Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên rotat1.2 của ký sinh trùng trypanosoma evansi trong e.coli 273081
- 71 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THU HIỀN
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN RoTAT1.2 CỦA KÝ SINH TRÙNG
TRYPANOSOMA EVANSI TRONG E.COLI
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG
2. TS. PHẠM THỊ TÂM
Hà Nội - 2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chưa từng
được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Thu Hiền
i
Luận văn thạc sỹ khoa học
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập
thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trong và ngoài trường.
Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Công nghệ
Sinh học tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trương Quốc Phong, Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS.
Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, đã trực tiếp hướng
dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng
cao chất lượng luận văn.
- Các thầy cô, đồng nghiệp trong khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học
Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiê cứu.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân, gia đình đã động
viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Thu Hiền
ii
Luận văn thạc sỹ khoa học
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU............................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TIÊN MAO TRÙNG, BỆNH TIÊN MAO
TRÙNG .................................................................................................................................. 4
1.2. TIÊN MAO TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI ...................................................... 6
1.2.1. Vị trí của Tiên mao trùng trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh6
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo, nuôi cấy, sinh học phân tử của Trypanosoma evansi 8
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái Trypanosoma evansi ............................................8
1.2.2.2. Cấu tạo của Trypanosoma evansi ........................................................9
1.2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................11
1.2.2.4. Sinh học phân tử của Trypanosoma evansi .......................................11
1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên của Tiên mao trùng Trypanosoma evansi ..........11
1.3. NGHIÊN CỨU BỆNH DO TIÊN MAO TRÙNG .................................................. 14
1.3.1. Nguyên nhân gây bệnh Tiên mao trùng ...................................................14
1.3.2. Phân bố địa lý của bệnh Tiên mao trùng ..................................................14
1.3.3. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng................................................................15
1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng ..........................................................................15
1.3.3.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ....................................................................15
1.3.3.3. Phương pháp phát hiện DNA của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Châm Reaction) .........................................................................21
1.5. HỆ BIỂU HIỆN ESCHERICHIA COLI .................................................................... 22
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....26
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 26
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU................................................................................................. 26
iii
Luận văn thạc sỹ khoa học
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................26
2.1.2. Hóa chất, enzyme, kháng thể....................................................................26
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................27
2.1.4. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ..........................................................27
2.1.5. Các dung dịch và môi trường sử dụng .....................................................27
2.1.5.1. Dung dịch ...........................................................................................27
2.1.5.2. Môi trường .........................................................................................28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 29
2.3.1. Phương pháp vi sinh vật ...........................................................................29
2.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ......................................................29
2.3.1.2. Phương phương giữ giống vi sinh vật................................................29
2.3.1.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH10b hoặc E.coli
BL21(DE3) .....................................................................................................29
2.3.1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang
gen tái tổ hợp trên môi trường có chất cảm ứng IPTG ..................................30
2.3.2. Phương pháp hóa sinh ..............................................................................31
2.3.2.1. Phương pháp điện di trên gel agarose ..............................................31
2.3.2.2. Phương pháp Tricine-SDS-PAGE .....................................................32
2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................32
2.3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ...............................................32
2.3.3.2.Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phương
pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................................33
2.3.3.3. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen ......................................35
2.3.3.4. Biến nạp vào tế bào E.coli .................................................................36
2.3.3.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli .................37
2.3.3.4. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ................38
2.3.3.5. Phương pháp Western blot ................................................................39
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................41
3.1. THIẾT KẾ CẶP MỒI KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN CỦA KÝ SINH TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI .......... 41
3.2. TÁCH CHIÊT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU HUYẾT THANH ........................ 41
iv
Luận văn thạc sỹ khoa học
3.3. KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
CỦA KÝ SINH TRÙNG T. EVANSI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)...................................................................... 42
3.4. TÁCH DÒNG GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T. EVANSI .. 43
3.4.1. Gắn đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt .....................................................................................................43
3.4.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH10b ......44
3.4.3. Tách chiết DNA plasmid ..........................................................................45
3.4.4. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT1.2 bằng
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ..................................................................46
3.4.5. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng cắt với enzym
EcoRI và SalI ......................................................................................................47
3.4.6. Giải trình tự đoạn gen RoTAT1.2 đã tách dòng .......................................48
3.5. TẠO DÒNG E.COLI BL21(DE3)/pET22b-ROTAT1.2......................................... 49
3.5.1. Nối ghép gen RoTAT1.2 vào vector biểu hiện pET22b(+) .....................49
3.5.2. Tác chiết DNA plasmid ............................................................................50
3.5.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 từ dòng tế bào E.coli
BL21(DE3) .........................................................................................................51
3.6. BIỂU HIỆN PROTEIN CỦA GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
T. EVANSI TRONG E.COLI BL21(DE3) ...................................................................... 53
3.6.1. Kết quả biểu hiện protein của gen RoTAT1.2 trong E.coli BL21(DE3) .53
3.6.2. Kết quả Western blot ................................................................................54
3.7. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CẢM ỨNG ........................................................... 55
3.7.1. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG .....................................................55
3.7.2. Khảo sát thời gian cảm ứng ......................................................................56
3.7.3. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng .......................................................................57
KẾT LUẬN ..............................................................................................................59
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................60
v
Luận văn thạc sỹ khoa học
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
BLAST Basis local alignment search tool
Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
dNTP Deoxynucleotid triphotphat
ddNTP Dideoxynucletid triphotphat
EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic
IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test
IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside
MCS Multi clonding site
PBS Phosphat Buffered Saline
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulfat
SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide
TAE Tris – axit acetic - EDTA
VAT Variant Antigen Tupe
VSG Variant Surface Glucoprotein
TMT Tiên mao trùng
T. evansi Trypanosoma evansi
vi
Luận văn thạc sỹ khoa học
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình thái T. evansi dưới kính hiển vi điện tử .............................................8
Hình 1.2: Cấu tạo của Trypanosoma evansi .............................................................10
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pJET1.2/blunt ..................22
Hình 1.4: Bản đồ cấu trúc và nhận biết các vị trí trên vector pET-22b(+) ...............25
Hình 3.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số ...............................................................42
Hình 3.2: Kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%..........................................43
Hình 3.3: Kết quả biến nạp plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 vào tế bào DH10b ..........45
Hình 3.4: kết quả tách chiết DNA plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 ..............................45
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 ..................46
Hình 3.6: Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và SalI ............47
Hình 3.7: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng 2 enzyme EcoRI và SalI ................49
Hình 3.8: Kết quả biến nạp plasmid pET22b-RoTAT1.2 vào tế bào E.coli
BL21(DE3) ...............................................................................................50
Hình 3.9: Kết quả tách chiết DNA plasmid pET22-RoTAT1.2 ...............................51
Hình 3.10: Kết quả PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2...............51
Hình 3.11: Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 .................52
Hình 3.12: Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp ..........54
Hình 3.13: Kết quả Western blot...............................................................................55
Hình 3.14: Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau ...... 56
Hình 3.15: Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng ........................................................57
Hình 3.15: Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng .........................................................58
vii
Luận văn thạc sỹ khoa học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Trình tự và thông số của cặp mồi thiết kế ................................................41
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các trình tự trên NCBI .....................................................48
viii
Luận văn thạc sỹ khoa học
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh do Trypanosoma (Trypanosomiasis) là bệnh truyền lây giữa người và
gia súc do ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây ra. Có
nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense,
Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae…
Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi thấy ở những loài động vật,
trong đó trâu, bò là các động vật khá mẫn cảm với động vật đơn bào này. Trâu, bò
mắc bệnh thể cấp tính thường sốt cao 41 – 41,70C với các triệu chứng thần kinh như
ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn, thuỷ thũng ở hầu, ức, nách, chân, háng. Trường
hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chướng to rồi lăn ra chết.
Bệnh Tiên mao trùng do ký sinh trùng T. evansi gây ra phân bố rất rộng, từ
phía Tây sang phía Đông bán cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán
cầu trải dài từ châu Phi cho đến Philippine.
Theo Haridy F. M. và cs (2011), bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước
nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ [19].
Trâu, bò mắc bệnh ở thể cấp tính có thể chết sau 7 – 15 ngày. Ở thể mãn tính,
triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và bệnh kéo dài 1 – 2 tháng, con vật ngày càng gầy,
da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, đôi khi có chấm máu, chảy nước mắt
và mắt có nhiều dử đặc như keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm. Sức khoẻ trâu,
bò suy yếu dần, kém ăn, kém nhai lại, đi phân táo có lẫn máu hoặc đi tháo phân
lỏng, mùi thối khắm, có khi con vật ỉa ra cả màng ruột, nát từng đoạn.
Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân và cs (2004), Phan
Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ
lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc
chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%.
Nguyễn Thị Thu Hiền 1 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Cũng theo báo cáo của các tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi ở gia
súc vùng núi và trung du cao hơn các vùng đồng bằng và ven biển. Trong khi đó, ở
nước ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ
yếu ở các tỉnh miền núi và trung du – là các vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp
cho sự phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhưng cơ sở hạ tầng phục vụ công tác
chẩn đoán và điều trị tại địa phương còn yếu kém; dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao
trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn.
Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng
được thực hiện dựa trên nguyên tắc phát hiện, kháng nguyên hoặc kháng thể trong máu
gia súc bệnh. Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng lại rất đa dạng với
nhiều epitop biến đổi khác nhau. Việc lựa chọn một epitop kháng nguyên có tính ổn
định và tính đặc hiệu với nhiều serotype của tiên mao trùng là công việc cần thiết để
đảm bảo phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao.
Theo nghiên cứu của Dia và cs (1997), Verloo và cs (1998 - 2000), kháng nguyên
RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type) của Trypanosoma evansi.
Kháng nguyên này có thể chế tạo được bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc
hiệu kháng thể kháng tiên mao trùng đạt 98% (Verloo và cs, 2000). Trong khuôn khổ của
đề tài này, chúng tôi tiến hành: “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
RoTAT1.2 của ký sinh trùng Trypanosoma evansi trong E.coli”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen RoTAT1.2 mã hóa kháng nguyên
T. evansi.
- Tạo cấu trúc biểu hiện và biểu hiện kháng nguyên RoTAT1.2 tái tổ hợp
trong tế bào E.coli.
3. Điểm mới của đề tài
- Đề tài xác định được gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 của tiên mao
trùng phân lập ở Việt Nam tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc kháng nguyên.
Nguyễn Thị Thu Hiền 2 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
- Kháng nguyên Ro-TAT 1.2 được chế tạo bằng công nghệ gen ở Việt Nam sẽ
phục vụ việc sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao
trùng ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài thực hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện được gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của
tiên mao trùng Trypanosoma evansi trong E.coli.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ
hợp, phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao
trùng gia súc ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
Nguyễn Thị Thu Hiền 3 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TIÊN MAO TRÙNG, BỆNH
TIÊN MAO TRÙNG
Trypanosoma được các nhà khoa học phát hiện rất sớm: Năm 1837, lần đầu
tiên Donne phát hiện một loài Trychomonas trong ruột người. Năm 1841 valetin tìm
ra con trùng roi xanh (Trypanosoma) đầu tiên trong máu một loài cá. Sau đó nhiều
loài tiên mao trùng khác đã được phát hiện trong máu của nhiều loài động vật.
Trong các loài được phát hiện thì loài Trypanosoma evansi ký sinh, gây bệnh cho
động vật đóng vai trò đặc biệt quan trọng [6].
Năm 1843 Gruby đã phát hiện thấy tiên mao trùng trong máu ếch, đặt tên là
Eryganosoma sanguinis. Tiếp sau đó nhiều loại tiên mao trùng khác thuộc giống
Trypanosome gruby lần lượt được phát hiện ký sinh, gây bệnh cho đông vật có vú
và người. Năm 1880, Evans đã tìm thấy tiên mao trùng gây bệnh trong máu la,
ngựa, lạc đà ở bang Punjab, Ấn Độ. Nó là nguyên nhân gây bệnh cho la, ngựa, lạc
đà ở Ấn Dộ được gọi chung là bệnh “Surra”. Năm 1885, Steel phát hiện
Trypanosoma trong máu la Miến Điện, mô tả hình thái kí sinh trùng, đặt tên
Spirochaete evansi, sau đổi là Trypanosoma evansi. Năm 1886, Blanchard cũng
thông báo tìm thấy T. evansi trong máu la nhập nội vào bắc bộ Việt Nam. Tác giả
đã mô tả rất tỉ mỉ hình thái ký sinh trùng, những biểu hiện lâm sàng ở vật bệnh do T.
evansi [6].
Năm 1906, Laveran và Mesnil trong tác phẩm kinh điển về tiên mao trùng,
nhưng bệnh do tiêm mao trùng đã trình bày về bệnh lý học do T.evansi gây ra cho
các loài động vật , vai trò ký chủ trung gian của một loài ruồi hút máu họ
Stomoxydinae, loài mòng họ Tabanidae [6].
Trong khoảng thời gian 1885 đến năm 1920, nhiều bệnh ở gia súc, dã thú
như bệnh “Surra” lưu hành ở nhiều nước trên thế giới: bệnh “m’bori” của lạc đà ở
các nước miền tây Châu Phi. Bệnh “eldebab”, bệnh “Tahaga” của lạc đà Angieri và
Nguyễn Thị Thu Hiền 4 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Negieria. Bệnh “Zousifana” của ngựa, chó các nước nam sa mạc Sahara. Bệnh “ Su-
suru” của lạc đà ở tây nam Liên Xô cũ. Bệnh “Murvina” của ngựa ở Trung Mỹ.
Bệnh đau mông “mal de cadera” của ngựa, la ở các nước Nam Mỹ…. đã được các
nhà khoa học nghiên cứu, tìm ra nguyên nhân. Đó là những tiên mao trùng có hình
thái, tính chất sinh học gần giống như Trypanosoma evansi được đặt tên khác nhau
như: Trypanosoma hippicum,Trypanosoma equinum,Trypanosoma vietnamense,
Trypanosoma soudanense, Trypanosoma ninae Kohl–Yakimovi,Trypanosoma
berberum, Trypanosoma venezuelense [6].
Hoare C.A, Sulsby E.J (1972) nghiên cứu lịch sử phát triển, hình thái, tính
chất sinh vật học của tiên mao trùng trên, đi đến kết luận: Tất cả đều là chủng gốc
châu Á, gốc châu Phi, gốc châu Mỹ, gốc châu Âu của một loài duy nhất là
Trypanosoma evansi [10].
Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã thông báo hiện nay có 7 loại tiên mao trùng
gây bệnh cho động vật có vú và người là Trypanosoma evansi, trypanosoma vivax,
Trypanosoma brucei, Trypanosoma congolence, Trypanosoma gambiense,
Trypanosoma simiae, Trypanosoma cruzi. Trong số các loại tiên mao trùng kể trên
thì Trypanosoma evansi là phổ biến nhất, phân bố khắp nơi trên thế giới, gây bệnh
hầu hết cho các loài động vật có vú trừ người, chiếm ưu thế ở vùng cận đông, châu
Á và châu Mỹ la tinh [5].
Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện lần đầu tiên ở Việt
Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả
nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Năm 1906, Vassal ở
viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu khá đầy đủ về bệnh và gửi tiêm mao trùng về
viện Pasteur Paris để xác đinh rõ thêm về chúng [6].
Tiếp đến là báo cáo về tiên mao trùng của Lorh, K.F (1986) [11]. Đến nay ba
loại tiên mao trùng trên động vật có vú được tìm thấy ở nước ta là:
T. evansi do Steel tìm ra vào năm 1885 ký sinh trên trâu bò.
Nguyễn Thị Thu Hiền 5 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
T. theileri do Laveran tìm ra vào năm 1902, ký sinh ở trâu, bò.
Schein (1907), Mathis và Leger (1911) phát hiện thấy Tiên mao trùng ở trâu, bò
nước ta nhưng chưa rõ tác hại gây bệnh.
T. lewisi do Kent tìm ra 1980, ký sinh ở chuột.
Trong khi đó thế giới đã phát hiện hai chủng lây từ động vật sang người :
- Bệnh do Trypanosoma Châu Mỹ (American Trypanosomiasis), còn gọi là bệnh
Chagas là do T. cruzi gây ra.
- Bệnh do Trypanosoma Châu Phi (African Trypanosomiasis), còn gọi bệnh
ngủ (sleeping sickness), do các chủng của T. brucei gây ra.
1.2. TIÊN MAO TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI
1.2.1. Vị trí của Tiên mao trùng trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh
Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [3], vị trí
của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Nguyễn Thị Thu Hiền 6 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Loài Trvpanosoma (D) uniform
Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei
Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)
Giống Trypanosoma bao gồm rất nhiều loài đã được phát hiện ở động vật có
xương sống thuộc lớp cá, lớp ếch, lớp bò sát, lớp chim, lớp động vật có vú. Việc
phân biệt các loài Tiên mao trùng ở các lớp khác nhau là tương đối dễ, tuy nhiên
việc phân biệt các loài Tiên mao trùng trong lớp động vật có vú thì phức tạp hơn rất
nhiều [5].
Phạm Sỹ Lăng (1982) cho biết: 1943 Neveu – Lemarie, đã chia các loài
thuộc giống Trypanosoma ký sinh ở động vật có vú và người thành 5 nhóm căn cứ
theo đặc tính hình thái học, sinh vật học của chúng. Các nhóm đó là nhóm Lewisi,
nhóm Evansi, nhóm Vivax, nhóm Congolense, nhóm Brucei [6].
Theo đề nghị của Lapage (1968), nhóm Evansi thuộc nhóm Brucei gồm 7
loài, nhóm này chia làm 3 nhóm phụ: nhóm phụ Suis có một loài là Trypanosoma
Suis, nhóm phụ Evansi có 4 loài Trypanosoma brucei, Trypanosoma evansi,
Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense [14].
Trong các loài Tiên trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE)
thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T. brucei,
T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
Nguyễn Thị Thu Hiền 7 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo, nuôi cấy, sinh học phân tử của Trypanosoma evansi
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái Trypanosoma evansi
Chen Qijun (1992) cho biết Trypanosoma evansi được xếp vào loại đơn
hình thái. Trypanosoma evansi hình suốt chỉ hay hình thoi, ở giữa có nhân không
có Cytochrome. Cuối thân có Kinetoplast và Kinetosome, màng rung động rộng,
gấp nếp rõ. Trong nguyên sinh chất có những hạt nhỏ bắt màu [12].
Phạm Sỹ Lăng (1982) cho biết: Trypanosoma evansi thuộc giống
Trypanosoma, là những Tiên mao trùng có hình suốt chỉ thoi, mảnh, hai đầu thót
tròn hoặc nhọn. Thân là một khối nguyên sinh chất, giữa có một nhân, cuối thân có
thể cơ động (Kinetoplast) hay còn gọi là hạch cơ động. Từ thể cơ động hoặc gần thể
cơ động có xuất hiện một roi đính vào thân chạy dọc tên phía trước tạo thành màng
rung động nhiều nếp gấp do có một đoạn tự do ở phía trước, cũng có tiên mao
trùng trong quá trình phát triển không có roi [6].
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996),
Trypanosoma evansi là loài ký sinh trùng ký sinh ngoài hồng cầu, có hình thoi,
dài 18-34 µm giữa thân có một roi bắt nguồn từ thể hình roi cách đuôi TMT khoảng
1,5 µm. Roi này chạy dọc thân tạo thành nhiều màng ngăn rung động, cuối cùng roi
này lơ lửng ở phần đầu thành roi tự do dài 6 µm. Nhờ có roi, màng rung động mà
TMT chuyển động được trong máu động vật [2]. Tiêu bản máu nhuộm Giemsa,
Trypanosoma evansi bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất của TMT bắt màu tím.
Hình 1.1: Hình thái T. evansi dưới kính hiển vi điện tử
Nguyễn Thị Thu Hiền 8 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Một số loài TMT có thể quan sát được nhiều hình thái trong quá trình phát
triển ở ký chủ trung gian, ký chủ cuối cùng. Hình thái TMT thường gặp là:[15].
- Thể Crithidia: thể cơ động ở trước, gần thân, từ thể cơ động xuất phát 1 roi,
giới hạn một màng rung động ngắn, rơi tự do ở phía trước.
- Thể Leptomonas: thể cơ động hoàn toàn ở phía trước, từ thể cơ động xuất
hiện một roi tự do, không có màng rung động.
- Thể Leishmania: hình bầu dục hay hình cầu có một nhân to, một bào tử thể
hình gậy, từ đó xuất phát một cái roi chưa thành hình kết thúc ở giữa thân.
- Thể Trypanosoma: trong côn trùng có hình dạng bình thường, nhưng có roi
dính vào thân, chạy thẳng lên phía trước, không tạo thành màng rung.
1.2.2.2. Cấu tạo của Trypanosoma evansi
Vickerman, K (1974) cho biết: về cơ bản cấu tạo của các loài tiên mao trùng
của họ Trypanosomatidae là giống nhau. Tế bào hình con suốt là nhờ các vi ống xếp
song song nằm dọc theo chiều dài dưới màng tế bào. Chuyển động liên tục của Tiên
mao trùng hoạt hóa bởi một cái roi bắt nguồn từ thể cơ động (kinetoplast). Ở chỗ cái
roi nhập vào thân tế bào có một chỗ lõm trên bề mặt tế bào gọi là túi roi. Chính phần này
của tế bào là nơi thực hiện chủ yếu các quá trình bài tiết, quá trình hấp thu các chất dinh
dưỡng của Tiên mao trùng [13].
Cấu trúc từ ngoài vào trong của Trypanosoma evansi được chia thành 3 phần
chính:
Nguyễn Thị Thu Hiền 9 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 1.2: Cấu tạo của Trypanosoma evansi
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài
và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài
cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein
Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo
chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên
mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh [10], [6], [4].
- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất có chứa các
nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ
động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân
thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về phía
cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có một roi
chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của
tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi
ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi [10], [4].
Nguyễn Thị Thu Hiền 10 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
1.2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [4]
T. evansi có thể được nuôi cấy trong một số môi trường NNN ( Novy
MacNeal and Nicole). Ngoài ra T. evansi có thể được nuôi cấy trong môi trường
bào thai gà và môi trường dịch tổ chức.
Theo Neveu-Lemaire (1943),T. evansi rất khó nuôi cấy trong môi trường.
Tuy nhiên trong một số điều kiện đặc biệt TMT có thể phát triển nhưng tính kháng
nguyên bị biến đổi (không gây bệnh cho động vật). Đặc tính này dùng để phân biệt
với loài T. Brucei, đây là loài rất khó phân biệt với loài T. Evansi về hình thái và
khả năng gây bệnh.
1.2.2.4. Sinh học phân tử của Trypanosoma evansi
Nghiên cứu về sinh học phân tử, Hernmers R và Bajyanasonga (1992) cho
biết: T. evansi có thể là dạng đột biến ký chủ của T. Brucei và T.evansi không có
khả năng truyền bệnh qua ruồi Tsetse và thay đổi các chức năng khác có liên quan
tới sự thay đổi ký chủ được coi là đột biến. Thay đổi quan trọng nhất là thay đổi
các dạng procyclic và thay đổi một phần hoặc toàn bộ Kinetoplast, thay đổi này
không có ở hầu hết các TMT mà chỉ có ở T. evansi. Chúng mã hóa cho 3g. RNAs
và có thể bao gồm số lượng nào đó của gen nhân. Thay đổi các dạng TMT trong
máu ảnh hưởng tới các dạng procyclic bởi hoạt hóa của bộ gen ty nạp thể. Tổng
hợp procyclic protein bao gồm bộ mới của protein bề mặt và procyclins. T. evansi
không có thể làm thay đổi procyclic trừ khi T. evansi ở trong những điều kiện thay
đổi [16].
Qu.L.H., Yu, X.Q và Z.L.Lun (1992) khi phân tích trình tự rARN cho thấy T.
evansi và T. brucei có quan hệ rất gần gũi. Chỉ có 2 sai khác ở D2 đó là vòng phân
ly lớn nhất của Ls-rARN. Kết quả chỉ ra rằng 5 nucleotide cuối cùng của chuỗi Ls-
rARN có thể dùng làm chỉ số tế bào cho phân tích phát triển loài của giống
Trypanosoma. Vài chỉ số nucleotide được xây dựng để phát hiện T. evansi [17].
1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên của Tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng
nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
Nguyễn Thị Thu Hiền 11 2011-2013
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THU HIỀN
TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN RoTAT1.2 CỦA KÝ SINH TRÙNG
TRYPANOSOMA EVANSI TRONG E.COLI
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. TS. TRƯƠNG QUỐC PHONG
2. TS. PHẠM THỊ TÂM
Hà Nội - 2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi.
Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chưa từng
được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác.
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Thu Hiền
i
Luận văn thạc sỹ khoa học
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập
thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trong và ngoài trường.
Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học chuyên ngành Công nghệ
Sinh học tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trương Quốc Phong, Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm,Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và TS.
Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, đã trực tiếp hướng
dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực
phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng
cao chất lượng luận văn.
- Các thầy cô, đồng nghiệp trong khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học
Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiê cứu.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân, gia đình đã động
viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, tháng 12 năm 2013
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Thu Hiền
ii
Luận văn thạc sỹ khoa học
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU............................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................4
1.1. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TIÊN MAO TRÙNG, BỆNH TIÊN MAO
TRÙNG .................................................................................................................................. 4
1.2. TIÊN MAO TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI ...................................................... 6
1.2.1. Vị trí của Tiên mao trùng trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh6
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo, nuôi cấy, sinh học phân tử của Trypanosoma evansi 8
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái Trypanosoma evansi ............................................8
1.2.2.2. Cấu tạo của Trypanosoma evansi ........................................................9
1.2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................11
1.2.2.4. Sinh học phân tử của Trypanosoma evansi .......................................11
1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên của Tiên mao trùng Trypanosoma evansi ..........11
1.3. NGHIÊN CỨU BỆNH DO TIÊN MAO TRÙNG .................................................. 14
1.3.1. Nguyên nhân gây bệnh Tiên mao trùng ...................................................14
1.3.2. Phân bố địa lý của bệnh Tiên mao trùng ..................................................14
1.3.3. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng................................................................15
1.3.3.1. Chẩn đoán lâm sàng ..........................................................................15
1.3.3.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ....................................................................15
1.3.3.3. Phương pháp phát hiện DNA của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR
(Polymerase Châm Reaction) .........................................................................21
1.5. HỆ BIỂU HIỆN ESCHERICHIA COLI .................................................................... 22
CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....26
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................................... 26
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU................................................................................................. 26
iii
Luận văn thạc sỹ khoa học
2.1.1. Chủng vi sinh vật ......................................................................................26
2.1.2. Hóa chất, enzyme, kháng thể....................................................................26
2.1.3. Thiết bị .....................................................................................................27
2.1.4. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ..........................................................27
2.1.5. Các dung dịch và môi trường sử dụng .....................................................27
2.1.5.1. Dung dịch ...........................................................................................27
2.1.5.2. Môi trường .........................................................................................28
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 29
2.3.1. Phương pháp vi sinh vật ...........................................................................29
2.3.1.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật ......................................................29
2.3.1.2. Phương phương giữ giống vi sinh vật................................................29
2.3.1.3. Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH10b hoặc E.coli
BL21(DE3) .....................................................................................................29
2.3.1.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang
gen tái tổ hợp trên môi trường có chất cảm ứng IPTG ..................................30
2.3.2. Phương pháp hóa sinh ..............................................................................31
2.3.2.1. Phương pháp điện di trên gel agarose ..............................................31
2.3.2.2. Phương pháp Tricine-SDS-PAGE .....................................................32
2.3.3. Phương pháp sinh học phân tử .................................................................32
2.3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số ...............................................32
2.3.3.2.Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phương
pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................................33
2.3.3.3. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen ......................................35
2.3.3.4. Biến nạp vào tế bào E.coli .................................................................36
2.3.3.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli .................37
2.3.3.4. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn ................38
2.3.3.5. Phương pháp Western blot ................................................................39
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................41
3.1. THIẾT KẾ CẶP MỒI KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA
KHÁNG NGUYÊN CỦA KÝ SINH TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI .......... 41
3.2. TÁCH CHIÊT DNA TỔNG SỐ TỪ MẪU HUYẾT THANH ........................ 41
iv
Luận văn thạc sỹ khoa học
3.3. KHUẾCH ĐẠI ĐOẠN GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
CỦA KÝ SINH TRÙNG T. EVANSI BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)...................................................................... 42
3.4. TÁCH DÒNG GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN T. EVANSI .. 43
3.4.1. Gắn đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT1.2 vào vector tách dòng
pJET1.2/blunt .....................................................................................................43
3.4.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH10b ......44
3.4.3. Tách chiết DNA plasmid ..........................................................................45
3.4.4. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT1.2 bằng
phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu ..................................................................46
3.4.5. Kiểm tra sự mang gen của vector tái tổ hợp bằng phản ứng cắt với enzym
EcoRI và SalI ......................................................................................................47
3.4.6. Giải trình tự đoạn gen RoTAT1.2 đã tách dòng .......................................48
3.5. TẠO DÒNG E.COLI BL21(DE3)/pET22b-ROTAT1.2......................................... 49
3.5.1. Nối ghép gen RoTAT1.2 vào vector biểu hiện pET22b(+) .....................49
3.5.2. Tác chiết DNA plasmid ............................................................................50
3.5.3. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 từ dòng tế bào E.coli
BL21(DE3) .........................................................................................................51
3.6. BIỂU HIỆN PROTEIN CỦA GEN ROTAT1.2 MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN
T. EVANSI TRONG E.COLI BL21(DE3) ...................................................................... 53
3.6.1. Kết quả biểu hiện protein của gen RoTAT1.2 trong E.coli BL21(DE3) .53
3.6.2. Kết quả Western blot ................................................................................54
3.7. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN CẢM ỨNG ........................................................... 55
3.7.1. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG .....................................................55
3.7.2. Khảo sát thời gian cảm ứng ......................................................................56
3.7.3. Khảo sát nhiệt độ cảm ứng .......................................................................57
KẾT LUẬN ..............................................................................................................59
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................60
v
Luận văn thạc sỹ khoa học
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
BLAST Basis local alignment search tool
Bp Base pair
DNA Deoxyribonucleic acid
CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis
dNTP Deoxynucleotid triphotphat
ddNTP Dideoxynucletid triphotphat
EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic
IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test
IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside
MCS Multi clonding site
PBS Phosphat Buffered Saline
RNA Ribonucleic acid
SDS Sodium Dodecyl Sulfat
SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide
TAE Tris – axit acetic - EDTA
VAT Variant Antigen Tupe
VSG Variant Surface Glucoprotein
TMT Tiên mao trùng
T. evansi Trypanosoma evansi
vi
Luận văn thạc sỹ khoa học
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hình thái T. evansi dưới kính hiển vi điện tử .............................................8
Hình 1.2: Cấu tạo của Trypanosoma evansi .............................................................10
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của vectơ pJET1.2/blunt ..................22
Hình 1.4: Bản đồ cấu trúc và nhận biết các vị trí trên vector pET-22b(+) ...............25
Hình 3.1: Kết quả tách chiết DNA tổng số ...............................................................42
Hình 3.2: Kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1,2%..........................................43
Hình 3.3: Kết quả biến nạp plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 vào tế bào DH10b ..........45
Hình 3.4: kết quả tách chiết DNA plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 ..............................45
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid pJET1.2-RoTAT1.2 ..................46
Hình 3.6: Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI và SalI ............47
Hình 3.7: Kết quả tinh sạch sản phẩm cắt bằng 2 enzyme EcoRI và SalI ................49
Hình 3.8: Kết quả biến nạp plasmid pET22b-RoTAT1.2 vào tế bào E.coli
BL21(DE3) ...............................................................................................50
Hình 3.9: Kết quả tách chiết DNA plasmid pET22-RoTAT1.2 ...............................51
Hình 3.10: Kết quả PCR kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2...............51
Hình 3.11: Kết quả cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-RoTAT1.2 .................52
Hình 3.12: Kết quả điện di Tricine-SDS PAGE các dòng plasmid tái tổ hợp ..........54
Hình 3.13: Kết quả Western blot...............................................................................55
Hình 3.14: Kết quả khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau ...... 56
Hình 3.15: Kết quả khảo sát thời gian cảm ứng ........................................................57
Hình 3.15: Kết quả khảo sát nhiệt độ cảm ứng .........................................................58
vii
Luận văn thạc sỹ khoa học
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1: Trình tự và thông số của cặp mồi thiết kế ................................................41
Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các trình tự trên NCBI .....................................................48
viii
Luận văn thạc sỹ khoa học
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh do Trypanosoma (Trypanosomiasis) là bệnh truyền lây giữa người và
gia súc do ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây ra. Có
nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, như: Trypanosoma brucei, Trypanosoma
cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense,
Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae…
Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi thấy ở những loài động vật,
trong đó trâu, bò là các động vật khá mẫn cảm với động vật đơn bào này. Trâu, bò
mắc bệnh thể cấp tính thường sốt cao 41 – 41,70C với các triệu chứng thần kinh như
ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn, thuỷ thũng ở hầu, ức, nách, chân, háng. Trường
hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chướng to rồi lăn ra chết.
Bệnh Tiên mao trùng do ký sinh trùng T. evansi gây ra phân bố rất rộng, từ
phía Tây sang phía Đông bán cầu. Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán
cầu trải dài từ châu Phi cho đến Philippine.
Theo Haridy F. M. và cs (2011), bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước
nhiệt đới ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ [19].
Trâu, bò mắc bệnh ở thể cấp tính có thể chết sau 7 – 15 ngày. Ở thể mãn tính,
triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và bệnh kéo dài 1 – 2 tháng, con vật ngày càng gầy,
da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, đôi khi có chấm máu, chảy nước mắt
và mắt có nhiều dử đặc như keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm. Sức khoẻ trâu,
bò suy yếu dần, kém ăn, kém nhai lại, đi phân táo có lẫn máu hoặc đi tháo phân
lỏng, mùi thối khắm, có khi con vật ỉa ra cả màng ruột, nát từng đoạn.
Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân và cs (2004), Phan
Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ
lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc
chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%.
Nguyễn Thị Thu Hiền 1 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Cũng theo báo cáo của các tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi ở gia
súc vùng núi và trung du cao hơn các vùng đồng bằng và ven biển. Trong khi đó, ở
nước ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ
yếu ở các tỉnh miền núi và trung du – là các vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp
cho sự phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhưng cơ sở hạ tầng phục vụ công tác
chẩn đoán và điều trị tại địa phương còn yếu kém; dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao
trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn.
Hiện nay, các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học bệnh tiên mao trùng
được thực hiện dựa trên nguyên tắc phát hiện, kháng nguyên hoặc kháng thể trong máu
gia súc bệnh. Tuy vậy, kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng lại rất đa dạng với
nhiều epitop biến đổi khác nhau. Việc lựa chọn một epitop kháng nguyên có tính ổn
định và tính đặc hiệu với nhiều serotype của tiên mao trùng là công việc cần thiết để
đảm bảo phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và đặc hiệu cao.
Theo nghiên cứu của Dia và cs (1997), Verloo và cs (1998 - 2000), kháng nguyên
RoTAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type) của Trypanosoma evansi.
Kháng nguyên này có thể chế tạo được bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc
hiệu kháng thể kháng tiên mao trùng đạt 98% (Verloo và cs, 2000). Trong khuôn khổ của
đề tài này, chúng tôi tiến hành: “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên
RoTAT1.2 của ký sinh trùng Trypanosoma evansi trong E.coli”.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen RoTAT1.2 mã hóa kháng nguyên
T. evansi.
- Tạo cấu trúc biểu hiện và biểu hiện kháng nguyên RoTAT1.2 tái tổ hợp
trong tế bào E.coli.
3. Điểm mới của đề tài
- Đề tài xác định được gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 của tiên mao
trùng phân lập ở Việt Nam tạo cơ sở cho việc xác định cấu trúc kháng nguyên.
Nguyễn Thị Thu Hiền 2 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
- Kháng nguyên Ro-TAT 1.2 được chế tạo bằng công nghệ gen ở Việt Nam sẽ
phục vụ việc sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao
trùng ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài thực hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề
mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện được gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của
tiên mao trùng Trypanosoma evansi trong E.coli.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Sản phẩm của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ
hợp, phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao
trùng gia súc ở Việt Nam do tính tương đồng kháng nguyên.
Nguyễn Thị Thu Hiền 3 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TIÊN MAO TRÙNG, BỆNH
TIÊN MAO TRÙNG
Trypanosoma được các nhà khoa học phát hiện rất sớm: Năm 1837, lần đầu
tiên Donne phát hiện một loài Trychomonas trong ruột người. Năm 1841 valetin tìm
ra con trùng roi xanh (Trypanosoma) đầu tiên trong máu một loài cá. Sau đó nhiều
loài tiên mao trùng khác đã được phát hiện trong máu của nhiều loài động vật.
Trong các loài được phát hiện thì loài Trypanosoma evansi ký sinh, gây bệnh cho
động vật đóng vai trò đặc biệt quan trọng [6].
Năm 1843 Gruby đã phát hiện thấy tiên mao trùng trong máu ếch, đặt tên là
Eryganosoma sanguinis. Tiếp sau đó nhiều loại tiên mao trùng khác thuộc giống
Trypanosome gruby lần lượt được phát hiện ký sinh, gây bệnh cho đông vật có vú
và người. Năm 1880, Evans đã tìm thấy tiên mao trùng gây bệnh trong máu la,
ngựa, lạc đà ở bang Punjab, Ấn Độ. Nó là nguyên nhân gây bệnh cho la, ngựa, lạc
đà ở Ấn Dộ được gọi chung là bệnh “Surra”. Năm 1885, Steel phát hiện
Trypanosoma trong máu la Miến Điện, mô tả hình thái kí sinh trùng, đặt tên
Spirochaete evansi, sau đổi là Trypanosoma evansi. Năm 1886, Blanchard cũng
thông báo tìm thấy T. evansi trong máu la nhập nội vào bắc bộ Việt Nam. Tác giả
đã mô tả rất tỉ mỉ hình thái ký sinh trùng, những biểu hiện lâm sàng ở vật bệnh do T.
evansi [6].
Năm 1906, Laveran và Mesnil trong tác phẩm kinh điển về tiên mao trùng,
nhưng bệnh do tiêm mao trùng đã trình bày về bệnh lý học do T.evansi gây ra cho
các loài động vật , vai trò ký chủ trung gian của một loài ruồi hút máu họ
Stomoxydinae, loài mòng họ Tabanidae [6].
Trong khoảng thời gian 1885 đến năm 1920, nhiều bệnh ở gia súc, dã thú
như bệnh “Surra” lưu hành ở nhiều nước trên thế giới: bệnh “m’bori” của lạc đà ở
các nước miền tây Châu Phi. Bệnh “eldebab”, bệnh “Tahaga” của lạc đà Angieri và
Nguyễn Thị Thu Hiền 4 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Negieria. Bệnh “Zousifana” của ngựa, chó các nước nam sa mạc Sahara. Bệnh “ Su-
suru” của lạc đà ở tây nam Liên Xô cũ. Bệnh “Murvina” của ngựa ở Trung Mỹ.
Bệnh đau mông “mal de cadera” của ngựa, la ở các nước Nam Mỹ…. đã được các
nhà khoa học nghiên cứu, tìm ra nguyên nhân. Đó là những tiên mao trùng có hình
thái, tính chất sinh học gần giống như Trypanosoma evansi được đặt tên khác nhau
như: Trypanosoma hippicum,Trypanosoma equinum,Trypanosoma vietnamense,
Trypanosoma soudanense, Trypanosoma ninae Kohl–Yakimovi,Trypanosoma
berberum, Trypanosoma venezuelense [6].
Hoare C.A, Sulsby E.J (1972) nghiên cứu lịch sử phát triển, hình thái, tính
chất sinh vật học của tiên mao trùng trên, đi đến kết luận: Tất cả đều là chủng gốc
châu Á, gốc châu Phi, gốc châu Mỹ, gốc châu Âu của một loài duy nhất là
Trypanosoma evansi [10].
Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã thông báo hiện nay có 7 loại tiên mao trùng
gây bệnh cho động vật có vú và người là Trypanosoma evansi, trypanosoma vivax,
Trypanosoma brucei, Trypanosoma congolence, Trypanosoma gambiense,
Trypanosoma simiae, Trypanosoma cruzi. Trong số các loại tiên mao trùng kể trên
thì Trypanosoma evansi là phổ biến nhất, phân bố khắp nơi trên thế giới, gây bệnh
hầu hết cho các loài động vật có vú trừ người, chiếm ưu thế ở vùng cận đông, châu
Á và châu Mỹ la tinh [5].
Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện lần đầu tiên ở Việt
Nam. Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong cả
nước. Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra. Năm 1906, Vassal ở
viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu khá đầy đủ về bệnh và gửi tiêm mao trùng về
viện Pasteur Paris để xác đinh rõ thêm về chúng [6].
Tiếp đến là báo cáo về tiên mao trùng của Lorh, K.F (1986) [11]. Đến nay ba
loại tiên mao trùng trên động vật có vú được tìm thấy ở nước ta là:
T. evansi do Steel tìm ra vào năm 1885 ký sinh trên trâu bò.
Nguyễn Thị Thu Hiền 5 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
T. theileri do Laveran tìm ra vào năm 1902, ký sinh ở trâu, bò.
Schein (1907), Mathis và Leger (1911) phát hiện thấy Tiên mao trùng ở trâu, bò
nước ta nhưng chưa rõ tác hại gây bệnh.
T. lewisi do Kent tìm ra 1980, ký sinh ở chuột.
Trong khi đó thế giới đã phát hiện hai chủng lây từ động vật sang người :
- Bệnh do Trypanosoma Châu Mỹ (American Trypanosomiasis), còn gọi là bệnh
Chagas là do T. cruzi gây ra.
- Bệnh do Trypanosoma Châu Phi (African Trypanosomiasis), còn gọi bệnh
ngủ (sleeping sickness), do các chủng của T. brucei gây ra.
1.2. TIÊN MAO TRÙNG TRYPANOSOMA EVANSI
1.2.1. Vị trí của Tiên mao trùng trong hệ thống phân loại động vật nguyên sinh
Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [3], vị trí
của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:
Ngành Sarcomastigophora
Phân ngành Mastigophora
Lớp Zoomastigophorasida
Bộ Kinetoplastorida
Phân bộ Trypanosomatorida
Họ Trypanosomatidae Donein, 1901
Giống Trypanosoma Gruby, 1843
Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (M) theileria
Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901
Loài Trypanosoma (H) leisi
Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909
Loài Trypanosoma (S) cruzi
Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918
Loài Trypanosoma (D) vivax
Nguyễn Thị Thu Hiền 6 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Loài Trvpanosoma (D) uniform
Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (N) congolense
Loài Trypanosoma (N) siminae
Loài Trypanosoma (N) vanhogi
Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906
Loài Trypanosoma (T) brucei
Loài Trypanosoma (T) gambience
Loài Trypanosoma (T) rhodesiense
Loài Trypanosoma (T) equiperdum
Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964
Loài Trypanosoma (P) suis
Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843
Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)
Giống Trypanosoma bao gồm rất nhiều loài đã được phát hiện ở động vật có
xương sống thuộc lớp cá, lớp ếch, lớp bò sát, lớp chim, lớp động vật có vú. Việc
phân biệt các loài Tiên mao trùng ở các lớp khác nhau là tương đối dễ, tuy nhiên
việc phân biệt các loài Tiên mao trùng trong lớp động vật có vú thì phức tạp hơn rất
nhiều [5].
Phạm Sỹ Lăng (1982) cho biết: 1943 Neveu – Lemarie, đã chia các loài
thuộc giống Trypanosoma ký sinh ở động vật có vú và người thành 5 nhóm căn cứ
theo đặc tính hình thái học, sinh vật học của chúng. Các nhóm đó là nhóm Lewisi,
nhóm Evansi, nhóm Vivax, nhóm Congolense, nhóm Brucei [6].
Theo đề nghị của Lapage (1968), nhóm Evansi thuộc nhóm Brucei gồm 7
loài, nhóm này chia làm 3 nhóm phụ: nhóm phụ Suis có một loài là Trypanosoma
Suis, nhóm phụ Evansi có 4 loài Trypanosoma brucei, Trypanosoma evansi,
Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense [14].
Trong các loài Tiên trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế (OIE)
thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T. brucei,
T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. gambiense, T. siminae, T. vivax.
Nguyễn Thị Thu Hiền 7 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
1.2.2. Đặc điểm hình thái, cấu tạo, nuôi cấy, sinh học phân tử của Trypanosoma evansi
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái Trypanosoma evansi
Chen Qijun (1992) cho biết Trypanosoma evansi được xếp vào loại đơn
hình thái. Trypanosoma evansi hình suốt chỉ hay hình thoi, ở giữa có nhân không
có Cytochrome. Cuối thân có Kinetoplast và Kinetosome, màng rung động rộng,
gấp nếp rõ. Trong nguyên sinh chất có những hạt nhỏ bắt màu [12].
Phạm Sỹ Lăng (1982) cho biết: Trypanosoma evansi thuộc giống
Trypanosoma, là những Tiên mao trùng có hình suốt chỉ thoi, mảnh, hai đầu thót
tròn hoặc nhọn. Thân là một khối nguyên sinh chất, giữa có một nhân, cuối thân có
thể cơ động (Kinetoplast) hay còn gọi là hạch cơ động. Từ thể cơ động hoặc gần thể
cơ động có xuất hiện một roi đính vào thân chạy dọc tên phía trước tạo thành màng
rung động nhiều nếp gấp do có một đoạn tự do ở phía trước, cũng có tiên mao
trùng trong quá trình phát triển không có roi [6].
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996),
Trypanosoma evansi là loài ký sinh trùng ký sinh ngoài hồng cầu, có hình thoi,
dài 18-34 µm giữa thân có một roi bắt nguồn từ thể hình roi cách đuôi TMT khoảng
1,5 µm. Roi này chạy dọc thân tạo thành nhiều màng ngăn rung động, cuối cùng roi
này lơ lửng ở phần đầu thành roi tự do dài 6 µm. Nhờ có roi, màng rung động mà
TMT chuyển động được trong máu động vật [2]. Tiêu bản máu nhuộm Giemsa,
Trypanosoma evansi bắt màu xanh lơ, nguyên sinh chất của TMT bắt màu tím.
Hình 1.1: Hình thái T. evansi dưới kính hiển vi điện tử
Nguyễn Thị Thu Hiền 8 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Một số loài TMT có thể quan sát được nhiều hình thái trong quá trình phát
triển ở ký chủ trung gian, ký chủ cuối cùng. Hình thái TMT thường gặp là:[15].
- Thể Crithidia: thể cơ động ở trước, gần thân, từ thể cơ động xuất phát 1 roi,
giới hạn một màng rung động ngắn, rơi tự do ở phía trước.
- Thể Leptomonas: thể cơ động hoàn toàn ở phía trước, từ thể cơ động xuất
hiện một roi tự do, không có màng rung động.
- Thể Leishmania: hình bầu dục hay hình cầu có một nhân to, một bào tử thể
hình gậy, từ đó xuất phát một cái roi chưa thành hình kết thúc ở giữa thân.
- Thể Trypanosoma: trong côn trùng có hình dạng bình thường, nhưng có roi
dính vào thân, chạy thẳng lên phía trước, không tạo thành màng rung.
1.2.2.2. Cấu tạo của Trypanosoma evansi
Vickerman, K (1974) cho biết: về cơ bản cấu tạo của các loài tiên mao trùng
của họ Trypanosomatidae là giống nhau. Tế bào hình con suốt là nhờ các vi ống xếp
song song nằm dọc theo chiều dài dưới màng tế bào. Chuyển động liên tục của Tiên
mao trùng hoạt hóa bởi một cái roi bắt nguồn từ thể cơ động (kinetoplast). Ở chỗ cái
roi nhập vào thân tế bào có một chỗ lõm trên bề mặt tế bào gọi là túi roi. Chính phần này
của tế bào là nơi thực hiện chủ yếu các quá trình bài tiết, quá trình hấp thu các chất dinh
dưỡng của Tiên mao trùng [13].
Cấu trúc từ ngoài vào trong của Trypanosoma evansi được chia thành 3 phần
chính:
Nguyễn Thị Thu Hiền 9 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
Hình 1.2: Cấu tạo của Trypanosoma evansi
- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài
và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa). Lớp vỏ ngoài
cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein
Surface -VGS). Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo
chiều dài thân tiên mao trùng. Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên
mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh [10], [6], [4].
- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài. Trong nguyên sinh chất có chứa các
nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ
động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi.
- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng. Nhân
thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể. Ngoài nhân, về phía
cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN). Từ kinetoplast có một roi
chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự do. Roi của
tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân. Trong roi có 9 cặp vi
ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi [10], [4].
Nguyễn Thị Thu Hiền 10 2011-2013
Luận văn thạc sỹ khoa học
1.2.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [4]
T. evansi có thể được nuôi cấy trong một số môi trường NNN ( Novy
MacNeal and Nicole). Ngoài ra T. evansi có thể được nuôi cấy trong môi trường
bào thai gà và môi trường dịch tổ chức.
Theo Neveu-Lemaire (1943),T. evansi rất khó nuôi cấy trong môi trường.
Tuy nhiên trong một số điều kiện đặc biệt TMT có thể phát triển nhưng tính kháng
nguyên bị biến đổi (không gây bệnh cho động vật). Đặc tính này dùng để phân biệt
với loài T. Brucei, đây là loài rất khó phân biệt với loài T. Evansi về hình thái và
khả năng gây bệnh.
1.2.2.4. Sinh học phân tử của Trypanosoma evansi
Nghiên cứu về sinh học phân tử, Hernmers R và Bajyanasonga (1992) cho
biết: T. evansi có thể là dạng đột biến ký chủ của T. Brucei và T.evansi không có
khả năng truyền bệnh qua ruồi Tsetse và thay đổi các chức năng khác có liên quan
tới sự thay đổi ký chủ được coi là đột biến. Thay đổi quan trọng nhất là thay đổi
các dạng procyclic và thay đổi một phần hoặc toàn bộ Kinetoplast, thay đổi này
không có ở hầu hết các TMT mà chỉ có ở T. evansi. Chúng mã hóa cho 3g. RNAs
và có thể bao gồm số lượng nào đó của gen nhân. Thay đổi các dạng TMT trong
máu ảnh hưởng tới các dạng procyclic bởi hoạt hóa của bộ gen ty nạp thể. Tổng
hợp procyclic protein bao gồm bộ mới của protein bề mặt và procyclins. T. evansi
không có thể làm thay đổi procyclic trừ khi T. evansi ở trong những điều kiện thay
đổi [16].
Qu.L.H., Yu, X.Q và Z.L.Lun (1992) khi phân tích trình tự rARN cho thấy T.
evansi và T. brucei có quan hệ rất gần gũi. Chỉ có 2 sai khác ở D2 đó là vòng phân
ly lớn nhất của Ls-rARN. Kết quả chỉ ra rằng 5 nucleotide cuối cùng của chuỗi Ls-
rARN có thể dùng làm chỉ số tế bào cho phân tích phát triển loài của giống
Trypanosoma. Vài chỉ số nucleotide được xây dựng để phát hiện T. evansi [17].
1.2.3. Cấu trúc kháng nguyên của Tiên mao trùng Trypanosoma evansi
Kháng nguyên của T. evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng
nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi
Nguyễn Thị Thu Hiền 11 2011-2013