So sánh và đánh giá phương pháp multiplex pcr trong phát hiện candida spp. từ mẫu bệnh phẩm
- 101 trang
- file .pdf
.
TÔN HOÀNG DIỆU - KHÓA: 2019 – 2021 - NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TÔN HOÀNG DIỆU
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT HIỆN CANDIDA SPP.
TỪ MẪU BỆNH PHẨM
LUẬN VĂN DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TÔN HOÀNG DIỆU
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT HIỆN CANDIDA SPP.
TỪ MẪU BỆNH PHẨM
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8.72.02.10
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. NGUYỄN TÚ ANH
2. TS. TRẦN QUỐC VIỆT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. ix
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM CANDIDA SPP. ..................................................4
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CANDIDA...........................................10
1.3. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CANDIDA SPP. BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR ................................................................................................16
1.4. NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ...............................................18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................21
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................21
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................24
2.4. Y ĐỨC ............................................................................................................32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 33
3.1. Đặc điểm mẫu nấm thu được từ bệnh phẩm ...................................................33
3.2. Kết quả phát hiện Candida spp. bằng phương pháp truyền thống. ................36
3.3. Phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật multiplex PCR ...................................53
3.4. Đánh giá quy trình phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật multiplex PCR ....56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 61
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 66
5.1. KẾT LUẬN.....................................................................................................66
5.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70
Phụ lục 1: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Đại Học Y Dược TP. HCM
.........................................................................................................................PL1-1
.
.
Phụ lục 2: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Lê Văn Thịnh ...............PL2-1
Phụ lục 3: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Quân Y 175 ..................PL3-1
Phụ lục 4: Kết quả phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp nghiên cứu
.........................................................................................................................PL4-1
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là luận văn nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu khác.
Tác giả
Tôn Hoàng Diệu
.
.
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT
HIỆN CANDIDA SPP. TỪ MẪU BỆNH PHẨM
TÓM TẮT
Mục tiêu:
1. Phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng
kỹ thuật multiplex PCR và bằng phương pháp truyền thống.
2. So sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C.
tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR
Phương pháp nghiên cứu: Mẫu Candida spp. được thu nhận tại Bệnh viện Đại học
Y Dược TP. HCM, Bệnh viện Lê Văn Thịnh và Bệnh viện Quân đội 175 từ tháng
10/2020 đến tháng 5/2021. Vi nấm được phát hiện 3 bằng phương pháp: (1) thử
nghiệm tạo ống mầm, (2) phân lập trên môi trường CHROMagar Candida và (3) kỹ
thuật multiplex PCR. Sau đó, tiến hành so sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ
thuật multiplex PCR và phương pháp phát hiện trên CHROMagar Candida, dựa trên
độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm, độ lập lại và độ
chính xác.
Kết quả: Phân lập trên môi trường CHROMagar Candida: có 186 chủng phân lập
được với tỷ lệ nhiễm cao nhất là C. albicans 112/186 (55,45%), C. tropicalis 39/186
(19,31%), C. glabrata hoặc C. parapsilosis 35/189 (17,33%) và 16 mẫu nghi ngờ
không thuộc chi Candida. Định danh bằng kỹ thuật multiplex PCR: có 186 sản phẩm
PCR được phát hiện, trong đó C. albicans 112/186 (55,45%), C. tropicalis 39/186
(19,31%), C. glabrata 25/186 (12,38%), C. parapsolosis 10/189 (4,59%) và 16 mẫu
không phát hiện sản phẩm PCR.
Quy trình multiplex PCR phát hiện 4 loài Candida spp. được đánh giá các chỉ tiêu,
có 5 chỉ tiêu đạt yêu cầu theo hướng dẫn của Bộ Y tế (2016): độ nhạy (93,33%), độ
đặc hiệu (100%), độ chính xác (96,19%), giá trị tiên đoán dương (100%), độ lặp lại
(đạt), giá trị tiên đoán âm (66,67%) < 90%.
.
.
COMPARITION AND EVALUATION OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE
PROCESS OF THE IDENTIFICATION CANDIDA SPP.
FROM PATIENT SAMPLES
ABSTRACT
Ojective:
1. Detection of 4 species of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C.
parapsilosis by multiplex PCR and traditional methods.
2. Compare and evaluate the process of detecting 4 species of C. albicans, C.
glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis from patient samples by multiplex
PCR technique
Method: Sample Candida spp. was admitted at the University Medical Center – Ho
Chi Minh City, Le Van Thinh Hospital and Military Hospital 175 from October 2020
to May 2021. The fungus was detected by 3 methods: (1) Germ tube, (2) isolation on
CHROMagar Candida medium and (3) multiplex PCR technique. Then, compare and
evaluate the detection process of 4 species of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis
and C. parapsilosis from patient samples by multiplex PCR technique and detection
method on CHROMagar Candida, based on sensitivity, specificity, positive
predictive value, negative predictive value, repeatability and accuracy.
Results: Isolated on CHROMagar Candida medium: 186 isolates with the highest
infection rate being C. albicans 112/186 (55.45%), C. tropicalis 39/186 (19.31%), C.
glabrata or C. parapsilosis 35/189 (17.33%) and 16 samples suspected of not
belonging Candida. Identification by multiplex PCR: 186 PCR products were
detected, of which C. albicans 112/186 (55.45%), C. tropicalis 39/186 (19.31%), C.
glabrata 25/ 186 (12.38%), C. parapsolosis 10/189 (4.59%) and 16 samples did not
detect PCR products.
Multiplex PCR procedure detected 4 species of Candida spp. The criteria were
evaluated, there were 5 satisfactory criteria according to the guidance of the Ministry
of Health (2016): sensitivity (93.33%), specificity (100%), accuracy (96.19%),
.
.
positive predictive value (100%), repeatability (pass), negative predictive value
(66.67%) < 90%.
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
PCR Polymerase Chain Reaction
IGS Intergenic spacer Vùng đệm trong được sao mã
DNA Deoxyribonucleic acid
PPV Positive Predictable Value Giá trị tiên đoán dương
NPV Negative Predictable Value Giá trị tiên đoán âm
TP True positive Dương tính thật
TN True negative Âm tính thật
FP False positive Dương tính giả
FN False negative Âm tính giả
Recurrent Vulvovaginal
RVVC Viêm âm đạo do nấm
Candidiasis
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thiết bị ......................................................................................................22
Bảng 2.2. Hóa chất ....................................................................................................22
Bảng 2.3. Hình thái khóm nấm trên môi trường CHROMagar Candida ..................25
Bảng 2.4. Kết quả lên men đường của 4 loài Candida spp. ......................................27
Bảng 2.5. Thành phần của multiplex PCR ................................................................29
Bảng 2.6. Trình tự mồi của Candida spp. .................................................................29
Bảng 2.7. Chương trình PCR ....................................................................................30
Bảng 3.1. Mẫu nấm thu nhận từ 3 bệnh viện ............................................................33
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm nấm Candida spp. theo nhóm tuổi và giới tính ....................34
Bảng 3.3. Loại mẫu bệnh phẩm nhiễm Candida spp. ...............................................34
Bảng 3.4. Kết quả phân lập 4 loài Candida spp. trên CHROMagar Candida ..........45
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm tạo ống mầm.............................................................48
Bảng 3.6. Kết quả phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm.................................57
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hệ thống phân loại Candida spp. ................................................................4
Hình 1.2. Candida spp. quan sát dưới kính hiển vi.....................................................7
Hình 1.3. Sơ đồ vùng IGS .........................................................................................10
Hình 1.4. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi x100 ...............................................11
Hình 1.5. Bào tử bao dày ..........................................................................................12
Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng PCR .................................................................................14
Hình 1.7. Kỹ thuật multiplex PCR ............................................................................15
Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu.......................................................................24
Hình 2.2. Màu sắc khóm nấm Candida spp. trên môi trường CHROMagar Candida
..................................................................................................................25
Hình 2.3. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi X100 ..............................................26
Hình 2.4. Phản ứng lên men đường ..........................................................................27
Hình 3.1. Các mẫu bệnh phẩm nhiễm đồng thời 2 loài Candida spp. ......................35
Hình 3.2. Kết quả phân lập Candida spp. trên môi trường CHROMagar Candida ..44
Hình 3.3. Các mẫu không phân biệt được Candida spp. trên môi trường
CHROMagar Candida ..............................................................................46
Hình 3.4. Các mẫu có hơn 2 lọại khóm trên môi trường CHROMagar Candida .....47
Hình 3.5. Hình ảnh ống mầm quan sát dưới kính hiển vi x100 ................................47
Hình 3.6. Kết quả thử nghiệm tạo ống mầm của 185 mẫu .......................................53
Hình 3.7. Sơ đồ kết quả phát hiện sản phẩm multiplex PCR sau khi điện di ...........54
Hình 3.8. Kết quả phát hiện các sản phẩm multiplex PCR bằng phương pháp điện
di ...............................................................................................................56
Hình 3.9. Độ lặp lại của quy trình phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật multiplex PCR ............................................................................59
Hình 4.1. Kết quả phát hiện loài Candida spp. theo vị trí lấy mẫu bằn phương pháp
multiplex PCR ..........................................................................................64
.
.
MỞ ĐẦU
Bệnh nấm kí sinh (mycosis) là một trong những bệnh thường gặp ở người và
động vật [22]. Ở điều kiện bình thường, nấm sống hoại sinh [22], [28], nhưng gặp
điều kiện môi trường thuận lợi, nấm có thể phát triển mạnh và gây bệnh ở một số vị
trí trên cơ thể như: lớp da ngoài, màng nhầy, móng tay, móng chân, tóc, có thể nằm
ở các lớp da sâu hơn và phát tán đến máu hay các cơ quan nội tạng khác (phổi, gan,
thận, tủy,…) [39].
Trong các nấm gây bệnh, các loài thuộc chi Candida phổ biến nhất [37]. Hơn
1,5 triệu loài nấm ước tính hiện có, nhưng chỉ có khoảng 150 - 200 loài gây bệnh ở
người, đặc biệt một số nấm thuộc chi Candida có thể đe dọa tính mạng [40], [41].
Các nấm này gây nhiễm nấm cơ hội (opportunistic infection), bệnh nhân có các triệu
chứng như da bị biến sắc, dày lên, gồ ghề, mô cơ lở loét, biến dị móng tay, móng
chân, rụng tóc, hoại tử cơ quan, tê liệt cơ quan thần kinh và vận động, gây cảm giác
ngứa ngáy. Người bệnh bị khó chịu, ảnh hưởng sức khỏe và có thể tử vong [22], [54].
Thể bệnh phổ biến nhất là nhiễm nấm Candida hầu họng (oropharyngeal candidiasis,
OPC) và niêm mạc âm đạo (vulvovaginal candidiasis, VVC). Candida albicans
chiếm đến 80 – 85% nguyên nhân gây OPC và VVC; tiếp đến là các loài Candida
glabrata, Candida tropicalis đơn nhiễm hoặc đa nhiễm [45]. Nhiễm đồng thời C.
albicans và C. non-albicans, hoặc nhiễm Candida kháng thuốc, bệnh nhân nữ nhiễm
Candida trong thời kỳ mang thai hoặc nhiễm HIV hoặc suy giảm miễn dịch sẽ gặp
khó khăn trong điều trị [26].
Thời gian qua, tỷ lệ gây bệnh của vi nấm Candida có xu hướng gia tăng tại Việt
Nam và tập trung vào 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis
[13]. Sự thay đổi này ảnh hưởng rõ rệt đến phác đồ điều trị do đặc điểm nhạy cảm
với thuốc kháng nấm của các loài Candida spp. khác nhau – C. glabrata đề kháng
nội sinh đối với các triazole, C. tropicalis tương đối nhạy cảm với fluconazole nhưng
tình trạng đề kháng với fluconazole của loài này hiện đang được báo động ở một số
quốc gia [35], [53]. C. parapsilosis có tính đề kháng cao đối với echinocandin [26].
.
.
Một số chủng C. parapsilosis có khả năng kháng 2 azole. Mặc dù vậy, việc chẩn đoán
nhanh và chính xác ở mức độ loài các Candida spp. còn nhiều hạn chế.
Hiện nay, xét nghiệm vi sinh lâm sàng tại các bệnh viện chủ yếu phát hiện
Candida spp. bằng phương pháp nuôi cấy. Mặc dù đây là phương pháp tiêu chuẩn
trong xét nghiệm vi sinh, tuy nhiên, vẫn có một số nhược điểm như thời gian để định
danh vi nấm đến mức độ loài cần ít nhất từ 2 - 3 ngày. Đặc biệt, nếu bệnh phẩm nhiễm
đồng thời từ 2 loài Candida trở lên thì rất khó phát hiện chính xác. Do đó sẽ ảnh
hưởng đến phác đồ cũng như hiệu quả điều trị, nhất là đối với bệnh nhận nhiễm nấm
xâm lấn – là bệnh lý có nguy cơ tử vong cao nếu không được chỉ định thuốc kháng
nấm kịp thời, đúng phác đồ.
Các phương pháp truyền thống phát hiện các loài thuộc chi Candida, như thử
nghiệm tạo ống mầm, nuôi cấy trên môi trường phân biệt, tuy dễ thực hiện nhưng có
nhược điểm phụ thuộc vào một số yếu tố khách quan, cần nhiều thời gian, dẫn đến
chỉ định điều trị không nhanh chóng và kịp thời. Một trong những phương pháp đơn
giản có thể phát hiện nhanh các loài Candida spp. có độ tin cậy, đặc hiệu cao và đặc
biệt, phát hiện được đồng thời nhiều loài gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm đang được
nghiên cứu phát triển, đó là kỹ thuật multiplex PCR. Tuy nhiên, tại bệnh viện, kỹ
thuật này chưa được thực hiện thường quy và chưa được đánh giá các yếu tố liên quan
đến quy trình.
Vì vậy, để có thể triển khai trong thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài “So sánh
và đánh giá quy trình multiplex PCR trong phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh
phẩm”. Với kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời sẽ góp phần giúp bác sĩ sử dụng
phác đồ điều trị kháng nấm nhanh chóng, hiệu quả.
Mục tiêu:
3. Phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng
kỹ thuật multiplex PCR và bằng phương pháp truyền thống.
4. So sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C.
tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM CANDIDA SPP.
1.1.1. Phân loại
Candida thuộc ngành Ascomycota, bộ Saccharomycetales, họ
Cryptococcaceae. Chi Candida gồm khoảng 200 loài, chia thành 2 nhóm lớn C.
albicans và C. non-albicans (Hình 1.1) [25].
Hình 1.1. Hệ thống phân loại Candida spp.
.
.
Để phân loại Candida, có thể dựa vào đặc điểm khóm nấm trên môi trường nuôi
cấy chọn lọc và quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm và các cấu tử như ống mầm,
bào tử,… Tiếp theo, thực hiện các thử nghiệm huyết thanh, thử nghiệm lên men và
đồng hóa đường, đặc điểm sinh hóa,... Hiện nay, dựa vào các trình tự gen đặc hiệu
cũng phân biệt được các loài Candida.
C. albicans được nhận diện dựa trên khả năng tạo ống mầm và bào tử bao dày
trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, đây cũng là đặc điểm thường dùng để phân biệt
C. albicans với nhóm C. non-albicans. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy đặc
điểm đặc trưng này của C. albicans cũng có ở một số ít loài như C. dubliniensis và
C. stellatoidea. Do đó, để phân biệt 3 loài Candida này chủ yếu dựa trên đặc điểm
sinh hóa và giải trình tự gen. C. stellatoidea được chia thành 2 týp I và II, trong đó
týp I có kiểu gen hoàn toàn khác với C. albicans và týp II lại được xem như một dạng
đột biến mất khả năng đồng hóa sucrose của C. albicans serotype A. Kỹ thuật
Southern blots chứng minh kiểu gen của C. albicans và C. dubliniensis có sự khác
biệt [24], [48]. Kỹ thuật sinh học phân tử cũng xác định C. parapsilosis gồm 3 týp
I, II và III có trình tự gen khác biệt. Ba týp này khác nhau về khả năng đồng hóa
đường, nhiệt độ phát triển tối ưu và đặc điểm phát triển trên CHROMagar Candida.
Do đó, hiện nay, các týp này được xác định là các loài mới và đặt tên là C.
orthopsilosis, C. parapsilosis và C. metapsilosis [49]. Một loài Candida mới là C.
subhashii, có đặc điểm hình thái tương tự C. tropicalis. Để phân biệt 2 loài này, dựa
vào đặc điểm phát triển của khóm nấm trên môi trường CHROMagar Candida (C.
subhashii có khóm trắng, C. tropicalis có khóm trơn màu xanh tím hoặc xanh dương)
và trên thạch bột ngô bổ sung tween 80 (C. subhashii tạo sợi nấm giả dài và bào tử
bao dày ít), thử nghiệm tạo ống mầm, phản ứng sinh hóa và phân tích trình tự gen
[19].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Candida thuộc nhóm nấm men. Trên môi trường dinh dưỡng, khóm nấm
Candida màu trắng, bề mặt mịn. Đặc điểm khi quan sát dưới kính hiển vi của Candida
.
.
khá đa dạng. Tế bào men Candida thường có hình bầu dục, kích thước nhỏ 4 – 6 µm
với thành tế bào mỏng [9].
Candida sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Một chồi nhỏ mọc lên trên bề mặt
tế bào mẹ, nhân từ tế bào mẹ được phân chia vào chồi đang hình thành rồi tạo vách
ngăn, tách thành tế bào độc lập. Một số loài như C. albicans, C. dubliniensis,… có
khả năng tạo ống mầm (germ tube), sợi nấm giả (pseudohyphae) và sợi nấm thật
(hyphae). Sợi nấm giả được tạo thành do chồi vẫn gắn với tế bào mẹ và phát triển
thành các sợi mảnh dễ đứt. Sợi nấm giả thường gắn với bào tử chồi (blastospore)
(Hình 1.2).
Khả năng tạo sợi giúp Candida dễ dàng xâm nhập, gây ra các tổn thương ở ký
chủ. Trên môi trường nghèo dinh dưỡng, Candida có thể tạo bào tử bao dày
(chlamydospore). Khi đó, nguyên sinh chất ở một số ngăn của sợi nấm tập trung lại
tạo thành một khối đặc, chiết quang, vách phồng to và dày lên, tạo bào tử bao dày.
Bào tử bao dày hình tròn, nằm ở đầu hay ở giữa sợi nấm. Ngoài ra, một số loài
Candida có khả năng sinh sản hữu tính [9], [24].
C. albicans mang đặc điểm đặc trưng của chi Candida. C. albicans có thể phát
triển ở nhiều dạng hình thể, từ tế bào men hình cầu, nảy chồi cho bào tử chồi, tạo ống
mầm, dạng sợi nấm giả đến sợi nấm thật và bào tử bao dày. Sự chuyển đổi từ dạng
men sang dạng sợi của C. albicans phụ thuộc vào điều kiện môi trường, đặc biệt là
nhiệt độ. Chỉ có hai loài có khả năng tạo sợi nấm thật gồm C. albicans và C.
dubliniensis. Thuật ngữ thường được dùng để chỉ sự chuyển đổi hình dạng của
Candida là “vi nấm lưỡng hình” (dimorphism) hoặc “vi nấm đa hình”
(polymorphism) [9], [24], [36].
.
.
a b c
Hình 1.2. Candida spp. quan sát dưới kính hiển vi
(a) Tế bào nấm men, (b) Sợi nấm thật, (c) Sợi nấm giả
1.1.3. Khả năng gây bệnh
Candida sống hoại sinh ở người và các động vật máu nóng. Ở người bình
thường, Candida được tìm thấy trong đường tiêu hóa, âm đạo, niệu đạo, miệng, trên
da và dưới móng,… Ở trạng thái hoại sinh, số lượng tế bào nấm rất ít và tỷ lệ hạt men
nảy chồi thấp. Hệ miễn dịch kiểm soát sự phát triển của Candida và giữ thế cân bằng
với các vi sinh vật khác tạo thành hệ vi sinh bình thường của cơ thể. Trong một số
điều kiện như hàng rào miễn dịch bị suy yếu, Candida chuyển từ trạng thái hoại sinh
sang ký sinh (gây bệnh). Đặc biệt khi sự hình thành sợi nấm giả, vi nấm sẽ len lỏi
giữa những tế bào ký chủ và xâm nhập sâu hơn. Candida gây các bệnh phổ biến như
tưa miệng, viêm thực quản, phổi, viêm âm đạo, nấm móng, viêm da, nhiễm nấm
máu,… và gây bệnh cơ hội trên da, phổi, tim, bệnh nhân mắc bệnh suy giảm miễn
dịch hoặc đang sử dụng thuốc gây ức chế miễn dịch như HIV, tiểu đường, ung thư
[8].
Hơn 17 loài Candida được báo cáo là tác nhân gây bệnh. Nhưng phần lớn là các
loài C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis và C.
krusei. C. albicans là loài gây bệnh thường gặp nhất ở người và là nguyên nhân gây
nhiễm nấm niêm mạc và các cơ quan. Hiện nay, nhiễm C. glabrata có xu hướng gia
tăng do tình trạng đề kháng thuốc. Ở một số bệnh viện, C. glabrata là nguyên nhân
phổ biến thứ hai (sau C. albicans) gây ra các bệnh nhiễm Candida. C. parapsilosis,
C. tropicalis và C. krusei là nguyên nhân gây ra nhiễm nấm máu ở bệnh nhân đặt ống
thông tĩnh mạch, sử dụng thuốc tiêm truyền thường xuyên, mắc bệnh bạch cầu, điều
.
.
trị dài ngày ở khoa ICU (Intensive Care Unit),... Các loài này có khả năng tạo màng
nhầy (slime) làm tăng khả năng bám dính trên bề mặt da và niêm mạc, do đó gia tăng
độc lực đối với ký chủ. Còn C. dubliniensis thường được phân lập từ khoang miệng,
ít xâm lấn. Tuy nhiên, độc lực của C. dubliniensis cũng được chú ý do khả năng kháng
các thuốc kháng nấm azole và nystatin. Ngoài ra, C. non-albicans như C. kefyr, C.
ciferii, C. famata,... có thể gây bệnh ở da, móng hoặc tìm thấy ở bệnh nhân suy giảm
miễn dịch [24], [31].
Nguồn gây nhiễm chính trong tất cả các loại bệnh do Candida là nguồn nội sinh.
Yếu tố cần thiết cho vi nấm xâm nhập và gây bệnh là sự suy giảm hàng rào bảo vệ
của ký chủ. Sự truyền Candida từ cơ quan tiêu hóa vào máu cần có sự phát triển vượt
trội về số lượng nấm men nơi chúng cư trú và tình trạng không nguyên vẹn của niêm
mạc đường tiêu hóa. Vì vậy, nguồn Candida nội sinh chiếm hầu hết các trường hợp
nhiễm Candida ở tất cả các vị trí trong cơ thể. Trong một số trường hợp, bệnh
Candida có thể do sự nhiễm vi nấm từ các vật dụng, thuốc bị nhiễm như nhiễm
Candida nội võng mạc sau phẫu thuật do dung dịch nhỏ vào thể kính, nhiễm Candida
máu do tiêm truyền tĩnh mạch, dịch truyền cung cấp chất dinh dưỡng bị nhiễm, hoặc
thuốc đặt hậu môn dùng cho trẻ em bị nhiễm. Ở người nghiện ma túy có thể nhiễm
Candida máu do tiêm dung dịch heroin bị nhiễm. Sự truyền Candida từ nhân viên y
tế sang bệnh nhân, từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác… thường gặp ở các bệnh
nhân bệnh nặng như phỏng, người già, người ung thư máu, người được chăm sóc đặc
biệt (sau giải phẫu, trẻ sơ sinh, người ghép cơ quan…). Sự nhiễm Candida ở trẻ sơ
sinh có thể từ mẹ truyền sang khi sinh hoặc trong thời gian mang thai hoặc tay của
các nhân viên y tế chăm sóc bệnh nhân ở bệnh viện có thể là nguồn tồn trữ để lây
nhiễm Candida cho trẻ sơ sinh. Nhiễm Candida đường niệu – sinh dục phần lớn từ
các chủng sống nội sinh.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Nhị Hà và cộng sự (2017) tại Bệnh viện Bạch
Mai, Candida là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu đứng thứ 5 với tỷ lệ là 22,2%,
trong đó C. albicans, C. tropicalis và C. glabrata là các loài được phát hiện nhiều
nhất [6].
.
.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Lê Như Tùng và cộng sự (2007), Candida là loài
gây nhiễm nấm xâm lấn, thường tìm thấy ở mẫu nước tiểu và máu. Các loài phân lập
được bao gồm C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata và C. parapsilosis. Trong đó,
C. albicans và C. glabrata được phân lập nhiều nhất từ máu, C. tropicalis phân lập
nhiều nhất từ nước tiểu [14].
C. tropicalis là loài có độc lực cao thứ hai thuộc chi Candida. Hầu hết các
nghiên cứu đều thấy rằng C. tropicalis có khả năng tạo màng sinh học mạnh hơn cả
C. albicans. C. tropicalis là tác nhân đứng thứ hai của bệnh thiếu máu, đặc biệt là ở
các nước Mỹ Latinh và châu Á [21].
C. glabrata là tác nhân gây bệnh bề mặt đứng thứ hai, thứ ba trên thế giới như
gây nhiễm nấm miệng, thực quản, âm đạo hoặc tiết niệu, biến chứng nặng nhất là
nhiễm nấm toàn thân, đặc biệt là nhiễm nấm máu [35].
Xu hướng nhiễm Candida trong những năm gần đây cho thấy tỷ lệ gây bệnh của
4 loài C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosi và C. glabrata là cao nhất. Vì vậy, để
có thể phục vụ công tác xét nghiệm vi nấm trong thực tế lâm sàng, tiếp tục kết quả
của nhóm nghiên cứu, đề tài tiến hành đánh giá quy trình phát hiện 4 loài thuộc chi
Candida: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis và C. glabrata bằng kỹ thuật
multiplex PCR.
1.1.4. Trình tự IGS (Intergenic spacer)
Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện vi nấm gây
bệnh từ mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật định danh hay phát hiện nấm ở mức độ chi hoặc
loài bao gồm giải trình tự 18S DNA ribosome (rDNA), DNA ty thể vùng đệm xen kẽ
[29], [32]. Kích thước các gen 18S, 5,8S và 26S rDNA giống nhau ở các loài, trong
khi kích thước các vùng IGS lại khác nhau. Trình tự IGS nằm giữa 26S và 5S và có
độ dài từ 195 - 719 bp, được phân chia thành vùng IGS1 - giữa gen 26S rDNA và 5S
rDNA và vùng IGS2 - giữa gen 5S rDNA và 18S rDNA (Hình 1.3). Sự khác biệt kích
thước hoặc trình tự của các vùng IGS1 và vùng IGS2 được dùng để phát hiện và phân
biệt nấm ở mức độ loài nấm [42], [47].
.
0.
Hình 1.3. Sơ đồ vùng IGS
1.1.5. Trình tự gen mã hóa phospholipase
Enzym phospholipase (B1, B2, C và D) là 1 yếu tố độc lực đóng vai trò quan
trọng trong quá trình xâm nhập vào tế bào vật chủ của các loài Candida. Trong đó,
các nghiên cứu gần đây cho thấy sản xuất phospholipase là một yếu tố độc lực quan
trọng trong nhiễm trùng máu do C. parapsilosis gây ra, đồng thời gen mã hóa enzyme
này có tính đặc hiệu của loài [27], [52].
1.1.6. Protein giả định
Protein giả định là các protein mà chức năng chưa được rõ. Protein giả định
được mã hóa bởi gần 50% số gen của vi sinh vật. Mặc dù vậy, một số gen này vẫn có
tính đặc hiệu loài và được sử dụng với mục đích định danh [38].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CANDIDA
1.2.1. Phương pháp truyền thống
Dựa vào hình thái vi nấm để phát hiện, định danh là phương pháp truyền thống
được sử dụng trong nghiên cứu cũng như xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Đối với
Candida, các phương pháp định danh gồm có quan sát bào tử bao dày, thử nghiệm
tạo ống mầm, nuôi cấy trên môi trường CHROMagar Candida,…
1.2.1.1. Môi trường CHROMagar Candida
Đây là môi trường có tính phân biệt và chọn lọc cao, được sử dụng để phân lập
và xác định nhanh một số loài Candida spp.. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất,
CHROMagar Candida có độ nhạy và đặc hiệu > 99% đối với C. albicans, C. tropicalis
và C. krusei. Môi trường CHROMagar Candida chứa cơ chất phản ứng với các
enzyme do Candida spp. tiết ra và tạo khóm nấm có màu sắc khác nhau: C. albicans
tạo khóm nấm màu xanh lá, C. dubliniensis màu xanh lá đậm, C. glabrata màu tím
đậm, C. tropicalis màu xanh tím hoặc xanh dương, C. krusei màu hồng viền trắng,
các loài khác có màu trắng đến hồng đậm[20], [46].
.
TÔN HOÀNG DIỆU - KHÓA: 2019 – 2021 - NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TÔN HOÀNG DIỆU
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT HIỆN CANDIDA SPP.
TỪ MẪU BỆNH PHẨM
LUẬN VĂN DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TÔN HOÀNG DIỆU
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP
MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT HIỆN CANDIDA SPP.
TỪ MẪU BỆNH PHẨM
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8.72.02.10
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. NGUYỄN TÚ ANH
2. TS. TRẦN QUỐC VIỆT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. ix
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM CANDIDA SPP. ..................................................4
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CANDIDA...........................................10
1.3. ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH PHÁT HIỆN CANDIDA SPP. BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR ................................................................................................16
1.4. NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ...............................................18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................21
2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................21
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................24
2.4. Y ĐỨC ............................................................................................................32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 33
3.1. Đặc điểm mẫu nấm thu được từ bệnh phẩm ...................................................33
3.2. Kết quả phát hiện Candida spp. bằng phương pháp truyền thống. ................36
3.3. Phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật multiplex PCR ...................................53
3.4. Đánh giá quy trình phát hiện Candida spp. bằng kỹ thuật multiplex PCR ....56
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 61
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 66
5.1. KẾT LUẬN.....................................................................................................66
5.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70
Phụ lục 1: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Đại Học Y Dược TP. HCM
.........................................................................................................................PL1-1
.
.
Phụ lục 2: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Lê Văn Thịnh ...............PL2-1
Phụ lục 3: Danh sách mẫu bệnh phẩm tại Bệnh viện Quân Y 175 ..................PL3-1
Phụ lục 4: Kết quả phát hiện Candida spp. bằng 3 phương pháp nghiên cứu
.........................................................................................................................PL4-1
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là luận văn nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu khác.
Tác giả
Tôn Hoàng Diệu
.
.
SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ QUY TRÌNH MULTIPLEX PCR TRONG PHÁT
HIỆN CANDIDA SPP. TỪ MẪU BỆNH PHẨM
TÓM TẮT
Mục tiêu:
1. Phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng
kỹ thuật multiplex PCR và bằng phương pháp truyền thống.
2. So sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C.
tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR
Phương pháp nghiên cứu: Mẫu Candida spp. được thu nhận tại Bệnh viện Đại học
Y Dược TP. HCM, Bệnh viện Lê Văn Thịnh và Bệnh viện Quân đội 175 từ tháng
10/2020 đến tháng 5/2021. Vi nấm được phát hiện 3 bằng phương pháp: (1) thử
nghiệm tạo ống mầm, (2) phân lập trên môi trường CHROMagar Candida và (3) kỹ
thuật multiplex PCR. Sau đó, tiến hành so sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ
thuật multiplex PCR và phương pháp phát hiện trên CHROMagar Candida, dựa trên
độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm, độ lập lại và độ
chính xác.
Kết quả: Phân lập trên môi trường CHROMagar Candida: có 186 chủng phân lập
được với tỷ lệ nhiễm cao nhất là C. albicans 112/186 (55,45%), C. tropicalis 39/186
(19,31%), C. glabrata hoặc C. parapsilosis 35/189 (17,33%) và 16 mẫu nghi ngờ
không thuộc chi Candida. Định danh bằng kỹ thuật multiplex PCR: có 186 sản phẩm
PCR được phát hiện, trong đó C. albicans 112/186 (55,45%), C. tropicalis 39/186
(19,31%), C. glabrata 25/186 (12,38%), C. parapsolosis 10/189 (4,59%) và 16 mẫu
không phát hiện sản phẩm PCR.
Quy trình multiplex PCR phát hiện 4 loài Candida spp. được đánh giá các chỉ tiêu,
có 5 chỉ tiêu đạt yêu cầu theo hướng dẫn của Bộ Y tế (2016): độ nhạy (93,33%), độ
đặc hiệu (100%), độ chính xác (96,19%), giá trị tiên đoán dương (100%), độ lặp lại
(đạt), giá trị tiên đoán âm (66,67%) < 90%.
.
.
COMPARITION AND EVALUATION OF MULTIPLEX PCR TECHNIQUE
PROCESS OF THE IDENTIFICATION CANDIDA SPP.
FROM PATIENT SAMPLES
ABSTRACT
Ojective:
1. Detection of 4 species of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C.
parapsilosis by multiplex PCR and traditional methods.
2. Compare and evaluate the process of detecting 4 species of C. albicans, C.
glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis from patient samples by multiplex
PCR technique
Method: Sample Candida spp. was admitted at the University Medical Center – Ho
Chi Minh City, Le Van Thinh Hospital and Military Hospital 175 from October 2020
to May 2021. The fungus was detected by 3 methods: (1) Germ tube, (2) isolation on
CHROMagar Candida medium and (3) multiplex PCR technique. Then, compare and
evaluate the detection process of 4 species of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis
and C. parapsilosis from patient samples by multiplex PCR technique and detection
method on CHROMagar Candida, based on sensitivity, specificity, positive
predictive value, negative predictive value, repeatability and accuracy.
Results: Isolated on CHROMagar Candida medium: 186 isolates with the highest
infection rate being C. albicans 112/186 (55.45%), C. tropicalis 39/186 (19.31%), C.
glabrata or C. parapsilosis 35/189 (17.33%) and 16 samples suspected of not
belonging Candida. Identification by multiplex PCR: 186 PCR products were
detected, of which C. albicans 112/186 (55.45%), C. tropicalis 39/186 (19.31%), C.
glabrata 25/ 186 (12.38%), C. parapsolosis 10/189 (4.59%) and 16 samples did not
detect PCR products.
Multiplex PCR procedure detected 4 species of Candida spp. The criteria were
evaluated, there were 5 satisfactory criteria according to the guidance of the Ministry
of Health (2016): sensitivity (93.33%), specificity (100%), accuracy (96.19%),
.
.
positive predictive value (100%), repeatability (pass), negative predictive value
(66.67%) < 90%.
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt
PCR Polymerase Chain Reaction
IGS Intergenic spacer Vùng đệm trong được sao mã
DNA Deoxyribonucleic acid
PPV Positive Predictable Value Giá trị tiên đoán dương
NPV Negative Predictable Value Giá trị tiên đoán âm
TP True positive Dương tính thật
TN True negative Âm tính thật
FP False positive Dương tính giả
FN False negative Âm tính giả
Recurrent Vulvovaginal
RVVC Viêm âm đạo do nấm
Candidiasis
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Thiết bị ......................................................................................................22
Bảng 2.2. Hóa chất ....................................................................................................22
Bảng 2.3. Hình thái khóm nấm trên môi trường CHROMagar Candida ..................25
Bảng 2.4. Kết quả lên men đường của 4 loài Candida spp. ......................................27
Bảng 2.5. Thành phần của multiplex PCR ................................................................29
Bảng 2.6. Trình tự mồi của Candida spp. .................................................................29
Bảng 2.7. Chương trình PCR ....................................................................................30
Bảng 3.1. Mẫu nấm thu nhận từ 3 bệnh viện ............................................................33
Bảng 3.2. Tỷ lệ nhiễm nấm Candida spp. theo nhóm tuổi và giới tính ....................34
Bảng 3.3. Loại mẫu bệnh phẩm nhiễm Candida spp. ...............................................34
Bảng 3.4. Kết quả phân lập 4 loài Candida spp. trên CHROMagar Candida ..........45
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm tạo ống mầm.............................................................48
Bảng 3.6. Kết quả phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm.................................57
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Hệ thống phân loại Candida spp. ................................................................4
Hình 1.2. Candida spp. quan sát dưới kính hiển vi.....................................................7
Hình 1.3. Sơ đồ vùng IGS .........................................................................................10
Hình 1.4. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi x100 ...............................................11
Hình 1.5. Bào tử bao dày ..........................................................................................12
Hình 1.6. Sơ đồ phản ứng PCR .................................................................................14
Hình 1.7. Kỹ thuật multiplex PCR ............................................................................15
Hình 2.1. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu.......................................................................24
Hình 2.2. Màu sắc khóm nấm Candida spp. trên môi trường CHROMagar Candida
..................................................................................................................25
Hình 2.3. Ống mầm quan sát dưới kính hiển vi X100 ..............................................26
Hình 2.4. Phản ứng lên men đường ..........................................................................27
Hình 3.1. Các mẫu bệnh phẩm nhiễm đồng thời 2 loài Candida spp. ......................35
Hình 3.2. Kết quả phân lập Candida spp. trên môi trường CHROMagar Candida ..44
Hình 3.3. Các mẫu không phân biệt được Candida spp. trên môi trường
CHROMagar Candida ..............................................................................46
Hình 3.4. Các mẫu có hơn 2 lọại khóm trên môi trường CHROMagar Candida .....47
Hình 3.5. Hình ảnh ống mầm quan sát dưới kính hiển vi x100 ................................47
Hình 3.6. Kết quả thử nghiệm tạo ống mầm của 185 mẫu .......................................53
Hình 3.7. Sơ đồ kết quả phát hiện sản phẩm multiplex PCR sau khi điện di ...........54
Hình 3.8. Kết quả phát hiện các sản phẩm multiplex PCR bằng phương pháp điện
di ...............................................................................................................56
Hình 3.9. Độ lặp lại của quy trình phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật multiplex PCR ............................................................................59
Hình 4.1. Kết quả phát hiện loài Candida spp. theo vị trí lấy mẫu bằn phương pháp
multiplex PCR ..........................................................................................64
.
.
MỞ ĐẦU
Bệnh nấm kí sinh (mycosis) là một trong những bệnh thường gặp ở người và
động vật [22]. Ở điều kiện bình thường, nấm sống hoại sinh [22], [28], nhưng gặp
điều kiện môi trường thuận lợi, nấm có thể phát triển mạnh và gây bệnh ở một số vị
trí trên cơ thể như: lớp da ngoài, màng nhầy, móng tay, móng chân, tóc, có thể nằm
ở các lớp da sâu hơn và phát tán đến máu hay các cơ quan nội tạng khác (phổi, gan,
thận, tủy,…) [39].
Trong các nấm gây bệnh, các loài thuộc chi Candida phổ biến nhất [37]. Hơn
1,5 triệu loài nấm ước tính hiện có, nhưng chỉ có khoảng 150 - 200 loài gây bệnh ở
người, đặc biệt một số nấm thuộc chi Candida có thể đe dọa tính mạng [40], [41].
Các nấm này gây nhiễm nấm cơ hội (opportunistic infection), bệnh nhân có các triệu
chứng như da bị biến sắc, dày lên, gồ ghề, mô cơ lở loét, biến dị móng tay, móng
chân, rụng tóc, hoại tử cơ quan, tê liệt cơ quan thần kinh và vận động, gây cảm giác
ngứa ngáy. Người bệnh bị khó chịu, ảnh hưởng sức khỏe và có thể tử vong [22], [54].
Thể bệnh phổ biến nhất là nhiễm nấm Candida hầu họng (oropharyngeal candidiasis,
OPC) và niêm mạc âm đạo (vulvovaginal candidiasis, VVC). Candida albicans
chiếm đến 80 – 85% nguyên nhân gây OPC và VVC; tiếp đến là các loài Candida
glabrata, Candida tropicalis đơn nhiễm hoặc đa nhiễm [45]. Nhiễm đồng thời C.
albicans và C. non-albicans, hoặc nhiễm Candida kháng thuốc, bệnh nhân nữ nhiễm
Candida trong thời kỳ mang thai hoặc nhiễm HIV hoặc suy giảm miễn dịch sẽ gặp
khó khăn trong điều trị [26].
Thời gian qua, tỷ lệ gây bệnh của vi nấm Candida có xu hướng gia tăng tại Việt
Nam và tập trung vào 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis
[13]. Sự thay đổi này ảnh hưởng rõ rệt đến phác đồ điều trị do đặc điểm nhạy cảm
với thuốc kháng nấm của các loài Candida spp. khác nhau – C. glabrata đề kháng
nội sinh đối với các triazole, C. tropicalis tương đối nhạy cảm với fluconazole nhưng
tình trạng đề kháng với fluconazole của loài này hiện đang được báo động ở một số
quốc gia [35], [53]. C. parapsilosis có tính đề kháng cao đối với echinocandin [26].
.
.
Một số chủng C. parapsilosis có khả năng kháng 2 azole. Mặc dù vậy, việc chẩn đoán
nhanh và chính xác ở mức độ loài các Candida spp. còn nhiều hạn chế.
Hiện nay, xét nghiệm vi sinh lâm sàng tại các bệnh viện chủ yếu phát hiện
Candida spp. bằng phương pháp nuôi cấy. Mặc dù đây là phương pháp tiêu chuẩn
trong xét nghiệm vi sinh, tuy nhiên, vẫn có một số nhược điểm như thời gian để định
danh vi nấm đến mức độ loài cần ít nhất từ 2 - 3 ngày. Đặc biệt, nếu bệnh phẩm nhiễm
đồng thời từ 2 loài Candida trở lên thì rất khó phát hiện chính xác. Do đó sẽ ảnh
hưởng đến phác đồ cũng như hiệu quả điều trị, nhất là đối với bệnh nhận nhiễm nấm
xâm lấn – là bệnh lý có nguy cơ tử vong cao nếu không được chỉ định thuốc kháng
nấm kịp thời, đúng phác đồ.
Các phương pháp truyền thống phát hiện các loài thuộc chi Candida, như thử
nghiệm tạo ống mầm, nuôi cấy trên môi trường phân biệt, tuy dễ thực hiện nhưng có
nhược điểm phụ thuộc vào một số yếu tố khách quan, cần nhiều thời gian, dẫn đến
chỉ định điều trị không nhanh chóng và kịp thời. Một trong những phương pháp đơn
giản có thể phát hiện nhanh các loài Candida spp. có độ tin cậy, đặc hiệu cao và đặc
biệt, phát hiện được đồng thời nhiều loài gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm đang được
nghiên cứu phát triển, đó là kỹ thuật multiplex PCR. Tuy nhiên, tại bệnh viện, kỹ
thuật này chưa được thực hiện thường quy và chưa được đánh giá các yếu tố liên quan
đến quy trình.
Vì vậy, để có thể triển khai trong thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài “So sánh
và đánh giá quy trình multiplex PCR trong phát hiện Candida spp. từ mẫu bệnh
phẩm”. Với kết quả xét nghiệm chính xác, kịp thời sẽ góp phần giúp bác sĩ sử dụng
phác đồ điều trị kháng nấm nhanh chóng, hiệu quả.
Mục tiêu:
3. Phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis và C. parapsilosis bằng
kỹ thuật multiplex PCR và bằng phương pháp truyền thống.
4. So sánh và đánh giá quy trình phát hiện 4 loài C. albicans, C. glabrata, C.
tropicalis và C. parapsilosis từ mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật multiplex PCR.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI NẤM CANDIDA SPP.
1.1.1. Phân loại
Candida thuộc ngành Ascomycota, bộ Saccharomycetales, họ
Cryptococcaceae. Chi Candida gồm khoảng 200 loài, chia thành 2 nhóm lớn C.
albicans và C. non-albicans (Hình 1.1) [25].
Hình 1.1. Hệ thống phân loại Candida spp.
.
.
Để phân loại Candida, có thể dựa vào đặc điểm khóm nấm trên môi trường nuôi
cấy chọn lọc và quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm và các cấu tử như ống mầm,
bào tử,… Tiếp theo, thực hiện các thử nghiệm huyết thanh, thử nghiệm lên men và
đồng hóa đường, đặc điểm sinh hóa,... Hiện nay, dựa vào các trình tự gen đặc hiệu
cũng phân biệt được các loài Candida.
C. albicans được nhận diện dựa trên khả năng tạo ống mầm và bào tử bao dày
trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, đây cũng là đặc điểm thường dùng để phân biệt
C. albicans với nhóm C. non-albicans. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy đặc
điểm đặc trưng này của C. albicans cũng có ở một số ít loài như C. dubliniensis và
C. stellatoidea. Do đó, để phân biệt 3 loài Candida này chủ yếu dựa trên đặc điểm
sinh hóa và giải trình tự gen. C. stellatoidea được chia thành 2 týp I và II, trong đó
týp I có kiểu gen hoàn toàn khác với C. albicans và týp II lại được xem như một dạng
đột biến mất khả năng đồng hóa sucrose của C. albicans serotype A. Kỹ thuật
Southern blots chứng minh kiểu gen của C. albicans và C. dubliniensis có sự khác
biệt [24], [48]. Kỹ thuật sinh học phân tử cũng xác định C. parapsilosis gồm 3 týp
I, II và III có trình tự gen khác biệt. Ba týp này khác nhau về khả năng đồng hóa
đường, nhiệt độ phát triển tối ưu và đặc điểm phát triển trên CHROMagar Candida.
Do đó, hiện nay, các týp này được xác định là các loài mới và đặt tên là C.
orthopsilosis, C. parapsilosis và C. metapsilosis [49]. Một loài Candida mới là C.
subhashii, có đặc điểm hình thái tương tự C. tropicalis. Để phân biệt 2 loài này, dựa
vào đặc điểm phát triển của khóm nấm trên môi trường CHROMagar Candida (C.
subhashii có khóm trắng, C. tropicalis có khóm trơn màu xanh tím hoặc xanh dương)
và trên thạch bột ngô bổ sung tween 80 (C. subhashii tạo sợi nấm giả dài và bào tử
bao dày ít), thử nghiệm tạo ống mầm, phản ứng sinh hóa và phân tích trình tự gen
[19].
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Candida thuộc nhóm nấm men. Trên môi trường dinh dưỡng, khóm nấm
Candida màu trắng, bề mặt mịn. Đặc điểm khi quan sát dưới kính hiển vi của Candida
.
.
khá đa dạng. Tế bào men Candida thường có hình bầu dục, kích thước nhỏ 4 – 6 µm
với thành tế bào mỏng [9].
Candida sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi. Một chồi nhỏ mọc lên trên bề mặt
tế bào mẹ, nhân từ tế bào mẹ được phân chia vào chồi đang hình thành rồi tạo vách
ngăn, tách thành tế bào độc lập. Một số loài như C. albicans, C. dubliniensis,… có
khả năng tạo ống mầm (germ tube), sợi nấm giả (pseudohyphae) và sợi nấm thật
(hyphae). Sợi nấm giả được tạo thành do chồi vẫn gắn với tế bào mẹ và phát triển
thành các sợi mảnh dễ đứt. Sợi nấm giả thường gắn với bào tử chồi (blastospore)
(Hình 1.2).
Khả năng tạo sợi giúp Candida dễ dàng xâm nhập, gây ra các tổn thương ở ký
chủ. Trên môi trường nghèo dinh dưỡng, Candida có thể tạo bào tử bao dày
(chlamydospore). Khi đó, nguyên sinh chất ở một số ngăn của sợi nấm tập trung lại
tạo thành một khối đặc, chiết quang, vách phồng to và dày lên, tạo bào tử bao dày.
Bào tử bao dày hình tròn, nằm ở đầu hay ở giữa sợi nấm. Ngoài ra, một số loài
Candida có khả năng sinh sản hữu tính [9], [24].
C. albicans mang đặc điểm đặc trưng của chi Candida. C. albicans có thể phát
triển ở nhiều dạng hình thể, từ tế bào men hình cầu, nảy chồi cho bào tử chồi, tạo ống
mầm, dạng sợi nấm giả đến sợi nấm thật và bào tử bao dày. Sự chuyển đổi từ dạng
men sang dạng sợi của C. albicans phụ thuộc vào điều kiện môi trường, đặc biệt là
nhiệt độ. Chỉ có hai loài có khả năng tạo sợi nấm thật gồm C. albicans và C.
dubliniensis. Thuật ngữ thường được dùng để chỉ sự chuyển đổi hình dạng của
Candida là “vi nấm lưỡng hình” (dimorphism) hoặc “vi nấm đa hình”
(polymorphism) [9], [24], [36].
.
.
a b c
Hình 1.2. Candida spp. quan sát dưới kính hiển vi
(a) Tế bào nấm men, (b) Sợi nấm thật, (c) Sợi nấm giả
1.1.3. Khả năng gây bệnh
Candida sống hoại sinh ở người và các động vật máu nóng. Ở người bình
thường, Candida được tìm thấy trong đường tiêu hóa, âm đạo, niệu đạo, miệng, trên
da và dưới móng,… Ở trạng thái hoại sinh, số lượng tế bào nấm rất ít và tỷ lệ hạt men
nảy chồi thấp. Hệ miễn dịch kiểm soát sự phát triển của Candida và giữ thế cân bằng
với các vi sinh vật khác tạo thành hệ vi sinh bình thường của cơ thể. Trong một số
điều kiện như hàng rào miễn dịch bị suy yếu, Candida chuyển từ trạng thái hoại sinh
sang ký sinh (gây bệnh). Đặc biệt khi sự hình thành sợi nấm giả, vi nấm sẽ len lỏi
giữa những tế bào ký chủ và xâm nhập sâu hơn. Candida gây các bệnh phổ biến như
tưa miệng, viêm thực quản, phổi, viêm âm đạo, nấm móng, viêm da, nhiễm nấm
máu,… và gây bệnh cơ hội trên da, phổi, tim, bệnh nhân mắc bệnh suy giảm miễn
dịch hoặc đang sử dụng thuốc gây ức chế miễn dịch như HIV, tiểu đường, ung thư
[8].
Hơn 17 loài Candida được báo cáo là tác nhân gây bệnh. Nhưng phần lớn là các
loài C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis và C.
krusei. C. albicans là loài gây bệnh thường gặp nhất ở người và là nguyên nhân gây
nhiễm nấm niêm mạc và các cơ quan. Hiện nay, nhiễm C. glabrata có xu hướng gia
tăng do tình trạng đề kháng thuốc. Ở một số bệnh viện, C. glabrata là nguyên nhân
phổ biến thứ hai (sau C. albicans) gây ra các bệnh nhiễm Candida. C. parapsilosis,
C. tropicalis và C. krusei là nguyên nhân gây ra nhiễm nấm máu ở bệnh nhân đặt ống
thông tĩnh mạch, sử dụng thuốc tiêm truyền thường xuyên, mắc bệnh bạch cầu, điều
.
.
trị dài ngày ở khoa ICU (Intensive Care Unit),... Các loài này có khả năng tạo màng
nhầy (slime) làm tăng khả năng bám dính trên bề mặt da và niêm mạc, do đó gia tăng
độc lực đối với ký chủ. Còn C. dubliniensis thường được phân lập từ khoang miệng,
ít xâm lấn. Tuy nhiên, độc lực của C. dubliniensis cũng được chú ý do khả năng kháng
các thuốc kháng nấm azole và nystatin. Ngoài ra, C. non-albicans như C. kefyr, C.
ciferii, C. famata,... có thể gây bệnh ở da, móng hoặc tìm thấy ở bệnh nhân suy giảm
miễn dịch [24], [31].
Nguồn gây nhiễm chính trong tất cả các loại bệnh do Candida là nguồn nội sinh.
Yếu tố cần thiết cho vi nấm xâm nhập và gây bệnh là sự suy giảm hàng rào bảo vệ
của ký chủ. Sự truyền Candida từ cơ quan tiêu hóa vào máu cần có sự phát triển vượt
trội về số lượng nấm men nơi chúng cư trú và tình trạng không nguyên vẹn của niêm
mạc đường tiêu hóa. Vì vậy, nguồn Candida nội sinh chiếm hầu hết các trường hợp
nhiễm Candida ở tất cả các vị trí trong cơ thể. Trong một số trường hợp, bệnh
Candida có thể do sự nhiễm vi nấm từ các vật dụng, thuốc bị nhiễm như nhiễm
Candida nội võng mạc sau phẫu thuật do dung dịch nhỏ vào thể kính, nhiễm Candida
máu do tiêm truyền tĩnh mạch, dịch truyền cung cấp chất dinh dưỡng bị nhiễm, hoặc
thuốc đặt hậu môn dùng cho trẻ em bị nhiễm. Ở người nghiện ma túy có thể nhiễm
Candida máu do tiêm dung dịch heroin bị nhiễm. Sự truyền Candida từ nhân viên y
tế sang bệnh nhân, từ bệnh nhân này sang bệnh nhân khác… thường gặp ở các bệnh
nhân bệnh nặng như phỏng, người già, người ung thư máu, người được chăm sóc đặc
biệt (sau giải phẫu, trẻ sơ sinh, người ghép cơ quan…). Sự nhiễm Candida ở trẻ sơ
sinh có thể từ mẹ truyền sang khi sinh hoặc trong thời gian mang thai hoặc tay của
các nhân viên y tế chăm sóc bệnh nhân ở bệnh viện có thể là nguồn tồn trữ để lây
nhiễm Candida cho trẻ sơ sinh. Nhiễm Candida đường niệu – sinh dục phần lớn từ
các chủng sống nội sinh.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Nhị Hà và cộng sự (2017) tại Bệnh viện Bạch
Mai, Candida là nguyên nhân gây nhiễm trùng máu đứng thứ 5 với tỷ lệ là 22,2%,
trong đó C. albicans, C. tropicalis và C. glabrata là các loài được phát hiện nhiều
nhất [6].
.
.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Lê Như Tùng và cộng sự (2007), Candida là loài
gây nhiễm nấm xâm lấn, thường tìm thấy ở mẫu nước tiểu và máu. Các loài phân lập
được bao gồm C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata và C. parapsilosis. Trong đó,
C. albicans và C. glabrata được phân lập nhiều nhất từ máu, C. tropicalis phân lập
nhiều nhất từ nước tiểu [14].
C. tropicalis là loài có độc lực cao thứ hai thuộc chi Candida. Hầu hết các
nghiên cứu đều thấy rằng C. tropicalis có khả năng tạo màng sinh học mạnh hơn cả
C. albicans. C. tropicalis là tác nhân đứng thứ hai của bệnh thiếu máu, đặc biệt là ở
các nước Mỹ Latinh và châu Á [21].
C. glabrata là tác nhân gây bệnh bề mặt đứng thứ hai, thứ ba trên thế giới như
gây nhiễm nấm miệng, thực quản, âm đạo hoặc tiết niệu, biến chứng nặng nhất là
nhiễm nấm toàn thân, đặc biệt là nhiễm nấm máu [35].
Xu hướng nhiễm Candida trong những năm gần đây cho thấy tỷ lệ gây bệnh của
4 loài C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosi và C. glabrata là cao nhất. Vì vậy, để
có thể phục vụ công tác xét nghiệm vi nấm trong thực tế lâm sàng, tiếp tục kết quả
của nhóm nghiên cứu, đề tài tiến hành đánh giá quy trình phát hiện 4 loài thuộc chi
Candida: C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis và C. glabrata bằng kỹ thuật
multiplex PCR.
1.1.4. Trình tự IGS (Intergenic spacer)
Hiện nay, các kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện vi nấm gây
bệnh từ mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật định danh hay phát hiện nấm ở mức độ chi hoặc
loài bao gồm giải trình tự 18S DNA ribosome (rDNA), DNA ty thể vùng đệm xen kẽ
[29], [32]. Kích thước các gen 18S, 5,8S và 26S rDNA giống nhau ở các loài, trong
khi kích thước các vùng IGS lại khác nhau. Trình tự IGS nằm giữa 26S và 5S và có
độ dài từ 195 - 719 bp, được phân chia thành vùng IGS1 - giữa gen 26S rDNA và 5S
rDNA và vùng IGS2 - giữa gen 5S rDNA và 18S rDNA (Hình 1.3). Sự khác biệt kích
thước hoặc trình tự của các vùng IGS1 và vùng IGS2 được dùng để phát hiện và phân
biệt nấm ở mức độ loài nấm [42], [47].
.
0.
Hình 1.3. Sơ đồ vùng IGS
1.1.5. Trình tự gen mã hóa phospholipase
Enzym phospholipase (B1, B2, C và D) là 1 yếu tố độc lực đóng vai trò quan
trọng trong quá trình xâm nhập vào tế bào vật chủ của các loài Candida. Trong đó,
các nghiên cứu gần đây cho thấy sản xuất phospholipase là một yếu tố độc lực quan
trọng trong nhiễm trùng máu do C. parapsilosis gây ra, đồng thời gen mã hóa enzyme
này có tính đặc hiệu của loài [27], [52].
1.1.6. Protein giả định
Protein giả định là các protein mà chức năng chưa được rõ. Protein giả định
được mã hóa bởi gần 50% số gen của vi sinh vật. Mặc dù vậy, một số gen này vẫn có
tính đặc hiệu loài và được sử dụng với mục đích định danh [38].
1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CANDIDA
1.2.1. Phương pháp truyền thống
Dựa vào hình thái vi nấm để phát hiện, định danh là phương pháp truyền thống
được sử dụng trong nghiên cứu cũng như xét nghiệm vi sinh lâm sàng. Đối với
Candida, các phương pháp định danh gồm có quan sát bào tử bao dày, thử nghiệm
tạo ống mầm, nuôi cấy trên môi trường CHROMagar Candida,…
1.2.1.1. Môi trường CHROMagar Candida
Đây là môi trường có tính phân biệt và chọn lọc cao, được sử dụng để phân lập
và xác định nhanh một số loài Candida spp.. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất,
CHROMagar Candida có độ nhạy và đặc hiệu > 99% đối với C. albicans, C. tropicalis
và C. krusei. Môi trường CHROMagar Candida chứa cơ chất phản ứng với các
enzyme do Candida spp. tiết ra và tạo khóm nấm có màu sắc khác nhau: C. albicans
tạo khóm nấm màu xanh lá, C. dubliniensis màu xanh lá đậm, C. glabrata màu tím
đậm, C. tropicalis màu xanh tím hoặc xanh dương, C. krusei màu hồng viền trắng,
các loài khác có màu trắng đến hồng đậm[20], [46].
.