Thăm dò khả năng khai thác beta glucan từ nấm vân chi (trametes versicolor) và nấm hương (lentinula edodes) ở điều kiện phòng thí nghiệm
- 63 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THĂM DÒ KHẢ NĂNG KHAI THÁC BETA-GLUCAN TỪ NẤM VÂN
CHI (TRAMETES VERSICOLOR) VÀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA
EDODES ) Ở ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2012B
Hà Nội – Năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
THĂM DÒ KHẢ NĂNG KHAI THÁC BETA-GLUCAN TỪ NẤM VÂN CHI
(TRAMETES VERSICOLOR) VÀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES ) Ở
ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
GS.TS HOÀNG ĐÌNH HÒA
Hà Nội – Năm 2014
MỤC LỤC
Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT β-GLUCAN ................................................. 3
1.1.1. Nghiên cứu về polysaccharide từ nấm lớn ....................................................... 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu về Beta -glucan ............... Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Định nghĩa ........................................................................................................ 8
1.1.4. Cấu trúc β-glucan ............................................................................................. 9
1.1.5. Tính chất hóa học của Beta-glucan [4] .......................................................... 10
1.1.6. Hoạt tính sinh học của β-glucan..................................................................... 11
1.1.6.1. Hoạt tính chống ung thư .............................................................................. 11
1.1.6.2. Hoạt tính chống virus, vi khuẩn .................................................................. 12
1.1.6.3. Hoạt tính kháng sinh ................................................................................... 12
1.1.6.4.Hoạt tính kích thích tăng cường miễn dịch của β-glucan ............................ 13
1.1.6.5. Ứng dụng của β-glucan ............................................................................... 14
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM HƯƠNG VÀ HỆ SỢI NẤM HƯƠNG ....... 16
1.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Hương ............................. 16
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 16
1.2.1.2. Đặc tính sinh học của nấm Hương .............................................................. 17
1.2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cảu nấm Hương ....... 17
1.2.1.4. Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương ............................................................ 18
1.2.1.5. β-glucan trong nấm Hương ......................................................................... 19
1.2.2. Nấm Vân Chi Trametes versicolor ................................................................ 20
1.2.2.1. Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái của nấm Vân Chi Trametes
versicolor .................................................................................................................. 20
1.2.2.2. Đặc điểm sinh học ....................................................................................... 21
1.2.2.3. Giá trị dược tính của nấm Vân Chi [3, 19, 25] ........................................... 21
1.2.2.4. β-glucan trong nấm Vân Chi ...................................................................... 22
1.3. Các phương pháp tách Chiết β-glucan .............................................................. 24
1.4.Quy trình công nghệ tách chiết β-glucan trọng lượng phân tử thấp ...........Error!
Bookmark not defined.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................................... 26
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 27
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy .................................................................................... 27
2.2.1.1. Phương pháp đặt thạch ................................................................................ 27
2.2.1.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng ........... 27
2.2.2. Nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm khác nhau trên
môi trường thạch PDA ............................................................................................. 27
2.2.3. Nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương
và nấm Vân Chi trong môi trường lỏng PDR .......................................................... 28
2.2.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối khô .................................................. 28
2.2.5. Phân tích hàm lượng beta-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm. ............ 28
2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng beta-glucan............................................. 29
2.2.6.1. Chiết xuất polysaccharide từ sinh khối sợi nấm khô .................................. 29
2.2.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide ..................................... 29
2.4. Phương pháp sắc ký trao đổi ion ....................................................................... 31
2.5. Sắc ký lọc gel Sapharose CL6B. ....................................................................... 32
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 33
3.1. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương và nấm Vân Chi
trên môi trường trên môi trường thạch PDA ............................................................ 33
3.1.1. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trên môi trường
trên môi trường thạch PDA ...................................................................................... 33
3.1.2. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Vân Chi trên môi trường
trên môi trường thạch PDA ...................................................................................... 35
3.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương và nấm Vân Chi môi trường
lỏng PDR .................................................................................................................. 36
3.2.1. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng
PDR .......................................................................................................................... 36
3.2.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Vân Chi môi trường lỏng PDR .. 37
3.3. Đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm phát triển trong môi
trường nuôi cấy lỏng ................................................................................................ 38
3.3.1. Xác định hàm lượng Glucan tổng số.............................................................. 39
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng glucan tổng số .................................................. 40
3.3.3. Khảo sát Beta - glucan từ nấm Vân Chi và nấm Hương .............................. 41
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 49
Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Đình Hòa là người thầy đã
hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ
thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua
mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên
tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Tác giả
Nguyễn Đức Thắng
i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng
tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả
Nguyễn Đức Thắng
ii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc hóa học của PSP gồm chuỗi β-1,3 glucan và các liên kết
nhánh β-1,6/1,4 (Cheng et al. 2008)
Hình 1.2. Đơn vị cấu trúc của polysaccharides có hoạt tính kháng u (Ren R. 2012)
Hình 1.3. Liên kết β- 1,3 glicozit và β- 1,6 glicozit
Hình 1.4. liên kết β- 1,3glicozit; β- 1,6 glicozit và β- 1,3: β- 1,6 glicozit của phân
tử β-glucan
Hình 1.5. Công thức cấu tạo Lentinan
Hình 1.6. Hình thái nấm Vân Chi là Trametes versicolor
Hình2.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ D-glucose.
Hình 2.2. đường chuẩn Glucose cho xác định glucan
Hình 3.1. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 9 ngày nuôi cấy trên môi
trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc)
Hình 3.2. Sự phát triển của nấm Vân Chi trên môi trường PDA
Hình 3.4. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ D-
glucose.
Hình 3.5. sắc ký đồ qua cột DEAE của polysaccharides
Hình 3.6. đường chuẩn Glucose cho xác định glucan
Hình 3.6. Kết quả tinh sạch qua cột Sapharose CL6B của 2 loại nấm
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư
từ các nấm điển hình
Bảng 1.2. Một số loại β-glucan
Bảng 3.1 Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng nấm Hương trên môi trường PDA
Bảng 3.2. Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng nấm Vân Chi trên môi trường
PDA
Bảng 3.4. Khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Vân Chi nuôi cấy
trong môi trường lỏng PDR sau 22 ngày.
Bảng 3.5. Hàm lượng glucan có trong sợi nấm khô của các chủng nấm Hương và
nấm Vân Chi
Bảng 3.6. Hàm lượng polysaccharide của chủng nấm VC2 của các phân đoạn khác
nhau sau khi qua cột DEAE.
Bảng 3.7. Hàm lượng polysaccharide của chủng nấm Ld của các phân đoạn khác
nhau sau khi qua cột DEAE.
Bảng 3.8. Hàm lượng β-glucan của các phân đoạn sau khi qua cột DEAE của nấm
Vân Chi VC2
Bảng 3.9. Hàm lượng β - glucan của các phân đoạn sau khi qua cột DEAE của nấm
Hương Ld
iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DEAE: demethylaminoethyl
PDA: potatoes dextrose agar
PDR: potatoes dextrose rice
PSK: polysaccharide -K
PSP: polysaccharopheptid
v
MỞ ĐẦU
β-Glucan (beta-glucan) là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các
đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside. Các hợp chất này
thường tồn tại dưới dạng phổ biến là cellulose của thực vật, vỏ cám của hạt ngũ
cốc, thành tế bào của nấm men, nấm và vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
được vai trò quan trọng của Beta Glucan trong điều trị Ung Thư, miễn dịch, nhiễm
khuẩn, giảm stress và phục hồi tủy xương bị hư tổn…[1].
Trong vai năm gần đây các sản phẩm được sản xuất từ Beta glucan được thu
nhận từ thực vật và các nguồn khác hiện đang được triển khai, sử dụng rộng dãi
trong các lĩnh vực như thực phẩm, lĩnh vực y dược, lĩnh vực thủy sản…Để có
những đánh giá về tình hình sản xuất và sử dụng beta- glucan được thu nhận từ
thưc vật, thì rất cần có những điều tra về tình hình sản xuất và sử dụng beta glucan
trong thực vật.
Nấm dược liệu và các loại nấm ăn từ lâu được coi là 1 loại thảo dược quý
hiếm có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, sức chống chịu của cơ thể với bệnh tật,
cung cấp năng lượng... Trong các loại nấm dược liệu có chứa β-Glucan như là:
Nấm Phục linh (Poria cocos), Linh Chi (Ganoderma lucidu), nấm Hương (Lentinus
edodes), Grifola frondosa (nấm tạo kê, nấm mùa ), nấm men bia (Saccharomyces
cerevisiae)[3], ngoài ra beta - glucan cũng có trong các loại nấm ăn như: Nấm
Hương chứa nhiền chất có hoạt tính sinh học cao (Beta – Glucan, Eritadinin, LEM)
giúp tang cường miễn dịch, hạ cholesterol và men gan [3].
Từ hàng ngàn năm trước, nấm dược liệu luôn được coi là loại thảo dược quý
hiếm và vô cùng đắt đỏ, vì thế không phải ai cũng có thể sử dụng chúng. Những
năm gần đây, ngoài việc chứng minh tác dụng của nấm dược liệu chúng ta đã thành
công trong việc nuôi trồng được nấm dược liệu giúp cho giá thành của loại dược
liệu này giảm bớt đáng kể. Ngoài ra, với các công nghệ tiên tiến, người ta đã có thể
1
chiết xuất được các polysaccharide quan trọng trong nấm để phục vụ cho các mục
đích khác nhau. Tuy nhiên, việc tách chiết các polysaccharide này đặc biệt là beta -
glucan rất khó khăn và đạt tỷ lệ thấp. Các thông số do các cơ sở sản xuất đưa ra
chưa có được độ chính xác và tin cậy cao.
Để có một cái nhìn khách quan hơn về thông số tách chiết các polysaccharide,
beta - glucan do các cơ sở sản xuất đưa ra và bước đầu đánh giá khả năng khai thác
beta glucan từ các loại nấm dược liệu và nấm ăn ở Việt Nam trong điều kiện nuối
cấy ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài
“Thăm dò khả năng khai thác beta-glucan từ nấm vân chi (trametes versicolor) và nấm
hương (lentinula edodes) ở điệu kiện phòng thí nghiệm”.
*/ Mục tiêu của đề tài:
Thăm dò khả năng khai thác beta glucan từ nấm Vân Chi và nấm Hương
nuôi cấy trong điệu kiện phòng thí nghiệm.
*/ Nội dung của đề tài:
- Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm trong điều kiện
nuôi cấy phòng thí nghiệm.
-Tách chiết và xác định hàm lượng polysaccharide của các chủng nấm.
- Kháo sát hàm lượng β - glucan từ các chủng nấm.
2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT β-GLUCAN
1.1.1. Nghiên cứu về polysaccharide từ nấm lớn
Nhiều polysaccharide từ nấm đã được thử nghiệm nghiêm ngặt trên người và
được dùng làm thuốc điều trị tại các nước như Nhật Bản, Trung Quốc với tên
tHương mại như: lentinan (Lentinula edodes), sChizophyllan (SChizophyllum
commune), PSK (polysaccharide–K, Krestin), PSP (polysaccharopheptide) từ
Coriolus versicolor. Các chất này hiện nay đang được sản xuất bởi các công ty
thuốc tại châu Á.
Xuất phát từ thực tế rằng rất khó sản xuất các loại thuốc chống vi rút, kháng
khuẩn, kháng ung thư đặc hiệu. Các tế bào ung thư phát triển từ tế bào thường và
khó có thuốc giết tế bào ung thư mà không làm tổn tHương tế bào khác. Vì vậy, các
pHương pháp chữa ung thư gần đây có khuynh hướng chuyển sang các liệu pháp
miễn dịch mục đích loại bỏ ung thư hay các viêm nhiễm khác bằng cách sử dụng
các chất tăng cường khả năng miễn dịch có nguồn gốc là polysaccharide từ nấm.
Polysaccharide là đại phân tử có cấu trúc hóa học rất đa dạng. Sự đa dạng về
polysaccharides sẽ dẫn đến nhiều kiểu tương tác khác nhau về phân tử ở sinh vật
bậc cao. Các polysaccharide ở nấm có nhiều hoạt tính khác nhau như chống oxi
hóa, kháng vi khuẩn, nấm, tăng cường miễn dịch hay tiêu diệt trực tiếp tế bào ung
thư. Tuy nhiên, hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch và tiêu diệt khối u là được
nghiên cứu nhiều và có tính ứng dụng cao bởi hoạt lực mạnh mẽ của các chất này
[33].
Một loạt các polysaccharide hoạt tính mạnh với cấu trúc khác nhau được
nghiên cứu. Các thành phần monomer trong phân tử có thể gồm glucose, galactose,
mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose, glucuromnic acid. Ngoài các β-glucan,
một số α-glucan mạch thẳng hoặc nhánh cũng có hoạt tính kháng u. Một nhóm lớn
3
các chất polysaccharides có hoạt tính có thể được gọi là heteroglycan gồm các
galactans, fucans, xylans, và mannan tùy thuộc vào các loại đường đơn trong chuỗi
chính và các đường nhánh gồm arabinose, mannose, fucose, galactose, xylose,
glucuronic acid.
Các polysaccharide kháng u được tìm thấy trong quả thể, trong khuẩn ti hoặc
trong dịch lên men nấm thuộc basidiomycetes. Các chất này khác nhau về thành
phần hóa học, cấu trúc không gian và hoạt tính kháng u, và phần lớn thuộc nhóm β-
1,3/1,6 glucan. Luca et al (1957) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng u
của nấm Boletus edulis (nấm thông), Clitopilus abortivus và một số nấm khác.
Nhiều polysaccharide được tinh sạch từ nấm là loại homoglycan hoặc heteroglycan
trong khi đó nhiều loại được gắn với các protein và gọi là phức hợp polysaccharide-
protein (peptide-glycan).
Bảng 1.1. Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư
từ các nấm điển hình
Loài Trị u hay Nguồn gốc Cấu trúc hóa học Tên gọi
ung thư phân lập
C. versicolor Ung thư hệ Khuẩn ti Chuỗi β1,3 glucan PSK và PSP
Vân Chi tiêu hóa, có nhánh β1,4 và 1,6
phổi và vú
L. edodes Ung thư dạ Quả thể β1,3/1,6 glucan Lentinan
Nấm Hương dày
S. commune Ung thư cổ Dịch lên β1,3/1,6 glucan SChizophylan
Nấm chân tử cung men
Chim
Ganoderma Chữa ung Quả thể, sợi β-glucan, Ganoderans
lucidum thư nấm heteropolysaccharide Protein LZ8
Linh Chi Glycoprotein GLP
4
Agaricus Chữa ung Quả thể, sợi β1,6 glucan
blazei thư nấm
Grifola Chữa ung Quả thể β 1,3/1,6 glucan Grifolan
frondosa thư
Maitake
H. erinaceus Chữa ung Quả thể Galactoxyloglucan-
Hầu thủ thư protein complex
Sclerotium β 1,3/1,6 glucan Scleroglucan
rolfsii or S.
glucanicum
Hoạt tính kháng u ở nấm phần lớn tập trung vào các polysaccharide có đơn
phân tử là glucose và được gọi chung là glucan. Các glucan có nhiều kiểu liên kết
trong phân tử và trong số chúng nhiều loại là heteroglycan. Các phân tử glucan này
tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm và cùng với một số polysaccharide khác như
Chitin, cellulose, galactomannan-protein, glucuromannan-protein v.v… Tuy nhiên,
Chitin, Chitosan hay cellulose không có hoạt tính kháng u.
Trong vài thập kỷ gần đây, 3 polysaccharide tự nhiên từ nấm là lentinan (từ
nấm Hương), sChizophylan (từ SChizophyllum commune) và PSK/Krestin (từ Vân
Chi) là được tiêu thụ nhiều ở Nhật. Lentinan và sChizophyllan là các β-glucan tinh
chất còn PSK là β-glucan-protein. Ở Trung Quốc, một sản phẩm thuốc tHương mại
cũng từ nấm Vân Chi, PSP được tách từ khuẩn ti cũng có bản chất β-glucan-
protein. 2 sản phẩm PSK và PSP có nguồn gốc từ các chủng Vân Chi khác nhau
(PSK từ chủng CM-101, và PSP từ Cov-1), và dùng công nghệ tách Chiết khác
nhau như tủa cồn hay amonium sulfate.
5
Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc hóa học của PSP gồm chuỗi β-1,3 glucan và các liên
kết nhánh β-1,6/1,4
PSP và PSK có bản chất là β-1,3/1,6 glucan với các nhánh β- 1,4 và 1,6 glucosidic.
Phân tử lượng PSP và PSK khoảng 10x104 Da. Chúng cũng chứa một lượng nhỏ
các đường khác như fucose, xylose, galactose và mannose. PSP và PSK được sử
dụng chữa bệnh có thể bằng cách tiêm tĩnh mạch hoặc uống, và có hiệu lực rộng
lên nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư vùng bụng, ung thư máu v.v..
Hình 1.2. Đơn vị cấu trúc của polysaccharides có hoạt tính kháng u
6
A: lentinan từ nấm Hương với cấu trúc 5 liên kết β1,3 và 2 liên kết nhánh
β1-6
B: SChizophylan từ nấm chân Chim, với cấu trúc 3 liên kết β 1,3 và 1 liên
kết nhánh β1-6
Lentinan từ quả thể nấm Hương, và được coi là đại diện cho β-1,3/1,6 glucan
trong hoạt tính chống u và tăng cường miễn dịch bởi chúng có hiệu lực cao và được
nghiên cứu rất sớm [8]. Lentinan cấu tạo mạch thẳng là chuỗi β-1,3 glucan và liên
kết nhanh β-1,6 glucan theo công thức là cứ 5 glucose mạch thẳng thì có 2 glucose
nhánh. Lentinan được dùng tiêm tĩnh mạch chữa các bệnh ung thư dạ dày, ruột,
tuyết tiền liệt, vú.
SChizophyllan từ dịch nuôi nấm SChizophyllum commune có hoạt lực chống u cao
và cấu tạo là chuỗi β-1,3 glucan với các liên kết nhánh bên β- 1,6 glucosidic (theo
tỉ lệ 3 liên kết thẳng: 1 liên kết nhánh).
Ngoài các β-1,3/1,6 glucan với hoạt tính cao đã được dùng điều trị cho bệnh
nhân, nhiều β-1,3/1,6 glucan có hoạt tính cao từ các nấm khác nhau đã được tách
Chiết từ nấm và thử nghiệm trên động vật thực nghiệm. [25] Mizuno đã tách Chiết
polysaccharide từ nấm Hầu thủ và nhận được 6 loại polysacchride có hoạt tính
kháng u. Các polysaccharide này khác nhau về thành phần đường và khối lượng
phân tử. Tuy nhiên, chúng đều chứa các liên kết β-1,3 và β-1,6 trong phân tử, và đa
số là heteroglucan gồm xylose, glucose và mannose hay galactoxyloglucan-protein
complex. Các polysaccharide này đều có khả năng ức chế 40−75,9% khối u
(Sarcoma 180) trên chuột. Cũng với nấm này, Dong et al. (2006) đã tách và tinh
sạch được β-1,3/1,6 glucan ở nấm này và nghiên cứu các tính chất lý hóa học. [27]
Ohno tinh sạch nhiều phân đoạn từ khuẩn ti nấm Agaricus blazei và nhận thấy
rằng, các phân đoạn có hoạt tính ức chế 90−99,9% khối u (sarcoma 180) đều có
7
liên quan cấu trúc β-1,3/1,6 glucan. Ở nấm Sparassis crispa (nấm súp lơ hay san
hô), cả 4 loại glucan có hoạt tính cao, với hoạt tính ức chế 90−99% ung thư
(sarcoma 180) đều cấu tạo β- 1,3/1,6 glucan [27].
1.1.2. Định nghĩa
β-glucan là một polysaccarit của D-glucose với cá liên kết glicozit. β-glucan
là một nhóm các phân tử glucan khác nhau ở khối lượng phân tử, tính hoàn tan, độ
nhớt và cấu hình trong không gian. β-glucan thường có trong thành tế bào thự vật,
hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn. Trong tự nhiên β-glucan có nhiều trong
nấm như nấm Sò, nấm Hương… [22].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β- glucan với liên kết ( 1,3/1,6) có hoạt tính
sinh học cao hơn β-glucan với liên kết ( 1,4/ 1,6). Sự khác nhau giữa các mối liên
kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt
tính sinh học của chúng. β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng
cao [22].
Bảng 1.2. Một số loại β-glucan
Tên Liên kết Glicozit Ghi chú
Cellulose β- 1,4
Curdlan β- 1,3
Laminarin β- 1,3 và β- 1,6
Chrysolaminarin β- 1,3
Lentinan β- 1,6 : β- 1,3 Được tách Chiết từ edodes Lentinula
Lichenin β- 1,3 và β- 1,4
Pleuran β- 1,3 và β- 1,6 Được tách Chiết từ ostreatus Pleurotus
zymosan β- 1,3
8
1.1.3. Cấu trúc β-glucan
β-glucan là các polysaccharide xuất hiện trong tự nhiên. β-glucan là hợp chất liên
kết phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-
glycosid. Các polymer này được tạo ra bởi các loài thực vật khác nhau như yến
mạch, đại mạch, tảo biển. β-glucan còn có ở thành tế bào của các vi khuẩn (
Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus,
Histopplasma capsulatum, Candida albicans) và nấm ( Saccharomyces cerevisiae).
Các thành phần chính cảu thành tế bào nấm là polysaccharide và glycoprotein.
Thành tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) gồm 3 lớp: lớp trong β-glucan
không hòa tan chiếm ( 30-35%), lớp giữa β-glucan hòa tan ( 20-22%), lớp ngoài là
glycoprotein (30%) và các thành phần khác như: Chitin, mannoprotein [10, 14].
Mannoprotein với khối lượng phân tử khoảng 100kDa liên kết với β-1,6-D-glucan
qua gốc glycosyl-phosphatidyl-inositol chứ 5 gốc manosyl liên kết α. Đầu khử của
β-1,6-D-glucan liên kết với đầu không khử của β-1,3-D-glucan. Chitin gắn thẳng
vào nhánh β-1,6-D-glucan. Mối liên kết này có vai trò trungtaam trong cấu trúc
thành tế bào nấm men.
Hình 1.3. Liên kết β- 1,3 glicozit và β- 1,6 glicozit
9
Hình 1.4. liên kết β- 1,3glicozit; β- 1,6 glicozit và β- 1,3: β- 1,6 glicozit của phân
tử β-glucan
1.1.4. Tính chất hóa học của Beta-glucan [22]
Theo định nghĩa, β-Glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D (D-
glucose), tạo nên bởi liên kết loại β-glycoside. Vòng 6 D-glucose có thể gắn với
phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D-glucose. Một vài hợp
chất β-Glucan lại có cấu tạo lập lại của cấu trúc vòng D-glucose gắn tại một vị trí
đặc biệt.
Tuy nhiên, β-glucan có thể khác nhiều so với phân tử như tinh bột. Ví dụ,
một phân tử β-glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D-glucose
gắn với nhau qua liên kết β-glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh
glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D-glucose. Các chuỗi phân nhỏ này có thể
tạo thành nhánh của trục chính β-glucan (trong trường hợp của tinh bột, trục chính
có thể là chuỗi D-glucose gắn tại vị trí 1,4) tại vị trí khác giống như vị trí 3, 6.
Ngoài ra, các chuỗi này có thể gắn kết với một phân tử loại khác, chẳng hạn như
protein. Ví dụ loại β-glucan có protein gắn với nó đó là Poly saccharide-K.
10
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
THĂM DÒ KHẢ NĂNG KHAI THÁC BETA-GLUCAN TỪ NẤM VÂN
CHI (TRAMETES VERSICOLOR) VÀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA
EDODES ) Ở ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
2012B
Hà Nội – Năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------
NGUYỄN ĐỨC THẮNG
THĂM DÒ KHẢ NĂNG KHAI THÁC BETA-GLUCAN TỪ NẤM VÂN CHI
(TRAMETES VERSICOLOR) VÀ NẤM HƯƠNG (LENTINULA EDODES ) Ở
ĐIỀU KIỆN PHÒNG THÍ NGHIỆM
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
GS.TS HOÀNG ĐÌNH HÒA
Hà Nội – Năm 2014
MỤC LỤC
Lời cảm ơn .................................................................................................................. i
Lời cam đoan .............................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT β-GLUCAN ................................................. 3
1.1.1. Nghiên cứu về polysaccharide từ nấm lớn ....................................................... 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu về Beta -glucan ............... Error! Bookmark not defined.
1.1.3. Định nghĩa ........................................................................................................ 8
1.1.4. Cấu trúc β-glucan ............................................................................................. 9
1.1.5. Tính chất hóa học của Beta-glucan [4] .......................................................... 10
1.1.6. Hoạt tính sinh học của β-glucan..................................................................... 11
1.1.6.1. Hoạt tính chống ung thư .............................................................................. 11
1.1.6.2. Hoạt tính chống virus, vi khuẩn .................................................................. 12
1.1.6.3. Hoạt tính kháng sinh ................................................................................... 12
1.1.6.4.Hoạt tính kích thích tăng cường miễn dịch của β-glucan ............................ 13
1.1.6.5. Ứng dụng của β-glucan ............................................................................... 14
1.2. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NẤM HƯƠNG VÀ HỆ SỢI NẤM HƯƠNG ....... 16
1.2.1. Đặc điểm hình thái và đặc tính sinh học của nấm Hương ............................. 16
1.2.1.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................... 16
1.2.1.2. Đặc tính sinh học của nấm Hương .............................................................. 17
1.2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển cảu nấm Hương ....... 17
1.2.1.4. Giá trị dinh dưỡng của nấm Hương ............................................................ 18
1.2.1.5. β-glucan trong nấm Hương ......................................................................... 19
1.2.2. Nấm Vân Chi Trametes versicolor ................................................................ 20
1.2.2.1. Đặc điểm sinh học và đặc điểm hình thái của nấm Vân Chi Trametes
versicolor .................................................................................................................. 20
1.2.2.2. Đặc điểm sinh học ....................................................................................... 21
1.2.2.3. Giá trị dược tính của nấm Vân Chi [3, 19, 25] ........................................... 21
1.2.2.4. β-glucan trong nấm Vân Chi ...................................................................... 22
1.3. Các phương pháp tách Chiết β-glucan .............................................................. 24
1.4.Quy trình công nghệ tách chiết β-glucan trọng lượng phân tử thấp ...........Error!
Bookmark not defined.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................................... 26
2.1. Vật liệu .............................................................................................................. 26
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................... 26
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 27
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy .................................................................................... 27
2.2.1.1. Phương pháp đặt thạch ................................................................................ 27
2.2.1.2. Phương pháp nhân nuôi chủng nấm Hương trong môi trường lỏng ........... 27
2.2.2. Nghiên cứu so sánh khả năng phát triển của các chủng nấm khác nhau trên
môi trường thạch PDA ............................................................................................. 27
2.2.3. Nghiên cứu so sánh khả năng phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương
và nấm Vân Chi trong môi trường lỏng PDR .......................................................... 28
2.2.4. Phương pháp xác định lượng sinh khối khô .................................................. 28
2.2.5. Phân tích hàm lượng beta-glucan trong sinh khối ở các chủng nấm. ............ 28
2.2.6. Phương pháp phân tích hàm lượng beta-glucan............................................. 29
2.2.6.1. Chiết xuất polysaccharide từ sinh khối sợi nấm khô .................................. 29
2.2.6.2. Phương pháp xác định hàm lượng polysaccharide ..................................... 29
2.4. Phương pháp sắc ký trao đổi ion ....................................................................... 31
2.5. Sắc ký lọc gel Sapharose CL6B. ....................................................................... 32
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 33
3.1. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương và nấm Vân Chi
trên môi trường trên môi trường thạch PDA ............................................................ 33
3.1.1. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Hương trên môi trường
trên môi trường thạch PDA ...................................................................................... 33
3.1.2. Đánh giá sự phát triển sinh khối của các chủng nấm Vân Chi trên môi trường
trên môi trường thạch PDA ...................................................................................... 35
3.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương và nấm Vân Chi môi trường
lỏng PDR .................................................................................................................. 36
3.2.1. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Hương trong môi trường lỏng
PDR .......................................................................................................................... 36
3.2.2. Đánh giá sự phát triển của các chủng nấm Vân Chi môi trường lỏng PDR .. 37
3.3. Đánh giá hàm lượng β-glucan trong sinh khối sợi nấm phát triển trong môi
trường nuôi cấy lỏng ................................................................................................ 38
3.3.1. Xác định hàm lượng Glucan tổng số.............................................................. 39
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng glucan tổng số .................................................. 40
3.3.3. Khảo sát Beta - glucan từ nấm Vân Chi và nấm Hương .............................. 41
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 49
Lời cảm ơn
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Đình Hòa là người thầy đã
hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ
và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ
thực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua
mọi khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu của mình.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình và bè bạn, những người luôn bên
tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và
nghiên cứu.
Tác giả
Nguyễn Đức Thắng
i
Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng
tác với các đồng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả
Nguyễn Đức Thắng
ii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc hóa học của PSP gồm chuỗi β-1,3 glucan và các liên kết
nhánh β-1,6/1,4 (Cheng et al. 2008)
Hình 1.2. Đơn vị cấu trúc của polysaccharides có hoạt tính kháng u (Ren R. 2012)
Hình 1.3. Liên kết β- 1,3 glicozit và β- 1,6 glicozit
Hình 1.4. liên kết β- 1,3glicozit; β- 1,6 glicozit và β- 1,3: β- 1,6 glicozit của phân
tử β-glucan
Hình 1.5. Công thức cấu tạo Lentinan
Hình 1.6. Hình thái nấm Vân Chi là Trametes versicolor
Hình2.1. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ D-glucose.
Hình 2.2. đường chuẩn Glucose cho xác định glucan
Hình 3.1. Sự phát triển của 3 chủng nấm Hương sau 9 ngày nuôi cấy trên môi
trường thạch PDA (Từ trái qua phải là các chủng Ld, Lg, Lc)
Hình 3.2. Sự phát triển của nấm Vân Chi trên môi trường PDA
Hình 3.4. Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang và nồng độ D-
glucose.
Hình 3.5. sắc ký đồ qua cột DEAE của polysaccharides
Hình 3.6. đường chuẩn Glucose cho xác định glucan
Hình 3.6. Kết quả tinh sạch qua cột Sapharose CL6B của 2 loại nấm
iii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư
từ các nấm điển hình
Bảng 1.2. Một số loại β-glucan
Bảng 3.1 Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng nấm Hương trên môi trường PDA
Bảng 3.2. Đường kính (mm) hệ sợi của các chủng nấm Vân Chi trên môi trường
PDA
Bảng 3.4. Khối lượng sinh khối sợi nấm khô của các chủng nấm Vân Chi nuôi cấy
trong môi trường lỏng PDR sau 22 ngày.
Bảng 3.5. Hàm lượng glucan có trong sợi nấm khô của các chủng nấm Hương và
nấm Vân Chi
Bảng 3.6. Hàm lượng polysaccharide của chủng nấm VC2 của các phân đoạn khác
nhau sau khi qua cột DEAE.
Bảng 3.7. Hàm lượng polysaccharide của chủng nấm Ld của các phân đoạn khác
nhau sau khi qua cột DEAE.
Bảng 3.8. Hàm lượng β-glucan của các phân đoạn sau khi qua cột DEAE của nấm
Vân Chi VC2
Bảng 3.9. Hàm lượng β - glucan của các phân đoạn sau khi qua cột DEAE của nấm
Hương Ld
iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DEAE: demethylaminoethyl
PDA: potatoes dextrose agar
PDR: potatoes dextrose rice
PSK: polysaccharide -K
PSP: polysaccharopheptid
v
MỞ ĐẦU
β-Glucan (beta-glucan) là hợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các
đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-glycoside. Các hợp chất này
thường tồn tại dưới dạng phổ biến là cellulose của thực vật, vỏ cám của hạt ngũ
cốc, thành tế bào của nấm men, nấm và vi khuẩn. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh
được vai trò quan trọng của Beta Glucan trong điều trị Ung Thư, miễn dịch, nhiễm
khuẩn, giảm stress và phục hồi tủy xương bị hư tổn…[1].
Trong vai năm gần đây các sản phẩm được sản xuất từ Beta glucan được thu
nhận từ thực vật và các nguồn khác hiện đang được triển khai, sử dụng rộng dãi
trong các lĩnh vực như thực phẩm, lĩnh vực y dược, lĩnh vực thủy sản…Để có
những đánh giá về tình hình sản xuất và sử dụng beta- glucan được thu nhận từ
thưc vật, thì rất cần có những điều tra về tình hình sản xuất và sử dụng beta glucan
trong thực vật.
Nấm dược liệu và các loại nấm ăn từ lâu được coi là 1 loại thảo dược quý
hiếm có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, sức chống chịu của cơ thể với bệnh tật,
cung cấp năng lượng... Trong các loại nấm dược liệu có chứa β-Glucan như là:
Nấm Phục linh (Poria cocos), Linh Chi (Ganoderma lucidu), nấm Hương (Lentinus
edodes), Grifola frondosa (nấm tạo kê, nấm mùa ), nấm men bia (Saccharomyces
cerevisiae)[3], ngoài ra beta - glucan cũng có trong các loại nấm ăn như: Nấm
Hương chứa nhiền chất có hoạt tính sinh học cao (Beta – Glucan, Eritadinin, LEM)
giúp tang cường miễn dịch, hạ cholesterol và men gan [3].
Từ hàng ngàn năm trước, nấm dược liệu luôn được coi là loại thảo dược quý
hiếm và vô cùng đắt đỏ, vì thế không phải ai cũng có thể sử dụng chúng. Những
năm gần đây, ngoài việc chứng minh tác dụng của nấm dược liệu chúng ta đã thành
công trong việc nuôi trồng được nấm dược liệu giúp cho giá thành của loại dược
liệu này giảm bớt đáng kể. Ngoài ra, với các công nghệ tiên tiến, người ta đã có thể
1
chiết xuất được các polysaccharide quan trọng trong nấm để phục vụ cho các mục
đích khác nhau. Tuy nhiên, việc tách chiết các polysaccharide này đặc biệt là beta -
glucan rất khó khăn và đạt tỷ lệ thấp. Các thông số do các cơ sở sản xuất đưa ra
chưa có được độ chính xác và tin cậy cao.
Để có một cái nhìn khách quan hơn về thông số tách chiết các polysaccharide,
beta - glucan do các cơ sở sản xuất đưa ra và bước đầu đánh giá khả năng khai thác
beta glucan từ các loại nấm dược liệu và nấm ăn ở Việt Nam trong điều kiện nuối
cấy ở phòng thí nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề tài
“Thăm dò khả năng khai thác beta-glucan từ nấm vân chi (trametes versicolor) và nấm
hương (lentinula edodes) ở điệu kiện phòng thí nghiệm”.
*/ Mục tiêu của đề tài:
Thăm dò khả năng khai thác beta glucan từ nấm Vân Chi và nấm Hương
nuôi cấy trong điệu kiện phòng thí nghiệm.
*/ Nội dung của đề tài:
- Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm trong điều kiện
nuôi cấy phòng thí nghiệm.
-Tách chiết và xác định hàm lượng polysaccharide của các chủng nấm.
- Kháo sát hàm lượng β - glucan từ các chủng nấm.
2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ HOẠT CHẤT β-GLUCAN
1.1.1. Nghiên cứu về polysaccharide từ nấm lớn
Nhiều polysaccharide từ nấm đã được thử nghiệm nghiêm ngặt trên người và
được dùng làm thuốc điều trị tại các nước như Nhật Bản, Trung Quốc với tên
tHương mại như: lentinan (Lentinula edodes), sChizophyllan (SChizophyllum
commune), PSK (polysaccharide–K, Krestin), PSP (polysaccharopheptide) từ
Coriolus versicolor. Các chất này hiện nay đang được sản xuất bởi các công ty
thuốc tại châu Á.
Xuất phát từ thực tế rằng rất khó sản xuất các loại thuốc chống vi rút, kháng
khuẩn, kháng ung thư đặc hiệu. Các tế bào ung thư phát triển từ tế bào thường và
khó có thuốc giết tế bào ung thư mà không làm tổn tHương tế bào khác. Vì vậy, các
pHương pháp chữa ung thư gần đây có khuynh hướng chuyển sang các liệu pháp
miễn dịch mục đích loại bỏ ung thư hay các viêm nhiễm khác bằng cách sử dụng
các chất tăng cường khả năng miễn dịch có nguồn gốc là polysaccharide từ nấm.
Polysaccharide là đại phân tử có cấu trúc hóa học rất đa dạng. Sự đa dạng về
polysaccharides sẽ dẫn đến nhiều kiểu tương tác khác nhau về phân tử ở sinh vật
bậc cao. Các polysaccharide ở nấm có nhiều hoạt tính khác nhau như chống oxi
hóa, kháng vi khuẩn, nấm, tăng cường miễn dịch hay tiêu diệt trực tiếp tế bào ung
thư. Tuy nhiên, hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch và tiêu diệt khối u là được
nghiên cứu nhiều và có tính ứng dụng cao bởi hoạt lực mạnh mẽ của các chất này
[33].
Một loạt các polysaccharide hoạt tính mạnh với cấu trúc khác nhau được
nghiên cứu. Các thành phần monomer trong phân tử có thể gồm glucose, galactose,
mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose, glucuromnic acid. Ngoài các β-glucan,
một số α-glucan mạch thẳng hoặc nhánh cũng có hoạt tính kháng u. Một nhóm lớn
3
các chất polysaccharides có hoạt tính có thể được gọi là heteroglycan gồm các
galactans, fucans, xylans, và mannan tùy thuộc vào các loại đường đơn trong chuỗi
chính và các đường nhánh gồm arabinose, mannose, fucose, galactose, xylose,
glucuronic acid.
Các polysaccharide kháng u được tìm thấy trong quả thể, trong khuẩn ti hoặc
trong dịch lên men nấm thuộc basidiomycetes. Các chất này khác nhau về thành
phần hóa học, cấu trúc không gian và hoạt tính kháng u, và phần lớn thuộc nhóm β-
1,3/1,6 glucan. Luca et al (1957) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng u
của nấm Boletus edulis (nấm thông), Clitopilus abortivus và một số nấm khác.
Nhiều polysaccharide được tinh sạch từ nấm là loại homoglycan hoặc heteroglycan
trong khi đó nhiều loại được gắn với các protein và gọi là phức hợp polysaccharide-
protein (peptide-glycan).
Bảng 1.1. Một số polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư
từ các nấm điển hình
Loài Trị u hay Nguồn gốc Cấu trúc hóa học Tên gọi
ung thư phân lập
C. versicolor Ung thư hệ Khuẩn ti Chuỗi β1,3 glucan PSK và PSP
Vân Chi tiêu hóa, có nhánh β1,4 và 1,6
phổi và vú
L. edodes Ung thư dạ Quả thể β1,3/1,6 glucan Lentinan
Nấm Hương dày
S. commune Ung thư cổ Dịch lên β1,3/1,6 glucan SChizophylan
Nấm chân tử cung men
Chim
Ganoderma Chữa ung Quả thể, sợi β-glucan, Ganoderans
lucidum thư nấm heteropolysaccharide Protein LZ8
Linh Chi Glycoprotein GLP
4
Agaricus Chữa ung Quả thể, sợi β1,6 glucan
blazei thư nấm
Grifola Chữa ung Quả thể β 1,3/1,6 glucan Grifolan
frondosa thư
Maitake
H. erinaceus Chữa ung Quả thể Galactoxyloglucan-
Hầu thủ thư protein complex
Sclerotium β 1,3/1,6 glucan Scleroglucan
rolfsii or S.
glucanicum
Hoạt tính kháng u ở nấm phần lớn tập trung vào các polysaccharide có đơn
phân tử là glucose và được gọi chung là glucan. Các glucan có nhiều kiểu liên kết
trong phân tử và trong số chúng nhiều loại là heteroglycan. Các phân tử glucan này
tập trung chủ yếu ở vách tế bào nấm và cùng với một số polysaccharide khác như
Chitin, cellulose, galactomannan-protein, glucuromannan-protein v.v… Tuy nhiên,
Chitin, Chitosan hay cellulose không có hoạt tính kháng u.
Trong vài thập kỷ gần đây, 3 polysaccharide tự nhiên từ nấm là lentinan (từ
nấm Hương), sChizophylan (từ SChizophyllum commune) và PSK/Krestin (từ Vân
Chi) là được tiêu thụ nhiều ở Nhật. Lentinan và sChizophyllan là các β-glucan tinh
chất còn PSK là β-glucan-protein. Ở Trung Quốc, một sản phẩm thuốc tHương mại
cũng từ nấm Vân Chi, PSP được tách từ khuẩn ti cũng có bản chất β-glucan-
protein. 2 sản phẩm PSK và PSP có nguồn gốc từ các chủng Vân Chi khác nhau
(PSK từ chủng CM-101, và PSP từ Cov-1), và dùng công nghệ tách Chiết khác
nhau như tủa cồn hay amonium sulfate.
5
Hình 1.1. Đơn vị cấu trúc hóa học của PSP gồm chuỗi β-1,3 glucan và các liên
kết nhánh β-1,6/1,4
PSP và PSK có bản chất là β-1,3/1,6 glucan với các nhánh β- 1,4 và 1,6 glucosidic.
Phân tử lượng PSP và PSK khoảng 10x104 Da. Chúng cũng chứa một lượng nhỏ
các đường khác như fucose, xylose, galactose và mannose. PSP và PSK được sử
dụng chữa bệnh có thể bằng cách tiêm tĩnh mạch hoặc uống, và có hiệu lực rộng
lên nhiều loại ung thư như ung thư vú, ung thư vùng bụng, ung thư máu v.v..
Hình 1.2. Đơn vị cấu trúc của polysaccharides có hoạt tính kháng u
6
A: lentinan từ nấm Hương với cấu trúc 5 liên kết β1,3 và 2 liên kết nhánh
β1-6
B: SChizophylan từ nấm chân Chim, với cấu trúc 3 liên kết β 1,3 và 1 liên
kết nhánh β1-6
Lentinan từ quả thể nấm Hương, và được coi là đại diện cho β-1,3/1,6 glucan
trong hoạt tính chống u và tăng cường miễn dịch bởi chúng có hiệu lực cao và được
nghiên cứu rất sớm [8]. Lentinan cấu tạo mạch thẳng là chuỗi β-1,3 glucan và liên
kết nhanh β-1,6 glucan theo công thức là cứ 5 glucose mạch thẳng thì có 2 glucose
nhánh. Lentinan được dùng tiêm tĩnh mạch chữa các bệnh ung thư dạ dày, ruột,
tuyết tiền liệt, vú.
SChizophyllan từ dịch nuôi nấm SChizophyllum commune có hoạt lực chống u cao
và cấu tạo là chuỗi β-1,3 glucan với các liên kết nhánh bên β- 1,6 glucosidic (theo
tỉ lệ 3 liên kết thẳng: 1 liên kết nhánh).
Ngoài các β-1,3/1,6 glucan với hoạt tính cao đã được dùng điều trị cho bệnh
nhân, nhiều β-1,3/1,6 glucan có hoạt tính cao từ các nấm khác nhau đã được tách
Chiết từ nấm và thử nghiệm trên động vật thực nghiệm. [25] Mizuno đã tách Chiết
polysaccharide từ nấm Hầu thủ và nhận được 6 loại polysacchride có hoạt tính
kháng u. Các polysaccharide này khác nhau về thành phần đường và khối lượng
phân tử. Tuy nhiên, chúng đều chứa các liên kết β-1,3 và β-1,6 trong phân tử, và đa
số là heteroglucan gồm xylose, glucose và mannose hay galactoxyloglucan-protein
complex. Các polysaccharide này đều có khả năng ức chế 40−75,9% khối u
(Sarcoma 180) trên chuột. Cũng với nấm này, Dong et al. (2006) đã tách và tinh
sạch được β-1,3/1,6 glucan ở nấm này và nghiên cứu các tính chất lý hóa học. [27]
Ohno tinh sạch nhiều phân đoạn từ khuẩn ti nấm Agaricus blazei và nhận thấy
rằng, các phân đoạn có hoạt tính ức chế 90−99,9% khối u (sarcoma 180) đều có
7
liên quan cấu trúc β-1,3/1,6 glucan. Ở nấm Sparassis crispa (nấm súp lơ hay san
hô), cả 4 loại glucan có hoạt tính cao, với hoạt tính ức chế 90−99% ung thư
(sarcoma 180) đều cấu tạo β- 1,3/1,6 glucan [27].
1.1.2. Định nghĩa
β-glucan là một polysaccarit của D-glucose với cá liên kết glicozit. β-glucan
là một nhóm các phân tử glucan khác nhau ở khối lượng phân tử, tính hoàn tan, độ
nhớt và cấu hình trong không gian. β-glucan thường có trong thành tế bào thự vật,
hạt ngũ cốc, nấm men, nấm và vi khuẩn. Trong tự nhiên β-glucan có nhiều trong
nấm như nấm Sò, nấm Hương… [22].
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng β- glucan với liên kết ( 1,3/1,6) có hoạt tính
sinh học cao hơn β-glucan với liên kết ( 1,4/ 1,6). Sự khác nhau giữa các mối liên
kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt
tính sinh học của chúng. β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng
cao [22].
Bảng 1.2. Một số loại β-glucan
Tên Liên kết Glicozit Ghi chú
Cellulose β- 1,4
Curdlan β- 1,3
Laminarin β- 1,3 và β- 1,6
Chrysolaminarin β- 1,3
Lentinan β- 1,6 : β- 1,3 Được tách Chiết từ edodes Lentinula
Lichenin β- 1,3 và β- 1,4
Pleuran β- 1,3 và β- 1,6 Được tách Chiết từ ostreatus Pleurotus
zymosan β- 1,3
8
1.1.3. Cấu trúc β-glucan
β-glucan là các polysaccharide xuất hiện trong tự nhiên. β-glucan là hợp chất liên
kết phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắn với nhau qua liên kết β-
glycosid. Các polymer này được tạo ra bởi các loài thực vật khác nhau như yến
mạch, đại mạch, tảo biển. β-glucan còn có ở thành tế bào của các vi khuẩn (
Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus,
Histopplasma capsulatum, Candida albicans) và nấm ( Saccharomyces cerevisiae).
Các thành phần chính cảu thành tế bào nấm là polysaccharide và glycoprotein.
Thành tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) gồm 3 lớp: lớp trong β-glucan
không hòa tan chiếm ( 30-35%), lớp giữa β-glucan hòa tan ( 20-22%), lớp ngoài là
glycoprotein (30%) và các thành phần khác như: Chitin, mannoprotein [10, 14].
Mannoprotein với khối lượng phân tử khoảng 100kDa liên kết với β-1,6-D-glucan
qua gốc glycosyl-phosphatidyl-inositol chứ 5 gốc manosyl liên kết α. Đầu khử của
β-1,6-D-glucan liên kết với đầu không khử của β-1,3-D-glucan. Chitin gắn thẳng
vào nhánh β-1,6-D-glucan. Mối liên kết này có vai trò trungtaam trong cấu trúc
thành tế bào nấm men.
Hình 1.3. Liên kết β- 1,3 glicozit và β- 1,6 glicozit
9
Hình 1.4. liên kết β- 1,3glicozit; β- 1,6 glicozit và β- 1,3: β- 1,6 glicozit của phân
tử β-glucan
1.1.4. Tính chất hóa học của Beta-glucan [22]
Theo định nghĩa, β-Glucan là chuỗi của các liên phân tử đường D (D-
glucose), tạo nên bởi liên kết loại β-glycoside. Vòng 6 D-glucose có thể gắn với
phân tử khác theo các vị trí khác nhau của cấu trúc vòng D-glucose. Một vài hợp
chất β-Glucan lại có cấu tạo lập lại của cấu trúc vòng D-glucose gắn tại một vị trí
đặc biệt.
Tuy nhiên, β-glucan có thể khác nhiều so với phân tử như tinh bột. Ví dụ,
một phân tử β-glucan có thể chứa cấu trúc lặp lại của các đơn nguyên D-glucose
gắn với nhau qua liên kết β-glycoside tại một vị trí như tinh bột, nhưng có nhánh
glucose gắn vào vị trí khác trên chuỗi D-glucose. Các chuỗi phân nhỏ này có thể
tạo thành nhánh của trục chính β-glucan (trong trường hợp của tinh bột, trục chính
có thể là chuỗi D-glucose gắn tại vị trí 1,4) tại vị trí khác giống như vị trí 3, 6.
Ngoài ra, các chuỗi này có thể gắn kết với một phân tử loại khác, chẳng hạn như
protein. Ví dụ loại β-glucan có protein gắn với nó đó là Poly saccharide-K.
10