Phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân leukemia 253851
- 89 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN TIẾN DŨNG
PHÂN TÍCH HỆ GLYCOPROTEIN HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN LEUKEMIA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội, 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN TIẾN DŨNG
PHÂN TÍCH HỆ GLYCOPROTEIN HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN LEUKEMIA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS PHAN VĂN ĐẠT
Hà Nội, 2010
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Phan Văn Chi-
Trưởng phòng Hoá Sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, đã tận tình hướng
dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt
quá trình học tập và thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Bích Nhi vì những góp ý
quý báu trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp phòng
Hoá Sinh - Protein, Viện Công Nghệ Sinh Học và các thầy, cô thuộc Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận
tình dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân - những người
đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 11 năm 2010
Học viên
Nguyễn Tiến Dũng
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ...................................................viii
DANH MỤC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ...................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 2
1.1 Tổng quan về bệnh Leukemia ...................................................................................... 2
1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Leukemia ..................................................................... 2
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Leukemia ........................................................................ 4
1.1.3 Phân loại Leukemia .............................................................................................. 4
1.1.3.1 Leukemia cấp .................................................................................................. 6
1.1.3.2 Leukemia kinh ................................................................................................ 7
1.1.4 Triệu chứng bệnh Leukemia ................................................................................. 8
1.1.5 Chẩn đoán bệnh Leukemia ................................................................................... 9
1.2 Proteomics – Khoa học nghiên cứu hệ protein .......................................................... 10
1.2.1 Proteomics là gì? ................................................................................................. 10
1.2.2 Proteome huyết thanh ......................................................................................... 11
1.2.2.1 Đặc điểm, thành phần của protein huyết thanh ............................................. 11
1.2.1.2 Chức năng của các protein huyết thanh ........................................................ 11
1.2.1.3 Vì sao phải nghiên cứu proteome huyết thanh? ............................................ 12
1.2.2 Quá trình glycosyl hóa ........................................................................................ 13
1.2.2.1 Đặc điểm của quá trình glycosyl hóa ............................................................ 13
1.2.2.2 Glycoprotein với quá trình bệnh lý ............................................................... 14
1.2.3 Các công cụ và kỹ thuật Proteomics cơ bản ....................................................... 14
1.2.3.1 Các kỹ thuật phân tách protein ..................................................................... 14
1.2.3.2 Khối phổ - Trung tâm của proteomics .......................................................... 18
1.2.3.3 Các phần mềm tin sinh học ........................................................................... 19
1.2.3.4 Các cơ sở dữ liệu về trình tự gen và protein ................................................. 20
1.3 Các nghiên cứu proteomics đối với bệnh ung thư và Leukemia ............................... 20
1.3.1 Nghiên cứu proteomics đối với bệnh ung thư..................................................... 20
1.3.2 Nghiên cứu proteomics đối với bệnh Leukemia ................................................. 21
ii
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 24
2.1 Vật liệu ....................................................................................................................... 24
2.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................................... 24
2.1.2 Hóa chất .............................................................................................................. 24
2.1.3 Trang thiết bị chính ............................................................................................. 24
2.2 Các phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 25
2.2.1 Thu nhận glycoprotein bằng sắc ký ái lực conA................................................. 25
2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ............................................... 26
2.2.3 Làm sạch hỗn hợp glycoprotein bằng phương pháp tủa với acetone ................. 26
2.2.4 Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di biến tính trên gel polyacrylamide........ 26
2.2.5 Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) ................................... 27
2.2.6 Thủy phân protein bằng enzym trypsin .............................................................. 28
2.2.6.1 Thủy phân protein trong gel.......................................................................... 28
2.2.6.2 Thủy phân protein trong dung dịch – Phân tích tổng thể.............................. 29
2.2.7 Phân tách peptide bằng sắc ký lỏng nano đa chiều ............................................. 29
2.2.8 Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS ......................................................................... 31
2.2.9 Nhận diện protein bằng phần mềm Mascot v1.8 ................................................ 32
2.2.10 Tìm kiếm thông tin protein ............................................................................... 33
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 34
3.1 Lựa chọn mẫu nghiên cứu.......................................................................................... 34
3.2 Xây dựng phương pháp phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh Leukemia ..... 35
3.3 Thu nhận các glycoprotein huyết thanh bằng sắc ký ái lực ConA............................. 36
3.4 Làm sạch mẫu bằng phương pháp tủa acetone .......................................................... 38
3.5 Phân tích mức độ biểu hiện........................................................................................ 39
3.5.1 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ............................................... 39
3.5.2 Phân tách glycoprotein bằng điện di 2-DE ......................................................... 40
3.5.3 Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện thay đổi bằng hệ 1DNanoLC-
MS/MS ......................................................................................................................... 42
3.5.4 Phân tích sự thay đổi mức độ biểu hiện bằng phần mềm PDQuest v7.1 ............ 44
3.6 Phân tích tổng thể proteome huyết thanh bệnh nhân NHL ........................................ 47
3.6.1 Ghi phổ 2DnanoLC-MS/MS ............................................................................... 47
3.6.2 Nhận diện hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia............................ 48
3.6.3 Tìm kiếm thông tin liên quan đến các glycoprotein được nhận diện .................. 49
3.6.4 Nhận diện các protein có liên quan đến bệnh ung thư và Leukemia .................. 50
3.7 Thảo luận ................................................................................................................... 53
3.7.1 Phương pháp xử lý mẫu ...................................................................................... 53
iii
3.7.2 Phân tích mức độ biểu hiện bằng điện di 2-DE .................................................. 54
3.7.3 Phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bằng kỹ thuật 2DnanoLC-MS/MS ........ 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 60
PHỤ LỤC ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
iv
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
1-DE One-dimensional electrophoresis Điện di một chiều
2-DE Two-dimensional electrophoresis Điện di hai chiều
Two-dimensional nano liquid Sắc kỷ lỏng nano hai chiều
2DnanoLC
chromatography
ACN Acetonitrile Acetonitrile
ALL Acute lymphocytic leukemia Leukemia cấp dòng lympho
AML Acute myeloid leukemia Leukemia cấp dòng tủy
amu Atomic mass unit Đơn vị khối lượng nguyên tử
APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate
3-[(3- Một chất tẩy rửa lưỡng tính để hòa
CHAPS
Cholamidopropyl)dimethylammonio] tan protein
CID Collision-induced dissociation Phân mảnh do va đập
CLL Chronic lymphocytic leukemia Leukemia kinh dòng lympho
CML Chronic myeloid leukemia Leukemia kinh dòng tủy
Da Dalton Dalton
DTT Dithiothreitol Dithiothreitol
EBI European Bioinformatics Institute Viện tin sinh học Châu Âu
Ion hóa bằng phương pháp phun
ESI Electrospray ionization
điện
FA Formic acid Axít formic
HL Hodgkin lymphoma Ung thư lympho dạng Hodgkin
v
High performent liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC
chromatography
HUPO Human Proteome Organization Tổ chức hệ protein người
IAA Iodoacetamide Iodoacetamide
IEF Isoelectric focusing Điện di đẳng điện
IPG immobilized pH gradient Gradien pH cố định
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
kV Kilo Volt Kilo Volt
m/z Mass to charge ratio Tỷ lệ khối lượng/điện tích
Matrix-asststed laser deorption Ion hóa do tác động của laze với sự
MALDI
ionization hỗ trợ của chất nền
MS Mass spectrometry Khối phổ
MS/MS Tandem mass spectrometry Khối phổ liên tục
NanoLC Nano liquid chromatography Sắc ký lỏng nano
National Center for Biotechnology Trung tâm quốc gia về thông tin
NCBI
Information Công nghệ sinh học
NHL Non-Hodgkin lymphoma Ung thu lympho dạng non-Hodgkin
PDB Protein data bank Ngân hàng dữ liệu protein
pI Isoelectric point Điểm đẳng điện
RP Reversed phase Ngược pha
Strong cation exchange
SCX Sắc ký trao đổi cation mạnh
chromatography
SDS- Sodium dodecyl sulphate Điện di biến tính trên gel
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide
TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine
vi
TFA Trifluoroacetic acid Axít trifluoroacetic
TOF Time-of-Flight Thời gian bay
V Volt Volt
w/v Weight/volumn Khối lượng/thể tích
vii
DANH MỤC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng Trang
Bảng 1 Ước tính các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 của 3
Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Bảng 2 Thành phần và các dung dịch đệm điện di SDS-PAGE 27
Bảng 3 Các thông số của hệ sắc ký lỏng nano 31
Bảng 4 Hồ sơ các mẫu được lựa chọn nghiên cứu 34
Bảng 5 Kết quả xác định nồng độ và tính toán lượng mẫu sử dụng cho 40
điện di 2-DE.
Bảng 6 Kết quả nhận diện các glycoprotein biểu hiện thay đổi giữa 44
mẫu K1 và mẫu BT05
Bảng 7 Mức độ biểu hiện của các glycoprotein giữa các mẫu bệnh 47
nghiên cứu và đối chứng.
Bảng Danh sách các glycoprotein huyết thanh bệnh nhân CML được 71
phụ lục nhận diện
viii
DANH MỤC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình Trang
Hình 1 Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh mới có liên quan đến tổ 2
chức tạo máu năm 2010 theo đánh giá của Viện nghiên cứu
Ung thư Quốc gia Mỹ
Hình 2 Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 tại Mỹ 3
theo dự báo của Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ
Hình 3 Sơ đồ phân loại bệnh leukemia theo FAB 5
Hình 4 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di SDS-PAGE 15
Hình 5 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE 16
Hình 6 Hệ sắc ký lỏng nano đa chiều (LC Packing, Dionex) 18
Hình 7 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống khối phổ 19
Hình 8 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của hệ thống NanoLC 30
Hình 9 Giao diện phần mềm Mascot v18 33
Hình 10 Quy trình phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân 35
Leukemia
Hình 11 Điện di đồ SDS-PAGE kết quả thu nhận glycoprotein bằng 38
sắc ký ái lực với ConA
Hình 12 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra quá trình tủa glycoprotein 39
với acetone
Hình 13 Kết quả diện di 2-DE mẫu glycoprotein huyết thanh bệnh 42
nhân CML (mẫu K1) và đối chứng (mẫu BT05)
Hình 14 Minh họa kết quả nhận diện vùng điểm 6 43
Hình 15 Minh họa hình ảnh 3D của bản gel khi phân tích với phần 45
PD Quest v71
Hình 16 So sánh mức độ biểu hiện của các vùng điểm protein giữa 46
mẫu K1 và đối chứng BT05
ix
Hình 17 Minh họa quá trình ghi phổ 2DnanoLC-MS/MS bằng phần 48
mềm BioAnalyst QS v11
Hình 18 Kết quả nhận diện protein bằng phần mềm Mascot v18 49
Hình 19 Kết quả nhận diện P-glycoprotein bằng phần mềm Mascot 51
v18
Hình 20 Kết quả nhận diện Novel cellular proto-oncogen với phần 52
mềm Mascot v18
Hình 21 Kết quả nhận diện Leptin receptor bằng phần mềm Mascot 53
v18
x
MỞ ĐẦU
Hiện nay, ung thư vẫn đang là thách thức lớn đối với toàn xã hội với số
lượng người mắc bệnh và tử vong gia tăng nhanh hàng năm. Đa số các trường hợp,
khi các tế bào ung thư đã di căn trong cơ thể thì quá trình điều trị trở nên khó khăn
hơn nhiều và nguy cơ tử vong cao. Do đó, việc phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và
đưa ra phác đồ điều trị phù hợp là yếu tố tiên quyết trong cuộc chiến chống lại căn
bệnh nan y này. Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các phương pháp chẩn đoán,
phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm là một yêu cầu cấp thiết.
Proteomics, một lĩnh vực mới phát triển trong vài thập niên gần đây hứa hẹn
đạt được nhiều thành tựu to lớn, đặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư.
Proteomics cho phép nghiên cứu những thay đổi của quá trình cải biến, các tương
tác protein – protein và trạng thái hoạt động của các phân tử truyền tin quan trọng
trong tế bào. Mục đích chính của proteomics là phát triển các phương pháp có độ
nhạy, đặc hiệu, và hiệu quả cao nhằm phân tích đồng thời tất cả các protein có mặt
cũng như những biến đổi của chúng trong một thời điểm nhất định. Ứng dụng của
các kỹ thuật proteomics đã được minh chứng như một công cụ hữu ích trong việc
phát hiện, tìm kiếm các biomarker và phát triển các loại thuốc chữa trị bệnh trong
hơn một thập kỷ qua.
Leukemia là bệnh ung thư liên quan trực tiếp đến hệ thống tạo máu trong cơ
thể, do đó việc lựa chọn hệ protein huyết thanh và cụ thể hơn là hệ glycoprotein
huyết thanh làm đối tượng nghiên cứu hứa hẹn đem lại nhiều kết quả khả quan.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân tích hệ
glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia” với các nội dung sau:
1. Xây dựng phương pháp nghiên cứu hệ glycoprotein huyết thanh người.
2. So sánh mức độ biểu hiện của các glycoprotein huyết thanh bệnh nhân
Leukemia với người bình thường nhằm tìm kiếm các ứng viên chỉ thị cho việc
phối hợp chẩn đoán sớm bệnh Leukemia.
3. Phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia và phát hiện các
glycoprotein có khả năng liên quan đến bệnh.
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về bệnh Leukemia
1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Leukemia
Leukemia là một loại ung thư liên quan đến hệ thống tạo máu của cơ thể, bao
gồm hệ bạch huyết và tủy xương, được đặc trưng bởi sự tăng sinh quá mức của các
các dòng tế bào máu, đặc biệt là các tế bào bạch cầu. Theo ước tính, có khoảng
259899 trường hợp mắc bệnh hoặc có nguy cơ mắc bệnh Leukemia trên toàn nước
Mỹ tính đến năm 2010, chiếm tỷ lệ khoảng 31% trong tổng số các bệnh về máu
[14]. Hình 1 minh họa mối tương quan tỷ lệ giữa số trường hợp mắc bệnh Leukemia
so các bệnh về máu chủ yếu khác.
Hình 1. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh mới có liên quan đến tổ chức tạo máu năm 2010
theo đánh giá của Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Cũng theo dự đoán, năm 2010, có khoảng 43,050 trường hợp mắc bệnh
Leukemia mới sẽ được phát hiện và điều trị trong đó có 21.840 trường hợp tử vong.
Điều đáng chú ý là nam giới và người trưởng thành có xu hướng mắc bệnh nhiều
hơn so với nữ giới và trẻ em - Bảng 1 [14].
2
Bảng 1. Ước tính các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 của Viện nghiên
cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Số trường hợp
Thể bệnh Nam Nữ
mắc bệnh
ALL 5.330 3.150 2.180
CLL 14.990 8.870 6.120
AML 12.330 6.590 5.740
CML 4.870 2.800 2.070
Các dạng
5.530 3.280 2.250
Leukemia khác
Trong 4 thể bệnh chủ yếu (Leukemia cấp dòng lympho - ALL, Leukemia
kinh dòng lympho - CLL, Leukemia cấp dòng tủy - AML, Leukemia kinh dòng tủy
- CML) thì CLL chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 35%), sau đó đến AML (29%), ALL
(12%), CML (11%) và 13% là các dạng Leukemia khác-Hình 2.
Hình 2. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 tại Mỹ theo dự báo của Viện
nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Tại Việt Nam, tuy chưa có những thống kê cụ thể về dịch tễ học bệnh
Leukemia, nhưng theo báo cáo của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương,
Leukemia chiếm khoảng 2% tổng số các bệnh ung thư. Trong số các trường hợp
3
bệnh nhân Leukemia được phát hiện và điều trị thì Leukemia cấp dòng tủy (AML)
có số lượng bệnh nhân chiếm tỷ lệ cao nhất (35,6%) [6].
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Leukemia
Cho tới nay, các nguyên nhân gây Leukemia vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đã
có nhiều quan điểm đề cập đến nguyên nhân gây bệnh Leukemia, trong đó 4 nhóm
nhân tố chính có thể gây bệnh bao gồm:
1. Các tia bức xạ (bao gồm cả các bức xạ tự nhiên, các tia vũ trụ và các bức xạ
nhân tạo).
2. Do sự tiếp xúc với các hóa chất độc hại, các chất dễ gây đột biến trong đó
các nhóm Alkyl được quan tâm hơn cả.
3. Do sự lây nhiễm của một số loại virus (các dạng virus HTLV type 1, 2 gây
Leukemia dòng lympho T).
4. Do các yếu tố di truyền: các dạng bất thường ở nhiễm sắc thể như chuyển
đoạn, thiếu hoặc thừa nhiễm sắc thể…
Cơ chế chủ yếu, trực tiếp đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư
nói chung và Leukemia nói riêng có liên quan đến các đột biến ADN trong quá trình
phân chia và nhân lên của tế bào. Các đột biến này gây hoạt hóa các gen ung thư
hoặc bất hoạt các gen triệt tiêu u bướu, làm hỏng quá trình phá hủy tế bào chết cũng
như quá trình biệt hóa và phân bào. Những đột biến này có thể phát sinh một cách
ngẫu nhiên hoặc là kết quả của việc phơi nhiễm bức xạ hoặc hợp chất gây ung thư
và những chất ảnh hưởng đến bộ máy di truyền. Virus cũng có liên quan đến một
vài dạng Leukemia. Bệnh thiếu máu Fanconi cũng là một tác nhân dẫn đến sự hình
thành bệnh leukemia dòng tủy [86].
Các biện pháp phòng bệnh cho đến nay chưa được đề cập nhiều do sự hiểu
biết hạn chế về nguyên nhân gây bệnh.
1.1.3 Phân loại Leukemia
4
Theo hệ thống phân loại FAB, Leukemia được chia làm 2 loại là Leukemia
cấp (Acute leukemia - AL) và Leukemia kinh (Chronic leukemia – CL). Leukemia
cấp là kết quả của sự tăng sinh các tế bào non, đôi khi một số tế bào đã biệt hóa, còn
leukemia kinh được đặc trưng bởi sự tăng sinh của các tế bào trưởng thành hơn
hoặc đã biệt hóa.
Leukemia
Leukemia Leukemia cấp
kinh (CL) (AL)
Leukemia Leukemia kinh Leukemia cấp Leukemia cấp
kinh dòng tủy dòng lympho dòng tủy dòng lympho
(CML) (CLL) (AML) (ALL)
(M0→M7) L1→L3
Hình 3. Sơ đồ phân loại bệnh leukemia theo FAB
Dựa vào nguồn gốc của tế bào ác tính thuộc dòng lympho hay dòng tủy,
người ta chia thành Leukemia cấp dòng lympho (Acute lymphocytic leukemia,
ALL), Leukemia cấp dòng tủy (Acute myelocytic leukemia, AML), Leukemia kinh
dòng lympho (Chronic lymphocytic leukemia-CLL) và Leukemia kinh dòng tủy
(Chronic myelocytic leukemia - CML). Nhờ những đặc điểm về hình thái học, hóa
học tế bào, phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định dấu ấn
màng tế bào (CD), di truyền tế bào, sinh học phân tử, người ta phân loại Leukemia
cấp dòng tủy thành 8 thể từ Mo đến M7 và Leukemia dòng lympho thành 3 thể L1,
L2, L3.
Ngoài ra còn một số thể khác như Leukemia tế bào gốc sinh máu chưa biệt
hóa, Leukemia tế bào hỗn hợp (Mixed Leukemia): tủy lai với lympho, tủy lai với tế
bào diệt tự nhiên (NK), tủy lai T hoặc B lympho.
5
1.1.3.1 Leukemia cấp
Đặc điểm của Leukemia cấp là sự tăng sinh tế bào non chưa trưởng thành
(immature hemopoietic), tủy xương có ≥ 30% tế bào non (blast) trong tổng số các tế
bào có nhân. Các tế bào máu non sinh sản nhanh chóng trong tủy xương, chúng lấn
át các tế bào bình thường, gây ức chế tạo hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, đôi khi có
thể lan ra các cơ quan khác (hiện tượng thâm nhiễm hay xâm lấn). Leukemia cấp
được chia làm hai nhóm chính: Leukemia cấp dòng tủy và Leukemia cấp dòng
Lympho.
(1) Leukemia cấp dòng lympho (ALL)
ALL xảy ra khi các tế bào tạo máu sơ cấp gọi là nguyên bào lympho tăng
sinh mà không phát triển thành các tế bào máu bình thường. Những tế bào bất
thường này lấn át các tế bào máu khỏe mạnh. Chúng có thể tập trung lại trong các
hạch bạch huyết và gây ra sưng tấy. Tỷ lệ sống sót đối với bệnh biến thiên theo lứa
tuổi, 85% ở trẻ em và 50% ở người lớn[39].
Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (căn cứ theo hệ thống phân loại FAB),
ALL được chia thành 3 thể khác nhau [5].
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L1 (ALL1): Tế bào tương đối đồng nhất về
mặt hình thái, đó là các tế bào nhỏ, kích cỡ tương đối đồng đều, tỷ lệ nhân và
nguyên sinh chất rất hẹp.
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L2 (ALL2): Hình thái tế bào to nhỏ khác
nhau, tỷ lệ nhân, nguyên sinh chất không đồng đều, nhân có biểu hiện không
thuần nhất.
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L3 (ALL3): Tế bào ác tính cao: to, nhân có
nhiều hốc (vacuole).
(2) Leukemia cấp dòng tủy (AML)
Leukemia cấp dòng tủy là dạng Leukemia cấp phổ biến nhất ở người trưởng
thành, tỷ lệ mắc bệnh tăng dần theo tuổi. Ở Mỹ, tử vong do AML chiếm tỷ lệ 1,2%
trong tổng số các ca tử vong vì ung thư [48]. AML xảy ra khi các tế bào non tăng
sinh quá mức nhưng không hoặc kém biệt hóa để phát triển thành tế bào máu bình
6
thường. Các nguyên tủy bào non chất đầy trong tủy xương và cản trở sự sản sinh
của các tế bào máu khỏe mạnh bình thường. Điều này dẫn tới thiếu máu (không có
đủ tế bào hồng cầu), chảy máu và thâm tím (do thiếu các tế bào tiểu cầu, yếu tố giúp
tạo thành cục máu đông) và thường xuyên bị nhiễm trùng vì không có đủ các tế bào
bạch cầu làm nhiệm vụ bảo vệ. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc AML
là 40% [24].
Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (FAB), AML được chia thành 8 thể khác
nhau [5].
• Leukemia cấp dòng tủy thể M0 (AML0): Tế bào tủy không biệt hóa hoặc biệt
hóa rất ít, phản ứng PO+ <3%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M1 (AML1): Tế bào tủy biệt hóa rất ít, phản ứng
PO+ >3%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M2 (AML2): Tế bào tủy đã biệt hóa một phần,
phản ứng PO+ >20%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M3 (AML3): Tế bào biệt hóa ở giai đoạn tiền tủy
bào – gọi là leukemia cấp tiền tủy bào.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M4 (AML4): Bệnh lý xảy ra ở tế bào nguồn giai
đoạn hạt/mono – gọi là leukemia cấp dòng hạt/mono.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M5 (AML5): Bệnh lý xuất hiện ở tế bào đầu dòng
mono - gọi là leukemia cấp dòng mono.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M6 (AML6): Bệnh lý xảy ra ở tế nào đầu dòng
hồng cầu gọi là leukemia cấp dòng hồng cầu.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M7 (AML7): Bệnh lý xảy ra ở đầu dòng mẫu tiểu
cầu gọi là leukemia dòng mẫu tiểu cầu.
1.1.3.2 Leukemia kinh
Đối với trường hợp Leukemia kinh, cơ thể sản sinh quá nhiều tế bào máu gần
trưởng thành, chúng phát triển theo các con đường khác nhau nhưng thường không
thực hiện chức năng giống như các tế bào máu trưởng thành. Leukemia kinh thường
7
phát triển chậm hơn và ít biểu hiện rầm rộ hơn leukemia cấp. Có hai dạng Leukemia
kinh yếu là: Leukemia kinh dòng Lympho và Leukemia kinh dòng tủy.
(1) Leukemia kinh dòng lympho(CLL) thường gặp ở những người trên 55 tuổi. Tỷ lệ
người mắc bệnh này cao nhất là ở độ tuổi từ 60 đến 70 tuổi. Ở CLL, các tế bào ác
tính trong tủy xương là tế bào thuộc lympho. Những tế bào bất thường này không
có khả năng chống lại sự nhiễm trùng như các tế bào bình thường. Ở CLL, các tế
bào ung thư có trong tủy xương, máu, lách và hạch bạch huyết, chúng gây ra lách
to, hạch to. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CLL là 75% [72].
(2) Leukemia kinh dòng tủy (CML): hay gặp nhất ở độ tuổi từ 25 đến 60 tuổi. Ở
CML, các tế bào ác tính là tế bào thuộc dòng tủy. Các tế bào CML thường chứa một
dạng bất thường trong mã di truyền gọi là nhiễm sắc thể Philadelphia. Tuy nhiên,
bệnh này không di truyền. Leukemia kinh dòng tủy có thể được chữa khỏi bằng việc
cấy ghép tủy xương. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CML là 90%
[63].
Ngoài ra còn có Leukemia tế bào tóc (Hairy cell leukemia - HCL). HCL đôi
khi được coi là một dạng của CLL, tuy nhiên nó không hoàn toàn giống những đặc
điểm của CLL. Khoảng 80% những người bị bệnh này là nam giới và chưa có một
trường hợp nào xảy ra ở trẻ em. Tỷ lệ sống của bệnh này trong 10 năm là từ 96-
100% [29].
1.1.4 Triệu chứng bệnh Leukemia
Các biểu hiện ban đầu của Leukemia cũng giống như triệu chứng của cảm
cúm hay các bệnh thông thường khác, bao gồm 4 hội chứng chủ yếu:
1) Hội chứng nhiễm trùng: sốt, mệt mỏi, đau khớp, thường xuyên nhiễm trùng.
2) Hội chứng thiếu máu: da xanh, đau đầu, chóng mặt, chảy máu hay sưng tấy ở
răng, lợi.
3) Hội chứng xuất huyết ở da, niêm mạc, cơ khớp, chậm lành các vết thương,
chảy máu mũi hay thường xuyên bị bầm tím.
4) Hội chứng hạch: hạch to, lách to, gan to, cảm thấy đầy bụng, chướng bụng.
8
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN TIẾN DŨNG
PHÂN TÍCH HỆ GLYCOPROTEIN HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN LEUKEMIA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hà Nội, 2010
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
NGUYỄN TIẾN DŨNG
PHÂN TÍCH HỆ GLYCOPROTEIN HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN LEUKEMIA
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
TS PHAN VĂN ĐẠT
Hà Nội, 2010
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Phan Văn Chi-
Trưởng phòng Hoá Sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học, đã tận tình hướng
dẫn và truyền thụ cho tôi kiến thức cũng như lòng say mê khoa học trong suốt
quá trình học tập và thực hiện khoá luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Bích Nhi vì những góp ý
quý báu trong quá trình hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp phòng
Hoá Sinh - Protein, Viện Công Nghệ Sinh Học và các thầy, cô thuộc Viện Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã tận
tình dạy bảo, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá luận.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân - những người
đã luôn động viên, khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 11 năm 2010
Học viên
Nguyễn Tiến Dũng
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................... i
MỤC LỤC ............................................................................................................................. ii
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT ............................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ...................................................viii
DANH MỤC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ...................................................... ix
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 2
1.1 Tổng quan về bệnh Leukemia ...................................................................................... 2
1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Leukemia ..................................................................... 2
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Leukemia ........................................................................ 4
1.1.3 Phân loại Leukemia .............................................................................................. 4
1.1.3.1 Leukemia cấp .................................................................................................. 6
1.1.3.2 Leukemia kinh ................................................................................................ 7
1.1.4 Triệu chứng bệnh Leukemia ................................................................................. 8
1.1.5 Chẩn đoán bệnh Leukemia ................................................................................... 9
1.2 Proteomics – Khoa học nghiên cứu hệ protein .......................................................... 10
1.2.1 Proteomics là gì? ................................................................................................. 10
1.2.2 Proteome huyết thanh ......................................................................................... 11
1.2.2.1 Đặc điểm, thành phần của protein huyết thanh ............................................. 11
1.2.1.2 Chức năng của các protein huyết thanh ........................................................ 11
1.2.1.3 Vì sao phải nghiên cứu proteome huyết thanh? ............................................ 12
1.2.2 Quá trình glycosyl hóa ........................................................................................ 13
1.2.2.1 Đặc điểm của quá trình glycosyl hóa ............................................................ 13
1.2.2.2 Glycoprotein với quá trình bệnh lý ............................................................... 14
1.2.3 Các công cụ và kỹ thuật Proteomics cơ bản ....................................................... 14
1.2.3.1 Các kỹ thuật phân tách protein ..................................................................... 14
1.2.3.2 Khối phổ - Trung tâm của proteomics .......................................................... 18
1.2.3.3 Các phần mềm tin sinh học ........................................................................... 19
1.2.3.4 Các cơ sở dữ liệu về trình tự gen và protein ................................................. 20
1.3 Các nghiên cứu proteomics đối với bệnh ung thư và Leukemia ............................... 20
1.3.1 Nghiên cứu proteomics đối với bệnh ung thư..................................................... 20
1.3.2 Nghiên cứu proteomics đối với bệnh Leukemia ................................................. 21
ii
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 24
2.1 Vật liệu ....................................................................................................................... 24
2.1.1 Nguyên liệu ......................................................................................................... 24
2.1.2 Hóa chất .............................................................................................................. 24
2.1.3 Trang thiết bị chính ............................................................................................. 24
2.2 Các phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 25
2.2.1 Thu nhận glycoprotein bằng sắc ký ái lực conA................................................. 25
2.2.2 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ............................................... 26
2.2.3 Làm sạch hỗn hợp glycoprotein bằng phương pháp tủa với acetone ................. 26
2.2.4 Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di biến tính trên gel polyacrylamide........ 26
2.2.5 Phân tách protein bằng kỹ thuật điện di hai chiều (2DE) ................................... 27
2.2.6 Thủy phân protein bằng enzym trypsin .............................................................. 28
2.2.6.1 Thủy phân protein trong gel.......................................................................... 28
2.2.6.2 Thủy phân protein trong dung dịch – Phân tích tổng thể.............................. 29
2.2.7 Phân tách peptide bằng sắc ký lỏng nano đa chiều ............................................. 29
2.2.8 Ghi phổ NanoLC-ESI- MS/MS ......................................................................... 31
2.2.9 Nhận diện protein bằng phần mềm Mascot v1.8 ................................................ 32
2.2.10 Tìm kiếm thông tin protein ............................................................................... 33
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 34
3.1 Lựa chọn mẫu nghiên cứu.......................................................................................... 34
3.2 Xây dựng phương pháp phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh Leukemia ..... 35
3.3 Thu nhận các glycoprotein huyết thanh bằng sắc ký ái lực ConA............................. 36
3.4 Làm sạch mẫu bằng phương pháp tủa acetone .......................................................... 38
3.5 Phân tích mức độ biểu hiện........................................................................................ 39
3.5.1 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford ............................................... 39
3.5.2 Phân tách glycoprotein bằng điện di 2-DE ......................................................... 40
3.5.3 Nhận diện các protein có mức độ biểu hiện thay đổi bằng hệ 1DNanoLC-
MS/MS ......................................................................................................................... 42
3.5.4 Phân tích sự thay đổi mức độ biểu hiện bằng phần mềm PDQuest v7.1 ............ 44
3.6 Phân tích tổng thể proteome huyết thanh bệnh nhân NHL ........................................ 47
3.6.1 Ghi phổ 2DnanoLC-MS/MS ............................................................................... 47
3.6.2 Nhận diện hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia............................ 48
3.6.3 Tìm kiếm thông tin liên quan đến các glycoprotein được nhận diện .................. 49
3.6.4 Nhận diện các protein có liên quan đến bệnh ung thư và Leukemia .................. 50
3.7 Thảo luận ................................................................................................................... 53
3.7.1 Phương pháp xử lý mẫu ...................................................................................... 53
iii
3.7.2 Phân tích mức độ biểu hiện bằng điện di 2-DE .................................................. 54
3.7.3 Phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bằng kỹ thuật 2DnanoLC-MS/MS ........ 56
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 60
PHỤ LỤC ............................................................................ Error! Bookmark not defined.
iv
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
1-DE One-dimensional electrophoresis Điện di một chiều
2-DE Two-dimensional electrophoresis Điện di hai chiều
Two-dimensional nano liquid Sắc kỷ lỏng nano hai chiều
2DnanoLC
chromatography
ACN Acetonitrile Acetonitrile
ALL Acute lymphocytic leukemia Leukemia cấp dòng lympho
AML Acute myeloid leukemia Leukemia cấp dòng tủy
amu Atomic mass unit Đơn vị khối lượng nguyên tử
APS Ammonium persulfate Ammonium persulfate
3-[(3- Một chất tẩy rửa lưỡng tính để hòa
CHAPS
Cholamidopropyl)dimethylammonio] tan protein
CID Collision-induced dissociation Phân mảnh do va đập
CLL Chronic lymphocytic leukemia Leukemia kinh dòng lympho
CML Chronic myeloid leukemia Leukemia kinh dòng tủy
Da Dalton Dalton
DTT Dithiothreitol Dithiothreitol
EBI European Bioinformatics Institute Viện tin sinh học Châu Âu
Ion hóa bằng phương pháp phun
ESI Electrospray ionization
điện
FA Formic acid Axít formic
HL Hodgkin lymphoma Ung thư lympho dạng Hodgkin
v
High performent liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC
chromatography
HUPO Human Proteome Organization Tổ chức hệ protein người
IAA Iodoacetamide Iodoacetamide
IEF Isoelectric focusing Điện di đẳng điện
IPG immobilized pH gradient Gradien pH cố định
kDa Kilo Dalton Kilo Dalton
kV Kilo Volt Kilo Volt
m/z Mass to charge ratio Tỷ lệ khối lượng/điện tích
Matrix-asststed laser deorption Ion hóa do tác động của laze với sự
MALDI
ionization hỗ trợ của chất nền
MS Mass spectrometry Khối phổ
MS/MS Tandem mass spectrometry Khối phổ liên tục
NanoLC Nano liquid chromatography Sắc ký lỏng nano
National Center for Biotechnology Trung tâm quốc gia về thông tin
NCBI
Information Công nghệ sinh học
NHL Non-Hodgkin lymphoma Ung thu lympho dạng non-Hodgkin
PDB Protein data bank Ngân hàng dữ liệu protein
pI Isoelectric point Điểm đẳng điện
RP Reversed phase Ngược pha
Strong cation exchange
SCX Sắc ký trao đổi cation mạnh
chromatography
SDS- Sodium dodecyl sulphate Điện di biến tính trên gel
PAGE polyacrylamide gel electrophoresis polyacrylamide
TEMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine
vi
TFA Trifluoroacetic acid Axít trifluoroacetic
TOF Time-of-Flight Thời gian bay
V Volt Volt
w/v Weight/volumn Khối lượng/thể tích
vii
DANH MỤC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Bảng Trang
Bảng 1 Ước tính các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 của 3
Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Bảng 2 Thành phần và các dung dịch đệm điện di SDS-PAGE 27
Bảng 3 Các thông số của hệ sắc ký lỏng nano 31
Bảng 4 Hồ sơ các mẫu được lựa chọn nghiên cứu 34
Bảng 5 Kết quả xác định nồng độ và tính toán lượng mẫu sử dụng cho 40
điện di 2-DE.
Bảng 6 Kết quả nhận diện các glycoprotein biểu hiện thay đổi giữa 44
mẫu K1 và mẫu BT05
Bảng 7 Mức độ biểu hiện của các glycoprotein giữa các mẫu bệnh 47
nghiên cứu và đối chứng.
Bảng Danh sách các glycoprotein huyết thanh bệnh nhân CML được 71
phụ lục nhận diện
viii
DANH MỤC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình Trang
Hình 1 Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh mới có liên quan đến tổ 2
chức tạo máu năm 2010 theo đánh giá của Viện nghiên cứu
Ung thư Quốc gia Mỹ
Hình 2 Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 tại Mỹ 3
theo dự báo của Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ
Hình 3 Sơ đồ phân loại bệnh leukemia theo FAB 5
Hình 4 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di SDS-PAGE 15
Hình 5 Sơ đồ phân tách protein bằng điện di 2-DE 16
Hình 6 Hệ sắc ký lỏng nano đa chiều (LC Packing, Dionex) 18
Hình 7 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống khối phổ 19
Hình 8 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của hệ thống NanoLC 30
Hình 9 Giao diện phần mềm Mascot v18 33
Hình 10 Quy trình phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân 35
Leukemia
Hình 11 Điện di đồ SDS-PAGE kết quả thu nhận glycoprotein bằng 38
sắc ký ái lực với ConA
Hình 12 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra quá trình tủa glycoprotein 39
với acetone
Hình 13 Kết quả diện di 2-DE mẫu glycoprotein huyết thanh bệnh 42
nhân CML (mẫu K1) và đối chứng (mẫu BT05)
Hình 14 Minh họa kết quả nhận diện vùng điểm 6 43
Hình 15 Minh họa hình ảnh 3D của bản gel khi phân tích với phần 45
PD Quest v71
Hình 16 So sánh mức độ biểu hiện của các vùng điểm protein giữa 46
mẫu K1 và đối chứng BT05
ix
Hình 17 Minh họa quá trình ghi phổ 2DnanoLC-MS/MS bằng phần 48
mềm BioAnalyst QS v11
Hình 18 Kết quả nhận diện protein bằng phần mềm Mascot v18 49
Hình 19 Kết quả nhận diện P-glycoprotein bằng phần mềm Mascot 51
v18
Hình 20 Kết quả nhận diện Novel cellular proto-oncogen với phần 52
mềm Mascot v18
Hình 21 Kết quả nhận diện Leptin receptor bằng phần mềm Mascot 53
v18
x
MỞ ĐẦU
Hiện nay, ung thư vẫn đang là thách thức lớn đối với toàn xã hội với số
lượng người mắc bệnh và tử vong gia tăng nhanh hàng năm. Đa số các trường hợp,
khi các tế bào ung thư đã di căn trong cơ thể thì quá trình điều trị trở nên khó khăn
hơn nhiều và nguy cơ tử vong cao. Do đó, việc phát hiện bệnh ở giai đoạn đầu và
đưa ra phác đồ điều trị phù hợp là yếu tố tiên quyết trong cuộc chiến chống lại căn
bệnh nan y này. Trước thực trạng đó, việc tìm kiếm các phương pháp chẩn đoán,
phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm là một yêu cầu cấp thiết.
Proteomics, một lĩnh vực mới phát triển trong vài thập niên gần đây hứa hẹn
đạt được nhiều thành tựu to lớn, đặc biệt trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư.
Proteomics cho phép nghiên cứu những thay đổi của quá trình cải biến, các tương
tác protein – protein và trạng thái hoạt động của các phân tử truyền tin quan trọng
trong tế bào. Mục đích chính của proteomics là phát triển các phương pháp có độ
nhạy, đặc hiệu, và hiệu quả cao nhằm phân tích đồng thời tất cả các protein có mặt
cũng như những biến đổi của chúng trong một thời điểm nhất định. Ứng dụng của
các kỹ thuật proteomics đã được minh chứng như một công cụ hữu ích trong việc
phát hiện, tìm kiếm các biomarker và phát triển các loại thuốc chữa trị bệnh trong
hơn một thập kỷ qua.
Leukemia là bệnh ung thư liên quan trực tiếp đến hệ thống tạo máu trong cơ
thể, do đó việc lựa chọn hệ protein huyết thanh và cụ thể hơn là hệ glycoprotein
huyết thanh làm đối tượng nghiên cứu hứa hẹn đem lại nhiều kết quả khả quan.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân tích hệ
glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia” với các nội dung sau:
1. Xây dựng phương pháp nghiên cứu hệ glycoprotein huyết thanh người.
2. So sánh mức độ biểu hiện của các glycoprotein huyết thanh bệnh nhân
Leukemia với người bình thường nhằm tìm kiếm các ứng viên chỉ thị cho việc
phối hợp chẩn đoán sớm bệnh Leukemia.
3. Phân tích hệ glycoprotein huyết thanh bệnh nhân Leukemia và phát hiện các
glycoprotein có khả năng liên quan đến bệnh.
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về bệnh Leukemia
1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh Leukemia
Leukemia là một loại ung thư liên quan đến hệ thống tạo máu của cơ thể, bao
gồm hệ bạch huyết và tủy xương, được đặc trưng bởi sự tăng sinh quá mức của các
các dòng tế bào máu, đặc biệt là các tế bào bạch cầu. Theo ước tính, có khoảng
259899 trường hợp mắc bệnh hoặc có nguy cơ mắc bệnh Leukemia trên toàn nước
Mỹ tính đến năm 2010, chiếm tỷ lệ khoảng 31% trong tổng số các bệnh về máu
[14]. Hình 1 minh họa mối tương quan tỷ lệ giữa số trường hợp mắc bệnh Leukemia
so các bệnh về máu chủ yếu khác.
Hình 1. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh mới có liên quan đến tổ chức tạo máu năm 2010
theo đánh giá của Viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Cũng theo dự đoán, năm 2010, có khoảng 43,050 trường hợp mắc bệnh
Leukemia mới sẽ được phát hiện và điều trị trong đó có 21.840 trường hợp tử vong.
Điều đáng chú ý là nam giới và người trưởng thành có xu hướng mắc bệnh nhiều
hơn so với nữ giới và trẻ em - Bảng 1 [14].
2
Bảng 1. Ước tính các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 của Viện nghiên
cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Số trường hợp
Thể bệnh Nam Nữ
mắc bệnh
ALL 5.330 3.150 2.180
CLL 14.990 8.870 6.120
AML 12.330 6.590 5.740
CML 4.870 2.800 2.070
Các dạng
5.530 3.280 2.250
Leukemia khác
Trong 4 thể bệnh chủ yếu (Leukemia cấp dòng lympho - ALL, Leukemia
kinh dòng lympho - CLL, Leukemia cấp dòng tủy - AML, Leukemia kinh dòng tủy
- CML) thì CLL chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 35%), sau đó đến AML (29%), ALL
(12%), CML (11%) và 13% là các dạng Leukemia khác-Hình 2.
Hình 2. Tỷ lệ các trường hợp mắc bệnh Leukemia năm 2010 tại Mỹ theo dự báo của Viện
nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ.
Tại Việt Nam, tuy chưa có những thống kê cụ thể về dịch tễ học bệnh
Leukemia, nhưng theo báo cáo của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương,
Leukemia chiếm khoảng 2% tổng số các bệnh ung thư. Trong số các trường hợp
3
bệnh nhân Leukemia được phát hiện và điều trị thì Leukemia cấp dòng tủy (AML)
có số lượng bệnh nhân chiếm tỷ lệ cao nhất (35,6%) [6].
1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Leukemia
Cho tới nay, các nguyên nhân gây Leukemia vẫn chưa được làm sáng tỏ. Đã
có nhiều quan điểm đề cập đến nguyên nhân gây bệnh Leukemia, trong đó 4 nhóm
nhân tố chính có thể gây bệnh bao gồm:
1. Các tia bức xạ (bao gồm cả các bức xạ tự nhiên, các tia vũ trụ và các bức xạ
nhân tạo).
2. Do sự tiếp xúc với các hóa chất độc hại, các chất dễ gây đột biến trong đó
các nhóm Alkyl được quan tâm hơn cả.
3. Do sự lây nhiễm của một số loại virus (các dạng virus HTLV type 1, 2 gây
Leukemia dòng lympho T).
4. Do các yếu tố di truyền: các dạng bất thường ở nhiễm sắc thể như chuyển
đoạn, thiếu hoặc thừa nhiễm sắc thể…
Cơ chế chủ yếu, trực tiếp đến sự hình thành và phát triển của bệnh ung thư
nói chung và Leukemia nói riêng có liên quan đến các đột biến ADN trong quá trình
phân chia và nhân lên của tế bào. Các đột biến này gây hoạt hóa các gen ung thư
hoặc bất hoạt các gen triệt tiêu u bướu, làm hỏng quá trình phá hủy tế bào chết cũng
như quá trình biệt hóa và phân bào. Những đột biến này có thể phát sinh một cách
ngẫu nhiên hoặc là kết quả của việc phơi nhiễm bức xạ hoặc hợp chất gây ung thư
và những chất ảnh hưởng đến bộ máy di truyền. Virus cũng có liên quan đến một
vài dạng Leukemia. Bệnh thiếu máu Fanconi cũng là một tác nhân dẫn đến sự hình
thành bệnh leukemia dòng tủy [86].
Các biện pháp phòng bệnh cho đến nay chưa được đề cập nhiều do sự hiểu
biết hạn chế về nguyên nhân gây bệnh.
1.1.3 Phân loại Leukemia
4
Theo hệ thống phân loại FAB, Leukemia được chia làm 2 loại là Leukemia
cấp (Acute leukemia - AL) và Leukemia kinh (Chronic leukemia – CL). Leukemia
cấp là kết quả của sự tăng sinh các tế bào non, đôi khi một số tế bào đã biệt hóa, còn
leukemia kinh được đặc trưng bởi sự tăng sinh của các tế bào trưởng thành hơn
hoặc đã biệt hóa.
Leukemia
Leukemia Leukemia cấp
kinh (CL) (AL)
Leukemia Leukemia kinh Leukemia cấp Leukemia cấp
kinh dòng tủy dòng lympho dòng tủy dòng lympho
(CML) (CLL) (AML) (ALL)
(M0→M7) L1→L3
Hình 3. Sơ đồ phân loại bệnh leukemia theo FAB
Dựa vào nguồn gốc của tế bào ác tính thuộc dòng lympho hay dòng tủy,
người ta chia thành Leukemia cấp dòng lympho (Acute lymphocytic leukemia,
ALL), Leukemia cấp dòng tủy (Acute myelocytic leukemia, AML), Leukemia kinh
dòng lympho (Chronic lymphocytic leukemia-CLL) và Leukemia kinh dòng tủy
(Chronic myelocytic leukemia - CML). Nhờ những đặc điểm về hình thái học, hóa
học tế bào, phương pháp miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng để xác định dấu ấn
màng tế bào (CD), di truyền tế bào, sinh học phân tử, người ta phân loại Leukemia
cấp dòng tủy thành 8 thể từ Mo đến M7 và Leukemia dòng lympho thành 3 thể L1,
L2, L3.
Ngoài ra còn một số thể khác như Leukemia tế bào gốc sinh máu chưa biệt
hóa, Leukemia tế bào hỗn hợp (Mixed Leukemia): tủy lai với lympho, tủy lai với tế
bào diệt tự nhiên (NK), tủy lai T hoặc B lympho.
5
1.1.3.1 Leukemia cấp
Đặc điểm của Leukemia cấp là sự tăng sinh tế bào non chưa trưởng thành
(immature hemopoietic), tủy xương có ≥ 30% tế bào non (blast) trong tổng số các tế
bào có nhân. Các tế bào máu non sinh sản nhanh chóng trong tủy xương, chúng lấn
át các tế bào bình thường, gây ức chế tạo hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, đôi khi có
thể lan ra các cơ quan khác (hiện tượng thâm nhiễm hay xâm lấn). Leukemia cấp
được chia làm hai nhóm chính: Leukemia cấp dòng tủy và Leukemia cấp dòng
Lympho.
(1) Leukemia cấp dòng lympho (ALL)
ALL xảy ra khi các tế bào tạo máu sơ cấp gọi là nguyên bào lympho tăng
sinh mà không phát triển thành các tế bào máu bình thường. Những tế bào bất
thường này lấn át các tế bào máu khỏe mạnh. Chúng có thể tập trung lại trong các
hạch bạch huyết và gây ra sưng tấy. Tỷ lệ sống sót đối với bệnh biến thiên theo lứa
tuổi, 85% ở trẻ em và 50% ở người lớn[39].
Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (căn cứ theo hệ thống phân loại FAB),
ALL được chia thành 3 thể khác nhau [5].
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L1 (ALL1): Tế bào tương đối đồng nhất về
mặt hình thái, đó là các tế bào nhỏ, kích cỡ tương đối đồng đều, tỷ lệ nhân và
nguyên sinh chất rất hẹp.
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L2 (ALL2): Hình thái tế bào to nhỏ khác
nhau, tỷ lệ nhân, nguyên sinh chất không đồng đều, nhân có biểu hiện không
thuần nhất.
• Leukemia cấp dòng Lympho thể L3 (ALL3): Tế bào ác tính cao: to, nhân có
nhiều hốc (vacuole).
(2) Leukemia cấp dòng tủy (AML)
Leukemia cấp dòng tủy là dạng Leukemia cấp phổ biến nhất ở người trưởng
thành, tỷ lệ mắc bệnh tăng dần theo tuổi. Ở Mỹ, tử vong do AML chiếm tỷ lệ 1,2%
trong tổng số các ca tử vong vì ung thư [48]. AML xảy ra khi các tế bào non tăng
sinh quá mức nhưng không hoặc kém biệt hóa để phát triển thành tế bào máu bình
6
thường. Các nguyên tủy bào non chất đầy trong tủy xương và cản trở sự sản sinh
của các tế bào máu khỏe mạnh bình thường. Điều này dẫn tới thiếu máu (không có
đủ tế bào hồng cầu), chảy máu và thâm tím (do thiếu các tế bào tiểu cầu, yếu tố giúp
tạo thành cục máu đông) và thường xuyên bị nhiễm trùng vì không có đủ các tế bào
bạch cầu làm nhiệm vụ bảo vệ. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc AML
là 40% [24].
Dựa vào hình thái và hóa học tế bào (FAB), AML được chia thành 8 thể khác
nhau [5].
• Leukemia cấp dòng tủy thể M0 (AML0): Tế bào tủy không biệt hóa hoặc biệt
hóa rất ít, phản ứng PO+ <3%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M1 (AML1): Tế bào tủy biệt hóa rất ít, phản ứng
PO+ >3%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M2 (AML2): Tế bào tủy đã biệt hóa một phần,
phản ứng PO+ >20%.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M3 (AML3): Tế bào biệt hóa ở giai đoạn tiền tủy
bào – gọi là leukemia cấp tiền tủy bào.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M4 (AML4): Bệnh lý xảy ra ở tế bào nguồn giai
đoạn hạt/mono – gọi là leukemia cấp dòng hạt/mono.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M5 (AML5): Bệnh lý xuất hiện ở tế bào đầu dòng
mono - gọi là leukemia cấp dòng mono.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M6 (AML6): Bệnh lý xảy ra ở tế nào đầu dòng
hồng cầu gọi là leukemia cấp dòng hồng cầu.
• Leukemia cấp dòng tủy thể M7 (AML7): Bệnh lý xảy ra ở đầu dòng mẫu tiểu
cầu gọi là leukemia dòng mẫu tiểu cầu.
1.1.3.2 Leukemia kinh
Đối với trường hợp Leukemia kinh, cơ thể sản sinh quá nhiều tế bào máu gần
trưởng thành, chúng phát triển theo các con đường khác nhau nhưng thường không
thực hiện chức năng giống như các tế bào máu trưởng thành. Leukemia kinh thường
7
phát triển chậm hơn và ít biểu hiện rầm rộ hơn leukemia cấp. Có hai dạng Leukemia
kinh yếu là: Leukemia kinh dòng Lympho và Leukemia kinh dòng tủy.
(1) Leukemia kinh dòng lympho(CLL) thường gặp ở những người trên 55 tuổi. Tỷ lệ
người mắc bệnh này cao nhất là ở độ tuổi từ 60 đến 70 tuổi. Ở CLL, các tế bào ác
tính trong tủy xương là tế bào thuộc lympho. Những tế bào bất thường này không
có khả năng chống lại sự nhiễm trùng như các tế bào bình thường. Ở CLL, các tế
bào ung thư có trong tủy xương, máu, lách và hạch bạch huyết, chúng gây ra lách
to, hạch to. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CLL là 75% [72].
(2) Leukemia kinh dòng tủy (CML): hay gặp nhất ở độ tuổi từ 25 đến 60 tuổi. Ở
CML, các tế bào ác tính là tế bào thuộc dòng tủy. Các tế bào CML thường chứa một
dạng bất thường trong mã di truyền gọi là nhiễm sắc thể Philadelphia. Tuy nhiên,
bệnh này không di truyền. Leukemia kinh dòng tủy có thể được chữa khỏi bằng việc
cấy ghép tủy xương. Tỷ lệ sống sót trong 5 năm của bệnh nhân mắc CML là 90%
[63].
Ngoài ra còn có Leukemia tế bào tóc (Hairy cell leukemia - HCL). HCL đôi
khi được coi là một dạng của CLL, tuy nhiên nó không hoàn toàn giống những đặc
điểm của CLL. Khoảng 80% những người bị bệnh này là nam giới và chưa có một
trường hợp nào xảy ra ở trẻ em. Tỷ lệ sống của bệnh này trong 10 năm là từ 96-
100% [29].
1.1.4 Triệu chứng bệnh Leukemia
Các biểu hiện ban đầu của Leukemia cũng giống như triệu chứng của cảm
cúm hay các bệnh thông thường khác, bao gồm 4 hội chứng chủ yếu:
1) Hội chứng nhiễm trùng: sốt, mệt mỏi, đau khớp, thường xuyên nhiễm trùng.
2) Hội chứng thiếu máu: da xanh, đau đầu, chóng mặt, chảy máu hay sưng tấy ở
răng, lợi.
3) Hội chứng xuất huyết ở da, niêm mạc, cơ khớp, chậm lành các vết thương,
chảy máu mũi hay thường xuyên bị bầm tím.
4) Hội chứng hạch: hạch to, lách to, gan to, cảm thấy đầy bụng, chướng bụng.
8