Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây

  • 65 trang
  • file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THỊ NGỌC GIAO
MSSV: 3113710
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37
Cần Thơ, Tháng 12/2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN
ACID ACETIC CHỊU NHIỆT TỪ TRÁI CÂY
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG NGUYỄN THỊ NGỌC GIAO
MSSV: 3113710
LỚP: VI SINH VẬT HỌC K37
Cần Thơ, Tháng 12/2014
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung Nguyễn Thị Ngọc Giao
XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………..
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban Giám đốc
Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện
đề tài này.
Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ cán bộ
và sinh viên trong Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực phẩm. Tôi chân thành cám ơn cô
Ngô Thị Phương Dung, thầy Phạm Hồng Quang và thầy Huỳnh Xuân Phong đã tận
tình truyền đạt kiến thức cùng với anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Bùi Hoàng Đăng
Long đã tận tình giúp đỡ hướng dẫn và đóng góp ý kiến cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện thí nghiệm để tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn.
Tôi xin chân thành cám ơn những người bạn đã luôn bên cạnh, động viên tôi
trong những lúc khó khăn và giúp đỡ xuyên suốt quá trình thực hiện thí nghiệm và
hoàn thành luận văn.
Cám ơn các anh chị cao học cũng đã giúp đỡ và chỉ dạy tận tình cho tôi.
Nguyễn Thị Ngọc Giao
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
TÓM TẮT
Vi sinh vật chịu nhiệt bao gồm vi khuẩn lên men acid acetic là những nguồn
giống chủng đang được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Acid acetic là
một acid hữu cơ được sử dụng rất phổ biến trong điều vị và chế biến thực phẩm. Mục
tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn và thử khả năng lên men của các chủng vi
khuẩn acid acetic ở các nhiệt độ khác nhau. Đề tài đã phân lập được 30 chủng vi
khuẩn acid acetic từ 15 loại trái cây. Phân loại các chủng AAB thông qua khả năng
oxy hóa acetate cho thấy có 18 chủng Acetobacter và 12 chủng thuộc giống
Gluconobacter. Thử nghiệm khả năng sinh acid trên môi trường có 0,01%
bromocresol green đã sơ tuyển được 15 chủng có khả năng sinh acid nhanh và mạnh
thông qua khả năng hình thành vùng phân giải sau 36-48 giờ ủ ở 30oC với đường kính
vùng phân giải >20 mm. Tuyển chọn được 4 chủng có khả năng phát triển tốt đến
41oC, riêng chủng C2 có khả năng phát triển đến 43oC, khả năng chịu acid acetic lên
đến 2,5%. Thử nghiệm khả năng lên men acetic ở 30oC, 37oC, 38oC và 39oC trên môi
trường YPGD bổ sung 4% v/v ethanol trong điều kiện ủ lắc 150 vòng/phút trong 7
ngày đã tuyển chọn được 2 chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt lên men acid acetic
là C2 và NH2 với nồng độ acid acetic lần lượt đạt 3,56 và 3,44% (w/v) ở 38oC.
Từ khóa: acid acetic, chịu acid, chịu nhiệt, lên men acid acetic, vi khuẩn acid acetic.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học i Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
MỤC LỤC
Trang
PHẦN KÝ DUYỆT
LỜI CẢM TẠ
TÓM TẮT .......................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH .....................................................................................................vi
CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................................... vii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu đề tài .....................................................................................................2
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU......................................................................3
2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ...................................................... 3
2.1.1. Nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................3
2.1.2. Nghiên cứu trong nước...................................................................................3
2.2. Vi khuẩn acid acetic ............................................................................................ 4
2.2.1. Giới thiệu vi khuẩn acid acetic .......................................................................4
2.2.2. Phân loại .........................................................................................................4
2.2.3. Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic ...................................................6
2.3. Giới thiệu về acid acetic...................................................................................... 8
2.3.1. Giới thiệu chung acid acetic ...........................................................................8
2.3.2. Phương pháp sản xuất ....................................................................................9
2.3.3. Ứng dụng ......................................................................................................10
2.4. Tổng quan về quá trình lên men của vi sinh vật ............................................12
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học ii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
2.4.1 Bản chất của quá trình lên men .....................................................................12
2.4.2. Quá trình lên men acid acetic .......................................................................12
2.4.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men..............................................13
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................15
3.1. Phương tiện nghiên cứu.................................................................................... 15
3.1.1. Thời gian và địa điểm..................................................................................15
3.1.2. Nguyên liệu ..................................................................................................15
3.1.3. Thiết bị - dụng cụ và hóa chất ......................................................................15
3.1.4. Phương pháp theo dõi các chỉ tiêu ............................................................... 16
3.1.5. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu ........................................................ 16
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................17
3.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn acid acetic ....................................................... 17
3.2.2. Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa ......................................................... 17
3.2.3. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid acetic ......................... 18
3.2.4. Khảo sát khả năng chịu acid ở các nồng độ acid khác nhau ........................ 18
3.2.5. Khảo sát khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic ................................ 18
3.2.6. Tuyển chọn chủng vi khuẩn AAB chịu nhiệt ...............................................19
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN ....................................................................20
4.1. Phân lập và xác định đặc tính của các chủng vi khuẩn acid acetic ..............20
4.2. Đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng AAB ......................... 22
4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng sinh acid acetic ..............................................25
4.4. Khả năng chịu acid của vi khuẩn acid acetic .................................................27
4.5. Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn acid acetic ................................................28
4.6. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn acid acetic ...................................................30
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................36
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
5.1. Kết luận ..............................................................................................................36
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 37
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
PHỤ LỤC 3: BẢNG KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM
PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ THỐNG KÊ
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học iv Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Kết quả phân lập các chủng AAB ....................................................................22
Bảng 2: Kết quả phân loại các chủng AAB ...................................................................24
Bảng 3: Tỷ lệ vi khuẩn Acetobacter và Gluconobacter ................................................25
Bảng 4: Hình dạng khuẩn lạc và đặc điểm hình thái của các chủng AAB .................... 26
Bảng 5: Kết quả thử nghiệm khả năng chịu acid cao của 15 chủng AAB .................... 28
Bảng 6: Kết quả thử nghiệm khả năng chịu nhiệt cao của 15 chủng AAB ...................30
Bảng 7: Kết quả thí nghiệm khả năng sinh acid và chọn 15 chủng tốt nhất. ............. - 4 -
Bảng 8: Bảng thống kê sự phát triển của 4 chủng AAB ............................................ - 5 -
Bảng 9: Số liệu về hàm lượng acid của 4 chủng AAB ............................................... - 6 -
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học v Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1: Vi khuẩn Acetobacter aceti ................................................................................5
Hình 2: Cấu trúc hóa học của acid acetic ........................................................................9
Hình 3: Đặc điểm khuẩn lạc AAB trên môi trường có chứa CaCO 3............................. 20
Hình 4: Hình hình dạng vi khuẩn và nhuộm Gram của một số chủng AAB.................21
Hình 5 : Sự biến đổi màu môi trường chỉ thị sau 72 giờ. ..............................................23
Hình 6: Sự biến đổi màu chỉ thị của một số chủng AAB ..............................................25
Hình 7: Khả năng chịu acid của các chủng AAB ở 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%, 2,5% ....27
Hình 8: Khuẩn lạc của các chủng AAB ở: 30oC, 37oC, 39oC, 41oC và 43oC................29
Hình 9: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 30oC.............................................31
Hình 10: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 30oC .................................................... 31
Hình 11: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 37oC...........................................32
Hình 12: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 37oC .................................................... 32
Hình 13: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 38oC...........................................33
Hình 14: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 38oC .................................................... 33
Hình 15: Sự phát triển của 4 chủng vi khuẩn AAB ở 39oC...........................................34
Hình 16: Hàm lượng acid của 4 chủng AAB ở 39oC .................................................... 34
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vi Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
CÁC TỪ VIẾT TẮT
AAB Acetic Acid Bacteria
v/v Thể tích/Thể tích
w/v Khối lượng/Thể tích
YPGD Yeast – Polypeptone – Glycerol – D -Glucose
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học vii Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn
ứng dụng nhiều trong công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp chế biến mủ cao su,… cho nên nhu cầu ngày càng tăng, đặc
biệt là acid acetic. Acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như:
giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconates (Matsushita,
2009),… Ở nước ta việc sản xuất acid acetic chủ yếu chỉ bằng phương pháp truyền
thống với quy mô nhỏ phục vụ cho công nghiệp thực phẩm. Với quy mô này thì không
thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng ở nước ta trong các ngành công nghiệp, nhất
là công nghiệp chế biến mủ cao su.
Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn. Trong những
nghiên cứu gần đây của nhiều nhà khoa học, giấm có chứa như acid amin, glycerin có
tác dụng làm mềm da, loại bỏ gàu, giảm cân, chữa lành da khô nức nẻ, làm dịu cổ
họng, giảm cháy nắng và ong đốt, tốt cho người bị viêm khớp, giảm nhức do bị sứa
cắn, đau do viêm xoang,… Mới đây, các nhà khoa học Venezuela đã phát hiện thấy
acid acetic có khả năng chống lại vi trùng lao và các vi khẩn kháng thuốc khác (Jim
Sliwa, 2014). Để có được các sản phẩm lên men acid acetic này nhờ vào một nhóm vi
khuẩn gọi chung là vi khuẩn acid acetic (Acetic Acid Bacteria, AAB).
Trong những năm gần đây, việc gia tăng nhiệt độ toàn cầu làm xã hội có một số
thách thức nghiêm trọng trong việc lên men với quy mô công nghiệp vì những hệ
thống làm lạnh lớn tiêu tốn nhiều năng lượng để giữ ở nhiệt độ tối ưu. Vì vậy, việc
phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chịu nhiệt lên men acid acetic thu hút nhiều sự
quan tâm vì nó mang lại lợi nhuận rất lớn cho xã hội. Qua đó có thể tiến tới quy trình
sản xuất giấm và các sản phẩm lên men từ AAB ở quy mô công nghiệp mang lại hiệu
quả kinh tế cao cho nhà sản xuất, an toàn cho sức khỏe đồng thời giảm giá thành cho
người tiêu dùng. Bên cạnh đó, việc phân lập và định danh các chủng AAB cũng góp
phần làm phong phú thêm nguồn đa dạng sinh học đặc biệt là nguồn vi sinh vật.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 1 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện tự nhiên và khí hậu
phù hợp để phát triển nhiều loại cây ăn quả thuộc các dạng từ quả ôn đới như mận, đào
đến quả cận nhiệt đới như vải thiều hay quả nhiệt đới như măng cụt, sầu riêng,… Tính
đến năm 2004, diện tích cây ăn quả nước ta đạt 747,8 nghìn ha. Trong đó, Đồng bằng
Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng cây ăn quả quan trọng nhất của Việt Nam với diện
tích khoảng 253 nghìn ha, chiếm hơn 35% diện tích cây ăn quả cả nước (theo Tổng
cục Thống kê Việt Nam).. Trong các loại cây ăn quả của Việt Nam thì có 5 nhóm
chính: vải, chôm chôm, nhãn; chuối; xoài; quả có múi và dứa, chiếm hơn 73% tổng
diện tích trồng cây ăn quả cả nước. Từ những lý do trên với nguồn nguyên liệu trái cây
dồi dào, sẵn có quanh năm. Dựa vào đó mà đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn
acid acetic chịu nhiệt từ trái cây” được thực hiện nhằm mục đích đa dạng hơn về
nguồn nguyên liệu: mẫu và địa danh, mong muốn phân lập được nhiều chủng vi khuẩn
acid acetic có khả năng chịu nhiệt cao và sinh acid mạnh. Từ đó có thể phân loại các
chủng AAB có đặt tính tốt và tiến tới việc sản xuất giống thuần chủng cung cấp cho
các cơ sở sản xuất.
1.2. Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm phân lập và tuyển chọn được vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái
cây để lên men acetic.
Nội dung thực hiện:
- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn acid acetic.
- Khảo sát các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng phân lập.
- Khảo sát khả năng chịu nhiệt và chịu acid acetic của các chủng phân lập.
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển và lên men acetic.
- Tuyển chọn các chủng AAB chịu nhiệt lên men tốt nhất.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 2 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.1.1. Nghiên cứu ngoài nước
Theo nghiên cứu tại Châu Phi, nhiều nhà nghiên cứu về công nghệ vi sinh đã
phân lập được một số chủng chịu nhiệt cao lên men tốt. Ndoye (2006) đã dựa vào đặc
tính chịu nhiệt của AAB, chọn lọc ra 2 chủng AAB chịu nhiệt: CWBI-B418 thuộc loài
Acetobacter senegalensis và CWBI-B419 thuộc loài Acetobacter pasteurinus phân lập
từ trái xoài ở Burkina Faso, có khả năng phát triển và lên men acid acetic tối ưu ở
35oC và có thể phát triển đến 42oC trong 17 chủng AAB phân lập từ trái cây và ngũ
cốc. Gần đây các nhà khoa học đã phân loại các vi khuẩn AAB trong họ
Acetobacteraceae thành 9 giống: Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas,
Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia, Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia và
Granulibacter (Cleenwerck et al., 2002; Loganathan và Nair, 2004; Jojima et al.,
2004; Yukphan et al., 2005; Greeberg et al., 2006). Ở Thái Lan, Amornrut Moryadee
và Wasu Pathom-Aree, 2008 đã phân lập được 43 giống Acetobacter, 13 giống
Gluconobacter từ 13 loại trái cây như: táo, anh đào Jamaica, nhãn, xoài, dứa và chôm
chôm,…
2.1.2. Nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về vi khuẩn acid acetic điển hình như:
Nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng vi khuẩn acid acetic chịu nhiệt (Đặng
Thụy Thùy Vân. 2010) đã phân lập được hơn 20 chủng từ 10 loại trái cây khác nhau.
Trong đó, Acetobacter và Gluconobacter được sử dụng lên men acid acetic phổ biến
nhất vì chúng có khả năng oxy hóa rượu tốt tạo acid acetic với nồng độ cao và hiểu
được cơ chế lên men chịu nhiệt của AAB. Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số
điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây; Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn
lên men acid acetic chịu nhiệt” của Huỳnh Xuân Phong (2011) đã phân lập được 132
chủng từ 27 loại mẫu bao gồm các sản phẩm lên men, hoa và trái cây của một số loại
cây ăn quả sơ tuyển được 13 chủng chịu nhiệt và sinh acid mạnh. Gần đây, Võ Thị
Ngọc Bích (2012), với đề tài “Ảnh hưởng của ethanol và acid acetic đến khả năng lên
men của Acetobacter tropicalis” đã khảo sát và so sánh các đặc tính sinh lý,sinh hóa,
nhưng nhìn chung, nguồn nguyên liệu trái cây để phân lập tìm ra vi khuẩn acid acetic
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 3 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
có khả năng lên men tốt chưa được đa dạng. Vì thế, đề tài “ Phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn acid acetic chịu nhiệt từ trái cây” nhằm mục đích đa dạng nguồn nguyên liệu
cũng như đa dạng về loài của chủng vi khuẩn này.
2.2. Vi khuẩn acid acetic
2.2.1. Giới thiệu vi khuẩn acid acetic
Hiện nay, người ta đã biết tới hơn 20 loài AAB, những vi khuẩn này dễ tìm thấy
trong không khí, đất và nước. Vì vậy, các dịch nước quả, bia, rượu thấp, dịch
đường,… để hở tiếp xúc với không khí dễ bị vẫn đục nhẹ, trên mặt tạo thành 1 lớp
màng mỏng, mịn, màu trắng xám hoặc vàng xám. Đó là do các vi khuẩn acid acetic
phát triển. Trước đây, Pasteur cho rằng quá trình lên men giấm là do một loại vi sinh
vật gây ra và được gọi là Mycoderma aceti. Sau này, người ta biết đó là nhiều loài vi
khuẩn thuộc nhóm Acetobacter hoặc Bacterium.
Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn Gram âm, có thể xếp thành chuỗi dài hay chuỗi
ngắn, có khi đứng riêng lẻ. Là các trực khuẩn, không sinh bào tử (Lương Đức Phẩm,
2001).
Ngoài ra, A’ngel et al. (2005) còn phát hiện thêm chủng vi khuẩn Acetobacter có
dạng hình elip, từ đó cho thấy sự đa dạng về hình dạng của loài vi khuẩn này.
Trong môi trường đủ rượu etylic (5-13%) thì sản phẩm chủ yếu là acid acetic,
nếu nồng độ rượu thấp hơn các vi khuẩn acetic oxy hóa triệt để rượu tạo thành CO2 và
nước.
Vi khuẩn acid acetic rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh, từ 1 tế
bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và
phát triển chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh
trưởng của chúng. Vì vậy, trong sản xuất giấm có thể dùng rượu không cần thanh
trùng được bổ sung một ít acetic để acid hóa môi trường (Lương Đức Phẩm, 1998).
2.2.2. Phân loại
Vi khuẩn AAB thuộc Acetobacteraceae và được phân loại thành 9 giống:
Acetobacter, Gluconobacter, Acidomonas, Gluconacetobacter, Asaia, Kozakia,
Swaminathania, Saccharibacter, Neoasaia và Granulibacter (Cleenwerch et al., 2002;
Loganathan và Nair, 2004; Jojima et al., 2004; Greeberg et al., 2006). Tuy nhiên trong
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 4 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
tài liệu phân loại học Bergey (Holt et al., 1994) chỉ phân loại vi khuẩn AAB thành 3
nhóm chính là Gluconobacter, Acetobacter và Frateuria.
Phân loại vi khuẩn AAB dựa trên các đặc điểm hình thái học và các đặc điểm
sinh lý, sinh hóa được mô tả trong tài liệu phân loại học Bergey: Gram âm biến đổi và
khi biến đổi, tế bào hình elip thành hình cầu, xuất hiện đơn lẻ, thành từng cặp hay kết
hợp thành chuỗi. Các dạng biến đổi có thể xuất hiện như hình cầu, thon dài, phình bầu,
hình gậy, cong hoặc dạng sợi. Có thể di động nhờ các chiên mao hoặc không di động.
Không hình thành nội bào tử, hiếu khí. Sinh vật tự dưỡng, catalase dương tính (ngoại
trừ A. pasteurianus subsp. paradoxus và A. peroxydans). Oxydase âm tính. Nhiệt độ
tối thích 25-30oC. pH tối thích 5-6. Không phân hủy nitrate, không tạo indole. Oxy hóa
ethanol tạo acid acetic ở môi trường có pH trung tính và acid (pH 4,5). Mol% G+C của
DNA trong khoảng 51-65%.
 Một số loài vi khuẩn acetic có nhiều ý nghĩa thực tế
Acetobacter aceti: hình que ngắn, không sinh bào tử, thường kết dính nhau thành
chuỗi dài. Tế bào chất được nhuộm bằng iod cho màu vàng. Giống này có thể phát
triển ở nồng độ rượu 11% và tích tụ trong môi trường tới 6% acid acetic. Nhiệt độ tối
thích cho sinh trưởng là 34oC.
Hình 1: Vi khuẩn Acetobacter aceti
(*Nguồn: Becca,2012)
Acetobacter pasteurianum: Hình que ngắn, tế bào chất nhuộm bằng iod có màu
xanh.
Acetobacter orleaneuse: hình que nhỏ, hai đầu hơi nhọn, phát triển thành màng
mỏng nhưng chắc trên bề mặt dịch nuôi cấy. Tế bào chất nhuộm iod cho màu vàng.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 5 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Giống này có thể phát triển ở dung dịch 9-12% rượu và tạo thành được 9,5% acid
acetic.
Acetobacter xylinum: có khả năng tạo thành màng mạnh và đôi khi màng khá
dày. Màng nhuộm bằng iod và acid sulfuric cho màu xanh. Giống này tích tụ được
4,5% acid acetic. Đôi khi loài này được dùng với nấm men để sản xuất đồ uống có độ
rượu thấp.
Acetobacter schiitzenbachii: hình que, tương đối dài kết hợp thành chuỗi, không
sinh bào tử, không chuyển động, Gram âm. Các tế bào giả tạo thành màng chặt nhưng
không chắc. Vì vậy, giống này có thể dùng để sản xuất theo phương pháp chìm và có
thể tạo thành 11,5-12% acid acetic trong dịch nuôi cấy.
Acetobacter curvum: có đặc tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii tạo
thành màng chắc, không làm bẩn vỏ bào và làm đục giấm. Nhiệt độ tối thích sinh
trưởng là 35-37oC, còn Acetobacter schiitzenbachii là 28oC.
Acetobacter suboxydans: vi khuẩn này được dùng nhiều trong công nghiệp
vitamin để sản xuất acid ascorbic. Trong lên men nhờ các chủng vi khuẩn suboxydans
acid acetic được tích tụ lại trong môi trường mà không bị oxy hóa tiếp. Các loài có khả
năng oxy hóa cao tiếp tục chuyển hóa acid acetic được xếp vào nhóm peroxydans, như
Acetobacter suboxydans, Acetobacter pasteurianum (Lương Đức Phẩm, 1998).
Các loài của Acetobacter chứa 5 đặc điểm: có mặt catalase, oxy hóa ethanol qua
acid acetic tới CO2 và nước, oxy hóa lactate thành carbonate, oxy hóa glycerol thành
DHP và sự sản sinh acid gluconic từ glucose (Kiều Hữu Ảnh, 1999).
2.2.3. Vai trò quan trọng của vi khuẩn acid acetic
Sản xuất giấm ăn: Trong lên men acetic, cơ chất chủ yếu là ethanol với nồng
độ trên dưới 10% trong môi trường. Có 2 phương pháp lên men acetic:
- Phương pháp nhanh: còn gọi là phương pháp Đức, hiện nay được sử dụng để
sản xuất giấm ăn trên thế giới. Giống được sử dụng là Acetobacter schiitzenbachii và
Acetobacter curvum. Cho dịch lên men và oxy hóa rượu thành acid. Như vậy, nhờ phoi
bào chủng môi trường chảy chậm, quanh co, diện tích tiếp xúc với vi khuẩn rất lớn.
Hơn nữa, để tăng hiệu quả oxy hóa người ta phun môi trường thành bụi và thổi không
khí vào thùng lên men qua các lớp phoi bào từ dưới lên trên. Mỗi lần môi trường qua
lớp phoi bào bị nóng lên vì phản ứng oxy hóa và vi khuẩn hô hấp tỏa nhiệt. VÌ vậy
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 6 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
trước khi co môi trường phun thành bụi lần sau cần phải làm lạnh. Môi trường có thể
cho qua lớp phoi bào nhiều lần để cho vi khuẩn tiếp xúc và oxy hóa hầu hết rượu trong
đó để biến thành giấm (rượu etylic dư khoảng 0,1-0,2% g/L). Nhiệt độ lên men trong
khoảng 8-10 ngày.Với phương pháp này người ta có thể lên men các thùng gỗ tới 10
m3
- Phương pháp chậm: còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp,
giống ở đây được sử dụng là Acetobacter orleaneuse. Phương pháp này hiệu suất thấp
nhưng thích hợp cho công việc làm giấm ở gia đình hoặc sản xuất ở quy mô nhỏ dùng
rượu lại, dịch đường, nước quả hoặc bia hỏng, rượu vang kém chất lượng...cho lên
men.
Ngoài ra còn phương pháp lên men chìm với chủng vi khẩn Acetobacter
suboxydans. Các nồi lên men đặc biệt được thông khí mạnh (acetator), khi thay thế
từng phần dịch dinh dưỡng cũng được thông khí đầy đủ. Sau khi ethanol được chuyển
thành acid acetic thì cũng rút bớt phần lớn và đưa dịch mới vào nồi lên men tiếp tục.
Với phương pháp lên men như vậy gần như là lên men bán liên tục. Lên men ở 28-
32oC khoảng 2 ngày (Lương Đức Phẩm, 1998).
Sản xuất thạch dừa: thạch dừa là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được
dùng chung với sirô thêm hương. Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi
khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo.
Khi vi khuẩn Acetobacter xylinum sống trong môi trường nước dừa thì glucose sẽ kết
hợp với acid béo để tạo thành một chất mầm ở màng tế bào cùng với enzyme. Enzyme
này có thể polymer hóa glucose thành cellulose.
Sản xuất vitamin C: Trong sản xuất vitamin C cần nguyên liệu đầu là L-
sorbose. Muốn có sorbose cần phải chuyển hóa từ D-sorbit là một sản phẩm hóa học
được biến đổi từ glucose, sự chuyển hóa sorbit thành sorbose phải nhờ vi khuẩn
Acetobacter suboxydans với enzyme xúc tác là sorbit-dehydrogenase. Quá trình
chuyển hóa kéo dài 1-3 ngày và có thể bổ sung sorbit một lần nữa để tổng nồng độ đạt
tới 30%. Hiệu suất chuyển hóa sorbit thành sorbose có thể đạt tới 90% (Lương Đức
Phẩm, 1998).
Một số ứng dụng khác: Màng BC (bacteria cellulose) thu nhận bằng phương
pháp lên men bề mặt sau 1 ngày. Sau khi xử lý màng thực phẩm BC đạt giá trị cảm
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 7 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
quan, có độ chịu lực cao và không bị biến tính khi xử lý nhiệt. Sử dụng màng BC làm
màng bao xúc xích được đánh giá tốt. Dùng BC làm màng bảo quản dừa tươi giữ
nguyên chất lượng sau 2 tuần bảo quản ở nhiệt độ phòng và 4 tuần bảo quản ở nhiệt độ
mát.
Sử dụng màng BC hấp phụ Bacterionic 200 AU/mL có thể bảo quản 3 ngày thịt
tươi sơ chế tối thiểu ở nhiệt độ mát. Sản phẩm sữa chua uống với nồng độ bột BC
0,5% đạt chất lượng về chỉ tiêu cảm quan, không tách lớp, dung dịch đồng nhất trong
thời gian bảo quản (Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như Huỳnh.
2012.Tạp chí Công nghệ Sinh học, số 50).
Ngoài ra vi khuẩn Acetobacter còn được ứng dụng trong sản xuất nước giải khát,
bánh mì đen,… (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2008).
2.3. Giới thiệu về acid acetic
2.3.1. Giới thiệu chung acid acetic
Acid acetic (hay còn gọi là acid ethanoic) là một acid hữu cơ, công thức hóa học
là CH3COOH, khối lượng phân tử của acid acetic là 60 g/mol. Acid acetic là một acid
yếu, thuộc nhóm acid monoprotic.
Acid acetic tan tốt trong nước, ethanol, eter, benzene, acetone và chloroform;
không tan trong CS2. Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic và
permanganate. Có khả năng hòa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose, phân
hủy da, gây bỏng da, ăn mòn nhiều kim loại. Nó có thể hòa tan không chỉ trong các
hợp chất phân cực như các muối vô cơ và các loại đường mà còn có khả năng hòa tan
trong các hợp chất không phân cực, các nguyên tố như lưu huỳnh và iod. Acid acetic
có thể ăn mòn các kim loại như sắt, mangan và kẽm sinh ra khí hydro và các muối kim
loại tương ứng gọi là các muối acetate.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 8 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học
Luận văn tốt nghệp Đại học Khóa 37- 2014 Trường Đại học Cần Thơ
Hình 2: Cấu trúc hóa học của acid acetic
(*Nguồn: Ben Mills,2009)
2.3.2. Phương pháp sản xuất
Thế kỷ thứ 8, Jabir Ibn Hayyan (Geber) là người đầu tiên cô đặc acid acetic từ
giấm bằng cách chưng cất. Thế kỷ thứ 16, nhà giả kim thuật Đức, Andreá Libavius đã
mô tả cách chưng cất acid acetic dạng tinh thể được bằng cách chưng cất khô các
acetate kim loại nhất định(loại phổ biến nhất là đồng (II) acetate (Cu(CH 3COO)2) và
ông đã so sánh acid acetic tạo ra bằng phương pháp này từ giấm. Sự có mặt của nước
trong giấm đã làm ảnh hưởng đến tính chất của acid acetic mà các nhà hóa học trong
vài thế kỷ đã cho rằng acid acetic dạng tinh thể và acid acetic trong giấm là hai chất
khác nhau. Năm 1917 nhà hóa học người Pháp Pierre Adet đã chứng minh rằng chúng
là một.
Năm 1847, nhà hóa học người Đức, Hermann Kolbe lần đầu tiên tổng hợp acid
acetic từ các vật liệu vô cơ. Chuỗi phản ứng này gồm quá trình clo hóa carbon disulfua
(CS2) thành carbon tetraclorua (CCl4), sau đó là quá trình nhiệt phân thành
tetracloruethylen và clo hóa trong nước tạo thành acid tricloracetic (C 2HCl3O2) và cuối
cùng là phản ứng oxy hóa khử vô cơ bằng cách điện phân tạo thành acid acetic.
Năm 1910, phần lớn các acid acetic được sản xuất từ sản phẩm trung gian là rượu
chưng cất từ gỗ. Loại rượu này cho tác dụng với canxi hydroxyde tạo ra canxi acetate,
sau đó cho canxi acetate tác dụng với acid sulfuric thu được acid acetic.
Acid acetic chủ yếu được sản xuất theo 2 phương pháp sinh học và tổng hợp,
acid sản xuất theo phương pháp sinh học chỉ chiếm khoảng 9% sản lượng thế giới,
khoảng 75% sản xuất ở quy mô công nghiệp theo phương pháp carbonyl hóa
methanol, 15% còn lại sản xuất theo phương pháp khác.
Chuyên ngành Vi Sinh Vật Học 9 Viện NC &PT Công Nghệ Sinh Học