Sử dụng kỹ thuật pcr khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu
- 72 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------
ĐẶNG THỊ THANH HUYỀN
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SỰ NHIỄM KHUẨN
TỤ CẦU VÀNG TRONG CHẾ PHẨM MÁU
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
T.S NGUYỄN THỊ THANH MAI
PGS.TS KHUẤT HỮU THANH
Hà Nội – 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo trong bộ môn
công nghệ sinh học- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như sự giúp đỡ
của các cán bộ hiện đang công tác tại bệnh viện Nhi TW.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS. TS Khuất Hữu Thanh, là những người thầy
cô tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến bạn bè và người thân của tôi
đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành
luận văn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2013
Sinh viên
Đặng Thị Thanh Huyền
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: “Sử dụng kỹ thuật
PCR khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu” là do tôi thực
hiện với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS Khuất
Hữu Thanh. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức
nào.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình
bày trong luận văn này.
Hà Nôi, ngày 25 tháng 03 năm 2013
Học viên
Đặng Thị Thanh Huyền
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... v
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
TỔNG QUAN .................................................................................................. 3
I.1 Truyền máu ............................................................................................ 3
I.1.1 Khái quát chung về truyền máu ........................................................ 3
I.1.2. Các chế phẩm máu ........................................................................... 4
I.2 Nhiễm khuẩn trong truyền máu........................................................... 6
I.2.1 Yêu cầu về truyền máu ..................................................................... 6
I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn trong truyền máu ........................................ 7
I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh . 9
I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus .................................................... 10
I.3.1 Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng ......................................................... 10
I.3.2 Phân loại ......................................................................................... 11
I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng ............................................................... 12
I.4 Một số kỹ thuật phát hiện tụ cầu vàng .............................................. 17
I.4.1.Phương pháp chuẩn đoán vi sinh .................................................... 18
I.4.2 Kỹ thuật phân tử ............................................................................. 20
PHẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 30
II.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 30
II.2 Thiết bị, hoá chất và sinh phẩm........................................................ 30
II.2.1 Trang thiết bị ................................................................................. 30
II.2.2 Hoá chất và sinh phẩm .................................................................. 30
II.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 31
iii
II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu .............................................................. 31
III.3.2 Phương pháp phân lập .................................................................. 33
III.3.3 Phương pháp PCR xác định gen 16S của tụ cầu vàng ................. 34
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39
III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................................... 39
III.2. Tách chiết ADN tổng số: ................................................................. 40
III.3. Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. aureus ............. 43
III.4. Tinh sạch ADN ................................................................................. 44
III.4. Đọc trình tự và so sánh trên ngân hàng gen quốc tế .................... 45
PHẦN IV: KẾT LUẬN ................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 53
iv
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
AND Axit deoxyribonucleic
RNA Axit ribonucleic
dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates
EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid
Epd Eppendorf
EtBr Ethidium bromide
LB Lauria- Bertani
mRNA RNA thông tin
PCR Polymerase Chain Reaction
Rnase Ribonuclease
Sol I, Sol II, Sol III Solution I, Solution II, Solution III
TAE Tris- acetate- EDTA
Taq polymerase Polymerase Thermus aquaticus
TE Tris- EDTA
X- gal 5- Bomo- chlorua 3- β- D- galactoside
ACD Acid citric, citrat natri, dextrose
CPD Citrat, phosphat, dextrose
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ ....8
Bảng 1.2 Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S. aureus ............................ 14
Bảng 1.3 Bảng phân biệt S. aureus và S. epidemidis, S. saprophyticus ......... 18
Bảng 2.1. Bảng lấy mẫu và kí hiệu mẫu ......................................................... 32
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 35
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen ........................... 37
Bảng 3.1 Các mẫu nhiễm khuẩn khi phân lập ................................................ 40
Bảng 3.2. Nồng độ ADN của các mẫu thu được tại bệnh viện Nhi TW......... 41
Bảng 3.3. Nồng độ ADN tinh sạch của các PCR từ mẫu tiểu cầu sau truyền
ngày 1 và 5 ...................................................................................................... 44
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh túi máu ................................................................................ 3
Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu .......................................................................... 4
Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus .......................................... 11
Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus ...................................................... 12
Hình 1.5 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus ............................... 15
Hình 1.6 Hình ảnh S. aureus bắt màu Gram ................................................... 19
Hình 1.7 Các bước thực hiện LAMP .............................................................. 26
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn thuộc chi staphylococcus
......................................................................................................................... 46
vii
MỞ ĐẦU
Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm
nào thay thế được máu. Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày càng
tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa. Do vậy truyền máu là một vấn đề
được nhiều người quan tâm, đặc biệt là công tác sàng lọc và chống nhiễm
khuẩn. Một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn trong truyền máu là tụ cầu
vàng (Staphylococcus aureus)
Tụ cầu vàng có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng
kháng sinh của chúng rất mạnh. Tụ cầu vàng thường gây những bệnh nhiễm
trùng da. Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ hoặc to. Tổn thương tại chố có
thể nhẹ nhàng nhưng nó cũng là một mối nguy cơ phát tán vi khuẩn đến
những cơ quan xa hơn.
Trẻ sơ sinh và người mắc bệnh mạn tính là đối tượng dễ bị tụ cầu xâm
nhập nhất. Người cao tuổi, bị suy nhược, người lạm dụng thuốc kháng sinh,
bệnh nhân đái tháo đường, xơ túi mật…cũng có nguy cơ cao nhiễm loại vi
khuẩn này.
Hiểu được mối nguy hại mà tụ cầu vàng mang đến trong truyền máu
mà chúng tôi tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát sự nhiễm
khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu. Đề tài được thực hiện tại Bệnh viện
Nhi TW.
Mục đích của đề tài:
- Khảo sát sự nhiễm khuẩn của tụ cầu vàng trong các chế phẩm máu
được truyền cho bệnh nhân bằng phương pháp hiệu quả mà tiết kiệm
thời gian.
- Định hướng trong việc sàng lọc vi khuẩn trong nguốn cung cấp máu
cho bệnh nhân
1
Đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:
Thu ththập mẫu Phân lập
Tăng sinh
Tách chiết ADN
Xác định nồng độ ADN bằng máy quang phổ
Tinh sạch và PCR
Điện di
Tinh sạch
Giải trình tự gen và dựng cây phân loại
2
TỔNG QUAN
I.1 Truyền máu
I.1.1 Khái quát chung về truyền máu
Truyền máu là một khâu trọng yếu của hệ thống cấp cứu và điều trị
thương bệnh binh, bệnh nhân và nạn nhân.
Truyền máu lâm sàng là các hoạt động liên quan đến việc đưa máu và
các thành phần máu vào mạch máu của người nhận với mục đích điều trị y
học.
Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm
nào có thể thay thế được máu. Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày
càng tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa.
Hình 1.1 Hình ảnh túi máu
Việc truyền máu và chế phẩm máu là nhằm mục đích chữa bệnh. Vì
vậy máu và chế phẩm máu phải được sử dụng cho đúng bệnh nhân và vào
thời điểm thích hợp. Tổ chức Y tế thế giới có khẩu hiệu là truyền đúng loại,
cho đúng bệnh nhân cần, và đúng thời điểm. Nếu không cần thiết phải truyền
máu hay chế phẩm, nếu còn biện pháp khác để thay thế thì việc truyền máu và
chế phẩm là chống chỉ định.
3
Tác dụng của truyền máu:
Cung cấp các thành phần hữu hình: hồng cầu, tiểu cầu… có thể
cả bạch cầu với bệnh nhân tuyệt lạc bạch cầu.
Cung cấp các yếu tố đông máu.
Cung cấp protein tạo áp lực keo.
Các nguy cơ do truyền máu:
Lây bệnh truyền qua đường máu: các virus, vi khuẩn.
Các tai biến do truyền máu.
Ứ sắt do truyền máu.
Gây phản ứng miễn dịch tiềm tàng.
I.1.2. Các chế phẩm máu
Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu
Máu toàn phần
Máu toàn phần là máu được lấy từ mạch máu của người, bao gồm tất cả
các loại tế bào và thành phần.
Là máu tĩnh mạch của người hiến máu được lấy vào túi nhựa dẻo đã có
chứa sẵn dung dịch chống đông. Máu toàn phần gồm có các thành phần hữu
hình gồm các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương. Máu toàn
phần có lượng hemoglobin không thấp hơn 10g/100ml máu toàn phần có
4
chống đông [3,16].
Máu toàn phần được bảo quản ở +20C đến +60C trong tủ lạnh chuyên dùng
cho ngân hàng máu với bảng nhiệt độ theo dõi và các thiết bị cảnh báo.
Máu toàn phần có thể bảo quản được 21 ngày với chất chống đông ACD
(acid citric, citrat natri, dextrose); 28 ngày với chất chống đông CPD (citrat,
phosphat, dextrose); 35ngày với chất chống đông CPDA1 (CPD có bổ sung
thêm adenin) [3,29].
Khối hồng cầu
Khối hồng cầu là máu toàn phần đã loại bỏ phần lớn huyết tương, có
hematocrit không vượt quá 75%.
Huyết sắc tố không thấp hơn 10g/100ml.
Khối hồng cầu còn có: khối hồng cầu rửa; khối hồng cầu nghèo bạch cầu,
tiểu cầu.
Bảo quản ở +20C đến +60C trong tủ lạnh chuyên dùng cho ngân hàng máu
với bảng nhiệt độ theo dõi và các thiết bị cảnh báo[28,30].
Hạn sử dụng không quá 42 ngày.
Khối tiểu cầu
Là chế phẩm tiểu cầu đậm đặc được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn
phần (khối tiểu cầu pool) hoặc tách chiết trực tiếp từ 1 người cho.
Khối tiểu cầu pool: Được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn phần, máu để
điều chế tiểu cầu cần phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 200C đến 240C và
không quá 24 giờ sau khi lấy máu.
+ Có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 14 × 109 tiểu cầu tính theo điều chế từ
100ml máu toàn phần. Thể tích là 50 – 60ml.
+ Nếu được điều chế trong hệ thống kín, đựng trong túi dẻo chuyên dùng,
bảo quản ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm theo lắc liên tục và hạn dùng không
quá 5 ngày.
+ Nếu điều chế trong hệ thống hở, bảo quan ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm
theo có lắc liên tục có hạn dùng không quá 24 giờ kể từ khi điều chế [30].
Khối tiểu cầu gạn tách được điều chế từ 1 người cho: Được gạn tách từ
một người cho bằng hệ thống máy tự động
5
+ Có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 300×109 trong thể tích huyết tương không
dưới 300ml với 1 lượt gạn tách.
+ Nếu được điều chế trong hệ thống kín, đựng trong túi dẻo chuyên dùng bảo
quản ở nhiệt độ từ 200C đến 240C kèm theo có lắc liên tục có hạn dùng không
quá 5 ngày kể từ khi lấy máu [30].
Huyết tương
Huyết tương gồm có huyết tương tươi và huyết tương tươi đông lạnh
Huyết tương tưới là huyết tương được điều chế từ máu toàn phần tốt nhất
trong 6 giờ và tối đa không quá 18 giờ kể từ sau khi lấy máu.
Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tươi được làm đông lạnh và được
bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh thấp hơn – 180C. Hạn dùng không quá 12 tháng
khi bảo quản ở - 180 C đến – 250 C; không quá 24 tháng khi bảo quản ở -250C
hoặc thấp hơn.
Ngoài các chế phẩm trên còn có một số chế phẩm khác như: tủa lạnh yếu tố
VIII (là chế phẩm gồm phần tủa hình thành trong quá trình làm tan đông chậm
huyết tương tươi đông lạnh ở nhiệt độ thấp); khối bạch cầu hạt [3,29].
I.2 Nhiễm khuẩn trong truyền máu
I.2.1 Yêu cầu về truyền máu
Truyền máu chỉ đạt hiệu quả khi truyền máu an toàn. An toàn truyền máu
là một qui trình khép kín gồm nhiều giai đoạn từ khi tuyển chọn người hiến
máu, khám lâm sàng, làm các xét nghiệm sàng lọc, thu thập máu, sản xuất các
chế phẩm máu, lưu trữ, phân phối máu... đến chỉ định truyền máu và thực hiện
truyền máu trên lâm sàng [21]
Các xét nghiệm sàng lọc gồm: sàng lọc virus HIV, virus viêm gan B,
virus viêm gan C, giang mai, sốt rét và có thể có cytomegalovirus (CMV). Tất
cả các xét nghiệm trên phải âm tính thì mới thực hiện việc thu gom máu và sản
xuất các chế phẩm máu [1]
Các chế phẩm máu trước khi đem truyền cho bệnh nhân cần đảm bảo
đúng hạn sử dụng, đúng về nhiệt độ bảo quản và phải được làm phản ứng hòa
hợp âm tính.
6
I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn trong truyền máu
Thông thường máu trước khi được lấy đem vào sử dụng chỉ được làm thủ
tục sàng lọc virus, còn vi khuẩn thì không được kiểm soát. Trong khi đó những
ca tử vong liên quan đến nhiễm khuẩn chiếm tỉ lê trên 10% (Theo báo cáo của
Cục Quản lý dược phẩm Mỹ từ năm 1976 đến 1999) [20,22].
Trong khi nguy cơ lây truyền liên quan đến các bệnh do virus như virus
suy giảm miễn dịch ở người HIV và viêm gan đã liên tục giảm trong 40 năm qua
thì nguy cơ lây truyền vi khuẩn vẫn như nhau. Vi khuẩn có thể dễ dàng sinh sôi
nảy nở ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường máu trong quá trình
truyền máu và lưu trữ máu. Một khi máu đã bị nhiễm khuẩn thì chỉ trong vài giờ
chúng có thể đạt số lượng 106/1ml hoặc cao hơn. Số lượng vi khuẩn như vậy mà
truyền máu cho bệnh nhân chỉ trong một khoảng thời gian ngắn đã có thể gây ra
nhiễm trùng mà có thể phát triển thành nhiễm trùng huyết và tử vong[11,36].
Nguyên nhân của nhiễm trùng máu phần lớn là do vi khuẩn gây ra.
Staphylococcus aureus là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng máu, với mức
độ tử vong và biến chứng cao. Tỷ lệ biến chứng gia tăng cùng với thời gian
chậm phát hiện và điều trị nhiễm trùng.
Một số vi khuẩn hay lây truyền trong truyền máu như: Serratia
marcescens, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
sp, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus... Trong số những vi khuẩn này, S.
aureus là vi khuẩn thưởng gây nhiễm khuẩn huyết nhất vì chúng gây nên nhiều
loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đó vi khuẩn xâm nhập
vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết. Đây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ
nhiễm khuẩn huyết tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áo
xe (gan, phổi, não, tủy xương…) hoặc viêm nội tâm mạc [5,8].
Theo ghi nhận FDA của Mỹ có 76 trường hợp tử vong liên quan đến
nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong truyền máu từ năm 2005 đến 2010[22,33].
7
Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ
Organism FY05 FY05 FY06 FY06 FY07 FY07 FY08 FY08 FY09 FY09 FY10 FY10 Total Total
No. % No. % No. % No. % No. % No. % No. %
Babesia* 0 0% 2 29% 3 50% 5 71% 0 0% 1 50% 11 31%
Staphylococcus aureus 3 37% 0 0% 1 17% 1 14% 2 40% 0 0% 7 20%
Escherichia coli 0 0% 3 43% 0 0% 0 0% 0 0% 1 50% 4 11%
Serratia marcescens 2 24% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 6%
Staphylococcus epidermidis 1 13% 0 0% 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 2 6%
Staphylococcus lugdunensis 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Eubacterium limosum 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Morganella morganii 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Yersinia enterocolitica 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Streptococcus dysgalactiae (Group C) 0 0% 0 0% 1 17% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Klebsiella oxytoca 0 0% 0 0% 1 17% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Streptococcus viridans 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Streptococcus pneumoniae 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Staphylococcus warneri 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Total 8 100% 7 100% 6 100% 7 100% 5 100% 2 100% 35 100%
8
Nhìn vào bảng trên thì thấy từ năm 2005 đến năm 2010 S.aureus hầu
như năm nào cũng có mặt trong các ca tử vong có liên quan đến nhiễm khuẩn
với tỉ lệ khá cao.
Một ví dụ điển hình là tháng 7 năm 2000, một người đàn ông 60 tuổi bị
đa u tuỷ nhập viện St-Louis (Paris- Pháp). Lúc đầu nhập viện, số lượng bạch
cầu là 1100tế bào/mm3; tiểu cầu là 26000/mm3. Bệnh nhân đã được truyền
tiểu cầu máy Apheris. Sau 20 phút truyền, phát hiện thấy bệnh nhân ớn lạnh,
tiêu chảy, nôn mửa, nhịp tim nhanh và bị trụy mạch. Nuôi cấy máu tĩnh mạch
của bệnh nhân và lượng tiểu cầu còn sót lại trong túi truyền rồi phân lập thì
thấy phát hiện ra mẫu tiểu cầu truyền cho bệnh nhân đã bị nhiễm S. aureus
[31,36].
Ngày 25 tháng 11 năm 2011, tại Hà Nội, Hội Hồi sức cấp cứu và
Chống độc Việt Nam phối hợp cùng Công ty Dược phẩm Astra Zeneca tổ
chức Hội thảo khoa học quản lý nhiễm khuẩn với chủ đề: “Cập nhật tình hình
tụ cầu vàng tại Việt Nam và giải pháp kháng sinh điều trị”. Theo thống kê,
loại vi khuẩn gây các nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp, vi khuẩn Gram âm
chiếm 60-80%, vi khuẩn Gram dương chiếm 20-40%. Kết quả phân lập các vi
khuẩn gây bệnh tại khoa ICU, bệnh viện Bạch Mai thì tụ cầu vàng được xếp
thứ 3 là nguyên nhân gây bệnh (chiếm 13,9%). Hậu quả của tình trạng này
làm tỷ lệ tử vong tăng, thời gian điều trị kéo dài, chi phí điều trị tăng…Trong
các loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp thì tụ cầu vàng
thuộc nhóm đứng đầu [4,23].
I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh
Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu
Nhiễm khuẩn trong truyền máu có rất nhiều nguyên nhân:
Do người hiến máu bị nhiễm khuẩn: Người hiến máu có thể không có
triệu chứng gì của nhiễm khuẩn mà chỉ đang trong giai đoạn cửa sổ hoặc cũng
9
có thể người đó đang trong giai đoạn hồi phục do bị nhiễm khuẩn [13].
Nhiễm khuẩn trong suốt quá trình thu gom máu: Ô nhiễm tại thời điểm
thu gom máu là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn. Khi lấy máu không sát
trùng cẩn thận là yếu tố gây nhiễm khuẩn. Ngoài ra có thể vi khuẩn xâm nhập
chỉ qua viết kim chọc vào rất nhỏ. Vật liệu sát trùng như bông, cồn bị nhiễm
khuẩn.
Túi thu thập máu bị nhiễm khuẩn: Có thể dây trong bộ túi thu thập bị rò
rỉ cũng là con đường xâm nhập của vi khuẩn.
Quá trình khử khuẩn môi trường làm chế phẩm máu cũng như truyền
máu là nguyên nhân rất lớn gây ra nhiễm khuẩn khi truyền máu.
Biện pháp phòng tránh
Vệ sinh sạch sẽ khu vực lấy máu, làm chế phẩm máu và nơi truyền máu.
Sát trùng kỹ trước khi chọc ven lấy máu và truyền máu.
Các trang thiết bị phục vụ cho công tác lấy máu, làm chê phẩm máu và
truyền máu cần phải đảm bảo vệ sinh.
I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus
I.3.1 Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng
Ngày 9-4-1881 bác sĩ người ScotlADN AlexADNer Ogston đã trình
bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó
ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) trình bày tương đối đầy
đủ vai trò của vi khuẩn này trong bệnh sinh lý mủ trong lâm sàng.
S. aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ
mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ
đầu của lịch sử vi sinh vật học [18,27].
10
Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus
Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương
quan giữa sự hiện diện của hoạt động enzym coagulase huyết tương của vi
khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1984, phát hiện
này mới được chấp nhận rộng rãi [18].
I.3.2 Phân loại
Phân loại Staphylococcus theo khoa học
Giới: Eubacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Giống: Staphylococcus
Loài: aureus
Tên khoa học: Staphylococcus aureus
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính : tụ cầu có enzym coagulase và tụ cầu không có enzym coagulase
[8,27].
11
Tụ cầu không có enzym coagulase: do không có enzym coagulase nên
trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà. Trên lâm sàng
thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng (S. Epidermidis. S.
Saprophyticus...) [5,8].
Tụ cầu có enzym coagulase: Nhờ có enzym coagulase mà trên môi
trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi
khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng. Vi khuẩn quan trọng của nhóm này là
Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng [5,8].
I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng
I.3.3.1 Hình thái và tính chất nuôi cấy tụ cầu vàng
Hình thái
Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,8 µm – 1 µm, ở canh thang thường
tập hợp thành từng cụm nhỏ như chùm nho, hình thức tập hợp này do vi
khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian. Trong bệnh phẩm vi
khuẩn họp thành từng đôi hoặc đám nhỏ. Vi khuẩn bắt màu Gram dương,
không có lông, không nha bào, thường không có vỏ [8,18].
Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus
Đặc điểm nuôi cấy
S.aureus mọc dễ trên nhiều loại môi trường nuôi vấy vi khuẩn ở điều kiện
12
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
--------------------------
ĐẶNG THỊ THANH HUYỀN
SỬ DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SỰ NHIỄM KHUẨN
TỤ CẦU VÀNG TRONG CHẾ PHẨM MÁU
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
T.S NGUYỄN THỊ THANH MAI
PGS.TS KHUẤT HỮU THANH
Hà Nội – 2013
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân,
tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo trong bộ môn
công nghệ sinh học- Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cũng như sự giúp đỡ
của các cán bộ hiện đang công tác tại bệnh viện Nhi TW.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS.
Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS. TS Khuất Hữu Thanh, là những người thầy
cô tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến bạn bè và người thân của tôi
đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành
luận văn.
Hà Nội, ngày 25 tháng 03 năm 2013
Sinh viên
Đặng Thị Thanh Huyền
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sỹ kỹ thuật: “Sử dụng kỹ thuật
PCR khảo sát sự nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu” là do tôi thực
hiện với sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Thanh Mai và PGS.TS Khuất
Hữu Thanh. Đây không phải là bản sao chép của bất kỳ một cá nhân, tổ chức
nào.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình
bày trong luận văn này.
Hà Nôi, ngày 25 tháng 03 năm 2013
Học viên
Đặng Thị Thanh Huyền
ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT ......................................................... v
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
TỔNG QUAN .................................................................................................. 3
I.1 Truyền máu ............................................................................................ 3
I.1.1 Khái quát chung về truyền máu ........................................................ 3
I.1.2. Các chế phẩm máu ........................................................................... 4
I.2 Nhiễm khuẩn trong truyền máu........................................................... 6
I.2.1 Yêu cầu về truyền máu ..................................................................... 6
I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn trong truyền máu ........................................ 7
I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh . 9
I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus .................................................... 10
I.3.1 Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng ......................................................... 10
I.3.2 Phân loại ......................................................................................... 11
I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng ............................................................... 12
I.4 Một số kỹ thuật phát hiện tụ cầu vàng .............................................. 17
I.4.1.Phương pháp chuẩn đoán vi sinh .................................................... 18
I.4.2 Kỹ thuật phân tử ............................................................................. 20
PHẦN II: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 30
II.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 30
II.2 Thiết bị, hoá chất và sinh phẩm........................................................ 30
II.2.1 Trang thiết bị ................................................................................. 30
II.2.2 Hoá chất và sinh phẩm .................................................................. 30
II.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 31
iii
II.3.1 Thu thập mẫu nghiên cứu .............................................................. 31
III.3.2 Phương pháp phân lập .................................................................. 33
III.3.3 Phương pháp PCR xác định gen 16S của tụ cầu vàng ................. 34
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39
III.1. Phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus ..................................... 39
III.2. Tách chiết ADN tổng số: ................................................................. 40
III.3. Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. aureus ............. 43
III.4. Tinh sạch ADN ................................................................................. 44
III.4. Đọc trình tự và so sánh trên ngân hàng gen quốc tế .................... 45
PHẦN IV: KẾT LUẬN ................................................................................. 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 53
iv
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT
AND Axit deoxyribonucleic
RNA Axit ribonucleic
dNTP Deoxyribonucleotide 5’- triphosphates
EDTA Ethylen diamin tetraacetic acid
Epd Eppendorf
EtBr Ethidium bromide
LB Lauria- Bertani
mRNA RNA thông tin
PCR Polymerase Chain Reaction
Rnase Ribonuclease
Sol I, Sol II, Sol III Solution I, Solution II, Solution III
TAE Tris- acetate- EDTA
Taq polymerase Polymerase Thermus aquaticus
TE Tris- EDTA
X- gal 5- Bomo- chlorua 3- β- D- galactoside
ACD Acid citric, citrat natri, dextrose
CPD Citrat, phosphat, dextrose
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ ....8
Bảng 1.2 Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S. aureus ............................ 14
Bảng 1.3 Bảng phân biệt S. aureus và S. epidemidis, S. saprophyticus ......... 18
Bảng 2.1. Bảng lấy mẫu và kí hiệu mẫu ......................................................... 32
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR ...................................................... 35
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen ........................... 37
Bảng 3.1 Các mẫu nhiễm khuẩn khi phân lập ................................................ 40
Bảng 3.2. Nồng độ ADN của các mẫu thu được tại bệnh viện Nhi TW......... 41
Bảng 3.3. Nồng độ ADN tinh sạch của các PCR từ mẫu tiểu cầu sau truyền
ngày 1 và 5 ...................................................................................................... 44
vi
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh túi máu ................................................................................ 3
Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu .......................................................................... 4
Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus .......................................... 11
Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus ...................................................... 12
Hình 1.5 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus ............................... 15
Hình 1.6 Hình ảnh S. aureus bắt màu Gram ................................................... 19
Hình 1.7 Các bước thực hiện LAMP .............................................................. 26
Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn thuộc chi staphylococcus
......................................................................................................................... 46
vii
MỞ ĐẦU
Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm
nào thay thế được máu. Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày càng
tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa. Do vậy truyền máu là một vấn đề
được nhiều người quan tâm, đặc biệt là công tác sàng lọc và chống nhiễm
khuẩn. Một trong những tác nhân gây nhiễm khuẩn trong truyền máu là tụ cầu
vàng (Staphylococcus aureus)
Tụ cầu vàng có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề kháng
kháng sinh của chúng rất mạnh. Tụ cầu vàng thường gây những bệnh nhiễm
trùng da. Các ổ nhiễm trùng này có thể chỉ nhỏ hoặc to. Tổn thương tại chố có
thể nhẹ nhàng nhưng nó cũng là một mối nguy cơ phát tán vi khuẩn đến
những cơ quan xa hơn.
Trẻ sơ sinh và người mắc bệnh mạn tính là đối tượng dễ bị tụ cầu xâm
nhập nhất. Người cao tuổi, bị suy nhược, người lạm dụng thuốc kháng sinh,
bệnh nhân đái tháo đường, xơ túi mật…cũng có nguy cơ cao nhiễm loại vi
khuẩn này.
Hiểu được mối nguy hại mà tụ cầu vàng mang đến trong truyền máu
mà chúng tôi tiến hành đề tài: Sử dụng kỹ thuật PCR khảo sát sự nhiễm
khuẩn tụ cầu vàng trong chế phẩm máu. Đề tài được thực hiện tại Bệnh viện
Nhi TW.
Mục đích của đề tài:
- Khảo sát sự nhiễm khuẩn của tụ cầu vàng trong các chế phẩm máu
được truyền cho bệnh nhân bằng phương pháp hiệu quả mà tiết kiệm
thời gian.
- Định hướng trong việc sàng lọc vi khuẩn trong nguốn cung cấp máu
cho bệnh nhân
1
Đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:
Thu ththập mẫu Phân lập
Tăng sinh
Tách chiết ADN
Xác định nồng độ ADN bằng máy quang phổ
Tinh sạch và PCR
Điện di
Tinh sạch
Giải trình tự gen và dựng cây phân loại
2
TỔNG QUAN
I.1 Truyền máu
I.1.1 Khái quát chung về truyền máu
Truyền máu là một khâu trọng yếu của hệ thống cấp cứu và điều trị
thương bệnh binh, bệnh nhân và nạn nhân.
Truyền máu lâm sàng là các hoạt động liên quan đến việc đưa máu và
các thành phần máu vào mạch máu của người nhận với mục đích điều trị y
học.
Ngày nay khoa học không ngừng phát triển nhưng chưa có chế phẩm
nào có thể thay thế được máu. Nhu cầu sử dụng máu và chế phẩm máu ngày
càng tăng trong điều trị nội khoa và ngoại khoa.
Hình 1.1 Hình ảnh túi máu
Việc truyền máu và chế phẩm máu là nhằm mục đích chữa bệnh. Vì
vậy máu và chế phẩm máu phải được sử dụng cho đúng bệnh nhân và vào
thời điểm thích hợp. Tổ chức Y tế thế giới có khẩu hiệu là truyền đúng loại,
cho đúng bệnh nhân cần, và đúng thời điểm. Nếu không cần thiết phải truyền
máu hay chế phẩm, nếu còn biện pháp khác để thay thế thì việc truyền máu và
chế phẩm là chống chỉ định.
3
Tác dụng của truyền máu:
Cung cấp các thành phần hữu hình: hồng cầu, tiểu cầu… có thể
cả bạch cầu với bệnh nhân tuyệt lạc bạch cầu.
Cung cấp các yếu tố đông máu.
Cung cấp protein tạo áp lực keo.
Các nguy cơ do truyền máu:
Lây bệnh truyền qua đường máu: các virus, vi khuẩn.
Các tai biến do truyền máu.
Ứ sắt do truyền máu.
Gây phản ứng miễn dịch tiềm tàng.
I.1.2. Các chế phẩm máu
Hình 1.2 Sơ đồ chế phẩm máu
Máu toàn phần
Máu toàn phần là máu được lấy từ mạch máu của người, bao gồm tất cả
các loại tế bào và thành phần.
Là máu tĩnh mạch của người hiến máu được lấy vào túi nhựa dẻo đã có
chứa sẵn dung dịch chống đông. Máu toàn phần gồm có các thành phần hữu
hình gồm các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và huyết tương. Máu toàn
phần có lượng hemoglobin không thấp hơn 10g/100ml máu toàn phần có
4
chống đông [3,16].
Máu toàn phần được bảo quản ở +20C đến +60C trong tủ lạnh chuyên dùng
cho ngân hàng máu với bảng nhiệt độ theo dõi và các thiết bị cảnh báo.
Máu toàn phần có thể bảo quản được 21 ngày với chất chống đông ACD
(acid citric, citrat natri, dextrose); 28 ngày với chất chống đông CPD (citrat,
phosphat, dextrose); 35ngày với chất chống đông CPDA1 (CPD có bổ sung
thêm adenin) [3,29].
Khối hồng cầu
Khối hồng cầu là máu toàn phần đã loại bỏ phần lớn huyết tương, có
hematocrit không vượt quá 75%.
Huyết sắc tố không thấp hơn 10g/100ml.
Khối hồng cầu còn có: khối hồng cầu rửa; khối hồng cầu nghèo bạch cầu,
tiểu cầu.
Bảo quản ở +20C đến +60C trong tủ lạnh chuyên dùng cho ngân hàng máu
với bảng nhiệt độ theo dõi và các thiết bị cảnh báo[28,30].
Hạn sử dụng không quá 42 ngày.
Khối tiểu cầu
Là chế phẩm tiểu cầu đậm đặc được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn
phần (khối tiểu cầu pool) hoặc tách chiết trực tiếp từ 1 người cho.
Khối tiểu cầu pool: Được điều chế từ nhiều đơn vị máu toàn phần, máu để
điều chế tiểu cầu cần phải được bảo quản ở nhiệt độ từ 200C đến 240C và
không quá 24 giờ sau khi lấy máu.
+ Có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 14 × 109 tiểu cầu tính theo điều chế từ
100ml máu toàn phần. Thể tích là 50 – 60ml.
+ Nếu được điều chế trong hệ thống kín, đựng trong túi dẻo chuyên dùng,
bảo quản ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm theo lắc liên tục và hạn dùng không
quá 5 ngày.
+ Nếu điều chế trong hệ thống hở, bảo quan ở nhiệt độ 200C đến 240C kèm
theo có lắc liên tục có hạn dùng không quá 24 giờ kể từ khi điều chế [30].
Khối tiểu cầu gạn tách được điều chế từ 1 người cho: Được gạn tách từ
một người cho bằng hệ thống máy tự động
5
+ Có số lượng tiểu cầu tối thiểu là 300×109 trong thể tích huyết tương không
dưới 300ml với 1 lượt gạn tách.
+ Nếu được điều chế trong hệ thống kín, đựng trong túi dẻo chuyên dùng bảo
quản ở nhiệt độ từ 200C đến 240C kèm theo có lắc liên tục có hạn dùng không
quá 5 ngày kể từ khi lấy máu [30].
Huyết tương
Huyết tương gồm có huyết tương tươi và huyết tương tươi đông lạnh
Huyết tương tưới là huyết tương được điều chế từ máu toàn phần tốt nhất
trong 6 giờ và tối đa không quá 18 giờ kể từ sau khi lấy máu.
Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tươi được làm đông lạnh và được
bảo quản ở nhiệt độ đông lạnh thấp hơn – 180C. Hạn dùng không quá 12 tháng
khi bảo quản ở - 180 C đến – 250 C; không quá 24 tháng khi bảo quản ở -250C
hoặc thấp hơn.
Ngoài các chế phẩm trên còn có một số chế phẩm khác như: tủa lạnh yếu tố
VIII (là chế phẩm gồm phần tủa hình thành trong quá trình làm tan đông chậm
huyết tương tươi đông lạnh ở nhiệt độ thấp); khối bạch cầu hạt [3,29].
I.2 Nhiễm khuẩn trong truyền máu
I.2.1 Yêu cầu về truyền máu
Truyền máu chỉ đạt hiệu quả khi truyền máu an toàn. An toàn truyền máu
là một qui trình khép kín gồm nhiều giai đoạn từ khi tuyển chọn người hiến
máu, khám lâm sàng, làm các xét nghiệm sàng lọc, thu thập máu, sản xuất các
chế phẩm máu, lưu trữ, phân phối máu... đến chỉ định truyền máu và thực hiện
truyền máu trên lâm sàng [21]
Các xét nghiệm sàng lọc gồm: sàng lọc virus HIV, virus viêm gan B,
virus viêm gan C, giang mai, sốt rét và có thể có cytomegalovirus (CMV). Tất
cả các xét nghiệm trên phải âm tính thì mới thực hiện việc thu gom máu và sản
xuất các chế phẩm máu [1]
Các chế phẩm máu trước khi đem truyền cho bệnh nhân cần đảm bảo
đúng hạn sử dụng, đúng về nhiệt độ bảo quản và phải được làm phản ứng hòa
hợp âm tính.
6
I.2.2 Tình hình nhiễm khuẩn trong truyền máu
Thông thường máu trước khi được lấy đem vào sử dụng chỉ được làm thủ
tục sàng lọc virus, còn vi khuẩn thì không được kiểm soát. Trong khi đó những
ca tử vong liên quan đến nhiễm khuẩn chiếm tỉ lê trên 10% (Theo báo cáo của
Cục Quản lý dược phẩm Mỹ từ năm 1976 đến 1999) [20,22].
Trong khi nguy cơ lây truyền liên quan đến các bệnh do virus như virus
suy giảm miễn dịch ở người HIV và viêm gan đã liên tục giảm trong 40 năm qua
thì nguy cơ lây truyền vi khuẩn vẫn như nhau. Vi khuẩn có thể dễ dàng sinh sôi
nảy nở ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường máu trong quá trình
truyền máu và lưu trữ máu. Một khi máu đã bị nhiễm khuẩn thì chỉ trong vài giờ
chúng có thể đạt số lượng 106/1ml hoặc cao hơn. Số lượng vi khuẩn như vậy mà
truyền máu cho bệnh nhân chỉ trong một khoảng thời gian ngắn đã có thể gây ra
nhiễm trùng mà có thể phát triển thành nhiễm trùng huyết và tử vong[11,36].
Nguyên nhân của nhiễm trùng máu phần lớn là do vi khuẩn gây ra.
Staphylococcus aureus là nguyên nhân hàng đầu của nhiễm trùng máu, với mức
độ tử vong và biến chứng cao. Tỷ lệ biến chứng gia tăng cùng với thời gian
chậm phát hiện và điều trị nhiễm trùng.
Một số vi khuẩn hay lây truyền trong truyền máu như: Serratia
marcescens, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas
sp, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus... Trong số những vi khuẩn này, S.
aureus là vi khuẩn thưởng gây nhiễm khuẩn huyết nhất vì chúng gây nên nhiều
loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, từ đó vi khuẩn xâm nhập
vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết. Đây là một nhiễm trùng rất nặng. Từ
nhiễm khuẩn huyết tụ cầu vàng đi tới các cơ quan khác nhau và gây nên các ổ áo
xe (gan, phổi, não, tủy xương…) hoặc viêm nội tâm mạc [5,8].
Theo ghi nhận FDA của Mỹ có 76 trường hợp tử vong liên quan đến
nhiễm khuẩn tụ cầu vàng trong truyền máu từ năm 2005 đến 2010[22,33].
7
Bảng 1.1 Nhiễm khuẩn liên quan đến sinh vật, 2005 đến năm 2010 của FDA, Mỹ
Organism FY05 FY05 FY06 FY06 FY07 FY07 FY08 FY08 FY09 FY09 FY10 FY10 Total Total
No. % No. % No. % No. % No. % No. % No. %
Babesia* 0 0% 2 29% 3 50% 5 71% 0 0% 1 50% 11 31%
Staphylococcus aureus 3 37% 0 0% 1 17% 1 14% 2 40% 0 0% 7 20%
Escherichia coli 0 0% 3 43% 0 0% 0 0% 0 0% 1 50% 4 11%
Serratia marcescens 2 24% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 6%
Staphylococcus epidermidis 1 13% 0 0% 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 2 6%
Staphylococcus lugdunensis 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Eubacterium limosum 1 13% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Morganella morganii 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Yersinia enterocolitica 0 0% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Streptococcus dysgalactiae (Group C) 0 0% 0 0% 1 17% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Klebsiella oxytoca 0 0% 0 0% 1 17% 0 0% 0 0% 0 0% 1 3%
Streptococcus viridans 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Streptococcus pneumoniae 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Staphylococcus warneri 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 0 0% 1 3%
Total 8 100% 7 100% 6 100% 7 100% 5 100% 2 100% 35 100%
8
Nhìn vào bảng trên thì thấy từ năm 2005 đến năm 2010 S.aureus hầu
như năm nào cũng có mặt trong các ca tử vong có liên quan đến nhiễm khuẩn
với tỉ lệ khá cao.
Một ví dụ điển hình là tháng 7 năm 2000, một người đàn ông 60 tuổi bị
đa u tuỷ nhập viện St-Louis (Paris- Pháp). Lúc đầu nhập viện, số lượng bạch
cầu là 1100tế bào/mm3; tiểu cầu là 26000/mm3. Bệnh nhân đã được truyền
tiểu cầu máy Apheris. Sau 20 phút truyền, phát hiện thấy bệnh nhân ớn lạnh,
tiêu chảy, nôn mửa, nhịp tim nhanh và bị trụy mạch. Nuôi cấy máu tĩnh mạch
của bệnh nhân và lượng tiểu cầu còn sót lại trong túi truyền rồi phân lập thì
thấy phát hiện ra mẫu tiểu cầu truyền cho bệnh nhân đã bị nhiễm S. aureus
[31,36].
Ngày 25 tháng 11 năm 2011, tại Hà Nội, Hội Hồi sức cấp cứu và
Chống độc Việt Nam phối hợp cùng Công ty Dược phẩm Astra Zeneca tổ
chức Hội thảo khoa học quản lý nhiễm khuẩn với chủ đề: “Cập nhật tình hình
tụ cầu vàng tại Việt Nam và giải pháp kháng sinh điều trị”. Theo thống kê,
loại vi khuẩn gây các nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp, vi khuẩn Gram âm
chiếm 60-80%, vi khuẩn Gram dương chiếm 20-40%. Kết quả phân lập các vi
khuẩn gây bệnh tại khoa ICU, bệnh viện Bạch Mai thì tụ cầu vàng được xếp
thứ 3 là nguyên nhân gây bệnh (chiếm 13,9%). Hậu quả của tình trạng này
làm tỷ lệ tử vong tăng, thời gian điều trị kéo dài, chi phí điều trị tăng…Trong
các loại vi khuẩn gây nhiễm khuẩn bệnh viện thường gặp thì tụ cầu vàng
thuộc nhóm đứng đầu [4,23].
I.2.3 Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu và cách phòng tránh
Nguyên nhân nhiễm khuẩn trong truyền máu
Nhiễm khuẩn trong truyền máu có rất nhiều nguyên nhân:
Do người hiến máu bị nhiễm khuẩn: Người hiến máu có thể không có
triệu chứng gì của nhiễm khuẩn mà chỉ đang trong giai đoạn cửa sổ hoặc cũng
9
có thể người đó đang trong giai đoạn hồi phục do bị nhiễm khuẩn [13].
Nhiễm khuẩn trong suốt quá trình thu gom máu: Ô nhiễm tại thời điểm
thu gom máu là nguyên nhân chính gây nhiễm khuẩn. Khi lấy máu không sát
trùng cẩn thận là yếu tố gây nhiễm khuẩn. Ngoài ra có thể vi khuẩn xâm nhập
chỉ qua viết kim chọc vào rất nhỏ. Vật liệu sát trùng như bông, cồn bị nhiễm
khuẩn.
Túi thu thập máu bị nhiễm khuẩn: Có thể dây trong bộ túi thu thập bị rò
rỉ cũng là con đường xâm nhập của vi khuẩn.
Quá trình khử khuẩn môi trường làm chế phẩm máu cũng như truyền
máu là nguyên nhân rất lớn gây ra nhiễm khuẩn khi truyền máu.
Biện pháp phòng tránh
Vệ sinh sạch sẽ khu vực lấy máu, làm chế phẩm máu và nơi truyền máu.
Sát trùng kỹ trước khi chọc ven lấy máu và truyền máu.
Các trang thiết bị phục vụ cho công tác lấy máu, làm chê phẩm máu và
truyền máu cần phải đảm bảo vệ sinh.
I.3 Khái quát về Staphylococcus aerus
I.3.1 Lịch sử phát hiện tụ cầu vàng
Ngày 9-4-1881 bác sĩ người ScotlADN AlexADNer Ogston đã trình
bày tại hội nghị lần thứ 9 Hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học trong đó
ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) trình bày tương đối đầy
đủ vai trò của vi khuẩn này trong bệnh sinh lý mủ trong lâm sàng.
S. aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ
mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ
đầu của lịch sử vi sinh vật học [18,27].
10
Hình 1.3 Tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus
Năm 1926, Julius von Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương
quan giữa sự hiện diện của hoạt động enzym coagulase huyết tương của vi
khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1984, phát hiện
này mới được chấp nhận rộng rãi [18].
I.3.2 Phân loại
Phân loại Staphylococcus theo khoa học
Giới: Eubacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Staphylococcaceae
Giống: Staphylococcus
Loài: aureus
Tên khoa học: Staphylococcus aureus
Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn được chia thành hai nhóm
chính : tụ cầu có enzym coagulase và tụ cầu không có enzym coagulase
[8,27].
11
Tụ cầu không có enzym coagulase: do không có enzym coagulase nên
trên môi trường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà. Trên lâm sàng
thường gọi các vi khuẩn này là tụ cầu trắng (S. Epidermidis. S.
Saprophyticus...) [5,8].
Tụ cầu có enzym coagulase: Nhờ có enzym coagulase mà trên môi
trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng. Do vậy vi
khuẩn này còn gọi là tụ cầu vàng. Vi khuẩn quan trọng của nhóm này là
Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng [5,8].
I.3.3 Đặc điểm của tụ cầu vàng
I.3.3.1 Hình thái và tính chất nuôi cấy tụ cầu vàng
Hình thái
Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0,8 µm – 1 µm, ở canh thang thường
tập hợp thành từng cụm nhỏ như chùm nho, hình thức tập hợp này do vi
khuẩn phân bào theo nhiều chiều trong không gian. Trong bệnh phẩm vi
khuẩn họp thành từng đôi hoặc đám nhỏ. Vi khuẩn bắt màu Gram dương,
không có lông, không nha bào, thường không có vỏ [8,18].
Hình 1.4 Hình thể Staphylococcus aureus
Đặc điểm nuôi cấy
S.aureus mọc dễ trên nhiều loại môi trường nuôi vấy vi khuẩn ở điều kiện
12