotide của vùng gen 16S rRNA cho thấy 2 dòng vi khuẩn CD11 và CD43 lần lượt
đồng hình với các dòng vi khuẩn Achromobacter piechaudii strain M52 và Bacillus
tequilensis strain Z78 với mức đồng hình là 79% và 99%.
Từ khóa: bã mía, in vitro, phân giải, tỷ lệ tiêu hóa, vi khuẩn dạ cỏ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................ ii
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii
TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii
TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. ix
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Tổng quan về bã mía và các thành phần, cấu trúc .................................................... 3
2.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 3
2.1.2. Thành phần và cấu trúc ................................................................................. 3
2.1.2.1. Cellulose ............................................................................................ 3
2.1.2.2. Hemicellulose.................................................................................... 4
2.1.2.3. Lignin ................................................................................................ 5
2.2. Vi khuẩn trong dạ cỏ gia súc .................................................................................... 5
2.2.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 5
2.2.2. Tác động tương hỗ của vi sinh vật trong dạ cỏ ............................................. 6
2.2.3. Quá trình phân giải thức ăn xơ thô trong dạ cỏ ............................................ 7
2.2.4. Các điều kiện cần thiết cho vi khuẩn phân giải thức ăn xơ trong dạ cỏ ....... 8
2.3. Enzyme cellulase ...................................................................................................... 9
2.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 9
2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính cellulase ................................................... 10
2.4. Đánh giá chất lượng thức ăn thô bằng tỉ lệ tiêu hóa in vitro .................................. 10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
2.4.1. Vai trò phân tích hydrate carbon và xơ ...................................................... 11
2.5. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 11
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 11
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .............................................................. 12
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13
3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................................... 13
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 13
3.1.2. Thiết bị - Dụng cụ ...................................................................................... 13
3.1.3. Hóa chất ..................................................................................................... 13
3.1.4. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 15
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16
3.2.1. Khảo sát nguyên liệu .................................................................................. 16
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn
dạ cỏ cừu với nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò trong điều kiện in vitro .................................... 20
3.2.3. Định danh vi khuẩn bằng việc giải trình tự vùng gene 16S rRNA ............ 22
3.3. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25
4.1. Kết quả khảo sát nguyên vật liệu – bã mía ............................................................. 25
4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ
cừu với nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò trong điều kiện in vitro ...................................... 26
4.2.1. Hàm lượng vật chất khô ............................................................................. 27
4.2.2. Hàm lượng cellulose .................................................................................. 29
4.2.3. Hàm lượng hemicelluloses ......................................................................... 32
4.2.4. Hàm lượng lignin ....................................................................................... 35
4.3. Định danh vi khuẩn bằng việc giải trình tự vùng gene 16S rRNA......................... 37
4.3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR .................................................................. 37
4.3.2. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA và định danh 2 dòng vi
khuẩn…….. ................................................................................................................... 38
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 42
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
5.1. Kết luận................................................................................................................... 42
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43
Tiếng Việt ............................................................................................................. 43
Tiếng Anh ............................................................................................................. 44
Trang web ............................................................................................................. 49
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm
Phụ lục 2: Kết quả thống kê
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Các thành phần nghiên cứu trong thức ăn........ Error! Bookmark not defined.
Bảng 2. Thành phần môi trường đặc cải tiến (M1) ...................................................... 14
Bảng 3. Thành phân môi trường lỏng cải tiến (M2) ...................................................... 15
Bảng 4. Thành phần môi trường Luria-Bertani (LB) .................................................... 15
Bảng 5. Thành phần dung dịch đệm (buffer) cho phương pháp phân giải bã mía
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 15
Bảng 6. Phần trăm dịch dạ cỏ và dịch vi khuẩn trong các ĐC và NT ........................... 20
Bảng 7. Thành phần thực liệu trong bình ủ in vitro ...................................................... 22
Bảng 8. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR ...................................................... 24
Bảng 9. Kết quả khảo sát thành phần của bã mía sau khi xử lý .................................... 25
Bảng 10. Kết quả khảo sát hàm lượng vật chất khô của bã mía nguyên liệu
Bảng 11. Kết quả khảo sát hàm lượng tro tổng của bã mía nguyên liệu
Bảng 12. Kết quả khảo sát hàm lượng NDF của bã mía nguyên liệu
Bảng 13. Kết quả khảo sát hàm lượng ADF của bã mía nguyên liệu
Bảng 14. Kết quả khảo sát hàm lượng ADL của bã mía nguyên liệuii
Bảng 15. Kết quả khảo sát hàm lượng hemicellulose, lignin, cellulose của bã mía
nguyên liệu
Bảng 16. Kết quả hàm lượng DM trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 17. Kết quả hàm lượng NDF trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 18. Kết quả hàm lượng ADF trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 19. Kết quả hàm lượng ADL (Lignin) trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và
NT trong điều kiện in vitro
Bảng 20. Kết quả hàm lượng cellulose và hemicellulose trong bã mía bị phân giải ở
các ĐC và NT trong điều kiện in vitro
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 21. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng vật chất khô trong bã mía của
các nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 22. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng cellulose trong bã mía của các
nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 23. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng hemicellulose trong bã mía của
các nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 24. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng lignin trong bã mía của các
nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose .................................................................................. 3
Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicellulose .......................................................................... 4
Hình 3. Cấu trúc phân tử lignin ....................................................................................... 5
Hình 4. Quá trình phân giải và lên men gluxit ở dạ cỏ ................................................... 7
Hình 5. Sự tương quan giữa pH và hoạt lực của các nhóm VSV dạ cỏ .......................... 9
Hình 6. Một số thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 14
Hình 7. Bò đã mổ lỗ dò.................................................................................................. 21
Hình 8. Dụng cụ lấy dịch dạ cỏ ..................................................................................... 21
Hình 9. Lấy khí từ hệ thống E103.1 .............................................................................. 22
Hình 10. Mô hình ủ in vitro ........................................................................................... 22
Hình 11. Chu trình phản ứng PCR ................................................................................ 24
Hình 12. Biểu đồ hàm lượng vật chất khô bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 27
Hình 13. Biểu đồ hàm lượng cellulose bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 30
Hình 14. Biểu đồ hàm lượng lignin bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp trong
điều kiện in vitro ............................................................................................ 35
Hình 15. Phổ điện di đoạn 16S rRNA của hai dòng vi khuẩn CD43 và CD11 ............. 38
Hình 16. Trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD43..................... 40
Hình 17. Mức độ tương đồng của dòng vi khuẩn CD43 với Bacillus
tequilensis strain Z78 ..................................................................................... 41
Hình 18. So sánh trình tự 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD43 với Bacillus
tequilensis strain Z78 ..................................................................................... 41
Hình 19. Trình tự DNA vùng gen 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD11 ...................... 39
Hình 20. Mức độ tương đồng của dòng vi khuẩn CD11 với Achromobacter
piechaudii strain M52..................................................................................... 39
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Hình 21. So sánh trình tự 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD11 với Achromobacter
piechaudii strain M52..................................................................................... 39
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
TỪ VIẾT TẮT
ABBH Acid béo bay hơi.
ADF Acid Detergent Fiber
ADL Acid Detergent Lignin
Ash Hàm lượng tro- khoáng tổng
CF crube fiber – xơ thô
CP crube protein
DM Vật chất khô – Dry matter
ĐC Đối chứng
g gram
L lít
ME Metabolizable energy
N Nitơ
NDF Neutral Detergent Fiber
NT Nghiệm thức
µl microliter
VSV Vi sinh vật
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Theo số liệu của Tổng cục thống kê Việt Nam, tính đến cuối năm 2010, diện tích
mía cả nước đạt 266.300 ha, năng suất mía bình quân đạt 59,9 tấn/ha, cùng với quy
hoạch phát triển mía đường của Chính phủ dẫn đến lượng mía được tiêu thụ ngày càng
tăng (Cục Trồng trọt, 2010). Song song đó, lượng bã mía thải ra hàng năm cũng rất
lớn. Mặc dù, có nhiều ứng dụng sử dụng nguồn nguyên liệu bỏ đi này (năng lượng
sinh học, năng lượng tái tạo, làm phân hữu cơ), nhưng chúng chỉ chiếm một phần
không đáng kể.
Ngày nay, do đời sống của nhân dân ta ngày càng được nâng cao, nhu cầu về
đạm động vật trong cơ cấu bữa ăn thay đổi lớn nên đã kích thích ngành chăn nuôi phát
triển, với quy mô lớn. Hiện nay, chăn nuôi truyền thống dựa vào nguồn thức ăn sẵn có
của địa phương như đồng cỏ tự nhiên và phụ phẩm cây trồng. Để giúp hộ gia đình có
thể nâng cao sản lượng, nhiều biện pháp để cải thiện khả năng sử dụng thức ăn đã
được nghiên cứu trong suốt nhiều thập kỷ qua, với nhiều thử nghiệm đa dạng (Jackson,
1978). Một trong những biện pháp phổ biến được người dân sử dụng hiện nay để giải
quyết vấn đề trên là sử dụng các loại phụ phẩm bổ sung, làm tăng khả năng hấp thụ
dinh dưỡng cho gia súc. Bên cạnh sử dụng các loại rơm rạ, cỏ tươi, nhiều người dân sử
dụng bã mía như một loại phụ phẩm (Nguyễn Xuân Trạch, 2003).
Việc thu hoạch mía mang tính mùa vụ và ồ ạt, dẫn đến tình trạng gia súc không
sử dụng hết; còn việc bảo quản lâu dài, đa phần chúng bị giảm hoặc mất chất dinh
dưỡng. Mặt khác, tốc độ phân giải thức ăn thô và hiệu quả sử dụng thức ăn được xác
định chính bởi hiệu quả làm việc của hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Vì vậy, bổ sung một
lượng vi khuẩn phân giải chất xơ thích hợp, nhằm nâng cao tỷ lệ tiêu hóa thức ăn, tận
dụng triệt để hàm lượng chất dinh đưỡng trong thức ăn.
Để đánh giá khả năng tiêu hoá xơ, nhiều kỹ thuật đã được thực hiện trong nhiều
thập kỷ qua. Gần đây, kỹ thuật tiêu hoá in vitro sử dụng nguồn dịch dạ cỏ làm nguồn
dưỡng chất cho vi sinh vật phân lặp từ dạ cỏ gia súc nhai lại, phát triển mạnh. Mặc dù
ít tốn lém và than thiện với môi trường, nhưng vẫn chưa được áp dụng phổ biến ở
nước ta (Danh Mô và Nguyễn Văn Thu, 2008)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
1.2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá được tỉ lệ phối hợp tối ưu của các dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu với các
dòng vi khuẩn dạ cỏ bò, để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bã mía và các thành phần, cấu trúc
2.1.1. Giới thiệu chung
Bã mía được xem là nguồn sản phẩm thừa từ ngành công nghiệp sản xuất mía.
Nhìn chung, bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép với trung bình 49% là
nước, 48% là xơ. Ngày nay, bã mía có thể dùng làm sản phẩm ethanol, nguyên liệu đốt
lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là
nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp.
2.1.2. Thành phần và cấu trúc
Bã mía có giá trị dinh dưỡng thấp, chứa nhiều xơ khoảng 40%, 24% hemicellu-
lose và 25% lignin (Lee et al., 2003).
2.1.2.1. Cellulose: chiếm gần nửa khối lượng của cây với cấu trúc chủ yếu
của tế bào thực vật, là chuỗi carbohydrate đơn giản, phân tử mạch thẳng, được tạo bởi
-D-glucose bằng liên kết -1,4-glocosid (Hình 1). Công thức cấu tạo cellulose là
(C6H10O5)n.
Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose
(*Nguồn: http://www.fibersource.com/f-tutor/cellulose.htm ngày 22/09/2012)
Trong tự nhiên, cellulose tồn tại ở dạng tinh thể, với nhiều chuỗi thẳng liên kết
với nhau nhờ mạch nối hydrogen tạo thành các sợi cellulose bền vững (microfibril).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Phân giải cellulose tạo ra nhiều loại đường như: cellotriose và cellotetraose. Liên kết
nhóm hydroxyl giữa các phân tử trong và khác sợi, tạo thành lực hình thành cấu trúc
cellulose. Liên kết hydrogen giữa các nhóm hydroxyl trong cùng một chuỗi cellulose
tạo ra độ xơ cao. Liên kết hydrogen giữa các nhóm hydroxyl giữa các chuỗi cellulose
gần nhau, hình thành cấu trúc song song tạo ra các bó sợi cellulose.
2.1.2.2. Hemicellulose: là những heteropolysaccharide polymer với một số
loại đường đơn như xylose, arabinose, mannose và galactose. Xylose chiếm đa phần
trong thành phần hemicellulose cùng với arabinose. Các thành phần còn lại chiếm
lượng nhỏ (Hình 2). Loại này thường liên kết với các cấu trúc phenolic bao bọc xung
quanh các microfibril cùng với một số thành phần khác như pectin và glycoprotein.
Hemicellulose không hòa tan trong nước, nhưng hòa tan trong kiềm và bị phân giải dễ
dàng bởi acid. Công thức cấu tạo là (C5H8O4)n và một số trường hợp là (C6H10O5)n.
Một số hemicellulose chứa glucomannans và galactoglucomannans.
Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicellulose
(*Nguồn:http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-
center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html ngày 22/09/2012)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
2.1.2.3. Lignin: là hetero-polyme vô định hình của các loại rượu phenolic.
Chỉ dưới tác dụng của kiềm, bisulfitnatri hay acid sulfur, một phần lignin bị phân giải
và chuyển vào dung dịch. Thực vật càng già thì lignin hóa càng cao. Điều này làm cho
thành tế bào thực vật trở nên cứng và bền vững, nhưng gây khó khăn cho quá trình tiêu
hóa chất xơ ở gia súc. Lignin và hemicellulose liên kết với nhau bởi cầu nối ester giữa
arabinose của hemicellulose và nhóm hydroxyl của lignin (Hình 3).
Hình 3. Cấu trúc phân tử lignin
(*Nguồn:http://blogs.princeton.edu/chm333/f2006/biomass/bio_oil/02_chemistryprocessing_the
_basics/01_chemistry/ ngày 29/10/2010)
2.2. Vi khuẩn trong dạ cỏ gia súc
2.2.1. Giới thiệu chung
Hệ vi sinh vật (VSV) thường nằm trong dạ cỏ với điều kiện môi trường thuận lợi
(yếm khí, nhiệt độ, pH,..), nhằm giúp việc tiêu hoá thức ăn bằng phương thức lên men,
hấp thu dinh dưỡng từ thức ăn, cũng như hòa tan các chất dinh dưỡng chuyển xuống
phần dưới của đường tiêu hoá. Có tới khoảng 50-80% các chất dinh dưỡng thức ăn
được lên men ở dạ cỏ, với các sản phẩm chính là các acid béo bay hơi (ABBH), sinh
khối VSV, các khí thể (CH4, CO2), và các vitamin nhóm B, vitamin K. Tổng số vi
khuẩn trong dạ cỏ thường 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ. Trong dạ cỏ, 30% vi
khuẩn ở thể tự do, còn lại bám vào các nếp gấp ở biểu mô, protozoa, thức ăn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Hệ VSV dạ cỏ ở gia súc rất phức tạp, cũng như phụ thuộc nhiều vào loại khẩu
phần và gia súc. Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính: vi khuẩn (Bacteria), động vật
nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi). Trong đó, hệ vi khuẩn chiếm số lượng lớn
nhất, và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ. Vi khuẩn dạ cỏ có thể được phân
loại dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng
(Nguyễn Bá Mùi, 2010). Theo Nguyễn Xuân Trạch et al. (2004), một số nhóm vi
khuẩn dạ cỏ chính gồm:
- Vi khuẩn phân giải chất xơ: Đây là nhóm chiếm số lượng lớn trong tổng số
các loại vi khuẩn. Thời gian sống trung bình là 18 giờ, với mật độ 1010CFU/ml. Tại dạ
cỏ, loại vi khuẩn này tiết ra enzyme để tiêu hóa chất xơ, đây là loại vi khuẩn quan
trọng trong dạ cỏ, chúng phân giải cellulose, hemicellulose và pectin. Những loài vi
khuẩn quan trọng phân giải cellulose: Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisol-
vens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens.
Những loài vi khuẩn sử dụng hemicellulose: Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira
multiparus và Bacteroides ruminicola.
- Vi khuẩn phân giải chất tinh bột: nhóm này đứng thứ hai về mặt số lượng vi
khuẩn chiếm trong dạ cỏ. Phần lớn tinh bột trong thức ăn nhờ vào nhóm vi khuẩn ở dạ
cỏ phân giải, trong đó có cả một số vi khuẩn phân giải chất xơ. Những loài vi khuẩn
thuộc nhóm này gồm: Bacteroides amylophilus, Succinimonas amylolytica, Butyri-
vibrio fibrisolbvens, Bacteroides ruminantium, Selenomonas ruminantium và Stepto-
coccus bovis.
- Vi khuẩn phân giải protein: Trong số những loài vi khuẩn phân giải protein
và sinh amoniac thì Peptostreptococca và Clostridium có khả năng lớn nhất. Sự phân
giải protein và amoniac dễ sản sinh ra ammoniae, có ý nghĩa quan trọng trong việc tiết
kiệm và nguy cơ dư thừa amoniac.
- Còn lại, các loài vi khuẩn có khả năng phân giải đa dạng các thành phần
dinh dưỡng như: vitamin, đường, axit hữu cơ, tạo khí metan…
2.2.2. Tác động tương hỗ của vi sinh vật trong dạ cỏ
Trong điều kiện bình thường, hệ vi khuẩn trong dạ cỏ có sự cộng sinh, loài này
phát triển trên sản phẩm của loài kia, đặc biệt là trong tiêu hóa xơ. Sự kết hợp này có
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
tác dụng tạo ra sản phẩm trung gian, cần thiết cho các loài. Chúng cung cấp các điều
kiện môi trường ổn định cho hoạt động.
Trong điều kiện bình thường, giữa vi khuẩn và protozoa cũng có sự cộng sinh có
lợi, đặc biệt là tiêu hóa chất xơ. Protoza tạo điều kiện bình ổn định, hạn chế giảm pH
đột ngột, tăng điều kiện yếm khí, nên có lợi cho vi khuẩn phân giải chất xơ (Nguyễn
Xuân Trạch, 2003).
2.2.3. Quá trình phân giải thức ăn xơ thô trong dạ cỏ
Quá trình tổng quát tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ gồm: thức ăn được nhai nát
thành những mẫu nhỏ, nhào trộn với nước bọt, co bóp của dạ cỏ, thức ăn vẫn còn kích
thước lớn được đưa trở lại miệng nhai lại.
Phân giải sinh học là quá trình quan trọng, nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh phong
phú trong dạ cỏ, nhiệt độ và độ pH trung tính khá ổn định, lại có môi trường yếm khí
và các chất dinh dưỡng từ thức ăn trong dạ cỏ đã tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh
vật phát triển. Nhờ sự hoạt động của hệ vi sinh vật dạ cỏ này, 20-30% hàm lượng xơ
trong vật chất khô được tiêu hóa, trong khi các gia súc dạ dày đơn chỉ có thể tiêu hoá
các loại thức ăn có hàm lượng chất xơ dưới 10%.
Hình 4. Quá trình phân giải và lên men gluxit ở dạ cỏ
(*Nguồn: Nguyễn Xuân Trạch, 2007)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Các vi sinh vật bám vào các tiểu phần thức ăn và phân giải từng phần cellulose
và hemicellulose nhờ enzyme cellulase. Xơ được tiêu hoá thành các sản phẩm đơn
giản cùng với đường, tinh bột được lên men tạo thành các loại đường, ABBH, CO2 và
CH4. Sản phẩm đường lại trở thành các sản phẩm trung gian và được lên men bởi các
VSV. Các ABBH được hấp thu vào máu qua thành dạ cỏ và tham gia vào quá trình
trao đổi chất. Các chất có nitơ (N) được phân giải thành NH3 và được vi sinh vật sử
dụng để tổng hợp thành protein cho cơ thể chúng và đây cũng là nguồn protein cung
cấp cho cơ thể gia súc.
Quá trình phân giải vách tế bào đòi hỏi các enzyme tiết ra từ vi sinh vật xâm
nhập vào bên trong cấu trúc xơ của vách tế bào. Thế nhưng, các loại thức ăn của gia
súc có vách tế bào bị lignin hoá cao với những cấu trúc rất phức tạp. Cellulose và
hemicellulose liên kết với lignin tạo thành các phức chất bền vững, rất khó tiêu hoá.
Đặc biệt trong môi trường acid nhẹ của dạ cỏ, các liên kết hoá học trong các phức hợp
rất bền, và trở thành hàng rào ngăn chặn quá trình enzyme cellulase tiếp xúc với vách
tế bào (Nguyễn Xuân Trạch, 2007).
2.2.4. Các điều kiện cần thiết cho vi khuẩn phân giải thức ăn xơ trong dạ cỏ
Vai trò của pH: Có độ pH thích hợp từ 6,4 -7. Nước bọt đóng vai trò quan trọng
như là dung dịch đệm bicarbonate, giúp cho sự ổn định pH, và phát triển của hệ VSV
kỵ khí. Khối lượng VSV trong dạ cỏ luôn được duy trì ổn định. Metan (CH4) và car-
bon (CO2) cũng là sản phẩm cuối của quá trình lên men. Ở độ pH thấp, mật độ vi
khuẩn phân giải cellulose giảm mạnh, và thường protozoa cũng mất. Khí carbonic và
metan được thải ra qua ợ hơi. Việc phân giải chất xơ bị ức chế, giảm khả năng tiêu
hóa. Ở độ pH cao, hầu hết các carbonic sản sinh ra trong quá trình lên men hay nước
bọt và thải ra ngoài (Võ Ngọc Anh, 2011).
Hầu hết các yếu tố cần thiết như: nhiệt độ, độ ẩm, yếm khí, áp suất thẩm thấu
được điều tiết tự động bởi cơ chế riêng trong dạ cỏ với nhiệt độ ổn định: 38-41oC, độ
ẩm cao (85-90%), mức độ oxygen <1%.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TUYỂN CHỌN VI KHUẨN DẠ CỎ CỪU
PHỐI HỢP VỚI VI KHUẨN DẠ CỎ BÕ
ĐỂ THỦY PHÂN BÃ MÍA TRONG ĐIỀU KIỆN
IN VITRO
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN LƢ VŨ THẢO VI
Ts. HỒ QUẢNG ĐỒ MSSV: 2082249
Ts. TRẦN NHÂN DŨNG LỚP: CNSHTT K34
Cần Thơ, Tháng 12/2012
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên) (ký tên)
Võ Văn Song Toàn Lư Vũ Thảo Vi
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(ký tên) (ký tên)
Hồ Quảng Đồ Trần Nhân Dũng
XÉT DUYỆT CỦA CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2012
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)
LỜI CẢM TẠ
-------------------
Để hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp, không chỉ có sự nổ lực, cố gắng của
bản thân, mà tôi còn luôn nhận được sự giúp đỡ rất chân thành và nhiệt tình từ gia
đình, thầy cô, bạn bè và rất nhiều người. Tôi xin gửi những lời tri ân sâu sắc đến:
Gia đình tôi, những người đã luôn theo sát, động viên và tạo mọi điều kiện tốt
nhất cho tôi có thể hoàn thành tốt luận văn.
Ts. Trần Nhân Dũng - Viện trưởng viện NC&PT CNSH, Ts. Hồ Quãng Đồ - Phó
trưởng bộ môn Chăn nuôi tiên tiến - khoa Nông và Sinh học ứng dụng, Ths. Võ Văn
Song Toàn – giảng viên phòng thí nghiệm Công nghệ và Enzyme - Viện NC&PT
CNSH - Trường ĐH Cần Thơ, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, quan tâm và cho những
lời khuyên bổ ích trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài về mặt lý thuyết cũng như
thực hành.
Anh Trần Văn Bé Năm – kỹ thuật viên phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Viện
NC&PT CNSH, Võ Phương Ghil - cán bộ phòng thí nghiệm Chăn nuôi tiên tiến - khoa
Nông và Sinh học ứng dụng - trường ĐH Cần Thơ, đã tận tình giúp đỡ và hỗ trợ các
thiết bị giúp tôi hoàn thành đề tài.
Các anh chị lớp Công nghệ Sinh học khóa 33 đã tận tình chỉ dẫn giúp tôi nắm
vững những kiến thức cơ bản trong phòng thí nghiệm.
Các bạn và các em lớp Công nghệ Sinh học khóa 34, 35 và Vi sinh vật khóa 36
đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 34 đã nhiệt tình giúp đỡ và động
viên tôi trong suốt những năm học qua.
Toàn thể thầy cô, cán bộ Viện NC&PT CNSH đã hết lòng quan tâm và truyền
đạt kiến thức trong suốt thời gian tôi học tập, để hôm nay tôi có thể vận dụng tốt trong
quá trình thực hiện đề tài cũng như công việc sau này.
Xin chân thành cảm ơn tất cả!
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
TÓM LƢỢC
Đề tài “Tuyển chọn vi khuẩn dạ cỏ cừu phối hợp với vi khuẩn dạ cỏ bò để phân
giải bã mía trong điều kiện in vitro” được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn tổ hợp
giữa các dòng vi khuẩn được phân lập từ dạ cỏ cừu và các dòng vi khuẩn được phân
lập từ dạ cỏ bò có khả năng phân giải bã mía ở điều kiện in vitro. Kết quả khảo sát
khả năng phân giải cho thấy nghiệm thức 4 với tổ hợp CD11: CD43: tổ hợp 3 dòng vi
khuẩn dạ cỏ bò (BM13, BM21 và BM49) theo tỷ lệ phối trộn là 1:1:2 cho hiệu quả cao
nhất, với tỷ lệ tiêu hoá các thành phần trong bã mía lần lượt là 13,31% DM , 7,08%
cellulose, 3,33% hemicellulose và 1,14% lignin. Dựa vào việc khảo sát trình tự
nucleotide của vùng gen 16S rRNA cho thấy 2 dòng vi khuẩn CD11 và CD43 lần lượt
đồng hình với các dòng vi khuẩn Achromobacter piechaudii strain M52 và Bacillus
tequilensis strain Z78 với mức đồng hình là 79% và 99%.
Từ khóa: bã mía, in vitro, phân giải, tỷ lệ tiêu hóa, vi khuẩn dạ cỏ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT ........................................................................................................ ii
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii
TÓM LƢỢC .................................................................................................................... i
MỤC LỤC ...................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... v
DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii
TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................................. ix
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu đề tài .......................................................................................................... 2
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ..................................................................... 3
2.1. Tổng quan về bã mía và các thành phần, cấu trúc .................................................... 3
2.1.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 3
2.1.2. Thành phần và cấu trúc ................................................................................. 3
2.1.2.1. Cellulose ............................................................................................ 3
2.1.2.2. Hemicellulose.................................................................................... 4
2.1.2.3. Lignin ................................................................................................ 5
2.2. Vi khuẩn trong dạ cỏ gia súc .................................................................................... 5
2.2.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 5
2.2.2. Tác động tương hỗ của vi sinh vật trong dạ cỏ ............................................. 6
2.2.3. Quá trình phân giải thức ăn xơ thô trong dạ cỏ ............................................ 7
2.2.4. Các điều kiện cần thiết cho vi khuẩn phân giải thức ăn xơ trong dạ cỏ ....... 8
2.3. Enzyme cellulase ...................................................................................................... 9
2.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................... 9
2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính cellulase ................................................... 10
2.4. Đánh giá chất lượng thức ăn thô bằng tỉ lệ tiêu hóa in vitro .................................. 10
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
2.4.1. Vai trò phân tích hydrate carbon và xơ ...................................................... 11
2.5. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................. 11
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 11
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước .............................................................. 12
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 13
3.1. Phương tiện nghiên cứu .......................................................................................... 13
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 13
3.1.2. Thiết bị - Dụng cụ ...................................................................................... 13
3.1.3. Hóa chất ..................................................................................................... 13
3.1.4. Nguyên vật liệu .......................................................................................... 15
3.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 16
3.2.1. Khảo sát nguyên liệu .................................................................................. 16
3.2.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn
dạ cỏ cừu với nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò trong điều kiện in vitro .................................... 20
3.2.3. Định danh vi khuẩn bằng việc giải trình tự vùng gene 16S rRNA ............ 22
3.3. Xử lý số liệu ........................................................................................................... 24
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 25
4.1. Kết quả khảo sát nguyên vật liệu – bã mía ............................................................. 25
4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng phân giải bã mía của tổ hợp vi khuẩn dạ cỏ
cừu với nhóm vi khuẩn dạ cỏ bò trong điều kiện in vitro ...................................... 26
4.2.1. Hàm lượng vật chất khô ............................................................................. 27
4.2.2. Hàm lượng cellulose .................................................................................. 29
4.2.3. Hàm lượng hemicelluloses ......................................................................... 32
4.2.4. Hàm lượng lignin ....................................................................................... 35
4.3. Định danh vi khuẩn bằng việc giải trình tự vùng gene 16S rRNA......................... 37
4.3.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR .................................................................. 37
4.3.2. Kết quả giải trình tự vùng gen 16S rRNA và định danh 2 dòng vi
khuẩn…….. ................................................................................................................... 38
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 42
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
5.1. Kết luận................................................................................................................... 42
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 43
Tiếng Việt ............................................................................................................. 43
Tiếng Anh ............................................................................................................. 44
Trang web ............................................................................................................. 49
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Kết quả thí nghiệm
Phụ lục 2: Kết quả thống kê
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Các thành phần nghiên cứu trong thức ăn........ Error! Bookmark not defined.
Bảng 2. Thành phần môi trường đặc cải tiến (M1) ...................................................... 14
Bảng 3. Thành phân môi trường lỏng cải tiến (M2) ...................................................... 15
Bảng 4. Thành phần môi trường Luria-Bertani (LB) .................................................... 15
Bảng 5. Thành phần dung dịch đệm (buffer) cho phương pháp phân giải bã mía
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 15
Bảng 6. Phần trăm dịch dạ cỏ và dịch vi khuẩn trong các ĐC và NT ........................... 20
Bảng 7. Thành phần thực liệu trong bình ủ in vitro ...................................................... 22
Bảng 8. Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR ...................................................... 24
Bảng 9. Kết quả khảo sát thành phần của bã mía sau khi xử lý .................................... 25
Bảng 10. Kết quả khảo sát hàm lượng vật chất khô của bã mía nguyên liệu
Bảng 11. Kết quả khảo sát hàm lượng tro tổng của bã mía nguyên liệu
Bảng 12. Kết quả khảo sát hàm lượng NDF của bã mía nguyên liệu
Bảng 13. Kết quả khảo sát hàm lượng ADF của bã mía nguyên liệu
Bảng 14. Kết quả khảo sát hàm lượng ADL của bã mía nguyên liệuii
Bảng 15. Kết quả khảo sát hàm lượng hemicellulose, lignin, cellulose của bã mía
nguyên liệu
Bảng 16. Kết quả hàm lượng DM trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 17. Kết quả hàm lượng NDF trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 18. Kết quả hàm lượng ADF trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và NT trong
điều kiện in vitro
Bảng 19. Kết quả hàm lượng ADL (Lignin) trong bã mía bị phân giải ở các ĐC và
NT trong điều kiện in vitro
Bảng 20. Kết quả hàm lượng cellulose và hemicellulose trong bã mía bị phân giải ở
các ĐC và NT trong điều kiện in vitro
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Bảng 21. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng vật chất khô trong bã mía của
các nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 22. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng cellulose trong bã mía của các
nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 23. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng hemicellulose trong bã mía của
các nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Bảng 24. Kết quả phân tích thống kê hàm lượng lignin trong bã mía của các
nghiệm thức sau 3 ngày ủ với điều kiện in vitro
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose .................................................................................. 3
Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicellulose .......................................................................... 4
Hình 3. Cấu trúc phân tử lignin ....................................................................................... 5
Hình 4. Quá trình phân giải và lên men gluxit ở dạ cỏ ................................................... 7
Hình 5. Sự tương quan giữa pH và hoạt lực của các nhóm VSV dạ cỏ .......................... 9
Hình 6. Một số thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 14
Hình 7. Bò đã mổ lỗ dò.................................................................................................. 21
Hình 8. Dụng cụ lấy dịch dạ cỏ ..................................................................................... 21
Hình 9. Lấy khí từ hệ thống E103.1 .............................................................................. 22
Hình 10. Mô hình ủ in vitro ........................................................................................... 22
Hình 11. Chu trình phản ứng PCR ................................................................................ 24
Hình 12. Biểu đồ hàm lượng vật chất khô bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 27
Hình 13. Biểu đồ hàm lượng cellulose bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp
trong điều kiện in vitro ................................................................................... 30
Hình 14. Biểu đồ hàm lượng lignin bị phân giải của các nghiệm thức phối hợp trong
điều kiện in vitro ............................................................................................ 35
Hình 15. Phổ điện di đoạn 16S rRNA của hai dòng vi khuẩn CD43 và CD11 ............. 38
Hình 16. Trình tự DNA vùng gene 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD43..................... 40
Hình 17. Mức độ tương đồng của dòng vi khuẩn CD43 với Bacillus
tequilensis strain Z78 ..................................................................................... 41
Hình 18. So sánh trình tự 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD43 với Bacillus
tequilensis strain Z78 ..................................................................................... 41
Hình 19. Trình tự DNA vùng gen 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD11 ...................... 39
Hình 20. Mức độ tương đồng của dòng vi khuẩn CD11 với Achromobacter
piechaudii strain M52..................................................................................... 39
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Hình 21. So sánh trình tự 16S rRNA của dòng vi khuẩn CD11 với Achromobacter
piechaudii strain M52..................................................................................... 39
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
TỪ VIẾT TẮT
ABBH Acid béo bay hơi.
ADF Acid Detergent Fiber
ADL Acid Detergent Lignin
Ash Hàm lượng tro- khoáng tổng
CF crube fiber – xơ thô
CP crube protein
DM Vật chất khô – Dry matter
ĐC Đối chứng
g gram
L lít
ME Metabolizable energy
N Nitơ
NDF Neutral Detergent Fiber
NT Nghiệm thức
µl microliter
VSV Vi sinh vật
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Theo số liệu của Tổng cục thống kê Việt Nam, tính đến cuối năm 2010, diện tích
mía cả nước đạt 266.300 ha, năng suất mía bình quân đạt 59,9 tấn/ha, cùng với quy
hoạch phát triển mía đường của Chính phủ dẫn đến lượng mía được tiêu thụ ngày càng
tăng (Cục Trồng trọt, 2010). Song song đó, lượng bã mía thải ra hàng năm cũng rất
lớn. Mặc dù, có nhiều ứng dụng sử dụng nguồn nguyên liệu bỏ đi này (năng lượng
sinh học, năng lượng tái tạo, làm phân hữu cơ), nhưng chúng chỉ chiếm một phần
không đáng kể.
Ngày nay, do đời sống của nhân dân ta ngày càng được nâng cao, nhu cầu về
đạm động vật trong cơ cấu bữa ăn thay đổi lớn nên đã kích thích ngành chăn nuôi phát
triển, với quy mô lớn. Hiện nay, chăn nuôi truyền thống dựa vào nguồn thức ăn sẵn có
của địa phương như đồng cỏ tự nhiên và phụ phẩm cây trồng. Để giúp hộ gia đình có
thể nâng cao sản lượng, nhiều biện pháp để cải thiện khả năng sử dụng thức ăn đã
được nghiên cứu trong suốt nhiều thập kỷ qua, với nhiều thử nghiệm đa dạng (Jackson,
1978). Một trong những biện pháp phổ biến được người dân sử dụng hiện nay để giải
quyết vấn đề trên là sử dụng các loại phụ phẩm bổ sung, làm tăng khả năng hấp thụ
dinh dưỡng cho gia súc. Bên cạnh sử dụng các loại rơm rạ, cỏ tươi, nhiều người dân sử
dụng bã mía như một loại phụ phẩm (Nguyễn Xuân Trạch, 2003).
Việc thu hoạch mía mang tính mùa vụ và ồ ạt, dẫn đến tình trạng gia súc không
sử dụng hết; còn việc bảo quản lâu dài, đa phần chúng bị giảm hoặc mất chất dinh
dưỡng. Mặt khác, tốc độ phân giải thức ăn thô và hiệu quả sử dụng thức ăn được xác
định chính bởi hiệu quả làm việc của hệ vi sinh vật trong dạ cỏ. Vì vậy, bổ sung một
lượng vi khuẩn phân giải chất xơ thích hợp, nhằm nâng cao tỷ lệ tiêu hóa thức ăn, tận
dụng triệt để hàm lượng chất dinh đưỡng trong thức ăn.
Để đánh giá khả năng tiêu hoá xơ, nhiều kỹ thuật đã được thực hiện trong nhiều
thập kỷ qua. Gần đây, kỹ thuật tiêu hoá in vitro sử dụng nguồn dịch dạ cỏ làm nguồn
dưỡng chất cho vi sinh vật phân lặp từ dạ cỏ gia súc nhai lại, phát triển mạnh. Mặc dù
ít tốn lém và than thiện với môi trường, nhưng vẫn chưa được áp dụng phổ biến ở
nước ta (Danh Mô và Nguyễn Văn Thu, 2008)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
1.2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá được tỉ lệ phối hợp tối ưu của các dòng vi khuẩn dạ cỏ cừu với các
dòng vi khuẩn dạ cỏ bò, để phân giải bã mía trong điều kiện in vitro.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bã mía và các thành phần, cấu trúc
2.1.1. Giới thiệu chung
Bã mía được xem là nguồn sản phẩm thừa từ ngành công nghiệp sản xuất mía.
Nhìn chung, bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép với trung bình 49% là
nước, 48% là xơ. Ngày nay, bã mía có thể dùng làm sản phẩm ethanol, nguyên liệu đốt
lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là
nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp.
2.1.2. Thành phần và cấu trúc
Bã mía có giá trị dinh dưỡng thấp, chứa nhiều xơ khoảng 40%, 24% hemicellu-
lose và 25% lignin (Lee et al., 2003).
2.1.2.1. Cellulose: chiếm gần nửa khối lượng của cây với cấu trúc chủ yếu
của tế bào thực vật, là chuỗi carbohydrate đơn giản, phân tử mạch thẳng, được tạo bởi
-D-glucose bằng liên kết -1,4-glocosid (Hình 1). Công thức cấu tạo cellulose là
(C6H10O5)n.
Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose
(*Nguồn: http://www.fibersource.com/f-tutor/cellulose.htm ngày 22/09/2012)
Trong tự nhiên, cellulose tồn tại ở dạng tinh thể, với nhiều chuỗi thẳng liên kết
với nhau nhờ mạch nối hydrogen tạo thành các sợi cellulose bền vững (microfibril).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Phân giải cellulose tạo ra nhiều loại đường như: cellotriose và cellotetraose. Liên kết
nhóm hydroxyl giữa các phân tử trong và khác sợi, tạo thành lực hình thành cấu trúc
cellulose. Liên kết hydrogen giữa các nhóm hydroxyl trong cùng một chuỗi cellulose
tạo ra độ xơ cao. Liên kết hydrogen giữa các nhóm hydroxyl giữa các chuỗi cellulose
gần nhau, hình thành cấu trúc song song tạo ra các bó sợi cellulose.
2.1.2.2. Hemicellulose: là những heteropolysaccharide polymer với một số
loại đường đơn như xylose, arabinose, mannose và galactose. Xylose chiếm đa phần
trong thành phần hemicellulose cùng với arabinose. Các thành phần còn lại chiếm
lượng nhỏ (Hình 2). Loại này thường liên kết với các cấu trúc phenolic bao bọc xung
quanh các microfibril cùng với một số thành phần khác như pectin và glycoprotein.
Hemicellulose không hòa tan trong nước, nhưng hòa tan trong kiềm và bị phân giải dễ
dàng bởi acid. Công thức cấu tạo là (C5H8O4)n và một số trường hợp là (C6H10O5)n.
Một số hemicellulose chứa glucomannans và galactoglucomannans.
Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicellulose
(*Nguồn:http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-
center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html ngày 22/09/2012)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
2.1.2.3. Lignin: là hetero-polyme vô định hình của các loại rượu phenolic.
Chỉ dưới tác dụng của kiềm, bisulfitnatri hay acid sulfur, một phần lignin bị phân giải
và chuyển vào dung dịch. Thực vật càng già thì lignin hóa càng cao. Điều này làm cho
thành tế bào thực vật trở nên cứng và bền vững, nhưng gây khó khăn cho quá trình tiêu
hóa chất xơ ở gia súc. Lignin và hemicellulose liên kết với nhau bởi cầu nối ester giữa
arabinose của hemicellulose và nhóm hydroxyl của lignin (Hình 3).
Hình 3. Cấu trúc phân tử lignin
(*Nguồn:http://blogs.princeton.edu/chm333/f2006/biomass/bio_oil/02_chemistryprocessing_the
_basics/01_chemistry/ ngày 29/10/2010)
2.2. Vi khuẩn trong dạ cỏ gia súc
2.2.1. Giới thiệu chung
Hệ vi sinh vật (VSV) thường nằm trong dạ cỏ với điều kiện môi trường thuận lợi
(yếm khí, nhiệt độ, pH,..), nhằm giúp việc tiêu hoá thức ăn bằng phương thức lên men,
hấp thu dinh dưỡng từ thức ăn, cũng như hòa tan các chất dinh dưỡng chuyển xuống
phần dưới của đường tiêu hoá. Có tới khoảng 50-80% các chất dinh dưỡng thức ăn
được lên men ở dạ cỏ, với các sản phẩm chính là các acid béo bay hơi (ABBH), sinh
khối VSV, các khí thể (CH4, CO2), và các vitamin nhóm B, vitamin K. Tổng số vi
khuẩn trong dạ cỏ thường 109-1010 tế bào/g chất chứa dạ cỏ. Trong dạ cỏ, 30% vi
khuẩn ở thể tự do, còn lại bám vào các nếp gấp ở biểu mô, protozoa, thức ăn.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Hệ VSV dạ cỏ ở gia súc rất phức tạp, cũng như phụ thuộc nhiều vào loại khẩu
phần và gia súc. Hệ VSV dạ cỏ gồm có 3 nhóm chính: vi khuẩn (Bacteria), động vật
nguyên sinh (Protozoa) và nấm (Fungi). Trong đó, hệ vi khuẩn chiếm số lượng lớn
nhất, và là tác nhân chính trong quá trình tiêu hóa xơ. Vi khuẩn dạ cỏ có thể được phân
loại dựa vào cơ chất mà vi khuẩn sử dụng hay sản phẩm lên men cuối cùng của chúng
(Nguyễn Bá Mùi, 2010). Theo Nguyễn Xuân Trạch et al. (2004), một số nhóm vi
khuẩn dạ cỏ chính gồm:
- Vi khuẩn phân giải chất xơ: Đây là nhóm chiếm số lượng lớn trong tổng số
các loại vi khuẩn. Thời gian sống trung bình là 18 giờ, với mật độ 1010CFU/ml. Tại dạ
cỏ, loại vi khuẩn này tiết ra enzyme để tiêu hóa chất xơ, đây là loại vi khuẩn quan
trọng trong dạ cỏ, chúng phân giải cellulose, hemicellulose và pectin. Những loài vi
khuẩn quan trọng phân giải cellulose: Bacteroides succinogenes, Butyrivibrio fibrisol-
vens, Ruminoccocus flavefaciens, Ruminococcus albus, Cillobacterium cellulosolvens.
Những loài vi khuẩn sử dụng hemicellulose: Butyrivibrio fibrisolvens, Lachnospira
multiparus và Bacteroides ruminicola.
- Vi khuẩn phân giải chất tinh bột: nhóm này đứng thứ hai về mặt số lượng vi
khuẩn chiếm trong dạ cỏ. Phần lớn tinh bột trong thức ăn nhờ vào nhóm vi khuẩn ở dạ
cỏ phân giải, trong đó có cả một số vi khuẩn phân giải chất xơ. Những loài vi khuẩn
thuộc nhóm này gồm: Bacteroides amylophilus, Succinimonas amylolytica, Butyri-
vibrio fibrisolbvens, Bacteroides ruminantium, Selenomonas ruminantium và Stepto-
coccus bovis.
- Vi khuẩn phân giải protein: Trong số những loài vi khuẩn phân giải protein
và sinh amoniac thì Peptostreptococca và Clostridium có khả năng lớn nhất. Sự phân
giải protein và amoniac dễ sản sinh ra ammoniae, có ý nghĩa quan trọng trong việc tiết
kiệm và nguy cơ dư thừa amoniac.
- Còn lại, các loài vi khuẩn có khả năng phân giải đa dạng các thành phần
dinh dưỡng như: vitamin, đường, axit hữu cơ, tạo khí metan…
2.2.2. Tác động tương hỗ của vi sinh vật trong dạ cỏ
Trong điều kiện bình thường, hệ vi khuẩn trong dạ cỏ có sự cộng sinh, loài này
phát triển trên sản phẩm của loài kia, đặc biệt là trong tiêu hóa xơ. Sự kết hợp này có
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
tác dụng tạo ra sản phẩm trung gian, cần thiết cho các loài. Chúng cung cấp các điều
kiện môi trường ổn định cho hoạt động.
Trong điều kiện bình thường, giữa vi khuẩn và protozoa cũng có sự cộng sinh có
lợi, đặc biệt là tiêu hóa chất xơ. Protoza tạo điều kiện bình ổn định, hạn chế giảm pH
đột ngột, tăng điều kiện yếm khí, nên có lợi cho vi khuẩn phân giải chất xơ (Nguyễn
Xuân Trạch, 2003).
2.2.3. Quá trình phân giải thức ăn xơ thô trong dạ cỏ
Quá trình tổng quát tiêu hóa thức ăn trong dạ cỏ gồm: thức ăn được nhai nát
thành những mẫu nhỏ, nhào trộn với nước bọt, co bóp của dạ cỏ, thức ăn vẫn còn kích
thước lớn được đưa trở lại miệng nhai lại.
Phân giải sinh học là quá trình quan trọng, nhờ hệ vi sinh vật cộng sinh phong
phú trong dạ cỏ, nhiệt độ và độ pH trung tính khá ổn định, lại có môi trường yếm khí
và các chất dinh dưỡng từ thức ăn trong dạ cỏ đã tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh
vật phát triển. Nhờ sự hoạt động của hệ vi sinh vật dạ cỏ này, 20-30% hàm lượng xơ
trong vật chất khô được tiêu hóa, trong khi các gia súc dạ dày đơn chỉ có thể tiêu hoá
các loại thức ăn có hàm lượng chất xơ dưới 10%.
Hình 4. Quá trình phân giải và lên men gluxit ở dạ cỏ
(*Nguồn: Nguyễn Xuân Trạch, 2007)
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Đề cương LVTN Đại học Khóa 34 – 2012 Trường Đại học Cần Thơ
Các vi sinh vật bám vào các tiểu phần thức ăn và phân giải từng phần cellulose
và hemicellulose nhờ enzyme cellulase. Xơ được tiêu hoá thành các sản phẩm đơn
giản cùng với đường, tinh bột được lên men tạo thành các loại đường, ABBH, CO2 và
CH4. Sản phẩm đường lại trở thành các sản phẩm trung gian và được lên men bởi các
VSV. Các ABBH được hấp thu vào máu qua thành dạ cỏ và tham gia vào quá trình
trao đổi chất. Các chất có nitơ (N) được phân giải thành NH3 và được vi sinh vật sử
dụng để tổng hợp thành protein cho cơ thể chúng và đây cũng là nguồn protein cung
cấp cho cơ thể gia súc.
Quá trình phân giải vách tế bào đòi hỏi các enzyme tiết ra từ vi sinh vật xâm
nhập vào bên trong cấu trúc xơ của vách tế bào. Thế nhưng, các loại thức ăn của gia
súc có vách tế bào bị lignin hoá cao với những cấu trúc rất phức tạp. Cellulose và
hemicellulose liên kết với lignin tạo thành các phức chất bền vững, rất khó tiêu hoá.
Đặc biệt trong môi trường acid nhẹ của dạ cỏ, các liên kết hoá học trong các phức hợp
rất bền, và trở thành hàng rào ngăn chặn quá trình enzyme cellulase tiếp xúc với vách
tế bào (Nguyễn Xuân Trạch, 2007).
2.2.4. Các điều kiện cần thiết cho vi khuẩn phân giải thức ăn xơ trong dạ cỏ
Vai trò của pH: Có độ pH thích hợp từ 6,4 -7. Nước bọt đóng vai trò quan trọng
như là dung dịch đệm bicarbonate, giúp cho sự ổn định pH, và phát triển của hệ VSV
kỵ khí. Khối lượng VSV trong dạ cỏ luôn được duy trì ổn định. Metan (CH4) và car-
bon (CO2) cũng là sản phẩm cuối của quá trình lên men. Ở độ pH thấp, mật độ vi
khuẩn phân giải cellulose giảm mạnh, và thường protozoa cũng mất. Khí carbonic và
metan được thải ra qua ợ hơi. Việc phân giải chất xơ bị ức chế, giảm khả năng tiêu
hóa. Ở độ pH cao, hầu hết các carbonic sản sinh ra trong quá trình lên men hay nước
bọt và thải ra ngoài (Võ Ngọc Anh, 2011).
Hầu hết các yếu tố cần thiết như: nhiệt độ, độ ẩm, yếm khí, áp suất thẩm thấu
được điều tiết tự động bởi cơ chế riêng trong dạ cỏ với nhiệt độ ổn định: 38-41oC, độ
ẩm cao (85-90%), mức độ oxygen <1%.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học