Tiếp tục nghiên cứu cây mắc rạc (delavaya toxocarpa french., sapindaceae)
- 51 trang
- file .pdf
IỈỘ Y T Ể
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
CAO NGỌC ANH■
TIẾP TỤC NGHIÊN cứ a CÂY MfiC RỢC
DELflVfiYfi TOXOCflRPfi FRENCH. SfiPINDfKEfiE
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 51(1996-2001)
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: GS.TS. PHẠM THANH KỲ
DS. NCS. CẨN TUYẾT NGA
NƠI THỰC HIỆN: BỘ MÔN Dược LIỆU
THỜI GIAN: 03/2000 - 05/2001
Hà nội, íỉìáiĩíỊ 05 năm 2001
/ / X V
o {,¿0- /
■v V
V ta . 4 3 ^ .
LC0* V -
LỞI CẦM dN
^ßltiun Çjhanh 3Cụf nDS/ïtfîJi. @ẩn ÇJutjêt QíigxL —ithữitụ ạưồi (Tã tt'ựe iiểp Itíửĩễiạ (lan
oil ehr tui ú ein hoan thành Ulíúéí luận ễtítí/.
ố m eủỉt ụ æin e ả m ớềt eâừ th íỉi/ ạ ỉá ú , eồ (ịiáo , eáe eò Uụ th u ả t olên ỈMểiq hê tn êíi
^Diử/e tiêu, các phèềiụ han kháe tro ít ạ DỈi tiíịOỈii (rưĩínỉị đã ỉíííì ¿tiễu kỉềếi oỉt ụhíp (tở
eltú em ho ùil thành Uhúá Íi/ííễt tút nqhỉêp tviìiUị thài ụỉatt qua,
ũutíi eỉtễtạ, tồi æbz ạửi lẻ'ỉ eủm tín tối tat eủ lựiễt hỉ, tiạiĩồì than đũ ítộễtạ oìèn
Uhuụên Ultíelĩ tôi tnmg. quá trình ht) ùn thành khú€t liiíĩễt naiỊ.
Hà nội 15-05-2001
Sinh viên
Cao Ngọc Anh
CHÚ GIẦI CHỠ v iết tắ t
AOA Antioxydant activity
AS Ánh sáng
c s - iod Chỉ số iod
c s - xp Chỉ số xà phòng
c s - acid Chỉ số acid
CT Chỉ thị
Dd Dung dịch
Ftp Flavonoid toànphần
MDA Malonyldialdehyd
Mito. Mitochondri
Nm Nanomet
Nmol Nanomol
SKG Sắc ký giấy
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
MỤC LỤC Trang
PHẦN I: ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẦN II: TỔNG QUAN 2
1. Đặc điểm thực vật của cây Mắc rạc 2
2. Phân bố 3
3. Thành phần hoá học 3
4. Công dụng 3
PHẦN m . THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 4
1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 4
1.1. Nguyên liệu 4
1.2. Phương pháp nghiên cứu 4
2. Thực nghiệm và kết quả 5
2.1. Nghiên cứu về Flavonoid 5
2.1.1. Định tính Flavonoid trong lá 5
2.1.2.Chiết xuất Flavonoid toàn phần 6
2.1.3. Định tính cắn Flavonoid toàn phần bằng phản ứng 7
hoá học
2.1.4. Định tính cắn Flavonoid toàn phần bằng SKG 8
2.1.5. Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá 11
2.1.6. Phân lập Flavonoid 12
2.1.7. Sơ bộ nhận dạng F1? F2, F5, F6 14
2.2. Khảo sát Saponin trong lá 15
2.2.1 Hiện tượng tạo bọt 15
2.2.2. Sơ bộ phân biệt 2 loại SaponinSteroid và Saponin 15
triterpenoid
2.2.3. Xác định chỉ số bọt 15
2.2.4. Xác định chỉ số phá huyết 16
2.2.5. Chiết xuất Saponin 19
2.2.6. Khảo sát Saponin bằng SKLM 1chiều 19
2.2.7. Định lượng Saponin toàn phần 20
2.3. Nghiên cứu dầu béo trong hạt 21
2.3.1. Định lượng dầu béo trong hạt 21
2.3.2. Xác định chỉ số iod của dầu hạt 22
2.3.3. Xác định chỉ số xà phòng của dầu hạt 23
2.3.4. Xác định chỉ số acid của dầu hạt 24
2.3.5. Xác định chỉ số este của dầu hạt 25
2.4. Nghiên cứu 1 sô tác dụng sinh học 25
2.4.1. Tác dụng kháng khuẩn của Flavonoid toàn phần 25
2.4.2. Tác dụng chống oxy hoá 28
2.4.3. Thử tác dụng kích ứng trên da của dầu hạt 31
PHẦN IV: KẾT KUẬN YÀ ĐỂ XUẤT 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHẤN I - DẶT VẤN Dầ
Với vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam
có một hệ động vật, thực vật phong phú tạo cho chúng ta một nguồn dược liệu
đa dạng về chủng loại, giàu về số lượng. Do đó từ xa xưa ông cha ta đã biết sử
dụng cây cỏ động vật để làm thuốc phòng và chữa bệnh.
Nhằm phát huy truyền thống này Đảng và Nhà nước ta đã có những chủ
trương, chính sách tạo điều kiện cho việc bảo tồn và phát triển vốn y học cổ
truyền bên cạnh sự phát triển của y học hiện đại.
Tuy nhiên, bên cạnh những động vật, thực vật đã được nghiên cứu và
đưa vào sử dụng vẫn còn nhiều loại cây, con mới được sử dụng làm thuốc
theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa
đầy đủ. Mắc- rạc là một trong những loại dược liệu đó. Cây thuốc này chưa
được đưa vào danh mục trong cuốn sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam” của giáo sư Đỗ Tất Lợi nhưng đã có tên trong sách đỏ Việt Nam.
Do đó trong khoá luận tốt nghiệp này chúng tôi được giao nhiệm vụ “
Tiếp tục nghiên cứu cây Mắc rạc- Delavaya toxocarpa French.” Với những nội
dung sau:
1. Nghiên cứu Flavonoid:
+ Định tính Flavonoid trong lá Mắc rạc.
+ Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá.
+ Chiết xuất, phân lập Flavonoid.
2. Khảo sát Saponin: Định tính, định lượng, xác định chỉ số bọt, chỉ số phá
huyết.
3.Định lượng dầu béo trong hạt. Xác định chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ
số iod, chỉ số este.
4. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của dịch chiết Flavonoid toàn phần và
thử tác dụng kích ứng da của dầu hạt.
1
PHẦN n -TỐNG QUAN
1- Đặc điểm thực vật của cây Mắc rạc:
Theo tài liệu [7,8,10,11 ] cây Mắc Rạc (Cây Dầu Choòng, cây Mắc
Choòng) là cây bụi hay cây gỗ, cao 2-Ỉ-12 m. Cành không có lông, màu nâu đỏ.
Lá có 3 lá chét, lá chét ở đầu dài 7-Ï-15 cm, rộng 2.5-Ỉ-3 cm, mép có răng nằm,
gân phụ có 114-22 cặp nổi hai mặt, không lông; cuống phụ dài 2 mm, cuống lá
dài 3-^-5 cm. Chùm hoa dài 6-Ỉ-12 cm. Hoa màu trắng, thơm với 4-Ỉ-5 lá đài, 4-^8
cánh hoa, bộ nhị gồm 8 nhị, bầu 2+3 ô, mỗi ô chứa 2+3 noãn. Quả hình trái
xoan dài đến 3,5 cm màu đỏ tím mở làm 2-Ỉ-3 mảnh. Hạt đen dạng hạt nhãn.
Hình 1: Cây Mắc rạc.
2
2- Phân bố:
Theo tài liệu [8,11,18,19] cây mọc trong rừng thường xanh hay rừng
phục hồi trên núi đá vôi hay núi đất ở độ cao 250-Ỉ-1500 m. Phân bố ở Vân
Nam (Trung Quốc), gặp ở Cao Bằng, Lạng Sơn,Tuyên Quang,Hà Giang (Việt
Nam).
3- Thành phần hóa học:
Theo Nguyễn Văn Bách [6], trong lá cây Mắc Rạc có chứa Flavonoid,
Saponin, Coumarin, Tanin, Đường khử, Caroten, Sterol, Acid hữu cơ.
4- Công dụng[8,9,18]:
Gỗ cứng dùng trong xây dựng và đóng đồ gia dụng, nông cụ. Hạt chứa
dầu dùng để chế xà phòng và làm dầu bôi trơn, ở Trung Quốc dầu được dùng
để trị ghẻ, nấm ngoài da.
3
PHAN III - THƯC
* NGHIỄM
* VÀ KẼ r QUẦ
1- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1.1- Nguyên liệu:
Lá và hạt được thu hái tại Cao Bằng vào mùa hè năm 1999 và năm
2000 phơi khô để nghiên cứu.
1.2- Phương pháp nghiên cứu:
1.2.1- Nghiên cứu về hoá học
+ Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt
Nam I tập I [4], bài giảng Dược liệu [1], thực tập Dược liệu [2] và tài liệu [13].
+ Định tính Flavonoid bằng sắc ký giấy trên giấy Whatman số 1.
+ Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá và dầu béo trong hạt theo phương
pháp cân.
+ Định tính và định lượng Saponin theo tài liệu [1,13,17]
+ Đo độ ẩm trên máy PRECISA HA60 của Thụy Sỹ tại bộ môn Dược học cổ
truyền.
+ Phân lập Flavonoid bằng sắc ký giấy điều chế ( giấy Whatman số 3).
+ Sắc ký cột dùng Silicagen cho sắc ký cột của hãng Merck.
+ Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy UV-VIS spectrophotometer cary IE varian
(Australia) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm- Trường Đại học Dược và máy U-
3210 (Hitachi) tại phòng Vật lý - Viện Kiểm Nghiệm.
+Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy FIIR- 8110 M (Shimaclzu) tại phòng Vật
lý - Viện kiểm nghiệm.
1.2.2- Nghiên cứu 1 số tác dụng sinh học :
+ Tác dụng kháng khuẩn: Thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Flavonoid
toàn phần theo phương pháp của tài liệu [12] tại bộ môn Công nghiệp dược
Trường đại học Dược Hà Nội và tài liệu [15].
4
+Tác dụng chống oxy hóa:
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của Flavonoid toàn phần trong lá cây
Mắc rạc bằng cách xác định lượng aldehyd maleic (malonyldialdehyd - MDA)
tạo thành trong quá trình oxy hóa lipid trên ti thể tế bào gan chuột.
Chiết tách ti thể tế bào gan chuột theo phương pháp li tâm lạnh.
Thực hiện phản ứng peroxy hoá lipid của màng ti thể tế bào gan chuột
với những nồng độ khác nhau của chế phẩm. Định lượng lượng MDA tạo
thành trên nguyên tắc cho MDA phản ứng với acid thiobarbituric. Đo cường
độ màu của hỗn hợp ở bước sóng X = 532 nm.
Kết quả phản ứng peroxy hóa lipid được đánh giá bằng số nmol MDA
tạo thành.
Hoạt tính chống oxy hóa (antioxydant activity - AOA) được tính bằng
phần trăm từ lượng MDA chênh lệch giữa nhóm chứng và nhóm thử. Coi
MDA của nhóm chứng bằng không.
Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Đông Y thực nghiệm-Viện Y Học
Cổ Truyền.
+ Tác dụng kích ứng da: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Dược lý - Viện
Kiểm Nghiệm.
2- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ :
2.1- Nghiên cứu về Flavonoid:
2.1.1- Định tính Flavonoid trong lá:
Cân khoảng 1 gam bột lá cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml cồn 90°
đun sôi trong vài phút.Lọc lấy dịch lọc đem tiến hành làm các phản ứng sau:
+ Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm ít
bột magiê, vài giọt HC1 đặc. Để yên vài phút thấy dung dịch có màu đỏ cam.
( phản ứng dương tính ).
+ Với dung dịch NH3: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi
để lên miệng lọ NH3 thấy màu vàng tăng lên ( phản ứng dương tính ).
5
+ Với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm
1 giọt F e ơ 3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen ( phản ứng dương tính ).
+ Với dung dịch H2S04đậmđặc: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết,
thêm vài giọt H2S04địmđặcthấy xuất hiện màu vàng tươi (phản ứng dương tính).
Kết luận: Trong lá có Flavonoid.
2.1.2- Chiết xuất Flavonoid toàn phần:
Cân 200 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, cho túi vào bình Soxhlet
và loại clorophin bằng cloroform. Sau đó chiết flavonoid bằng methanol cho
đến khi dịch chiết trong suốt và không cho màu vàng với dung dịch NaOH
0.1N. Cất thu hồi dung môi đến khi còn khoảng 25ml. Dịch chiết được rót từ
từ vào 250ml aceton.Saponin tủa, lọc . Cô dịch lọc đến cắn. Hòa cắn vào nước
cất đun cách thủy cho tan hết, lọc loại tạp. Dịch lọc được cho vào bình gạn
500ml chiết với ethylacetat nhiều lần, gộp dịch chiết, cất thu hồi bớt dung
môi, cô cách thủy đến cắn ta được cắn flavonoid toàn phần.
6
Qúa trình chiết xuất được mô tả như sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết xuất Flavonoid toàn phần.
2.1.3- Định tính cán Flavonoid toàn phần bằng phản ứng hóa học:
Hòa một ít cắn vào cồn 90°, chia vào 4 ống nghiệm, làm các phản ứng
định tính Flavonoid. Kết quả được ghi ở bảng 1.
7
Bảng 1 —Kết quả định tính cắn Flavonoid toàn phần
TT Phản ứng Kết quả
1 Cyanidin ++
2 H2SO4[ Ịa ĩ l l ( | i ( c ++
3 FeCl3 5% ++
4 NaOH 10% ++
(++): Phản ứng rõ
2.1.4 - Định tính cán Flavonoid toàn phần bằng SKG:
+ SKG một chiều:
Hòa tan một ít cắn vào methanol dùng để chấm lên giấy sắc ký
Whatman số 1 (15x30cm).
Triển khai sắc ký với 3 hệ dung môi:
Hệ I: Dung dịch acid acetic 15 %
Hệ II: Dung dịch acid acetic 60%.
Hệ III: n- Butanol-acid acetic - nước (4:1:5).
Quan sát các vết Flavonoid dưới ánh sáng thường, đèn tử ngoại (UV) ở
bước sóng X =366nm và hơi NH3, sau đó phun thuốc thử hiện màu A1C13 3%
trong ethanol.
Kết quả sắc ký giấy một chiều cắn Flavonoid toàn phần được ghi ở bảng 2.
8
Bảng 2: Kết quả SKG một chiều cắn Flavonoid toàn phần
Vết Rf Màu sắc
Hệ I Hệ II Hệ III AS thường x=366 nh3 N H 3/ uv A1C13/ uv
nm
1 0,39 0,09 0,18 Không Vàng Vàng Vàng Vàng
màu nhạt đậm
2 0,62 0,31 0,49 Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng Vàng
chanh đậm
3 0,79 0,46 0,61 Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng Vàng
nâu đậm
4 0,88 0,58 0,79 Vàng đậm Nâu Vàng Vàng Vàng
đậm đậm
5 0,95 0,68 0,95 Không Xanh Không Vàng Vàng
màu tím màu nhạt đậm
+ SKG hai chiều:
Hoà một ít cắn Flavonoid toàn phần vào Methanol để chấm sắc ký, chạy
sắc ký hai chiều với hai hệ dung môi:
Chiều I: Acid acetic 15%.
Chiều II: Acid acetic 60%.
Kết quả SKG 2 chiều của cắn Flavonoid toàn phần được thể hiện ở sắc
ký đồ hình 2 và bảng 3.
9
0\J ' A 3 ¿f " 5
o czr>
(üj*
Hình 2: sắc ký đồ SKG 2 chiều cắn Flavonoid toàn phần.
Bảng 3: Kết quả SKG 2 chiều cắn Flavonoid toàn phần
Vết Màu sắc các vết
AS thường uv (366 nm) nh3 NH3/ uv AlCl3/uv(366nm)
1 Không màu Vàng Vàng Vàng đậm Nâu vàng
2 Vàng nhạt Nâu Vàng Vàng đậm Vàng đậm
3 Vàng Vàng Vàng Vàng đậm Vàng sáng
4 Không màu Vàng Vàng Vàng đậm Vàng sáng
5 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
6 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
7 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
8 Vàng Xanh Không Xanh Vàng chanh
màu
9 Không màu Nâu Không Vàng đậm Vàng đậm
màu
10
+Nhận xét: sắc ký giấy một chiều Flavonoid của lá Mắc rạc với 3 hệ dung
môi (I),(II),(III) cho ta 5 vết đặc trưng của Flavonoid. Với SKG 2 chiều cho ta
9 vết đặc trưng của Flavonoid.
2.1.5- Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá:
Cân chính xác khoảng 10,00 g bột lá (đã được xác định độ ẩm) cho vào
túi giấy lọc. Đặt túi vào bình Soxhlet. Loại tạp bằng Cloroform. Sau đó chiết
bằng Methanol đến khi dịch chiết trong suốt và không cho màu vàng với dung
dịch NaOH 0,1N. Cất thu hồi Methanol còn khoảng 20ml. Cho từ từ dịch
Methanol vào 100ml aceton.Saponin tủa, lọc. Bốc hơi dịch lọc tới cắn. Hoà tan
cắn vào nước cất đun cách thuỷ cho tan hết, lọc nóng qua bông để loại tạp.
Cho dịch lọc vào bình gạn dung tích 500 ml, chiết bằng Ethylacetat
nhiều lần cho đến hết Flavonoid. Gộp dịch chiết Ethylacetat rồi cất thu hồi
bớt dung môi, tiếp tục bay hơi cách thuỷ đến khô .Sấy cắn ở 80°c đến khối
lượng không đổi, cân rồi tính ra hàm lượng Flavonoid.
Hàm lượng Flavonoid toàn phần (Ftp) được tính theo công thức:
Ftp = -------- --------- 100
/> ( 1 0 0 % - * % )
Trong đó:
Ftp: Hàm lượng Flavonoid toàn phần(%).
a: Lượng cắn khô Flavonoid (g).
p: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).
x%: Độ ẩm của dược liệu.
Kết quả định lượng được ghi ở bảng 4.
11
Bảng 4: Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần trong lá
Số lần Khối lượng Độ ẩm (%) Khối lượng Hàm lượng
dược liệu (g) cắn Flavonoid (g) Flavonoid (%)
1 10,0065 11,99 0,2957 3,36
2 10,0016 11,77 0,2946 2,83
3 10,0459 11,46 0,2856 3,22
4 10,0147 11,85 0,3841 4,35
5 10,0032 11,61 0,2881 3,26
Trung bình 3,40 ± 0,39
Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần trong lá được tính theo phương
pháp thống kê với mức ý nghĩa oc = 0,05 cho hàm lượng Flavonoid toàn phần
trong lá khoảng 3,40 ± 0,39(%).
2.1.6- Phân lập Flavonoid:
+ Phân lập cắn Flavonoid toàn phần bằng sắc ký giấy điều chế:
Cắn Flavonoid toàn phần được hòa tan trong một lượng tối thiểu
methanol. Tiến hành sắc ký điều chế trên giấy Whatman số 3 (30x30cm).
Triển khai sắc ký với hệ dung môi là acid acetic 15%. Kết quả thu được 5 vết
Flavonoid. Chúng tôi đã đi sâu nghiên cứu vết số 1 và vết số 5 là hai vết xuất
hiện rõ và đậm nhất trên sắc ký đồ khi phun thuốc thử A1C13 3%/etanol.
Cắt các phần giấy có vết số 1 và vết số 5 rồi đem phản hấp phụ bằng
methanol đến khi dịch chiết không còn phản ứng với hơi amoniac. Gộp các
dịch chiết phân lập và cô cạn bớt methanol rồi tiếp tục để bay hơi ở nhiệt độ
phòng đến khô, bước đầu chúng tôi thu được hai Flavonoid ký hiệu là Fj và F5.
+ Tinh chế Fj và F5 bằng sắc ký cột:
- Chất hấp phụ: Silicagen dùng cho sắc ký cột của hãng Merck.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước (2x40cm) được lắp thẳng đứng
trên giá. Dùng Silicagen đã hoạt hóa ở 110°c trong 1 giờ ngâm trong hệ dung
môi Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1) 30 phút sau đó nhồi vào cột.
12
Dung môi chạy sắc ký là hỗn hợp Ethylacetat - acid acetic - nước
(20:2:1) cho chạy qua cột với tốc độ 15 giọt/phút để ổn định cột.
- Tiến hành sắc ký cột: Hòa tan Fj vào 2 ml hỗn hợp dung môi Ethylacetat -
acid acetic - nước (20:2:1).
Cho dung môi rút đến sát lớp Silicagen rồi nhồi chất lên cột. Tiến hành
rửa giải với hệ dung môi Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1) với tốc độ
15 giọt/phút.
Dùng ống nghiệm nhỏ (5ml) để hứng các phân đoạn. Kiểm tra
Flavonoid ở các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi Ethylacetat -
Methanol - nước (70:15:15) với thuốc thử hiện màu là A1C13 3% trong
ethanol.
Sau khi rửa giải, từ Flavonoid Fj chúng tôi thu được thêm 1 Flavonoid
nữa ký hiệu là F2.
F5 thu được ở SKG điều chế cũng tiến hành phân lập tiếp trên sắc ký cột
và cũng thu được thêm 1 Flavonoid khác ký hiệu là F6.
+ Kiểm tra độ tinh khiết của các Flavonoid thu được:
Hoà tan Fj, F2, F5, F6 vào lml methanol rồi chấm lên 3 bản sắc ký, khai
triển trên 3 hệ dung môi khác nhau:
Hệ I: Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1)
Hệ II: Ethylacetat - Methanol - nước (70:15:15)
Hệ III: Ethylacetat - ethanol - nước (10:2:1)
Kết quả SKLM trên 3 hệ dung môi của Fj, F2, F5, F6 đều cho một vết (bảng 5).
13
Bảng 5: Kết quả kiểm tra các Flavonoid thu được trên SKLM
STT Mẫu Rf Màu sau
Hệ I Hệ II Hệ III khi phun
thuốc thử
1 F, 0,31 0,43 0,24 Vàng
2 f2 0,09 0,08 0,08 Vàng
3 f5 0,47 0,63 0,56 Vàng
4 f6 0,52 0,71 0,73 Vàng
Nhận xét: Các Flavonoid thu được đều là đơn chất.
2.1.7- Sơ bộ nhận dạng Fx, F2, F5, F6:
- F i:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 409nm,
274nm và 202,6nm. (Phụ lục 1).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
3630, 2922, 2851, 1597, 1404, 1340, 1124, 1051, 1024, 936, 677 và 619 cm 1
(Phụ lục 2).
- F2:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 482nm,
433nm, 419nm, 388nm, 379nm, 272nm. (Phụ lục 3).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
3630, 2922, 2851, 1412, 1271, 1126, 806, 619 c m 1. (Phụ lục 4).
- F5:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 342nm,
273nm, 222nm và 206nm. (Phụ lục 5).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
2955, 2855, 2361, 1734, 1637, 1618, 1464, 1377, 1288, 1271, 1122, 1072,
1041, 738, 721, 617, 474 em '. (Phụ lục 6).
14
- F6:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 346nm,
273nm và 204nm. (Phụ lục 7).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
2955, 2924, 2855, 2361, 1732, 1637,1618, 1560, 1508, 1379, 1286, 1271,
1122, 1072, 740 và 669 cm'1. (Phụ lục 8).
Chúng tôi dự đoán Fj, F2 có thể là những hợp chất thuộc nhóm Flavon
và F5, F6 có thể là những hợp chất thuộc nhóm Flavanon.
2.2-Khảo sát Saponin trong lá:
2.2.1- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to 1 ít bột dược liệu, thêm 5
ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút thấy cột bọt cao, bền
vững.
2.2.2 - Sơ bộ phân biệt 2 loại Saponin steroid và Saponỉn triterpenoid:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml cồn 90° đun sôi,
lọc. Dịch lọc tiến hành làm thí nghiệm như sau:
+ Ống nghiệm 1: 5 ml NaOH 0,1 N và 5 giọt dịch chiết.
+ Ống nghiệm 2: 5 ml HC1 0,1 N và 5 giọt dịch chiết.
Lắc mạnh 2 ống nghiệm trong 1 phút và quan sát cột bọt ở 2 ống thấy:
cột bọt ở ống ngiệm 1 cao 1,8 cm ; cột bọt ở ống ngiệm 2 cao 0,6 cm.
Qua đó sơ bộ nhận xét Saponin trong lá Mắc rạc là Saponin Steroid.
2.2.3- Xác định chỉ sô bọt:
Cân 4g bột lá dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml
nước, đun cách thuỷ 30 phút, lọc nóng, để nguội rồi cho vào bình định mức
lOOml, thêm nước đến vạch.
Lấy 10 ống nghiệm to đánh số từ 1 đến 10 và bố trí thí nghiệm theo bảng 6:
15
TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI
CAO NGỌC ANH■
TIẾP TỤC NGHIÊN cứ a CÂY MfiC RỢC
DELflVfiYfi TOXOCflRPfi FRENCH. SfiPINDfKEfiE
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 51(1996-2001)
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: GS.TS. PHẠM THANH KỲ
DS. NCS. CẨN TUYẾT NGA
NƠI THỰC HIỆN: BỘ MÔN Dược LIỆU
THỜI GIAN: 03/2000 - 05/2001
Hà nội, íỉìáiĩíỊ 05 năm 2001
/ / X V
o {,¿0- /
■v V
V ta . 4 3 ^ .
LC0* V -
LỞI CẦM dN
oil ehr tui ú ein hoan thành Ulíúéí luận ễtítí/.
ố m eủỉt ụ æin e ả m ớềt eâừ th íỉi/ ạ ỉá ú , eồ (ịiáo , eáe eò Uụ th u ả t olên ỈMểiq hê tn êíi
^Diử/e tiêu, các phèềiụ han kháe tro ít ạ DỈi tiíịOỈii (rưĩínỉị đã ỉíííì ¿tiễu kỉềếi oỉt ụhíp (tở
eltú em ho ùil thành Uhúá Íi/ííễt tút nqhỉêp tviìiUị thài ụỉatt qua,
ũutíi eỉtễtạ, tồi æbz ạửi lẻ'ỉ eủm tín tối tat eủ lựiễt hỉ, tiạiĩồì than đũ ítộễtạ oìèn
Uhuụên Ultíelĩ tôi tnmg. quá trình ht) ùn thành khú€t liiíĩễt naiỊ.
Hà nội 15-05-2001
Sinh viên
Cao Ngọc Anh
CHÚ GIẦI CHỠ v iết tắ t
AOA Antioxydant activity
AS Ánh sáng
c s - iod Chỉ số iod
c s - xp Chỉ số xà phòng
c s - acid Chỉ số acid
CT Chỉ thị
Dd Dung dịch
Ftp Flavonoid toànphần
MDA Malonyldialdehyd
Mito. Mitochondri
Nm Nanomet
Nmol Nanomol
SKG Sắc ký giấy
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
MỤC LỤC Trang
PHẦN I: ĐẶT VÂN ĐỂ 1
PHẦN II: TỔNG QUAN 2
1. Đặc điểm thực vật của cây Mắc rạc 2
2. Phân bố 3
3. Thành phần hoá học 3
4. Công dụng 3
PHẦN m . THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 4
1. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 4
1.1. Nguyên liệu 4
1.2. Phương pháp nghiên cứu 4
2. Thực nghiệm và kết quả 5
2.1. Nghiên cứu về Flavonoid 5
2.1.1. Định tính Flavonoid trong lá 5
2.1.2.Chiết xuất Flavonoid toàn phần 6
2.1.3. Định tính cắn Flavonoid toàn phần bằng phản ứng 7
hoá học
2.1.4. Định tính cắn Flavonoid toàn phần bằng SKG 8
2.1.5. Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá 11
2.1.6. Phân lập Flavonoid 12
2.1.7. Sơ bộ nhận dạng F1? F2, F5, F6 14
2.2. Khảo sát Saponin trong lá 15
2.2.1 Hiện tượng tạo bọt 15
2.2.2. Sơ bộ phân biệt 2 loại SaponinSteroid và Saponin 15
triterpenoid
2.2.3. Xác định chỉ số bọt 15
2.2.4. Xác định chỉ số phá huyết 16
2.2.5. Chiết xuất Saponin 19
2.2.6. Khảo sát Saponin bằng SKLM 1chiều 19
2.2.7. Định lượng Saponin toàn phần 20
2.3. Nghiên cứu dầu béo trong hạt 21
2.3.1. Định lượng dầu béo trong hạt 21
2.3.2. Xác định chỉ số iod của dầu hạt 22
2.3.3. Xác định chỉ số xà phòng của dầu hạt 23
2.3.4. Xác định chỉ số acid của dầu hạt 24
2.3.5. Xác định chỉ số este của dầu hạt 25
2.4. Nghiên cứu 1 sô tác dụng sinh học 25
2.4.1. Tác dụng kháng khuẩn của Flavonoid toàn phần 25
2.4.2. Tác dụng chống oxy hoá 28
2.4.3. Thử tác dụng kích ứng trên da của dầu hạt 31
PHẦN IV: KẾT KUẬN YÀ ĐỂ XUẤT 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHẤN I - DẶT VẤN Dầ
Với vị trí địa lý nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam
có một hệ động vật, thực vật phong phú tạo cho chúng ta một nguồn dược liệu
đa dạng về chủng loại, giàu về số lượng. Do đó từ xa xưa ông cha ta đã biết sử
dụng cây cỏ động vật để làm thuốc phòng và chữa bệnh.
Nhằm phát huy truyền thống này Đảng và Nhà nước ta đã có những chủ
trương, chính sách tạo điều kiện cho việc bảo tồn và phát triển vốn y học cổ
truyền bên cạnh sự phát triển của y học hiện đại.
Tuy nhiên, bên cạnh những động vật, thực vật đã được nghiên cứu và
đưa vào sử dụng vẫn còn nhiều loại cây, con mới được sử dụng làm thuốc
theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu hoặc nghiên cứu chưa
đầy đủ. Mắc- rạc là một trong những loại dược liệu đó. Cây thuốc này chưa
được đưa vào danh mục trong cuốn sách “Những cây thuốc và vị thuốc Việt
Nam” của giáo sư Đỗ Tất Lợi nhưng đã có tên trong sách đỏ Việt Nam.
Do đó trong khoá luận tốt nghiệp này chúng tôi được giao nhiệm vụ “
Tiếp tục nghiên cứu cây Mắc rạc- Delavaya toxocarpa French.” Với những nội
dung sau:
1. Nghiên cứu Flavonoid:
+ Định tính Flavonoid trong lá Mắc rạc.
+ Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá.
+ Chiết xuất, phân lập Flavonoid.
2. Khảo sát Saponin: Định tính, định lượng, xác định chỉ số bọt, chỉ số phá
huyết.
3.Định lượng dầu béo trong hạt. Xác định chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa, chỉ
số iod, chỉ số este.
4. Nghiên cứu một số tác dụng sinh học của dịch chiết Flavonoid toàn phần và
thử tác dụng kích ứng da của dầu hạt.
1
PHẦN n -TỐNG QUAN
1- Đặc điểm thực vật của cây Mắc rạc:
Theo tài liệu [7,8,10,11 ] cây Mắc Rạc (Cây Dầu Choòng, cây Mắc
Choòng) là cây bụi hay cây gỗ, cao 2-Ỉ-12 m. Cành không có lông, màu nâu đỏ.
Lá có 3 lá chét, lá chét ở đầu dài 7-Ï-15 cm, rộng 2.5-Ỉ-3 cm, mép có răng nằm,
gân phụ có 114-22 cặp nổi hai mặt, không lông; cuống phụ dài 2 mm, cuống lá
dài 3-^-5 cm. Chùm hoa dài 6-Ỉ-12 cm. Hoa màu trắng, thơm với 4-Ỉ-5 lá đài, 4-^8
cánh hoa, bộ nhị gồm 8 nhị, bầu 2+3 ô, mỗi ô chứa 2+3 noãn. Quả hình trái
xoan dài đến 3,5 cm màu đỏ tím mở làm 2-Ỉ-3 mảnh. Hạt đen dạng hạt nhãn.
Hình 1: Cây Mắc rạc.
2
2- Phân bố:
Theo tài liệu [8,11,18,19] cây mọc trong rừng thường xanh hay rừng
phục hồi trên núi đá vôi hay núi đất ở độ cao 250-Ỉ-1500 m. Phân bố ở Vân
Nam (Trung Quốc), gặp ở Cao Bằng, Lạng Sơn,Tuyên Quang,Hà Giang (Việt
Nam).
3- Thành phần hóa học:
Theo Nguyễn Văn Bách [6], trong lá cây Mắc Rạc có chứa Flavonoid,
Saponin, Coumarin, Tanin, Đường khử, Caroten, Sterol, Acid hữu cơ.
4- Công dụng[8,9,18]:
Gỗ cứng dùng trong xây dựng và đóng đồ gia dụng, nông cụ. Hạt chứa
dầu dùng để chế xà phòng và làm dầu bôi trơn, ở Trung Quốc dầu được dùng
để trị ghẻ, nấm ngoài da.
3
PHAN III - THƯC
* NGHIỄM
* VÀ KẼ r QUẦ
1- NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
1.1- Nguyên liệu:
Lá và hạt được thu hái tại Cao Bằng vào mùa hè năm 1999 và năm
2000 phơi khô để nghiên cứu.
1.2- Phương pháp nghiên cứu:
1.2.1- Nghiên cứu về hoá học
+ Định tính các nhóm chất hữu cơ theo phương pháp ghi trong Dược điển Việt
Nam I tập I [4], bài giảng Dược liệu [1], thực tập Dược liệu [2] và tài liệu [13].
+ Định tính Flavonoid bằng sắc ký giấy trên giấy Whatman số 1.
+ Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá và dầu béo trong hạt theo phương
pháp cân.
+ Định tính và định lượng Saponin theo tài liệu [1,13,17]
+ Đo độ ẩm trên máy PRECISA HA60 của Thụy Sỹ tại bộ môn Dược học cổ
truyền.
+ Phân lập Flavonoid bằng sắc ký giấy điều chế ( giấy Whatman số 3).
+ Sắc ký cột dùng Silicagen cho sắc ký cột của hãng Merck.
+ Phổ tử ngoại (UV) đo trên máy UV-VIS spectrophotometer cary IE varian
(Australia) tại Phòng thí nghiệm Trung tâm- Trường Đại học Dược và máy U-
3210 (Hitachi) tại phòng Vật lý - Viện Kiểm Nghiệm.
+Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy FIIR- 8110 M (Shimaclzu) tại phòng Vật
lý - Viện kiểm nghiệm.
1.2.2- Nghiên cứu 1 số tác dụng sinh học :
+ Tác dụng kháng khuẩn: Thử hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Flavonoid
toàn phần theo phương pháp của tài liệu [12] tại bộ môn Công nghiệp dược
Trường đại học Dược Hà Nội và tài liệu [15].
4
+Tác dụng chống oxy hóa:
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của Flavonoid toàn phần trong lá cây
Mắc rạc bằng cách xác định lượng aldehyd maleic (malonyldialdehyd - MDA)
tạo thành trong quá trình oxy hóa lipid trên ti thể tế bào gan chuột.
Chiết tách ti thể tế bào gan chuột theo phương pháp li tâm lạnh.
Thực hiện phản ứng peroxy hoá lipid của màng ti thể tế bào gan chuột
với những nồng độ khác nhau của chế phẩm. Định lượng lượng MDA tạo
thành trên nguyên tắc cho MDA phản ứng với acid thiobarbituric. Đo cường
độ màu của hỗn hợp ở bước sóng X = 532 nm.
Kết quả phản ứng peroxy hóa lipid được đánh giá bằng số nmol MDA
tạo thành.
Hoạt tính chống oxy hóa (antioxydant activity - AOA) được tính bằng
phần trăm từ lượng MDA chênh lệch giữa nhóm chứng và nhóm thử. Coi
MDA của nhóm chứng bằng không.
Thí nghiệm được tiến hành tại Phòng Đông Y thực nghiệm-Viện Y Học
Cổ Truyền.
+ Tác dụng kích ứng da: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng Dược lý - Viện
Kiểm Nghiệm.
2- THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ :
2.1- Nghiên cứu về Flavonoid:
2.1.1- Định tính Flavonoid trong lá:
Cân khoảng 1 gam bột lá cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml cồn 90°
đun sôi trong vài phút.Lọc lấy dịch lọc đem tiến hành làm các phản ứng sau:
+ Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm ít
bột magiê, vài giọt HC1 đặc. Để yên vài phút thấy dung dịch có màu đỏ cam.
( phản ứng dương tính ).
+ Với dung dịch NH3: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô rồi
để lên miệng lọ NH3 thấy màu vàng tăng lên ( phản ứng dương tính ).
5
+ Với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm
1 giọt F e ơ 3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen ( phản ứng dương tính ).
+ Với dung dịch H2S04đậmđặc: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết,
thêm vài giọt H2S04địmđặcthấy xuất hiện màu vàng tươi (phản ứng dương tính).
Kết luận: Trong lá có Flavonoid.
2.1.2- Chiết xuất Flavonoid toàn phần:
Cân 200 g bột dược liệu cho vào túi giấy lọc, cho túi vào bình Soxhlet
và loại clorophin bằng cloroform. Sau đó chiết flavonoid bằng methanol cho
đến khi dịch chiết trong suốt và không cho màu vàng với dung dịch NaOH
0.1N. Cất thu hồi dung môi đến khi còn khoảng 25ml. Dịch chiết được rót từ
từ vào 250ml aceton.Saponin tủa, lọc . Cô dịch lọc đến cắn. Hòa cắn vào nước
cất đun cách thủy cho tan hết, lọc loại tạp. Dịch lọc được cho vào bình gạn
500ml chiết với ethylacetat nhiều lần, gộp dịch chiết, cất thu hồi bớt dung
môi, cô cách thủy đến cắn ta được cắn flavonoid toàn phần.
6
Qúa trình chiết xuất được mô tả như sơ đồ 1.
Sơ đồ 1: Sơ đồ chiết xuất Flavonoid toàn phần.
2.1.3- Định tính cán Flavonoid toàn phần bằng phản ứng hóa học:
Hòa một ít cắn vào cồn 90°, chia vào 4 ống nghiệm, làm các phản ứng
định tính Flavonoid. Kết quả được ghi ở bảng 1.
7
Bảng 1 —Kết quả định tính cắn Flavonoid toàn phần
TT Phản ứng Kết quả
1 Cyanidin ++
2 H2SO4[ Ịa ĩ l l ( | i ( c ++
3 FeCl3 5% ++
4 NaOH 10% ++
(++): Phản ứng rõ
2.1.4 - Định tính cán Flavonoid toàn phần bằng SKG:
+ SKG một chiều:
Hòa tan một ít cắn vào methanol dùng để chấm lên giấy sắc ký
Whatman số 1 (15x30cm).
Triển khai sắc ký với 3 hệ dung môi:
Hệ I: Dung dịch acid acetic 15 %
Hệ II: Dung dịch acid acetic 60%.
Hệ III: n- Butanol-acid acetic - nước (4:1:5).
Quan sát các vết Flavonoid dưới ánh sáng thường, đèn tử ngoại (UV) ở
bước sóng X =366nm và hơi NH3, sau đó phun thuốc thử hiện màu A1C13 3%
trong ethanol.
Kết quả sắc ký giấy một chiều cắn Flavonoid toàn phần được ghi ở bảng 2.
8
Bảng 2: Kết quả SKG một chiều cắn Flavonoid toàn phần
Vết Rf Màu sắc
Hệ I Hệ II Hệ III AS thường x=366 nh3 N H 3/ uv A1C13/ uv
nm
1 0,39 0,09 0,18 Không Vàng Vàng Vàng Vàng
màu nhạt đậm
2 0,62 0,31 0,49 Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng Vàng
chanh đậm
3 0,79 0,46 0,61 Vàng nhạt Vàng Vàng Vàng Vàng
nâu đậm
4 0,88 0,58 0,79 Vàng đậm Nâu Vàng Vàng Vàng
đậm đậm
5 0,95 0,68 0,95 Không Xanh Không Vàng Vàng
màu tím màu nhạt đậm
+ SKG hai chiều:
Hoà một ít cắn Flavonoid toàn phần vào Methanol để chấm sắc ký, chạy
sắc ký hai chiều với hai hệ dung môi:
Chiều I: Acid acetic 15%.
Chiều II: Acid acetic 60%.
Kết quả SKG 2 chiều của cắn Flavonoid toàn phần được thể hiện ở sắc
ký đồ hình 2 và bảng 3.
9
0\J ' A 3 ¿f " 5
o czr>
(üj*
Hình 2: sắc ký đồ SKG 2 chiều cắn Flavonoid toàn phần.
Bảng 3: Kết quả SKG 2 chiều cắn Flavonoid toàn phần
Vết Màu sắc các vết
AS thường uv (366 nm) nh3 NH3/ uv AlCl3/uv(366nm)
1 Không màu Vàng Vàng Vàng đậm Nâu vàng
2 Vàng nhạt Nâu Vàng Vàng đậm Vàng đậm
3 Vàng Vàng Vàng Vàng đậm Vàng sáng
4 Không màu Vàng Vàng Vàng đậm Vàng sáng
5 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
6 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
7 Vàng Nâu Vàng Vàng đậm Vàng sáng
8 Vàng Xanh Không Xanh Vàng chanh
màu
9 Không màu Nâu Không Vàng đậm Vàng đậm
màu
10
+Nhận xét: sắc ký giấy một chiều Flavonoid của lá Mắc rạc với 3 hệ dung
môi (I),(II),(III) cho ta 5 vết đặc trưng của Flavonoid. Với SKG 2 chiều cho ta
9 vết đặc trưng của Flavonoid.
2.1.5- Định lượng Flavonoid toàn phần trong lá:
Cân chính xác khoảng 10,00 g bột lá (đã được xác định độ ẩm) cho vào
túi giấy lọc. Đặt túi vào bình Soxhlet. Loại tạp bằng Cloroform. Sau đó chiết
bằng Methanol đến khi dịch chiết trong suốt và không cho màu vàng với dung
dịch NaOH 0,1N. Cất thu hồi Methanol còn khoảng 20ml. Cho từ từ dịch
Methanol vào 100ml aceton.Saponin tủa, lọc. Bốc hơi dịch lọc tới cắn. Hoà tan
cắn vào nước cất đun cách thuỷ cho tan hết, lọc nóng qua bông để loại tạp.
Cho dịch lọc vào bình gạn dung tích 500 ml, chiết bằng Ethylacetat
nhiều lần cho đến hết Flavonoid. Gộp dịch chiết Ethylacetat rồi cất thu hồi
bớt dung môi, tiếp tục bay hơi cách thuỷ đến khô .Sấy cắn ở 80°c đến khối
lượng không đổi, cân rồi tính ra hàm lượng Flavonoid.
Hàm lượng Flavonoid toàn phần (Ftp) được tính theo công thức:
Ftp = -------- --------- 100
/> ( 1 0 0 % - * % )
Trong đó:
Ftp: Hàm lượng Flavonoid toàn phần(%).
a: Lượng cắn khô Flavonoid (g).
p: Khối lượng dược liệu đem định lượng (g).
x%: Độ ẩm của dược liệu.
Kết quả định lượng được ghi ở bảng 4.
11
Bảng 4: Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần trong lá
Số lần Khối lượng Độ ẩm (%) Khối lượng Hàm lượng
dược liệu (g) cắn Flavonoid (g) Flavonoid (%)
1 10,0065 11,99 0,2957 3,36
2 10,0016 11,77 0,2946 2,83
3 10,0459 11,46 0,2856 3,22
4 10,0147 11,85 0,3841 4,35
5 10,0032 11,61 0,2881 3,26
Trung bình 3,40 ± 0,39
Kết quả định lượng Flavonoid toàn phần trong lá được tính theo phương
pháp thống kê với mức ý nghĩa oc = 0,05 cho hàm lượng Flavonoid toàn phần
trong lá khoảng 3,40 ± 0,39(%).
2.1.6- Phân lập Flavonoid:
+ Phân lập cắn Flavonoid toàn phần bằng sắc ký giấy điều chế:
Cắn Flavonoid toàn phần được hòa tan trong một lượng tối thiểu
methanol. Tiến hành sắc ký điều chế trên giấy Whatman số 3 (30x30cm).
Triển khai sắc ký với hệ dung môi là acid acetic 15%. Kết quả thu được 5 vết
Flavonoid. Chúng tôi đã đi sâu nghiên cứu vết số 1 và vết số 5 là hai vết xuất
hiện rõ và đậm nhất trên sắc ký đồ khi phun thuốc thử A1C13 3%/etanol.
Cắt các phần giấy có vết số 1 và vết số 5 rồi đem phản hấp phụ bằng
methanol đến khi dịch chiết không còn phản ứng với hơi amoniac. Gộp các
dịch chiết phân lập và cô cạn bớt methanol rồi tiếp tục để bay hơi ở nhiệt độ
phòng đến khô, bước đầu chúng tôi thu được hai Flavonoid ký hiệu là Fj và F5.
+ Tinh chế Fj và F5 bằng sắc ký cột:
- Chất hấp phụ: Silicagen dùng cho sắc ký cột của hãng Merck.
- Chuẩn bị cột sắc ký: Cột sắc ký có kích thước (2x40cm) được lắp thẳng đứng
trên giá. Dùng Silicagen đã hoạt hóa ở 110°c trong 1 giờ ngâm trong hệ dung
môi Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1) 30 phút sau đó nhồi vào cột.
12
Dung môi chạy sắc ký là hỗn hợp Ethylacetat - acid acetic - nước
(20:2:1) cho chạy qua cột với tốc độ 15 giọt/phút để ổn định cột.
- Tiến hành sắc ký cột: Hòa tan Fj vào 2 ml hỗn hợp dung môi Ethylacetat -
acid acetic - nước (20:2:1).
Cho dung môi rút đến sát lớp Silicagen rồi nhồi chất lên cột. Tiến hành
rửa giải với hệ dung môi Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1) với tốc độ
15 giọt/phút.
Dùng ống nghiệm nhỏ (5ml) để hứng các phân đoạn. Kiểm tra
Flavonoid ở các phân đoạn bằng SKLM với hệ dung môi Ethylacetat -
Methanol - nước (70:15:15) với thuốc thử hiện màu là A1C13 3% trong
ethanol.
Sau khi rửa giải, từ Flavonoid Fj chúng tôi thu được thêm 1 Flavonoid
nữa ký hiệu là F2.
F5 thu được ở SKG điều chế cũng tiến hành phân lập tiếp trên sắc ký cột
và cũng thu được thêm 1 Flavonoid khác ký hiệu là F6.
+ Kiểm tra độ tinh khiết của các Flavonoid thu được:
Hoà tan Fj, F2, F5, F6 vào lml methanol rồi chấm lên 3 bản sắc ký, khai
triển trên 3 hệ dung môi khác nhau:
Hệ I: Ethylacetat - acid acetic - nước (20:2:1)
Hệ II: Ethylacetat - Methanol - nước (70:15:15)
Hệ III: Ethylacetat - ethanol - nước (10:2:1)
Kết quả SKLM trên 3 hệ dung môi của Fj, F2, F5, F6 đều cho một vết (bảng 5).
13
Bảng 5: Kết quả kiểm tra các Flavonoid thu được trên SKLM
STT Mẫu Rf Màu sau
Hệ I Hệ II Hệ III khi phun
thuốc thử
1 F, 0,31 0,43 0,24 Vàng
2 f2 0,09 0,08 0,08 Vàng
3 f5 0,47 0,63 0,56 Vàng
4 f6 0,52 0,71 0,73 Vàng
Nhận xét: Các Flavonoid thu được đều là đơn chất.
2.1.7- Sơ bộ nhận dạng Fx, F2, F5, F6:
- F i:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 409nm,
274nm và 202,6nm. (Phụ lục 1).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
3630, 2922, 2851, 1597, 1404, 1340, 1124, 1051, 1024, 936, 677 và 619 cm 1
(Phụ lục 2).
- F2:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 482nm,
433nm, 419nm, 388nm, 379nm, 272nm. (Phụ lục 3).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
3630, 2922, 2851, 1412, 1271, 1126, 806, 619 c m 1. (Phụ lục 4).
- F5:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 342nm,
273nm, 222nm và 206nm. (Phụ lục 5).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
2955, 2855, 2361, 1734, 1637, 1618, 1464, 1377, 1288, 1271, 1122, 1072,
1041, 738, 721, 617, 474 em '. (Phụ lục 6).
14
- F6:
(-) Phổ tử ngoại đo trong Methanol cho các đỉnh hấp thu cực đại ở 346nm,
273nm và 204nm. (Phụ lục 7).
(-) Phổ hồng ngoại đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thu mạnh ở
2955, 2924, 2855, 2361, 1732, 1637,1618, 1560, 1508, 1379, 1286, 1271,
1122, 1072, 740 và 669 cm'1. (Phụ lục 8).
Chúng tôi dự đoán Fj, F2 có thể là những hợp chất thuộc nhóm Flavon
và F5, F6 có thể là những hợp chất thuộc nhóm Flavanon.
2.2-Khảo sát Saponin trong lá:
2.2.1- Hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm to 1 ít bột dược liệu, thêm 5
ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút thấy cột bọt cao, bền
vững.
2.2.2 - Sơ bộ phân biệt 2 loại Saponin steroid và Saponỉn triterpenoid:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml cồn 90° đun sôi,
lọc. Dịch lọc tiến hành làm thí nghiệm như sau:
+ Ống nghiệm 1: 5 ml NaOH 0,1 N và 5 giọt dịch chiết.
+ Ống nghiệm 2: 5 ml HC1 0,1 N và 5 giọt dịch chiết.
Lắc mạnh 2 ống nghiệm trong 1 phút và quan sát cột bọt ở 2 ống thấy:
cột bọt ở ống ngiệm 1 cao 1,8 cm ; cột bọt ở ống ngiệm 2 cao 0,6 cm.
Qua đó sơ bộ nhận xét Saponin trong lá Mắc rạc là Saponin Steroid.
2.2.3- Xác định chỉ sô bọt:
Cân 4g bột lá dược liệu cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm 80ml
nước, đun cách thuỷ 30 phút, lọc nóng, để nguội rồi cho vào bình định mức
lOOml, thêm nước đến vạch.
Lấy 10 ống nghiệm to đánh số từ 1 đến 10 và bố trí thí nghiệm theo bảng 6:
15