Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp giữa tế bào gốc trung mô mỡ thỏ và màng chân bì da người
- 81 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP
GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ
VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP
GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ
VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI
NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI)
MÃ SỐ: 8720101
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. HUỲNH DUY THẢO
2. TS. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự hướng dẫn
khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc Vương. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.
Những số liệu trong bảng biểu, đồ thị, hình ảnh phục vụ cho việc phân tích,
nhận xét, đánh giá được chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi thu thập từ các nguồn
khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử
dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức
khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
nội dung luận văn của mình.
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
.
.
MỤC LỤC
Trang
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục đồ thị
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................ 4
1.1 Tổng quan về mô sụn........................................................................................................ 4
1.2 Quá trình sửa chữa tổn thương sụn ................................................................................ 6
1.3 Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp ................. 7
1.3.1 Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học ................................ 8
1.3.2 Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học ............................................. 8
1.4 Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn........................................................... 10
1.4.1 Tổng quan và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn.......................... 10
1.4.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ........................................................................ 15
1.4.3 Giá thể màng chân bì .......................................................................................... 22
1.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................................ 23
1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................................. 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27
2.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 27
2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu...................................................................................................... 27
2.3 Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................................ 27
2.4 Y đức.................................................................................................................................. 27
2.5 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 27
2.5.1 Phân lập và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ.............................................. 27
2.5.2 Tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM và giá thể màng chân bì da người ........... 33
2.5.3 Đánh giá tấm tế bào sụn..................................................................................... 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 35
.
.
3.1 Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ ................................................................... 35
3.1.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô mỡ ........................... 35
3.1.2 Đánh giá sự tăng sinh của TBGTM từ mỡ ..................................................... 37
3.2 Kết quả định danh TBGTM từ mỡ............................................................................... 38
3.2.1 Khảo sát hình thái học và đặc tính bám dính ................................................. 38
3.2.2 Khảo sát khả năng biệt hóa ............................................................................... 40
3.2.3 Khảo sát biểu hiện gien bằng phương pháp PCR ......................................... 42
3.2.4 Khảo sát biểu hiện gien cho các marker đặc trưng sụn bằng qRT-PCR. . 46
3.3 Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM từ mô mỡ thỏ với màng chân bì ...... 49
3.3.1 Kết quả đánh giá mô học ................................................................................... 50
3.3.2 Kết quả chụp SEM .............................................................................................. 52
KẾT LUẬN............................................................................................................................. 54
KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................55
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ Viết Tắt Tiếng Anh
ACI Autologous Chodrocyte Implementation
ADSC Adipose Derived Stem Cell
CS Cộng sự
DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid
FBS Fetal Bovine Serum
H&E Hematocylin & Eosin
iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells
ISCT International Society for Cellular Therapy
KHV Kính hiển vi
MACI Membrane-asociated ACI
PBS Phophate-Buffered Saline
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain
qRT-PCR
Reaction
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SEM Scanning Electron Microscopy
TBGTM Tế Bào Gốc Trung Mô
TEM Transmission Electron Microscopy
TGF-1 Transforming growth factor-1
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn định danh TBGTM ............................................................. 21
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR .............................................................. 31
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR ......................................................... 31
Bảng 2.4. Thành phầ khuếch đại các gien tạo sụn ................................................. .32
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng qRT-PCR ....................................................... 32
Bảng 3.6. Mật độ tế bào thu nhận theo thời gian .................................................... 37
Bảng 3.7. So sánh các marker bề mặt giữa người và thỏ bằng Flow cytometry giữa
các nghiên cứu ...................................................................................................... 43
Bảng 3.8. So sánh các marker bề mặt bằng phương pháp RT-PCR giữa các nghiên
cứu ........................................................................................................................ 45
Bảng 3.9. Bảng số liệu mức độ biểu hiện gien theo thời gian ................................. 46
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phân bố sụn trong cơ thể ......................................................................... 5
Hình 1.2. Phân loại mô sụn .. ................................................................................... 6
Hình 1.3. Các dạng tổn thương sụn ......................................................................... 7
Hình 1.4 Lược đồ phương pháp ACI ....................................................................... 9
Hình 1.5. Những tiến bộ trong kỹ nghệ mô ............................................................ 12
Hình 1.6. Các thành phần chính của kỹ nghệ mô trong sửa chữa sụn .................... 13
Hình 1.7. Các nguồn tế bào gốc, nguồn thu nhận và đặc điểm của chúng .............. 14
Hình 1.8. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô ........................................... 16
Hình 1.9. Quy trình phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mỡ ..................................... 18
Hình 2.10. Xử lý mẫu mô mỡ để thu nhận TBGTM ............................................... 28
Hình 2.11. Một số loại môi trường được sử dụng để cảm ứng biệt hóa TBGTM thành
nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ .................................................. 29
Hình 3.12. Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ .. ........................................... 36
Hình 3.13. Kết quả quan sát hình thái và đặc tính bám dính của TBGTM từ mô mỡ
dưới KHV đảo ngược 10X..................................................................................... 39
Hình 3.14. Kết quả đánh giá khả năng biệt hóa của TBGTM.. ............................... 41
Hình 3.15. Kết quả RT-PCR của các marker TBGTM ........................................... 43
Hình 3.16. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn. ......... 50
Hình 3.17. Kết quả nhuộm mô học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM mỡ và
màng chân bì ........................................................................................................ 51
Hình 3.18. Cấu trúc mô học nhộm H&E của tấm tế bào sụn được đưa lên lần 2 .... 52
Hình 3.19. Kết quả chụp tấm tế bào sụn bằng KHV điện tử quét (SEM). ............... 53
.
.
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng tế bào của TBGTM F3. ................................. 38
Đồ thị 3.2: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện tương đối của gien SOX9, COL2A1,
COL10A1, RUNX2 bằng phương pháp Realtime-PCR. ........................................ 47
.
.
MỞ ĐẦU
Thoái hóa khớp gối là bệnh khá thường gặp. Trên thế giới có khoảng 263 triệu
người mắc bệnh này [42] và khoảng 20 % người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được
chẩn đoán bằng X-Quang trong nghiên cứu Framinham [50]. Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu
hành bệnh thoái hóa khớp gối trên X-quang là 44,60 % ở người trên 40 tuổi [4]. Tuy
nhiên, tỷ lệ thoái hóa khớp gối ở những người trẻ ngày càng gia tăng gây ảnh hưởng
tới khả năng vận động cũng như giảm đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh
[11].
Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng. Trong
những trường hợp tổn thương nặng hoặc điều trị nội khoa không hiệu quả thì phẫu
thuật thay khớp thường được lựa chọn. Phẫu thuật thay khớp gối là một phẫu thuật
lớn nên cũng đối mặt với những vấn đề gồm nhiễm khuẩn, mổ lại, tử vong và việc
thay khớp gối nhân tạo cũng có hạn chế là tuổi thọ của mảnh ghép, đặc biệt trên những
bệnh nhân trẻ tuổi [60], [10]. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để điều trị
nhằm làm chậm, phục hồi và kéo dài thời gian thay khớp tùy vào mức độ tổn thương
bề mặt sụn khớp như tiêm nội khớp, kích thích mọc sụn bằng tạo tổn thương dưới sụn
có hoặc không kết hợp với ghép sụn xương. Trong các chiến lược phục hồi, sửa chữa
tổn thương sụn khớp thì kỹ nghệ mô là một cách tiếp cận hiện đại và có tiềm năng
khắc phục những nhược điểm của các phương pháp điều trị truyền thống.
Kỹ nghệ mô sụn có thể kết hợp một trong ba thành phần quan trọng gồm tế bào,
giá thể và yếu tố sinh học để có thể tái tạo, sửa chữa hoặc tạo ra mô sụn giống với
sụn bình thường để có thể ứng dụng trong ghép sụn [32].
Đối với yếu tố tế bào trong kỹ nghệ mô sụn thì tế bào gốc là một trong những
ứng viên tuyệt vời để sử dụng vì chúng có những đặc điểm mà các tế bào khác không
có đó là khả năng tăng sinh và tiềm năng biệt hóa. Trong số các loại tế bào gốc được
quan tâm thì tế bào gốc trung mô là một trong những loại tế bào được ưu tiên lựa
chọn hàng đầu [23], [32].
.
.
Tế bào gốc trung mô là những tế bào gốc đa tiềm năng, có thể biệt hóa thành
nhiều dòng tế bào khác nhau kể cả tế bào sụn, do đó có thể sử dụng các tế bào gốc
này để tái tạo và thay thế các tế bào sụn bị tổn thương trên người bệnh. Chúng có thể
được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, tủy xương, máu ngoại vi…Đặc
biệt là sự xuất hiện của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ. Đây là nguồn tế bào có nguồn
cung cấp dồi dào, ít bị hạn chế về mặt đạo đức trong nghiên cứu, dễ thu nhận, số
lượng tế bào gốc trung mô trong mô mỡ cao hơn so với thu nhận từ các nguồn mẫu
khác như tủy xương, máu ngoại vi [14], [15]. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế
miễn dịch và chống viêm [23], [32].
Bên cạnh đó, giá thể hay khung nâng đỡ trong kỹ nghệ mô cũng là một trong ba
yếu tố vô cùng quan trọng. Việc lựa chọn giá thể phù hợp sẽ hỗ trợ và tạo điều kiện
cho tế bào tăng sinh, biệt hóa thành mô chức năng và làm tăng khả năng phục hồi tổn
thương sụn [63], [66] cũng như cải thiện lâm sàng [35]. Trong số đó, giá thể collagen
thuộc nhóm giá thể sinh học có nguồn gốc tự nhiên thường được sử dụng trong kỹ
nghệ mô sụn vì khả năng tương thích sinh học cao, khả năng thoái biến sinh học tốt,
gây phản ứng miễn dịch thấp, cấu trúc xốp, tính thấm tốt, giúp tế bào bám dính, di cư
và biệt hóa tế bào [27], [29], [41]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu lựa chọn
màng chân bì làm giá thể để tạo ra mảnh ghép. Màng chân bì (màng collagen có
nguồn gốc thu nhận từ da người) là một loại màng vô bào, để hạn chế thấp nhất khả
năng gây đáp ứng miễn dịch và có đặc điểm cấu tạo phù hợp để mang tế bào và phát
triển thành mảnh ghép [96], [38].
Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu về tiềm năng sử dụng tế bào gốc
trung mô trong điều trị bệnh thoái hóa khớp gối [10], [89], [90]. Kết quả nghiên cứu
cho thấy tiêm trực tiếp tế bào gốc trung mô giúp cải thiện triệu chứng và chất lượng
cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên, các nghiên cứu thử nghiệm đối với những
trường hợp thoái hóa khớp chưa có nhiều, cũng như chưa có nhiều nghiên cứu đánh
giá được sự tái tạo lại bề mặt sụn khớp từ việc ứng dụng tế bào gốc trung mô.
.
.
Với những ý tưởng nêu trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài nghiên cứu: “Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp giữa tế bào gốc trung mô mỡ
thỏ và màng collagen” với mục tiêu là tạo ra được mảnh ghép có đặc điểm tương tự
mô sụn từ tế bào gốc trung mô từ mô mỡ với giá thể màng chân bì trong in vitro.
Mục tiêu cụ thể:
- Phân lập và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ
- Tạo mảnh ghép mô sụn kỹ nghệ từ sự kết hợp tế bào gốc trung mô và giá thể
màng chân bì.
.
.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về mô sụn
Mô sụn và mô xương là 2 mô liên kết chuyên biệt thuộc về bộ xương. Bộ xương
của phôi thai lúc đầu chỉ gồm toàn mô sụn, về sau mới được thế dần bằng mô xương.
Ở người trưởng thành, sụn vẫn còn hiện diện ở tai, mũi, thanh quản, khí - phế quản
(Hình 1.1). Sụn là một loại mô liên kết tham gia vào cấu tạo bộ xương, cấu tạo bởi ba
thành phần là tế bào sụn, chất căn bản sụn và sợi liên kết. Có 3 loại mô sụn: sụn trong,
sụn chun và sụn xơ, tên gọi khác nhau là do sự khác nhau về thành phần sợi liên kết
(Hình 1.2).
Chất căn bản sụn khá phong phú, nhuộm màu base, tương đối mịn. Xung quanh
ổ sụn có vùng chất căn bản nhuộm màu đậm hơn gọi là cầu sụn. Chất căn bản sụn rất
giàu chất hữu cơ (protein, glycosaminoglycan, proteoglycan, lipid). Protein sợi (chủ
yếu là collagen loại II) rất phong phú. Các sợi tạo keo và sợi chun vùi trong chất căn
bản theo nhiều hướng khác nhau.
Mô sụn không có mạch máu do đó việc dinh dưỡng nhờ vào màng sụn. Ở sụn
khớp không có màng sụn nên mô sụn được nuôi dưỡng bởi dịch khớp hoặc từ mô
xương phía dưới sụn. Ở người trưởng thành, tế bào sụn dừng phân chia và số lượng
tế bào tương đối ổn định, chúng bị thoái hóa rất chậm chạp. Trong trường hợp bị hư
khớp, tế bào sụn có thể tăng lên.
Sụn ít thay đổi cấu trúc theo lứa tuổi. Khi già, hàm lượng proteoglycan giảm
nên tính ưa nước cũng giảm. Sụn có hiện tượng ngấm canxi vài nơi nên sụn trở nên
đục, cứng và dòn hơn. Sự tái tạo mô sụn xảy ra chậm chạp, nhờ sự sinh sản của các
tế bào ít biệt hóa của sụn.
Mô sụn là mô có ít tế bào, tế bào chiếm không quá 10 % trọng lượng mô sụn.
Tế bào có kích thước từ 10 – 40 micromet. Kích thước và hình dạng tế bào sụn phụ
thuộc vào mức độ biệt hóa. Tế bào sụn nằm trong hốc nhỏ chứa chất căn bản. Hốc
nhỏ này được gọi là ổ sụn. Ổ sụn có thể chứa một hoặc một số tế bào sụn cùng nhóm.
.
.
Nhân tế bào sụn hình cầu, có một hoặc hai hạch nhân. Bào tương có đủ bào quan và
một số chất vùi glycogen, lipid mà số lượng phụ thuộc vào loại sụn. Mô sụn tươi chứa
khoảng 70 – 80 % nước, 10 – 15 % chất hữu cơ và 4 – 7 % chất khoáng. Mô sụn khô
có lượng sợi collagen chiếm khoảng 50 - 70 % [9].
Hình 1.1. Phân bố sụn trong cơ thể. (a) Sụn ở người trưởng thành có ba loại phân
bố nhiều nơi trong cơ thể như ở khớp, mũi, tai, khí quản và dưới kính hiển vi điện tử
cho thấy một số đặc điểm chính của (b) sụn trong, (c) sụn chun và (b) sụn xơ. Màng
sụn có ở sụn trong và sụn chun [64].
.
.
Hình 1.2. Phân loại sụn. Sụn được phân chia thành 3 loại (sụn trong, sụn chun và
sụn xơ) dựa trên đặc trưng của chất nền. Chất nền của sụn trong đồng nhất và chứa
collagen loại II, chất nền của sụn chun khá giống với sụn trong ngoại trừ chất nền còn
giàu collagen loại elastic sắp xếp thành từng bó dày, sụn xơ không có màng sụn và
chất nền chứa collagen loại I và II [24].
1.2. Quá trình sửa chữa tổn thương sụn
Có thể chia làm hai dạng tổn thương sụn là tổn thương một phần và tổn thương
toàn phần (Hình 1.3) [12]. Tổn thương một phần sụn (partial-thickness defect) được
giới hạn ở lớp sụn, phần xương dưới sụn không bị tổn thương do đó không có sự thâm
nhập của các tế bào gốc từ tủy xương. Khả năng phục hồi tổn thương sụn bị hạn chế.
Những tổn thương này cuối cùng sẽ dẫn tới thoái hóa khớp về già. Đối với tổn thương
sụn toàn phần (full-thickness cartilage defect) thì có sự thâm nhập của các tế bào gốc
từ tủy xương dẫn tới xảy ra một số quá trình lành thương.
.
.
Quá trình lành thương xảy ra mạnh mẽ sau 2 tuần. Các mạch máu ở vùng dưới
sụn mang những tế bào gốc (chủ yếu là tế bào gốc trung mô – TBGTM) vào vùng tổn
thương. Những tế bào này có nhiều tác dụng sinh học trong việc sản xuất ra chất nền
sụn. Sự di trú, tăng sinh, biệt hóa của các TBGTM tại vùng tổn thương khoảng 2 tuần
sau tổn thương. Máu từ vùng dưới sụn tạo nên nút fibrin – chứa các tiểu cầu. Từ đó
chúng có thể tiết các yếu tố sinh học để kích hoạt/tuyển mộ các TBGTM tới để phục
hồi sụn. TBGTM sản xuất ra collagen týp I và II để lấp đầy vùng tổn thương và sau
khoảng 6 – 8 tuần thì vùng tổn thương được lấp đầy. Sau khoảng một năm thì sụn
được sửa chữa bao gồm cả mô sụn trong và sụn xơ.
Sự thiếu tế bào tạo sụn trong tổn thương một phần cũng như xơ hóa sụn trong
tổn thương sụn toàn phần có lẽ dẫn tới thoái hóa khớp ở người bệnh. Do đó, tổn
thương sụn khớp cần phải được điều trị từ rất sớm.
Hình 1.3. Các dạng tổn thương sụn. (A). Tổn thương sụn một phần, phần tổn
thương khu trú ở vùng sụn và không tổn thương tới vùng dưới sụn (B). Tổn thương
sụn toàn phần là tổn thương ở vùng sụn và kéo dài xuống vùng dưới sụn [12].
1.3. Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp
Có nhiều phương pháp đã được áp dụng nhằm phục hồi, sửa chữa tổn thương
sụn. Về cơ bản thì chia làm 2 nhóm là nhóm can thiệp không có thành phần sinh học
và nhóm can thiệp với các thành phần sinh học.
.
.
1.3.1. Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học
Nhóm can thiệp điều trị này không sử dụng các thành phần hay hợp chất sinh
học. Tính hiệu quả của những phương pháp này dựa trên sự kích thích các mô sụn
hoặc mô dưới sụn để tái tạo vùng sụn bị tổn thương. Các kỹ thuật chính trong nhóm
này gồm có rửa khớp (lavage) qua nội soi hiệu quả cho những tình huống tổn thương
sụn do chấn thương, bào sụn (chondral shaving), loại bỏ mô chết/mô viêm trong ổ
khớp (debridement), tạo lỗ nhỏ Pridie (Pridie drilling) và tạo các lỗ nhỏ li ti
(microfracture). Trong các kỹ thuật rửa, bào mòn sụn, cắt bỏ mô thì không có hiệu
quả tái tạo sụn. Còn 2 phương pháp sau có sự kích thích vùng mô dưới sụn với mục
đích tái tạo sụn khớp tuy nhiên chưa thực sự đạt hiệu quả trên lâm sàng và trên mô
hình động vật vì mô tái tạo chủ yếu là sụn xơ.
1.3.2. Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học
1.3.2.1. Ghép sụn đồng loài (allogeneic osteochodral and chondral grafting)
Trong kỹ thuật này sử dụng mô ghép sụn để làm đầy tổn thương sụn khớp không
có kích thích những đáp ứng sửa chữa sụn. Sự thay thế mô bị tổn thương bằng mô
ghép khỏe mạnh được thu nhận từ người hiến. Những bệnh nhân có tổn thương sụn
xương khớp nặng như hoại tử, thoái hóa khớp nặng, tổn thương nặng do chấn thương
sẽ hiệu quả khi sử dụng kỹ thuật này. Tuy nhiên, vấn đề về miễn dịch liên quan tới
kỹ thuật ghép này có thể dẫn tới thải ghép hoàn toàn mô ghép. Ngoài ra, khả năng
sống của mô ghép sụn sẽ lâu hơn sau khi được trải qua một quy trình xử lý, bảo quản
và đông khô. Tỷ lệ thành công được báo cáo là 65 – 85 % sau khi theo dõi 10 năm
[20], [58], [60], [88], 65 % sau 15 năm và 46 % sau 20 năm [78]. Tuy nhiên, giới hạn
của phương pháp này là sự khan hiếm nguồn mô hiến và nguy cơ của một số bệnh
truyền nhiễm. Để khắc phục những nhược điểm này có thể áp dụng phương pháp
ghép mô sụn tự thân.
1.3.2.2. Ghép sụn tự thân (autologous chondrocyte implementation – ACI)
Phương pháp ghép sụn tự thân (hay còn gọi là ACI phiên bản 1) được mô tả
ngắn gọn ở trong (Hình 1.4) [21]. Kỹ thuật này giúp khắc phục được những hạn chế
khi ghép sụn đồng loài là có sẵn mô ghép và không gây ra các đáp ứng miễn dịch
.
.
ghép. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế là gây ra tổn thương mới cho
bệnh nhân, chất lượng nuôi cấy và biệt hóa cũng như sự phì đại hay xương hóa của
miếng vá màng xương ở vị trí ghép. ACI phiên bản 2 thì màng xương được thay thế
bằng màng chứa collagen týp I/III. Phương pháp cải tiến hiện nay (ACI phiên bản thứ
3) sử dụng màng hoặc giá thể đã được nuôi cấy sẵn tế bào sụn từ trước, sau đó mới
tiến hành ghép mảnh ghép cho người bệnh. Phương pháp này cũng được biết đến với
tên khác là ACI kết hợp với màng ghép (membrane-associated ACI – MACI). Hiệu
quả của phương pháp điều trị này có kết quả khá tốt đối với người bệnh trẻ [68].
Hình 1.4. Lược đồ phương pháp ACI. Thu nhận mô sụn lành ở vùng sụn không tỳ
đè (vùng trên của lồi cầu trong xương đùi), nuôi cấy tăng sinh số lượng tế bào khoảng
10-21 ngày. Sau đó thực hiện mổ để đưa các tế bào sụn đã nuôi cấy vào vùng sụn tổn
thương và được che phủ bằng màng xương (thu nhận từ màng xương ở xương chày)
[21].
1.3.2.3. Chiến lược ứng dụng kỹ nghệ mô trong điều trị tổn thương sụn
Nhu cầu đặt ra đối với kỹ nghệ mô sụn trở nên cần thiết khi các phương pháp
điều trị truyền thống chưa hiệu quả triệt để và nhiều bệnh nhân phải chịu sự đau đớn
.
0.
do tổn thương sụn khớp gây ra. Tỷ lệ mắc bệnh viêm xương khớp cho thấy tăng theo
tuổi. Thoái hóa khớp gối có triệu chứng xảy ra trong 10 - 38 % ở người lớn tuổi.
Trong số những người chơi bóng đá là khoảng 19 – 29 %, vận động viên điền kinh là
14 - 21 % và những người nâng tạ là 31 % [83].
Kỹ nghệ mô sụn là một công nghệ sử dụng những tế bào qua nuôi cấy, giá thể
phù hợp và các phân tử sinh học như các yếu tố tăng trưởng để nuôi và kích thích
mảnh ghép mô sụn kỹ nghệ để phát triển tối ưu nhằm tạo thành mảnh ghép điều trị
cho các tổn thương mô sụn. Đây có thể được xem như là chiến lược điều trị mang
tính cá thể hóa cho từng bệnh nhân theo xu hướng điều trị bệnh của quốc tế hiện nay.
1.4. Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn
1.4.1. Tổng quan về kỹ nghệ mô và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn
Kỹ nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành với sự kết hợp kiến thức và công nghệ
của những lĩnh vực khác nhau như sinh học, hóa học, kỹ thuật, y học, dược và khoa
học vật liệu để phát triển các liệu pháp và sản phẩm cho mục đích sửa chữa hoặc thay
thế những mô và cơ quan bị tổn thương [23]. Kỹ nghệ mô trong vài thập kỷ gần đây
có nhiều bước tiến về vật liệu sinh học mới, công nghệ in sinh học 3D, ứng dụng công
nghệ nano, các công nghệ về tế bào gốc như tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) và
công nghệ chỉnh sửa gien như CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) [23], [34], [44] (Hình 1.5).
Điều trị những tổn thương sụn khớp lớn (> 4,0 - 4,5 cm2) [61], [59] thì với các
phương pháp tái tạo sụn như ACI/MACI hoặc microfracture thì không có khả năng
tái tạo được phần sụn trong (hyaline) và kết quả điều trị thường không kéo dài, thường
dẫn đến phải phẫu thuật thay sụn nhân tạo. Do đó, đặt ra vấn đề là cần phương pháp
khác có khả năng tái tạo được mô sụn và kéo dài hiệu quả điều trị.
Với sự phát triển ngày nay thì kỹ nghệ mô sụn là một hướng tiếp cận hiện đại
và có nhiều tiềm năng để điều trị tổn thương sụn khớp. Các chiến lược kỹ nghệ mô
trong sửa chữa mô sụn bao gồm việc sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp các thành phần
sau [32]:
.
1.
(i) Các tế bào có khả năng tái tạo ra chất nền chức năng;
(ii) Giá thể phù hợp để cấy ghép và hỗ trợ mang tế bào ghép;
(iii) Các thành phần sinh học như các cytokine và các yếu tố tăng trưởng để
hỗ trợ tạo ra mô mong muốn (Hình 1.6).
Một số loại tế bào đã được sử dụng trong kỹ nghệ mô sụn là tế bào sụn và tế
bào gốc. Đối với việc sử dụng tế bào sụn được thu nhận từ sụn hyaline hoặc vùng sụn
khớp dù là tự thân hay từ người hiến thì vấn đề chính gặp phải khi sử dụng đó là bị
giới hạn về số lượng tế bào có sẵn, không ổn định trong nuôi cấy in vitro và hạn chế
trong khả năng sửa chữa và tái tạo mô [26], [32]. Do đó, tế bào gốc trở nên đầy hứa
hẹn với các đặc tính vốn có của nó là tăng sinh nhanh, khả năng tự làm mới, khả năng
biệt hóa và khả năng sửa chữa và tái tạo mô [82], [32], [59]. Nếu dựa vào tiềm năng
biệt hóa thì tế bào gốc có thể được chia làm tế bào gốc toàn năng, tế bào gốc vạn năng
và tế bào gốc đa năng. Ngoài ra, chúng ta có thể phân chia tế bào gốc theo nguồn gốc
gồm tế bào gốc ở người trưởng thành (adult stem cells), tế bào gốc vạn năng cảm ứng
(induced pluripotent stem cells), tế bào gốc phôi (embryonic stem cells), tế bào gốc
thai (fetus-derived stem cells).
Với mỗi loại tế bào gốc có những ưu và nhược điểm khác nhau (Hình 1.7).
Trong đó, tế bào gốc ở người trưởng thành mà đặc biệt là tế bào gốc trung mô
(TBGTM) có một số ưu điểm khi lựa chọn để thử nghiệm lâm sàng như tránh được
nhiều vấn đề về y đức, dễ dàng thu nhận với số lượng lớn, ít nguy cơ gây ra ung thư
hơn so với các loại tế bào khác, có khả năng giúp mô ghép tránh được thải loại miễn
dịch cấp qua việc tác động vào cơ chế miễn dịch mà cụ thể là tiết ra các cytokine
kháng viêm như yếu tố tăng trưởng chuyển dạng 1 (transforming growth factor-1),
nitric oxide và interleukin-10 (IL-10) [23], [32].
Tế bào gốc trung mô ở người trưởng thành có thể thu được từ nhiều nguồn mô
khác nhau như trong tủy xương, mô mỡ, máu ngoại vi … Trong kỹ nghệ mô sụn thì
TBGTM từ mỡ là hướng lựa chọn phù hợp vì có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn
mô khác và thuận tiện khi thu nhận, đặc tính kháng viêm và điều hòa miễn dịch, khả
năng tăng sinh và biệt hóa ít bị ảnh hưởng bởi tuổi [61], [32], [59].
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP
GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ
VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
TẠO TẤM TẾ BÀO SỤN TỪ SỰ KẾT HỢP
GIỮA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ MỠ THỎ
VÀ MÀNG CHÂN BÌ DA NGƯỜI
NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI)
MÃ SỐ: 8720101
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. HUỲNH DUY THẢO
2. TS. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2021
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự hướng dẫn
khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc Vương. Các nội dung
nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.
Những số liệu trong bảng biểu, đồ thị, hình ảnh phục vụ cho việc phân tích,
nhận xét, đánh giá được chính nhóm nghiên cứu của chúng tôi thu thập từ các nguồn
khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử
dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức
khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về
nội dung luận văn của mình.
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021
NGUYỄN XUÂN HOÀNG
.
.
MỤC LỤC
Trang
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục đồ thị
MỞ ĐẦU ................................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................ 4
1.1 Tổng quan về mô sụn........................................................................................................ 4
1.2 Quá trình sửa chữa tổn thương sụn ................................................................................ 6
1.3 Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp ................. 7
1.3.1 Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học ................................ 8
1.3.2 Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học ............................................. 8
1.4 Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn........................................................... 10
1.4.1 Tổng quan và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn.......................... 10
1.4.2 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ ........................................................................ 15
1.4.3 Giá thể màng chân bì .......................................................................................... 22
1.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................................................ 23
1.6 Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................................. 24
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27
2.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................... 27
2.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu...................................................................................................... 27
2.3 Thiết kế nghiên cứu ........................................................................................................ 27
2.4 Y đức.................................................................................................................................. 27
2.5 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................... 27
2.5.1 Phân lập và định danh TBGTM từ mô mỡ thỏ.............................................. 27
2.5.2 Tạo tấm tế bào sụn từ TBGTM và giá thể màng chân bì da người ........... 33
2.5.3 Đánh giá tấm tế bào sụn..................................................................................... 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .......................................................................... 35
.
.
3.1 Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ ................................................................... 35
3.1.1 Kết quả phân lập, nuôi cấy tăng sinh TBGTM từ mô mỡ ........................... 35
3.1.2 Đánh giá sự tăng sinh của TBGTM từ mỡ ..................................................... 37
3.2 Kết quả định danh TBGTM từ mỡ............................................................................... 38
3.2.1 Khảo sát hình thái học và đặc tính bám dính ................................................. 38
3.2.2 Khảo sát khả năng biệt hóa ............................................................................... 40
3.2.3 Khảo sát biểu hiện gien bằng phương pháp PCR ......................................... 42
3.2.4 Khảo sát biểu hiện gien cho các marker đặc trưng sụn bằng qRT-PCR. . 46
3.3 Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp TBGTM từ mô mỡ thỏ với màng chân bì ...... 49
3.3.1 Kết quả đánh giá mô học ................................................................................... 50
3.3.2 Kết quả chụp SEM .............................................................................................. 52
KẾT LUẬN............................................................................................................................. 54
KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................55
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ Viết Tắt Tiếng Anh
ACI Autologous Chodrocyte Implementation
ADSC Adipose Derived Stem Cell
CS Cộng sự
DMEM/F12 Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12
EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid
FBS Fetal Bovine Serum
H&E Hematocylin & Eosin
iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells
ISCT International Society for Cellular Therapy
KHV Kính hiển vi
MACI Membrane-asociated ACI
PBS Phophate-Buffered Saline
Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain
qRT-PCR
Reaction
RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction
SEM Scanning Electron Microscopy
TBGTM Tế Bào Gốc Trung Mô
TEM Transmission Electron Microscopy
TGF-1 Transforming growth factor-1
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tiêu chuẩn định danh TBGTM ............................................................. 21
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR .............................................................. 31
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR ......................................................... 31
Bảng 2.4. Thành phầ khuếch đại các gien tạo sụn ................................................. .32
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt phản ứng qRT-PCR ....................................................... 32
Bảng 3.6. Mật độ tế bào thu nhận theo thời gian .................................................... 37
Bảng 3.7. So sánh các marker bề mặt giữa người và thỏ bằng Flow cytometry giữa
các nghiên cứu ...................................................................................................... 43
Bảng 3.8. So sánh các marker bề mặt bằng phương pháp RT-PCR giữa các nghiên
cứu ........................................................................................................................ 45
Bảng 3.9. Bảng số liệu mức độ biểu hiện gien theo thời gian ................................. 46
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Phân bố sụn trong cơ thể ......................................................................... 5
Hình 1.2. Phân loại mô sụn .. ................................................................................... 6
Hình 1.3. Các dạng tổn thương sụn ......................................................................... 7
Hình 1.4 Lược đồ phương pháp ACI ....................................................................... 9
Hình 1.5. Những tiến bộ trong kỹ nghệ mô ............................................................ 12
Hình 1.6. Các thành phần chính của kỹ nghệ mô trong sửa chữa sụn .................... 13
Hình 1.7. Các nguồn tế bào gốc, nguồn thu nhận và đặc điểm của chúng .............. 14
Hình 1.8. Khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô ........................................... 16
Hình 1.9. Quy trình phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mỡ ..................................... 18
Hình 2.10. Xử lý mẫu mô mỡ để thu nhận TBGTM ............................................... 28
Hình 2.11. Một số loại môi trường được sử dụng để cảm ứng biệt hóa TBGTM thành
nguyên bào xương, nguyên bào sụn và tế bào mỡ .................................................. 29
Hình 3.12. Phân lập và nuôi cấy TBGTM từ mô mỡ .. ........................................... 36
Hình 3.13. Kết quả quan sát hình thái và đặc tính bám dính của TBGTM từ mô mỡ
dưới KHV đảo ngược 10X..................................................................................... 39
Hình 3.14. Kết quả đánh giá khả năng biệt hóa của TBGTM.. ............................... 41
Hình 3.15. Kết quả RT-PCR của các marker TBGTM ........................................... 43
Hình 3.16. Cấu trúc mô học nhuộm H&E và Safranin O của tấm tế bào sụn. ......... 50
Hình 3.17. Kết quả nhuộm mô học tấm tế bào sụn từ sự kết hợp của TBGTM mỡ và
màng chân bì ........................................................................................................ 51
Hình 3.18. Cấu trúc mô học nhộm H&E của tấm tế bào sụn được đưa lên lần 2 .... 52
Hình 3.19. Kết quả chụp tấm tế bào sụn bằng KHV điện tử quét (SEM). ............... 53
.
.
DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng tế bào của TBGTM F3. ................................. 38
Đồ thị 3.2: Biểu đồ thể hiện mức độ biểu hiện tương đối của gien SOX9, COL2A1,
COL10A1, RUNX2 bằng phương pháp Realtime-PCR. ........................................ 47
.
.
MỞ ĐẦU
Thoái hóa khớp gối là bệnh khá thường gặp. Trên thế giới có khoảng 263 triệu
người mắc bệnh này [42] và khoảng 20 % người trưởng thành từ 45 tuổi ở Mỹ được
chẩn đoán bằng X-Quang trong nghiên cứu Framinham [50]. Tại Việt Nam, tỷ lệ lưu
hành bệnh thoái hóa khớp gối trên X-quang là 44,60 % ở người trên 40 tuổi [4]. Tuy
nhiên, tỷ lệ thoái hóa khớp gối ở những người trẻ ngày càng gia tăng gây ảnh hưởng
tới khả năng vận động cũng như giảm đáng kể chất lượng cuộc sống của người bệnh
[11].
Các phương pháp điều trị bệnh hiện nay chủ yếu là điều trị triệu chứng. Trong
những trường hợp tổn thương nặng hoặc điều trị nội khoa không hiệu quả thì phẫu
thuật thay khớp thường được lựa chọn. Phẫu thuật thay khớp gối là một phẫu thuật
lớn nên cũng đối mặt với những vấn đề gồm nhiễm khuẩn, mổ lại, tử vong và việc
thay khớp gối nhân tạo cũng có hạn chế là tuổi thọ của mảnh ghép, đặc biệt trên những
bệnh nhân trẻ tuổi [60], [10]. Hiện nay có nhiều phương pháp khác nhau để điều trị
nhằm làm chậm, phục hồi và kéo dài thời gian thay khớp tùy vào mức độ tổn thương
bề mặt sụn khớp như tiêm nội khớp, kích thích mọc sụn bằng tạo tổn thương dưới sụn
có hoặc không kết hợp với ghép sụn xương. Trong các chiến lược phục hồi, sửa chữa
tổn thương sụn khớp thì kỹ nghệ mô là một cách tiếp cận hiện đại và có tiềm năng
khắc phục những nhược điểm của các phương pháp điều trị truyền thống.
Kỹ nghệ mô sụn có thể kết hợp một trong ba thành phần quan trọng gồm tế bào,
giá thể và yếu tố sinh học để có thể tái tạo, sửa chữa hoặc tạo ra mô sụn giống với
sụn bình thường để có thể ứng dụng trong ghép sụn [32].
Đối với yếu tố tế bào trong kỹ nghệ mô sụn thì tế bào gốc là một trong những
ứng viên tuyệt vời để sử dụng vì chúng có những đặc điểm mà các tế bào khác không
có đó là khả năng tăng sinh và tiềm năng biệt hóa. Trong số các loại tế bào gốc được
quan tâm thì tế bào gốc trung mô là một trong những loại tế bào được ưu tiên lựa
chọn hàng đầu [23], [32].
.
.
Tế bào gốc trung mô là những tế bào gốc đa tiềm năng, có thể biệt hóa thành
nhiều dòng tế bào khác nhau kể cả tế bào sụn, do đó có thể sử dụng các tế bào gốc
này để tái tạo và thay thế các tế bào sụn bị tổn thương trên người bệnh. Chúng có thể
được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như mô mỡ, tủy xương, máu ngoại vi…Đặc
biệt là sự xuất hiện của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ. Đây là nguồn tế bào có nguồn
cung cấp dồi dào, ít bị hạn chế về mặt đạo đức trong nghiên cứu, dễ thu nhận, số
lượng tế bào gốc trung mô trong mô mỡ cao hơn so với thu nhận từ các nguồn mẫu
khác như tủy xương, máu ngoại vi [14], [15]. Ngoài ra chúng còn có khả năng ức chế
miễn dịch và chống viêm [23], [32].
Bên cạnh đó, giá thể hay khung nâng đỡ trong kỹ nghệ mô cũng là một trong ba
yếu tố vô cùng quan trọng. Việc lựa chọn giá thể phù hợp sẽ hỗ trợ và tạo điều kiện
cho tế bào tăng sinh, biệt hóa thành mô chức năng và làm tăng khả năng phục hồi tổn
thương sụn [63], [66] cũng như cải thiện lâm sàng [35]. Trong số đó, giá thể collagen
thuộc nhóm giá thể sinh học có nguồn gốc tự nhiên thường được sử dụng trong kỹ
nghệ mô sụn vì khả năng tương thích sinh học cao, khả năng thoái biến sinh học tốt,
gây phản ứng miễn dịch thấp, cấu trúc xốp, tính thấm tốt, giúp tế bào bám dính, di cư
và biệt hóa tế bào [27], [29], [41]. Trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu lựa chọn
màng chân bì làm giá thể để tạo ra mảnh ghép. Màng chân bì (màng collagen có
nguồn gốc thu nhận từ da người) là một loại màng vô bào, để hạn chế thấp nhất khả
năng gây đáp ứng miễn dịch và có đặc điểm cấu tạo phù hợp để mang tế bào và phát
triển thành mảnh ghép [96], [38].
Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu ban đầu về tiềm năng sử dụng tế bào gốc
trung mô trong điều trị bệnh thoái hóa khớp gối [10], [89], [90]. Kết quả nghiên cứu
cho thấy tiêm trực tiếp tế bào gốc trung mô giúp cải thiện triệu chứng và chất lượng
cuộc sống cho bệnh nhân. Tuy nhiên, các nghiên cứu thử nghiệm đối với những
trường hợp thoái hóa khớp chưa có nhiều, cũng như chưa có nhiều nghiên cứu đánh
giá được sự tái tạo lại bề mặt sụn khớp từ việc ứng dụng tế bào gốc trung mô.
.
.
Với những ý tưởng nêu trên, nhóm nghiên cứu chúng tôi tiến hành thực hiện đề
tài nghiên cứu: “Tạo tấm tế bào sụn từ sự kết hợp giữa tế bào gốc trung mô mỡ
thỏ và màng collagen” với mục tiêu là tạo ra được mảnh ghép có đặc điểm tương tự
mô sụn từ tế bào gốc trung mô từ mô mỡ với giá thể màng chân bì trong in vitro.
Mục tiêu cụ thể:
- Phân lập và định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thỏ
- Tạo mảnh ghép mô sụn kỹ nghệ từ sự kết hợp tế bào gốc trung mô và giá thể
màng chân bì.
.
.
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về mô sụn
Mô sụn và mô xương là 2 mô liên kết chuyên biệt thuộc về bộ xương. Bộ xương
của phôi thai lúc đầu chỉ gồm toàn mô sụn, về sau mới được thế dần bằng mô xương.
Ở người trưởng thành, sụn vẫn còn hiện diện ở tai, mũi, thanh quản, khí - phế quản
(Hình 1.1). Sụn là một loại mô liên kết tham gia vào cấu tạo bộ xương, cấu tạo bởi ba
thành phần là tế bào sụn, chất căn bản sụn và sợi liên kết. Có 3 loại mô sụn: sụn trong,
sụn chun và sụn xơ, tên gọi khác nhau là do sự khác nhau về thành phần sợi liên kết
(Hình 1.2).
Chất căn bản sụn khá phong phú, nhuộm màu base, tương đối mịn. Xung quanh
ổ sụn có vùng chất căn bản nhuộm màu đậm hơn gọi là cầu sụn. Chất căn bản sụn rất
giàu chất hữu cơ (protein, glycosaminoglycan, proteoglycan, lipid). Protein sợi (chủ
yếu là collagen loại II) rất phong phú. Các sợi tạo keo và sợi chun vùi trong chất căn
bản theo nhiều hướng khác nhau.
Mô sụn không có mạch máu do đó việc dinh dưỡng nhờ vào màng sụn. Ở sụn
khớp không có màng sụn nên mô sụn được nuôi dưỡng bởi dịch khớp hoặc từ mô
xương phía dưới sụn. Ở người trưởng thành, tế bào sụn dừng phân chia và số lượng
tế bào tương đối ổn định, chúng bị thoái hóa rất chậm chạp. Trong trường hợp bị hư
khớp, tế bào sụn có thể tăng lên.
Sụn ít thay đổi cấu trúc theo lứa tuổi. Khi già, hàm lượng proteoglycan giảm
nên tính ưa nước cũng giảm. Sụn có hiện tượng ngấm canxi vài nơi nên sụn trở nên
đục, cứng và dòn hơn. Sự tái tạo mô sụn xảy ra chậm chạp, nhờ sự sinh sản của các
tế bào ít biệt hóa của sụn.
Mô sụn là mô có ít tế bào, tế bào chiếm không quá 10 % trọng lượng mô sụn.
Tế bào có kích thước từ 10 – 40 micromet. Kích thước và hình dạng tế bào sụn phụ
thuộc vào mức độ biệt hóa. Tế bào sụn nằm trong hốc nhỏ chứa chất căn bản. Hốc
nhỏ này được gọi là ổ sụn. Ổ sụn có thể chứa một hoặc một số tế bào sụn cùng nhóm.
.
.
Nhân tế bào sụn hình cầu, có một hoặc hai hạch nhân. Bào tương có đủ bào quan và
một số chất vùi glycogen, lipid mà số lượng phụ thuộc vào loại sụn. Mô sụn tươi chứa
khoảng 70 – 80 % nước, 10 – 15 % chất hữu cơ và 4 – 7 % chất khoáng. Mô sụn khô
có lượng sợi collagen chiếm khoảng 50 - 70 % [9].
Hình 1.1. Phân bố sụn trong cơ thể. (a) Sụn ở người trưởng thành có ba loại phân
bố nhiều nơi trong cơ thể như ở khớp, mũi, tai, khí quản và dưới kính hiển vi điện tử
cho thấy một số đặc điểm chính của (b) sụn trong, (c) sụn chun và (b) sụn xơ. Màng
sụn có ở sụn trong và sụn chun [64].
.
.
Hình 1.2. Phân loại sụn. Sụn được phân chia thành 3 loại (sụn trong, sụn chun và
sụn xơ) dựa trên đặc trưng của chất nền. Chất nền của sụn trong đồng nhất và chứa
collagen loại II, chất nền của sụn chun khá giống với sụn trong ngoại trừ chất nền còn
giàu collagen loại elastic sắp xếp thành từng bó dày, sụn xơ không có màng sụn và
chất nền chứa collagen loại I và II [24].
1.2. Quá trình sửa chữa tổn thương sụn
Có thể chia làm hai dạng tổn thương sụn là tổn thương một phần và tổn thương
toàn phần (Hình 1.3) [12]. Tổn thương một phần sụn (partial-thickness defect) được
giới hạn ở lớp sụn, phần xương dưới sụn không bị tổn thương do đó không có sự thâm
nhập của các tế bào gốc từ tủy xương. Khả năng phục hồi tổn thương sụn bị hạn chế.
Những tổn thương này cuối cùng sẽ dẫn tới thoái hóa khớp về già. Đối với tổn thương
sụn toàn phần (full-thickness cartilage defect) thì có sự thâm nhập của các tế bào gốc
từ tủy xương dẫn tới xảy ra một số quá trình lành thương.
.
.
Quá trình lành thương xảy ra mạnh mẽ sau 2 tuần. Các mạch máu ở vùng dưới
sụn mang những tế bào gốc (chủ yếu là tế bào gốc trung mô – TBGTM) vào vùng tổn
thương. Những tế bào này có nhiều tác dụng sinh học trong việc sản xuất ra chất nền
sụn. Sự di trú, tăng sinh, biệt hóa của các TBGTM tại vùng tổn thương khoảng 2 tuần
sau tổn thương. Máu từ vùng dưới sụn tạo nên nút fibrin – chứa các tiểu cầu. Từ đó
chúng có thể tiết các yếu tố sinh học để kích hoạt/tuyển mộ các TBGTM tới để phục
hồi sụn. TBGTM sản xuất ra collagen týp I và II để lấp đầy vùng tổn thương và sau
khoảng 6 – 8 tuần thì vùng tổn thương được lấp đầy. Sau khoảng một năm thì sụn
được sửa chữa bao gồm cả mô sụn trong và sụn xơ.
Sự thiếu tế bào tạo sụn trong tổn thương một phần cũng như xơ hóa sụn trong
tổn thương sụn toàn phần có lẽ dẫn tới thoái hóa khớp ở người bệnh. Do đó, tổn
thương sụn khớp cần phải được điều trị từ rất sớm.
Hình 1.3. Các dạng tổn thương sụn. (A). Tổn thương sụn một phần, phần tổn
thương khu trú ở vùng sụn và không tổn thương tới vùng dưới sụn (B). Tổn thương
sụn toàn phần là tổn thương ở vùng sụn và kéo dài xuống vùng dưới sụn [12].
1.3. Các chiến lược điều trị trong phục hồi, sửa chữa tổn thương sụn khớp
Có nhiều phương pháp đã được áp dụng nhằm phục hồi, sửa chữa tổn thương
sụn. Về cơ bản thì chia làm 2 nhóm là nhóm can thiệp không có thành phần sinh học
và nhóm can thiệp với các thành phần sinh học.
.
.
1.3.1. Nhóm can thiệp điều trị không có thành phần sinh học
Nhóm can thiệp điều trị này không sử dụng các thành phần hay hợp chất sinh
học. Tính hiệu quả của những phương pháp này dựa trên sự kích thích các mô sụn
hoặc mô dưới sụn để tái tạo vùng sụn bị tổn thương. Các kỹ thuật chính trong nhóm
này gồm có rửa khớp (lavage) qua nội soi hiệu quả cho những tình huống tổn thương
sụn do chấn thương, bào sụn (chondral shaving), loại bỏ mô chết/mô viêm trong ổ
khớp (debridement), tạo lỗ nhỏ Pridie (Pridie drilling) và tạo các lỗ nhỏ li ti
(microfracture). Trong các kỹ thuật rửa, bào mòn sụn, cắt bỏ mô thì không có hiệu
quả tái tạo sụn. Còn 2 phương pháp sau có sự kích thích vùng mô dưới sụn với mục
đích tái tạo sụn khớp tuy nhiên chưa thực sự đạt hiệu quả trên lâm sàng và trên mô
hình động vật vì mô tái tạo chủ yếu là sụn xơ.
1.3.2. Nhóm can thiệp điều trị có thành phần sinh học
1.3.2.1. Ghép sụn đồng loài (allogeneic osteochodral and chondral grafting)
Trong kỹ thuật này sử dụng mô ghép sụn để làm đầy tổn thương sụn khớp không
có kích thích những đáp ứng sửa chữa sụn. Sự thay thế mô bị tổn thương bằng mô
ghép khỏe mạnh được thu nhận từ người hiến. Những bệnh nhân có tổn thương sụn
xương khớp nặng như hoại tử, thoái hóa khớp nặng, tổn thương nặng do chấn thương
sẽ hiệu quả khi sử dụng kỹ thuật này. Tuy nhiên, vấn đề về miễn dịch liên quan tới
kỹ thuật ghép này có thể dẫn tới thải ghép hoàn toàn mô ghép. Ngoài ra, khả năng
sống của mô ghép sụn sẽ lâu hơn sau khi được trải qua một quy trình xử lý, bảo quản
và đông khô. Tỷ lệ thành công được báo cáo là 65 – 85 % sau khi theo dõi 10 năm
[20], [58], [60], [88], 65 % sau 15 năm và 46 % sau 20 năm [78]. Tuy nhiên, giới hạn
của phương pháp này là sự khan hiếm nguồn mô hiến và nguy cơ của một số bệnh
truyền nhiễm. Để khắc phục những nhược điểm này có thể áp dụng phương pháp
ghép mô sụn tự thân.
1.3.2.2. Ghép sụn tự thân (autologous chondrocyte implementation – ACI)
Phương pháp ghép sụn tự thân (hay còn gọi là ACI phiên bản 1) được mô tả
ngắn gọn ở trong (Hình 1.4) [21]. Kỹ thuật này giúp khắc phục được những hạn chế
khi ghép sụn đồng loài là có sẵn mô ghép và không gây ra các đáp ứng miễn dịch
.
.
ghép. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có hạn chế là gây ra tổn thương mới cho
bệnh nhân, chất lượng nuôi cấy và biệt hóa cũng như sự phì đại hay xương hóa của
miếng vá màng xương ở vị trí ghép. ACI phiên bản 2 thì màng xương được thay thế
bằng màng chứa collagen týp I/III. Phương pháp cải tiến hiện nay (ACI phiên bản thứ
3) sử dụng màng hoặc giá thể đã được nuôi cấy sẵn tế bào sụn từ trước, sau đó mới
tiến hành ghép mảnh ghép cho người bệnh. Phương pháp này cũng được biết đến với
tên khác là ACI kết hợp với màng ghép (membrane-associated ACI – MACI). Hiệu
quả của phương pháp điều trị này có kết quả khá tốt đối với người bệnh trẻ [68].
Hình 1.4. Lược đồ phương pháp ACI. Thu nhận mô sụn lành ở vùng sụn không tỳ
đè (vùng trên của lồi cầu trong xương đùi), nuôi cấy tăng sinh số lượng tế bào khoảng
10-21 ngày. Sau đó thực hiện mổ để đưa các tế bào sụn đã nuôi cấy vào vùng sụn tổn
thương và được che phủ bằng màng xương (thu nhận từ màng xương ở xương chày)
[21].
1.3.2.3. Chiến lược ứng dụng kỹ nghệ mô trong điều trị tổn thương sụn
Nhu cầu đặt ra đối với kỹ nghệ mô sụn trở nên cần thiết khi các phương pháp
điều trị truyền thống chưa hiệu quả triệt để và nhiều bệnh nhân phải chịu sự đau đớn
.
0.
do tổn thương sụn khớp gây ra. Tỷ lệ mắc bệnh viêm xương khớp cho thấy tăng theo
tuổi. Thoái hóa khớp gối có triệu chứng xảy ra trong 10 - 38 % ở người lớn tuổi.
Trong số những người chơi bóng đá là khoảng 19 – 29 %, vận động viên điền kinh là
14 - 21 % và những người nâng tạ là 31 % [83].
Kỹ nghệ mô sụn là một công nghệ sử dụng những tế bào qua nuôi cấy, giá thể
phù hợp và các phân tử sinh học như các yếu tố tăng trưởng để nuôi và kích thích
mảnh ghép mô sụn kỹ nghệ để phát triển tối ưu nhằm tạo thành mảnh ghép điều trị
cho các tổn thương mô sụn. Đây có thể được xem như là chiến lược điều trị mang
tính cá thể hóa cho từng bệnh nhân theo xu hướng điều trị bệnh của quốc tế hiện nay.
1.4. Kỹ nghệ mô trong sửa chữa và tái tạo mô sụn
1.4.1. Tổng quan về kỹ nghệ mô và ứng dụng kỹ nghệ mô trong tái tạo mô sụn
Kỹ nghệ mô là một lĩnh vực đa ngành với sự kết hợp kiến thức và công nghệ
của những lĩnh vực khác nhau như sinh học, hóa học, kỹ thuật, y học, dược và khoa
học vật liệu để phát triển các liệu pháp và sản phẩm cho mục đích sửa chữa hoặc thay
thế những mô và cơ quan bị tổn thương [23]. Kỹ nghệ mô trong vài thập kỷ gần đây
có nhiều bước tiến về vật liệu sinh học mới, công nghệ in sinh học 3D, ứng dụng công
nghệ nano, các công nghệ về tế bào gốc như tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) và
công nghệ chỉnh sửa gien như CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats) [23], [34], [44] (Hình 1.5).
Điều trị những tổn thương sụn khớp lớn (> 4,0 - 4,5 cm2) [61], [59] thì với các
phương pháp tái tạo sụn như ACI/MACI hoặc microfracture thì không có khả năng
tái tạo được phần sụn trong (hyaline) và kết quả điều trị thường không kéo dài, thường
dẫn đến phải phẫu thuật thay sụn nhân tạo. Do đó, đặt ra vấn đề là cần phương pháp
khác có khả năng tái tạo được mô sụn và kéo dài hiệu quả điều trị.
Với sự phát triển ngày nay thì kỹ nghệ mô sụn là một hướng tiếp cận hiện đại
và có nhiều tiềm năng để điều trị tổn thương sụn khớp. Các chiến lược kỹ nghệ mô
trong sửa chữa mô sụn bao gồm việc sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp các thành phần
sau [32]:
.
1.
(i) Các tế bào có khả năng tái tạo ra chất nền chức năng;
(ii) Giá thể phù hợp để cấy ghép và hỗ trợ mang tế bào ghép;
(iii) Các thành phần sinh học như các cytokine và các yếu tố tăng trưởng để
hỗ trợ tạo ra mô mong muốn (Hình 1.6).
Một số loại tế bào đã được sử dụng trong kỹ nghệ mô sụn là tế bào sụn và tế
bào gốc. Đối với việc sử dụng tế bào sụn được thu nhận từ sụn hyaline hoặc vùng sụn
khớp dù là tự thân hay từ người hiến thì vấn đề chính gặp phải khi sử dụng đó là bị
giới hạn về số lượng tế bào có sẵn, không ổn định trong nuôi cấy in vitro và hạn chế
trong khả năng sửa chữa và tái tạo mô [26], [32]. Do đó, tế bào gốc trở nên đầy hứa
hẹn với các đặc tính vốn có của nó là tăng sinh nhanh, khả năng tự làm mới, khả năng
biệt hóa và khả năng sửa chữa và tái tạo mô [82], [32], [59]. Nếu dựa vào tiềm năng
biệt hóa thì tế bào gốc có thể được chia làm tế bào gốc toàn năng, tế bào gốc vạn năng
và tế bào gốc đa năng. Ngoài ra, chúng ta có thể phân chia tế bào gốc theo nguồn gốc
gồm tế bào gốc ở người trưởng thành (adult stem cells), tế bào gốc vạn năng cảm ứng
(induced pluripotent stem cells), tế bào gốc phôi (embryonic stem cells), tế bào gốc
thai (fetus-derived stem cells).
Với mỗi loại tế bào gốc có những ưu và nhược điểm khác nhau (Hình 1.7).
Trong đó, tế bào gốc ở người trưởng thành mà đặc biệt là tế bào gốc trung mô
(TBGTM) có một số ưu điểm khi lựa chọn để thử nghiệm lâm sàng như tránh được
nhiều vấn đề về y đức, dễ dàng thu nhận với số lượng lớn, ít nguy cơ gây ra ung thư
hơn so với các loại tế bào khác, có khả năng giúp mô ghép tránh được thải loại miễn
dịch cấp qua việc tác động vào cơ chế miễn dịch mà cụ thể là tiết ra các cytokine
kháng viêm như yếu tố tăng trưởng chuyển dạng 1 (transforming growth factor-1),
nitric oxide và interleukin-10 (IL-10) [23], [32].
Tế bào gốc trung mô ở người trưởng thành có thể thu được từ nhiều nguồn mô
khác nhau như trong tủy xương, mô mỡ, máu ngoại vi … Trong kỹ nghệ mô sụn thì
TBGTM từ mỡ là hướng lựa chọn phù hợp vì có nhiều ưu điểm hơn so với các nguồn
mô khác và thuận tiện khi thu nhận, đặc tính kháng viêm và điều hòa miễn dịch, khả
năng tăng sinh và biệt hóa ít bị ảnh hưởng bởi tuổi [61], [32], [59].
.