Phân lập và tuyển chọn chủng bacillus sp. sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp
- 77 trang
- file .pdf
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SỸ
Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus
sp. sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ
nhớt thấp
NGUYỄN THỊ THU TRANG
[email protected]
Ngành Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Tuân
Chữ ký của GVHD
Bộ môn: Công nghệ Sinh học
Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
HÀ NỘI, 10/2022
ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
Họ và tên học viên: Nguyễn Thị Thu Trang Mã học viên: 20202668M
Khóa: CH2020B Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Ngành: Công nghệ Sinh học
1. Đầu đề đề tài nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. sinh
tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp.
Nội dung nghiên cứu:
– Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase cao
và tạo độ nhớt thấp.
– Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ
nhớt canh trường lên men bởi chủng đã được tuyển chọn.
– Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men bằng phương pháp đáp ứng
bề mặt nhằm cải thiện hoạt lực enzyme và giảm độ nhớt canh trường.
– Lên men theo mẻ trên thiết bị 2 L.
2. Họ và tên giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Tuân
3. Ngày giao nhiệm vụ đồ án:
4. Ngày hoàn thành đồ án:
Ngày …… tháng …… năm 20….
Giảng viên hướng dẫn
(Ký, ghi rõ họ tên)
I
LỜI CẢM ƠN
Trải qua 2 năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
dưới sự giảng dạy của các Thầy, Cô cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân
mình, em đã hoàn thành đề tài luận văn.
Thông qua luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy TS. Lê Tuân;
Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm,
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đồng
thời, em muốn bày tỏ lòng biết ơn tới cô PGS.TS Nguyễn Lan Hương đã giúp đỡ
để em có thể học và hoàn thành chương trình Thạc sỹ tại Đại học Bách Khoa Hà
Nội. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đã giúp em tích lũy thêm nhiều kiến thức
trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Cuối cùng, em xin cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn quan tâm,
động viên và sát cánh bên em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đồ án tốt
nghiệp.
Trong quá trình hoàn thiện đồ án do còn hạn chế về mặt kiến thức và kinh
nghiệm nên khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của
Thầy, Cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
II
TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN
Nattokinase (NK) là enzyme phân hủy fibrin có tiềm năng lớn trong ngăn ngừa
và điều trị các bệnh liên quan huyết khối. Tuy nhiên, quá trình thu hồi NK từ dịch
lên men lỏng thường bị cản trở bởi độ nhớt canh trường cao. Trong bối cảnh đó,
luận văn này đặt mục tiêu phân lập chủng Bacillus subtilis sinh tổng hợp NK cao
và tạo độ nhớt thấp.
Trong nghiên cứu này, đã phân lập được 73 dòng khuẩn lạc sinh protease từ
25 mẫu phâp lập bao gồm tương, đất, nước biển và natto thương mại. Tiến hành
sàng lọc 73 dòng khuẩn lạc này theo tiêu chí khả năng sinh tổng hợp enzyme phân
giải fibrin và đột nhớt canh trường khi lên men lỏng đã lựa chọn được chủng
TVY.04 có hoạt lực NK cao nhất đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL và độ nhớt thấp nhất đạt
3,87 ± 3,5 cP. Kết quả định danh cho thấy chủng TVY.04 thuộc loài Bacillus
amyloliquefaciens. Kết quả khảo sát điều kiện lên men nhận thấy ở nhiệt độ lên
men 37°C, tốc độ lắc 150 rpm và tỉ lệ cấp giống OD 600 nm = 0,2 cho hoạt lực
NK cao nhất đồng thời tạo độ nhớt thấp nhất. Thành phần môi trường dinh dưỡng
đã được khảo sát và tối ưu theo các mô hình Minimal run và Box-Behnken với tiêu
chí hoạt lực enzyme cao và độ nhớt thấp. Kết quả thành phần môi trường tối ưu
bao gồm: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, 5 g/L CaCl2, 10 g/L cao nấm men, 5
g/L NaCl, 1 g/L K2HPO4. Lên men chủng TVY.04 trên môi trường tối ưu, quy mô
bình tam giác giúp hoạt lực NK tăng 2 lần, đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL tuy nhiên độ
nhớt chưa được cải thiện so với môi trường ban đầu. Lên men theo mẻ chủng
Bacillus amyloliquefaciens trong môi trường tối ưu trên thiết bị bioreator quy mô
1 L thu được hoạt lực NK đạt 460 ± 12 FU/mL, độ nhớt canh trường đạt 4,41 ± 0
cP; tăng lần lượt hơn 50% và xấp xỉ 10% so với hoạt lực NK và độ nhớt (4,08 ± 0
cP) khi lên men trên bình tam giác.
Học viên thực hiện
III
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG..........................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ VIII
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. X
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................1
1.1. Xu hướng nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 1
1.2. Enzyme Nattokinase ....................................................................................... 5
1.2.1. Lịch sử ............................................................................................... 5
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của nattokinase ............................................... 5
1.3. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase ..................................................... 6
1.4. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase ...................................... 7
1.4.1. Thực phẩm lên men ........................................................................... 7
1.4.2. Nguồn phân lập khác ......................................................................... 8
1.4.3. Tương Việt Nam................................................................................ 9
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp NK trong lên men lỏng . 10
1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ......................................................... 12
1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................. 13
1.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại ............................................................ 13
1.6. Poly – γ – glutamic acid (γ-PGA) ................................................................. 14
1.6.1. Cấu trúc của γ-PGA ......................................................................... 14
1.6.2. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA ............................................ 16
1.6.3. Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA ........................................................... 18
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp γ-PGA trong lên men
lỏng .................................................................................................................. 20
1.6.5. Ảnh hưởng của độ nhớt tới quá trình thu hồi enzyme..................... 21
1.7. Kết luận ......................................................................................................... 22
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................23
2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm ............................................................................................ 23
2.1.2. Chủng đối chứng ................................................................................................... 23
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm .............................................................................................. 23
2.1.4. Các môi trường dinh dưỡng .................................................................................. 23
2.1.5. Thiết bị .................................................................................................................. 24
2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................. 24
IV
2.2.1. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase................. 24
2.2.2. Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào vi sinh vật
.......................................................................................................................... 25
2.2.3. Phương pháp phân tích định lượng hoạt lực enzyme phân giải fibrin
.......................................................................................................................... 25
2.2.4. Phương pháp xác định độ nhớt canh trường lên men ...................... 26
2.2.5. Phương pháp phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) ................ 26
2.2.6. Phương pháp xác định nồng độ đường khử ..................................... 26
2.2.7. Phương pháp điện di SDS – PAGE ................................................. 27
2.2.8. Định danh chủng bằng phương pháp 16S rRNA ............................. 27
2.2.9. Xác định mật độ tế bào thông qua giá trị OD 600nm ....................... 28
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................. 28
2.3. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................... 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 29
2.4.1. Hoạt hóa và tăng sinh chủng............................................................ 29
2.4.2. Sàng lọc thứ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme NK bằng phương pháp
lên men lỏng..................................................................................................... 29
2.4.3. Sàng lọc thứ cấp chủng tạo độ nhớt thấp ......................................... 30
2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men tới khả năng sinh tổng hợp
NK và độ nhớt của chủng TVY.04 .................................................................. 30
2.4.5. Sàng lọc các yếu tố môi trường ảnh hường tới hoạt lực và độ nhớt của
chủng sản xuất ................................................................................................. 31
2.4.6. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt........................................................................................................ 31
2.4.7. Kiểm chứng thí nghiệm trên thiết bị bioreactor quy mô 1 L ........... 32
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh nattokinase ............................. 33
3.1.1. Sàng lọc sơ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme protease................... 33
3.1.2. Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí hoạt lực NK cao .............................. 37
3.1.3. Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí độ nhớt thấp..................................... 38
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng TVY.04 .................. 38
3.1.5. Định danh chủng bằng phương pháp 16S rRNA ............................. 39
3.1.6. Phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) ...................................... 41
3.1.7. Phân tích protein ngoại bào ............................................................. 41
V
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men tới khả năng sinh tổng hợp NK và
độ nhớt của chủng TVY.04 .................................................................................. 42
3.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ................................................................ 42
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men .................................................... 43
3.2.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống theo giá trị OD 600nm ..................... 44
3.3. Tối ưu hóa các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt lực NK và độ nhớt của
chủng TVY.04 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt ............................................. 45
3.3.1. Sàng lọc các thành phần môi trường bằng Minimum-Run screening
......................................................................................................................... 45
3.3.2. Tối ưu hóa hàm lượng các yếu tố lựa chọn bằng RSM ................... 48
3.3.3. So sánh chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 với chủng đối chứng
......................................................................................................................... 54
3.4. Kiểm chứng thí nghiệm trên Bioreactor quy mô 1 L .................................... 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................59
PHỤ LỤC.............................................................................................................65
VI
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nattokinase ở Việt Nam ...................................... 3
Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ các chủng vi khuẩn khác nhau .................. 6
Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên
men ......................................................................................................................... 8
Bảng 1.4: Nồng độ của từng thành phần trong môi trường lên men. .................. 12
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt lực NK trong lên men.............. 14
Bảng 1.6: Khối lượng phân tử của γ-PGA từ một số chủng vi khuẩn khác nhau [73,
74] ........................................................................................................................ 15
Bảng 1.7: Tóm tắt đặc tính một số vi khuẩn Bacillus sản xuất γ-PGA [68] ........ 17
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của các môi trường ...................................... 23
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng phân lập. ................ 34
Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm dựa trên thiết kế Minimum-Run resolution IV
screening .............................................................................................................. 45
Bảng 3.3: Phân tích ANOVA sự ảnh hưởng của các yếu tố lựa chọn tới hoạt lực
enzyme .................................................................................................................. 46
Bảng 3.4: Phân tích ANOVA sự ảnh hưởng của các yếu tố lựa chọn tới độ nhớt47
Bảng 3.5: Bảng kết quả thí nghiệm thực nghiệm tối ưu sử dụng Box – Behnken
design ................................................................................................................... 48
Bảng 3.6: Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng các yếu tố đến hoạt lực enzyme
.............................................................................................................................. 49
Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố đến độ nhớt .... 51
VII
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Thông kê số lượng các nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase”
trên cơ sở dữ liệu Science Direct trong khoảng thời gian từ 1988 – 2022. .......... 1
Hình 1.2: Infographic phân bố các nghiên cứu về nattokinase theo quốc gia ...... 2
Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ các nghiên cứu về phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
NK theo quốc gia trên tổng số 42 bài báo khoa học ............................................. 3
Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10] ............................................................... 5
Hình 1.5: Cấu trúc không gian nattokinase [15]................................................... 6
Hình 1.6: Sự phân bố các nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39] ........ 9
Hình 1.7: Tương lên men truyền thống của Việt Nam ......................................... 10
Hình 1.8: Thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp NK ............................ 11
Hình 1.9: Cấu trúc của γ-PGA [69] ................................................................... 15
Hình 1.10: a) Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA; b) Các gen sinh tổng hợp γ-PGA của
Bacillus. spp [75] ................................................................................................. 18
Hình 3.1: Khuẩn lạc thu được sau 24h khi phân lập trên môi trường LBS agar với
các mẫu khác nhau............................................................................................... 33
Hình 3.2: Hoạt lực enzyme phân giải fibrin của 40 chủng phân lập. ................. 37
Hình 3.3: Độ nhớt canh trường sau lên men từ 5 chủng ..................................... 38
Hình 3.4: Ảnh khuẩn lạc trên đĩa LBS agar (A) và nhuộm Gram (B) ................. 39
Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng TVY.04. .......... 39
Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự của chủng TVY.04 trên ngân hàng Genbank 40
Hình 3.7: Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân EPS ........................... 41
Hình 3.8: Điện di đồ enzyme thô (giếng 1: marker protein; giếng 2: enzyme thô)
.............................................................................................................................. 41
Hình 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh tổng hợp enzyme và độ nhớt
của chủng TVY.04 ................................................................................................ 42
Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men tới khả năng sinh tổng hợp enzyme NK và
độ nhớt chủng TVY.04. ......................................................................................... 43
Hình 3.11: Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống tới khả năng sinh tổng hợp enzyme NK và
độ nhớt của chủng TVY.04. .................................................................................. 44
Hình 3.12: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của các thông số đầu vào
tới khả năng sinh tổng hợp NK của chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ........... 50
Hình 3.13: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của các thông số đầu vào
tới quá trình sản xuất độ nhớt của chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ............ 52
Hình 3.14: Kết quả lên men kiểm chứng lại dự đoán của mô hình ..................... 53
VIII
Hình 3.15: Kết quả so sánh hoạt lực NK và độ nhớt giữa chủng B.
amyloliquefacines TVY.04 và chủng đối chứng B. subtilis D ............................. 54
Hình 3.16: Các thông số vận hành lên men thiết bị 2 L chứa 1 L môi trường tối ưu
.............................................................................................................................. 55
Hình 3.17: Kết quả lên men theo mẻ chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ở quy mô
thiết bị 2 L với 1 L môi trường. ............................................................................ 56
IX
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
NK Nattokinase
γ-PGA Poly-γ-glutamic acid
FU Fibrin degradation unit Đơn vị phân giải fibrin
cP Centipoise
Tris-HCl Tris (hydroxymethyl)
aminomethane hydrochloride
TPMT Thành phần môi trường lên men
ĐKLM Điều kiện lên men
KLPT Khối lượng phân tử
RSM Response surface methodolody Phương pháp đáp ứng bề mặt
SDS– Sodium dodecyl sulfate-
PAGE polyacrylamide gel
electrophoresis
APS Ammonium persulfate solution
Temed Tetramethylethylenediamine
RPM Round per minute Vòng trên phút
DNS 3,5-Dinitrosalicylic axit
GTT γ-glutamyl transpeptidase
X
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xu hướng nghiên cứu trong và ngoài nước
Từ tên đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. sinh
tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp”, các từ khóa liên quan đã được xác
định bao gồm: nattokinase, isolation (phân lập), screening (sàng lọc), Bacillus,
viscosity (độ nhớt), poly-gamma-glutamic acid (γ-PGA). Dựa vào các từ khóa này,
tiến hành tìm kiếm trong tiêu đề, tóm tắt và từ khóa (title, keywords, abstract) trên
cơ sở dữ liệu Science Direct để xác định các công bố khoa học có liên quan đến
nội dung nghiên cứu. Kết quả tìm kiếm được phân tích thống kê theo nhiều tiêu
chí khác nhau. Đồ thị thống kê số lượng công bố được trình bày trên Hình 1.1
Hình 1.1: Thông kê số lượng các nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase” trên
cơ sở dữ liệu Science Direct trong khoảng thời gian từ 1988 – 2022.
Từ đồ thị Hình 1.1 cho thấy số lượng các nghiên cứu tăng dần theo từng năm,
qua đó phản ánh sự quan tâm của giới khoa học đến enzyme nattokinase (NK).
Tính từ năm 1988 tới đầu năm 2022 có tất cả 82 công bố của các nhà nghiên cứu
trên thế giới liên quan tới loại enzyme nattokinase. Mặc dù số lượng công bố không
quá nhiều nhưng có thể thấy sự hấp dẫn của các đề tài liên quan tới nattokinase đối
với các nhà khoa học. Tuy nhiên khi tiến hành tìm kiếm đồng thời hai từ khóa
“nattokinase, poly-gamma-glutamic acid” với cách thức như trên trên cơ sở dữ liệu
Science Direct thì kết quả trả về chỉ có duy nhất một bài báo được công bố. Như
vậy các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào enzyme nattokinase mà chưa đề cập đồng
thời đến quá trình sinh tổng hợp enzyme và sản phẩm phụ, trong trường hợp này
là γ-PGA, một tác nhân làm tăng độ nhớt canh trường lên men lỏng.
1
Bên cạnh cơ sở dữ liệu khoa học Science Direct, các cơ sở dữ liệu uy tín khác
bao gồm: NCBI, BMC Biotechnology, JMB, Nature, Europe PMC, Tạp chí Sinh
học cũng được sử dụng để tìm kiếm các tài liệu tham khảo bằng các từ khóa nêu
trên. Với các tài liệu tham khảo tìm được tiến hành sàng lọc hai cấp. Quá trình
sàng lọc sơ cấp dựa từ khóa và tiêu đề để chọn lựa các công bố phù hợp với đề tài
nghiên cứu và sàng lọc thứ cấp dựa trên nội dung tóm tắt của các nghiên cứu được
lựa chọn ở bước sàng lọc sơ cấp để tìm ra những nghiên cứu thích hợp nhất, gần
nhất với đề tài luận văn. Quá trình sàng lọc hai cấp trên đã xác định được 70 nghiên
cứu từ trong và ngoài nước phù hợp với đề tài phân lập và tuyển chọn chủng
Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Các công bố này đến từ nhiều quốc gia khác
nhau trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Sự phân bố các nghiên cứu của các quốc
gia theo địa lí được trình bày trên Hình 1.2
Hình 1.2: Infographic phân bố các nghiên cứu về nattokinase theo quốc gia
Hình 1.2 cho thấy hầu hết các quốc gia có sự quan tâm tới đề tài nattokinase
đến từ Châu Á và chỉ có một công bố tới từ Châu Âu. Lí giải cho sự phân bổ không
đồng đều này có thể do các loại thực phẩm lên men từ đậu tương phổ biến và được
sử dụng rộng rãi ở các nước Châu Á hơn Châu Âu. Đối với các quốc gia Châu Á,
Trung Quốc là nước thể hiện mối quan tâm nhiều nhất tới nattokinase với 25
nghiên cứu. Việt Nam với 9 nghiên cứu tuy không nhiều so với Trung Quốc nhưng
cũng phần nào thể hiện sự quan tâm của các tác giả tới chủ đề “Nattokinase”. Đối
với 9 công bố của Việt Nam về nattokinase, phần lớn những công bố này đều được
đăng trên Tạp chí Sinh học và trên các tạp chí khoa học công nghệ khác, số lượng
các nghiên cứu về NK được đăng trên các tạp chí uy tín trên thế giới còn ít, chưa
thực sự nhiều.
2
Từ 70 nghiên cứu được sàng lọc ở trên, tiến hành phân tích nội dung kết quả
và đã chọn ra được 42 nghiên cứu có liên quan gần nhất tới đề tài nghiên cứu phân
lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ các nguồn phân lập
khác nhau. Hình 1.3 mô tả phân bố theo quốc gia thống kê trên 42 nghiên cứu này.
Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ các nghiên cứu về phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK
theo quốc gia trên tổng số 42 bài báo khoa học
Hình 1.3 cho thấy, chiếm tỷ lệ lớn nhất là các nghiên cứu tới từ Trung Quốc
với 26% (11 nghiên cứu), theo sau là Ấn Độ và Hàn Quốc cùng có 7 nghiên cứu
chiếm 17% và theo sau các nước trên là Việt Nam chiếm 14% số nghiên cứu về
nattokinase. Chiếm 26% tổng số nghiên cứu là những công bố đến từ các quốc gia
khác, trong đó gồm các nước đến từ Châu Âu và một số nước Châu Á với số lượng
công bố ít hơn những nước kể trên. Từ đồ thị trên có thể thấy rằng Trung Quốc,
Hàn Quốc, Ấn Độ và Việt Nam là những nước quan tâm nhiều nhất tới việc nghiên
cứu và phát triển các sản phẩm chứa NK.
Để có thể chủ động được nguyên liệu NK cho sản xuất thì những năm gần đây
trong nước đã có nhiều hướng nghiên cứu về NK được đưa ra và bước đầu đạt
được những kết quả khá khả quan. Bảng 1.1 thể hiện một số nghiên cứu về đề tài
nattokinase trong những năm gần đây ở Việt Nam.
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nattokinase ở Việt Nam
TLTK Nội dung Kết quả thu được
[1] Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính 11 chủng có hoạt tính tiêu
nattokinase cao và khảo sát ảnh hưởng huyết. Hoạt lực NK cao nhất là
một số yếu tố đối với quá trình lên 8,6 FU/mL.
men thu nhận nattokinase.
3
[2] Sàng lọc và xác định Bacillus sp. phân Bốn chủng Bacillus
lập từ sản phẩm đậu tương lên men amyloliquefaciens với hoạt lực
truyền thống của Việt Nam để sản enzyme cao nhất 77,9 FU/g.
xuất enzyme tiêu huyết khối.
[3] Tinh sạch và đặc điểm của Thông số động học của NK.
Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis
DB104 tái tố hợp
[4] Tối ưu hóa thành phần lên men thu Hiệu suất NK cao nhất đạt 69,3
nhận nattokinase từ chủng Bacillus ± 0,2 FU/mL.
subtilis natto.
[5] Tối ưu hóa thành phần lên men để đạt Hiệu suất NK cao nhất đạt
năng suất sinh khối cao nhất từ chủng được sau khi tối ưu là 31,06 ±
Bacillus subtilis natto và bước đầu 0,297 FU/mL.
khảo sát năng suất nattokinase.
[6] Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ Phân lập 2 chủng: B.subtilis
natto Nhật Bản làm giống sản xuất N18 và B.subtilis N441.
natto.
[7] Phân lập và tuyển chọn một số chủng Hai chủng Bacillus sp.7.2 và
Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Bacillus sp.NP3 với hoạt lực
NK cao nhất 470 FU/g.
[8] Tối ưu môi trường lên men chìm thu Hoạt lực NK đạt 242 FU/mL
nhận enzyme nattokinase từ chủng B. trong lên men theo mẻ.
Subtilis M1 và D. Lên men fed-batch hoạt lực
tăng gấp 7 lần so với lên men
theo mẻ.
[9] Tăng cường sản xuất enzyme phân 48 chủng trong số 64 chủng
giải fibrin bởi Bacillus sp. phân lập từ phân lập được có hoạt lực phân
đậu tương lên men truyền thống của giải fibrin.
Việt Nam (Tương bần) bằng chiếu xạ Đột biến chủng bằng chiếu tia
tia UV và hóa chất. UV và hoá chất thu được
chủng Bacillus sp. ES4 cho
hoạt lực sau đột biến là 404
FU/mL.
Qua các nghiên cứu trong nước về nattokinase (Bảng 1.1), các tác giả và nhóm
tác giả ở Việt Nam chủ yếu quan tâm đến phân lập các chủng vi khuẩn từ sản phẩm
natto thương mại cũng như khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa
môi trường giúp tăng khả năng sinh tổng hợp NK của chủng. Ngược lại, số nghiên
cứu phân lập chủng vi khuẩn sinh NK từ thực phẩm đậu tương lên men (tương) chỉ
chiếm tỉ lệ nhỏ (khoảng 22% tương đương với 2 công bố) trong số các nghiên cứu
nêu trên.
4
1.2. Enzyme Nattokinase
1.2.1. Lịch sử
Natto (Hình 1.4) hay đậu nành (đậu tương) lên men là một món ăn truyền thống
của người Nhật Bản được làm từ những hạt đậu nành lên men tự nhiên trong môi
trường chứa Bacillus subtilis natto ở nhiệt độ 40⁰C trong vòng 18 đến 24 tiếng
thậm chí lâu hơn. Natto có độ nhớt khá cao và mùi của nó khá khó ngửi đối với
những người lần đầu tiên tiếp xúc do đó loại thực phẩm này khá kén người tiêu
dùng. Người Nhật Bản thường sử dụng natto như một món ăn kèm trong các bữa
ăn, thông thường bữa sáng.
Natto nhận được sự quan tâm lớn của được giới khoa học và các nhà nghiên
cứu vào năm 1980 khi GS. Sumi Hiroyuki phát hiện ra rằng natto có thể hòa tan
fibrin nhân tạo. Sumi và nhóm nghiên cứu của ông đã tách chiết được một loại
enzyme có khả năng phân hủy fibrin từ natto. Sau đó, ông đặt tên cho enzyme mới
này là enzyme tan huyết khối hay còn được gọi là enzyme tiêu sợi huyết
“Nattokinase” [10]. Năm 1986, Sumi và cộng sự đã công bố toàn bộ kết quả nghiên
cứu về NK sau khi thử nghiệm hơn 173 loại thực phẩm khác nhau để so sánh và
xác định rằng nattokinase là một enzyme có khả năng phân giải các cục máu đông
(do sự hình thành một cách bất thường bởi các sợi fibrin và tiểu cầu [11]) một cách
hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme [12]. Khi đó, NK được coi là enzyme
phân giải fibrin đầu tiên từ Bacillus subtilis.
Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10]
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của nattokinase
Nattokinase (NK) hay subtilisin NAT (E.C.3.4.21.62) là một protease serine
thuộc họ subtilisin gồm 275 axit amin, không chứa các liên kết cầu disulfide và có
hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh, hoạt tính của NK mạnh gấp 4 lần plasmin [13-15].
NK hoạt động trong dải nhiệt độ 30-50⁰C, bền ở nhiệt độ 60⁰C, nhiệt độ tối ưu là
40⁰C. Hoạt động của NK chủ yếu ở pH 6 – 12 tuy nhiên thiếu ổn định trong môi
5
trường kiềm. Một số nghiên cứu khác cho thấy hoạt tính của NK có thời gian hiệu
lực trong máu cao, duy trì hoạt lực được 8 đến 12 giờ trong cơ thể dài hơn so với
urokinase (4-20 phút) và hơn chất hoạt hóa plasminogen (tissue plasminogen
activator, t-PA) (3-6 giờ) [16, 17]. Ngoài ra NK có tính tương đồng cao với
subtilisins E (99,5%) và subtilisins J (Amylosacchariticus, 99,3%) [18].
Hình 1.5: Cấu trúc không gian nattokinase [15]
1.3. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase
NK được biết đến là enzyme phân giải fibrin đầu tiên được tìm thấy từ Bacillus
subtilis natto. Ngoài ra, các enzyme phân giải firbin có thể được sinh tổng hợp từ
nhiều chi vi khuẩn khác nhau như: Streptococcus, Staphylococcus, Vibrio,
Paenibacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas [19]. Tuy nhiên, chi Bacillus là
nhóm vi sinh vật chính được biết đến là chủng sản xuất enzyme phân giải fibrin
tốt hơn cả [20]. Các enzyme phân giải fibrin từ các loài vi khuẩn khác nhau cùng
khối lượng phân tử của chúng được trình bày trong Bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ các chủng vi khuẩn khác nhau
Enzyme phân Khối lượng
Chủng vi khuẩn TLTK
giải fibrin phân tử (kDa)
Bacillus subtilis Nattokinase 27,7 [12]
B. amyloliquefaciens DC-4 Subtilisin DFE 28 [21]
Bacillus sp. CK11-4 CK 28,2 [22]
B. amyloliquefaciens MJ5-41 AprE5-41 27 [23]
6
Virgibacillus halodenitrificans
/ 20 và 36 [24]
SK1-3-7
Paenibacillus polymyxa EJS-3 / 63,3 [25]
B. amyloliquefaciens LSSE-62 Subtilisin DJ-4 / [26]
Bacillus subtilis LD-8547 Subtilisin DFE / [27]
Thông qua Bảng 1.3 có thể thấy được rằng các vi khuẩn thuộc chi Bacillus
chiếm đa số trong số các nhóm vi khuẩn kể trên. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus,
chủ yếu là Bacillus subtilis và Bacillus amyloliquefaciens, đã được các nhà nghiên
cứu trước đó chứng minh khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải fibrin. Đồng
thời hai loài này được chứng minh là có mặt trong nhiều thực phẩm lên men như
natto, tofuyo, tương cheonggukjang (Hàn Quốc), douchi (Trung Quốc), tempeh
(Indonesia) [28]. Khối lượng phân tử của các enzyme phân giải fibrin khác nhau
phụ thuộc vào chủng vi khuẩn sinh tổng hợp. Đối với các enzyme phân giải fibrin
từ các chủng thuộc chi Bacillus, khối lượng phân tử của chúng nằm trong khoảng
từ 27 đến 28 kDa.
1.4. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase
1.4.1. Thực phẩm lên men
Vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác
nhau. Tuy nhiên, thực phẩm lên men được coi là nguồn phân lập các chủng vi
khuẩn sinh tổng hợp NK tốt nhất [29]. Các nước Châu Á đã đạt được rất nhiều
thành công trong việc tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp NK
từ các loại thực phẩm lên men. Natto là một ví dụ điển hình khi món ăn này chính
là nguồn phân lập để tìm ra nattokinase lần đầu tiên vào năm 1986. Chungkook-
jang, một loại nước chấm lên men từ đậu tương của Hàn Quốc, cũng là một nguồn
phân lập chủng sinh NK rất phổ biến. Các nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn từ
chungkook-jang đã được thực hiện từ khá sớm, vào năm 1996. Qua đó thấy được
rằng, thực phẩm lên men từ đậu tương rất được ưa chuộng làm nguồn phân lập
chủng sinh tổng hợp NK. Một số loại thực phẩm lên men từ đậu tương khác được
sử dụng làm đối tượng phân lập như: meju, doenjang (Hàn Quốc), douchi (Trung
Quốc), thua nao (Thái Lan), gembus (Indonesia), tempe (Ấn Độ) [20, 29, 30]. Tại
Việt Nam, có một sản phẩm tương tự như các sản phẩm kể trên vừa được dùng
như một loại nước chấm, vừa được dùng như một gia vị nấu ăn đã xuất hiện từ thế
kỷ 19 và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay, đó là tương.
7
Tương là một thực phẩm truyền thống được lên men từ đậu tương – một nguyên
liệu giàu protein, do đó từ tương có thể tìm ra các vi sinh vật sinh protease và từ
đó phân lập ra chủng có khả năng sinh tổng hợp NK (do NK là một protease serine).
Chính vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất NK từ tương
sẽ làm tăng sự đa dạng sinh học các chủng vi sinh vật ở Việt Nam.
Ngoài các sản phẩm đậu tương lên men, NK còn được tìm thấy trong các loại
thực phẩm lên men từ tôm (jotgal), cá (skipjack Shiokara), rau (kim chi) [30]. Bảng
1.3 trình bày tóm tắt các nguồn phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp NK từ thực phẩm lên men.
Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên men
Nguồn phân lập Chủng vi khuẩn TLTK
Natto (Nhật Bản) B. subtilis natto [12]
Thua nao (Thái Lan) B. subtilis [31]
Meju (Hàn Quốc) B. amyloliquefaciens MJ5-41 [23]
Chungkook jang (Hàn Quốc) Bacillus sp. CK 11-4 [32]
Douchi (Trung Quốc) B. subtilis LD-8547 [33]
Douchi (Trung Quốc) B. amyloliquefaciens DC-4 [34]
Doenjang (Hàn Quốc) B. amyloliquefaciens RSB34 [35]
Gembus (Indonesia) B. licheniformis RO3 [36]
Tương bần (Việt Nam) B. amyloliquefaciens [2]
Tương bần (Việt Nam) Bacillus sp. ES4 [9]
Jotgal (Hàn Quốc) B. subtilis JS2 [37]
Kim chi (Hàn Quốc) B. subtilis ZA400 [38]
Từ Bảng 1.3 cho thấy, phần lớn nguồn phân lập các chủng vi khuẩn sinh NK
được sử dụng nhiều nhất là thực phẩm lên men từ đậu tương. Điều này một lần nữa
đã khẳng định lại nhận định rằng thực phẩm lên men tương tự như natto là nguồn
phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase tốt nhất. Đồng thời các chủng
phân lập được từ thực phẩn lên men đều thuộc chi Bacillus.
1.4.2. Nguồn phân lập khác
Bên cạnh các sản phẩm thực phẩm lên men, xu hướng gần đây cho thấy các
mẫu đất và nước biển là những nguồn phân lập đầy hứa hẹn được các nhóm nghiên
cứu lựa chọn để tìm ra chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK. Qua đó thấy được rằng,
8
nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK rất đa dạng và phong phú. Hình
1.6 biểu diễn các nguồn phân lập vi khuẩn sinh NK khác nhau.
Hình 1.6: Sự phân bố các nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39]
BFFs: Thực phẩm lên men; Soils: Đất, Seawaters: Nước biển; Others: Nguồn khác
Thông qua biểu đồ Hình 1.6 nhận thấy rằng mặc dù xu hướng gần đây đã mở
rộng các nguồn phân lập vi khuẩn sinh NK nhưng thực phẩm lên men (BFFs) vẫn
chiếm tỉ lệ lớn nhất (hơn 50% tổng số các nguồn phân lập). Điều này một lần nữa
đã khẳng định lại rằng thực phẩm lên men là đối tượng được lựa chọn để phân lập
chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK nhiều hơn cả [39].
1.4.3. Tương Việt Nam
Tương (Hình 1.7) là một loại nước chấm lên men phổ biến trong ẩm thực Việt
Nam, được làm từ gạo nếp đồ xôi, đậu tương, nước sạch và muối. Những địa
phương làm nước tương nổi tiếng phải kể đến như tương Bần (Hưng Yên), tương
Cự Đà (Hà Tây), tương Nam Đàn (Nghệ An). Mỗi địa phương tuy có một bí quyết
làm tương truyền thống riêng nhưng tựu chung lại đều có một số nét chung trong
cách làm như sau:
Thứ nhất: đậu tương được rang lên cho có mùi thơm rồi xay nhỏ hoặc giã vỡ
nhỏ (tùy theo từng địa phương mà độ nhỏ khác nhau). Sau đó đem ngâm nước
muối cho mềm.
Thứ hai: gạo nếp sau khi ngâm được nấu thành thôi thì đem ủ lên mốc vàng
hoa cau. Khi đã lên mốc và thành phẩm có mùi thơm ngọt rồi thì cho ngâm cùng
đậu tương. Hỗn hợp được cho vào vật đựng (hũ) kín và ngăn được ánh sáng.
Thứ ba: đem hũ đựng hỗn hợp phơi nắng vài ngày để lợi dụng nhiệt lượng của
ánh sáng mặt trời làm cho tương tiếp tục lên men và chín.
9
LUẬN VĂN THẠC SỸ
Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus
sp. sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ
nhớt thấp
NGUYỄN THỊ THU TRANG
[email protected]
Ngành Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Tuân
Chữ ký của GVHD
Bộ môn: Công nghệ Sinh học
Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
HÀ NỘI, 10/2022
ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
Họ và tên học viên: Nguyễn Thị Thu Trang Mã học viên: 20202668M
Khóa: CH2020B Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
Ngành: Công nghệ Sinh học
1. Đầu đề đề tài nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. sinh
tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp.
Nội dung nghiên cứu:
– Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase cao
và tạo độ nhớt thấp.
– Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp nattokinase và tạo độ
nhớt canh trường lên men bởi chủng đã được tuyển chọn.
– Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men bằng phương pháp đáp ứng
bề mặt nhằm cải thiện hoạt lực enzyme và giảm độ nhớt canh trường.
– Lên men theo mẻ trên thiết bị 2 L.
2. Họ và tên giảng viên hướng dẫn: TS. Lê Tuân
3. Ngày giao nhiệm vụ đồ án:
4. Ngày hoàn thành đồ án:
Ngày …… tháng …… năm 20….
Giảng viên hướng dẫn
(Ký, ghi rõ họ tên)
I
LỜI CẢM ƠN
Trải qua 2 năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
dưới sự giảng dạy của các Thầy, Cô cùng với sự nỗ lực và cố gắng của bản thân
mình, em đã hoàn thành đề tài luận văn.
Thông qua luận văn này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành thầy TS. Lê Tuân;
Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm,
Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình giảng dạy và hướng dẫn em trong
suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Đồng
thời, em muốn bày tỏ lòng biết ơn tới cô PGS.TS Nguyễn Lan Hương đã giúp đỡ
để em có thể học và hoàn thành chương trình Thạc sỹ tại Đại học Bách Khoa Hà
Nội. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới tập thể giảng viên Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm đã giúp em tích lũy thêm nhiều kiến thức
trong suốt thời gian học tập vừa qua.
Cuối cùng, em xin cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn quan tâm,
động viên và sát cánh bên em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đồ án tốt
nghiệp.
Trong quá trình hoàn thiện đồ án do còn hạn chế về mặt kiến thức và kinh
nghiệm nên khó tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của
Thầy, Cô để luận văn của em được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
II
TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN
Nattokinase (NK) là enzyme phân hủy fibrin có tiềm năng lớn trong ngăn ngừa
và điều trị các bệnh liên quan huyết khối. Tuy nhiên, quá trình thu hồi NK từ dịch
lên men lỏng thường bị cản trở bởi độ nhớt canh trường cao. Trong bối cảnh đó,
luận văn này đặt mục tiêu phân lập chủng Bacillus subtilis sinh tổng hợp NK cao
và tạo độ nhớt thấp.
Trong nghiên cứu này, đã phân lập được 73 dòng khuẩn lạc sinh protease từ
25 mẫu phâp lập bao gồm tương, đất, nước biển và natto thương mại. Tiến hành
sàng lọc 73 dòng khuẩn lạc này theo tiêu chí khả năng sinh tổng hợp enzyme phân
giải fibrin và đột nhớt canh trường khi lên men lỏng đã lựa chọn được chủng
TVY.04 có hoạt lực NK cao nhất đạt 98,5 ± 3,5 FU/mL và độ nhớt thấp nhất đạt
3,87 ± 3,5 cP. Kết quả định danh cho thấy chủng TVY.04 thuộc loài Bacillus
amyloliquefaciens. Kết quả khảo sát điều kiện lên men nhận thấy ở nhiệt độ lên
men 37°C, tốc độ lắc 150 rpm và tỉ lệ cấp giống OD 600 nm = 0,2 cho hoạt lực
NK cao nhất đồng thời tạo độ nhớt thấp nhất. Thành phần môi trường dinh dưỡng
đã được khảo sát và tối ưu theo các mô hình Minimal run và Box-Behnken với tiêu
chí hoạt lực enzyme cao và độ nhớt thấp. Kết quả thành phần môi trường tối ưu
bao gồm: 42,3 g/L glucose, 5,7 g/L peptone, 5 g/L CaCl2, 10 g/L cao nấm men, 5
g/L NaCl, 1 g/L K2HPO4. Lên men chủng TVY.04 trên môi trường tối ưu, quy mô
bình tam giác giúp hoạt lực NK tăng 2 lần, đạt 210,47 ± 4,36 FU/mL tuy nhiên độ
nhớt chưa được cải thiện so với môi trường ban đầu. Lên men theo mẻ chủng
Bacillus amyloliquefaciens trong môi trường tối ưu trên thiết bị bioreator quy mô
1 L thu được hoạt lực NK đạt 460 ± 12 FU/mL, độ nhớt canh trường đạt 4,41 ± 0
cP; tăng lần lượt hơn 50% và xấp xỉ 10% so với hoạt lực NK và độ nhớt (4,08 ± 0
cP) khi lên men trên bình tam giác.
Học viên thực hiện
III
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG..........................................................................................VII
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ VIII
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. X
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................1
1.1. Xu hướng nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 1
1.2. Enzyme Nattokinase ....................................................................................... 5
1.2.1. Lịch sử ............................................................................................... 5
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của nattokinase ............................................... 5
1.3. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase ..................................................... 6
1.4. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase ...................................... 7
1.4.1. Thực phẩm lên men ........................................................................... 7
1.4.2. Nguồn phân lập khác ......................................................................... 8
1.4.3. Tương Việt Nam................................................................................ 9
1.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp NK trong lên men lỏng . 10
1.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon ......................................................... 12
1.5.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ .............................................................. 13
1.5.3. Ảnh hưởng của ion kim loại ............................................................ 13
1.6. Poly – γ – glutamic acid (γ-PGA) ................................................................. 14
1.6.1. Cấu trúc của γ-PGA ......................................................................... 14
1.6.2. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA ............................................ 16
1.6.3. Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA ........................................................... 18
1.6.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp γ-PGA trong lên men
lỏng .................................................................................................................. 20
1.6.5. Ảnh hưởng của độ nhớt tới quá trình thu hồi enzyme..................... 21
1.7. Kết luận ......................................................................................................... 22
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................23
2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 23
2.1.1. Đối tượng thí nghiệm ............................................................................................ 23
2.1.2. Chủng đối chứng ................................................................................................... 23
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm .............................................................................................. 23
2.1.4. Các môi trường dinh dưỡng .................................................................................. 23
2.1.5. Thiết bị .................................................................................................................. 24
2.2. Phương pháp phân tích ................................................................................. 24
IV
2.2.1. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn sinh nattokinase................. 24
2.2.2. Phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào vi sinh vật
.......................................................................................................................... 25
2.2.3. Phương pháp phân tích định lượng hoạt lực enzyme phân giải fibrin
.......................................................................................................................... 25
2.2.4. Phương pháp xác định độ nhớt canh trường lên men ...................... 26
2.2.5. Phương pháp phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) ................ 26
2.2.6. Phương pháp xác định nồng độ đường khử ..................................... 26
2.2.7. Phương pháp điện di SDS – PAGE ................................................. 27
2.2.8. Định danh chủng bằng phương pháp 16S rRNA ............................. 27
2.2.9. Xác định mật độ tế bào thông qua giá trị OD 600nm ....................... 28
2.2.10. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................. 28
2.3. Sơ đồ nghiên cứu........................................................................................... 29
2.4. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 29
2.4.1. Hoạt hóa và tăng sinh chủng............................................................ 29
2.4.2. Sàng lọc thứ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme NK bằng phương pháp
lên men lỏng..................................................................................................... 29
2.4.3. Sàng lọc thứ cấp chủng tạo độ nhớt thấp ......................................... 30
2.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men tới khả năng sinh tổng hợp
NK và độ nhớt của chủng TVY.04 .................................................................. 30
2.4.5. Sàng lọc các yếu tố môi trường ảnh hường tới hoạt lực và độ nhớt của
chủng sản xuất ................................................................................................. 31
2.4.6. Tối ưu hóa thành phần môi trường lên men bằng phương pháp đáp
ứng bề mặt........................................................................................................ 31
2.4.7. Kiểm chứng thí nghiệm trên thiết bị bioreactor quy mô 1 L ........... 32
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 33
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh nattokinase ............................. 33
3.1.1. Sàng lọc sơ cấp chủng sinh tổng hợp enzyme protease................... 33
3.1.2. Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí hoạt lực NK cao .............................. 37
3.1.3. Sàng lọc thứ cấp theo tiêu chí độ nhớt thấp..................................... 38
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng TVY.04 .................. 38
3.1.5. Định danh chủng bằng phương pháp 16S rRNA ............................. 39
3.1.6. Phân tích polysaccharide ngoại bào (EPS) ...................................... 41
3.1.7. Phân tích protein ngoại bào ............................................................. 41
V
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện lên men tới khả năng sinh tổng hợp NK và
độ nhớt của chủng TVY.04 .................................................................................. 42
3.2.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc ................................................................ 42
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men .................................................... 43
3.2.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống theo giá trị OD 600nm ..................... 44
3.3. Tối ưu hóa các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới hoạt lực NK và độ nhớt của
chủng TVY.04 bằng phương pháp đáp ứng bề mặt ............................................. 45
3.3.1. Sàng lọc các thành phần môi trường bằng Minimum-Run screening
......................................................................................................................... 45
3.3.2. Tối ưu hóa hàm lượng các yếu tố lựa chọn bằng RSM ................... 48
3.3.3. So sánh chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 với chủng đối chứng
......................................................................................................................... 54
3.4. Kiểm chứng thí nghiệm trên Bioreactor quy mô 1 L .................................... 54
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................59
PHỤ LỤC.............................................................................................................65
VI
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nattokinase ở Việt Nam ...................................... 3
Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ các chủng vi khuẩn khác nhau .................. 6
Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên
men ......................................................................................................................... 8
Bảng 1.4: Nồng độ của từng thành phần trong môi trường lên men. .................. 12
Bảng 1.5: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt lực NK trong lên men.............. 14
Bảng 1.6: Khối lượng phân tử của γ-PGA từ một số chủng vi khuẩn khác nhau [73,
74] ........................................................................................................................ 15
Bảng 1.7: Tóm tắt đặc tính một số vi khuẩn Bacillus sản xuất γ-PGA [68] ........ 17
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của các môi trường ...................................... 23
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của một số chủng phân lập. ................ 34
Bảng 3.2: Kết quả thí nghiệm dựa trên thiết kế Minimum-Run resolution IV
screening .............................................................................................................. 45
Bảng 3.3: Phân tích ANOVA sự ảnh hưởng của các yếu tố lựa chọn tới hoạt lực
enzyme .................................................................................................................. 46
Bảng 3.4: Phân tích ANOVA sự ảnh hưởng của các yếu tố lựa chọn tới độ nhớt47
Bảng 3.5: Bảng kết quả thí nghiệm thực nghiệm tối ưu sử dụng Box – Behnken
design ................................................................................................................... 48
Bảng 3.6: Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng các yếu tố đến hoạt lực enzyme
.............................................................................................................................. 49
Bảng 3.7: Kết quả phân tích ANOVA ảnh hưởng của các yếu tố đến độ nhớt .... 51
VII
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Thông kê số lượng các nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase”
trên cơ sở dữ liệu Science Direct trong khoảng thời gian từ 1988 – 2022. .......... 1
Hình 1.2: Infographic phân bố các nghiên cứu về nattokinase theo quốc gia ...... 2
Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ các nghiên cứu về phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp
NK theo quốc gia trên tổng số 42 bài báo khoa học ............................................. 3
Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10] ............................................................... 5
Hình 1.5: Cấu trúc không gian nattokinase [15]................................................... 6
Hình 1.6: Sự phân bố các nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39] ........ 9
Hình 1.7: Tương lên men truyền thống của Việt Nam ......................................... 10
Hình 1.8: Thành phần môi trường lên men sinh tổng hợp NK ............................ 11
Hình 1.9: Cấu trúc của γ-PGA [69] ................................................................... 15
Hình 1.10: a) Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA; b) Các gen sinh tổng hợp γ-PGA của
Bacillus. spp [75] ................................................................................................. 18
Hình 3.1: Khuẩn lạc thu được sau 24h khi phân lập trên môi trường LBS agar với
các mẫu khác nhau............................................................................................... 33
Hình 3.2: Hoạt lực enzyme phân giải fibrin của 40 chủng phân lập. ................. 37
Hình 3.3: Độ nhớt canh trường sau lên men từ 5 chủng ..................................... 38
Hình 3.4: Ảnh khuẩn lạc trên đĩa LBS agar (A) và nhuộm Gram (B) ................. 39
Hình 3.5: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng TVY.04. .......... 39
Hình 3.6: Kết quả so sánh trình tự của chủng TVY.04 trên ngân hàng Genbank 40
Hình 3.7: Sắc ký bản mỏng của các sản phẩm thủy phân EPS ........................... 41
Hình 3.8: Điện di đồ enzyme thô (giếng 1: marker protein; giếng 2: enzyme thô)
.............................................................................................................................. 41
Hình 3.9: Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh tổng hợp enzyme và độ nhớt
của chủng TVY.04 ................................................................................................ 42
Hình 3.10: Ảnh hưởng nhiệt độ lên men tới khả năng sinh tổng hợp enzyme NK và
độ nhớt chủng TVY.04. ......................................................................................... 43
Hình 3.11: Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống tới khả năng sinh tổng hợp enzyme NK và
độ nhớt của chủng TVY.04. .................................................................................. 44
Hình 3.12: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của các thông số đầu vào
tới khả năng sinh tổng hợp NK của chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ........... 50
Hình 3.13: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng của các thông số đầu vào
tới quá trình sản xuất độ nhớt của chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ............ 52
Hình 3.14: Kết quả lên men kiểm chứng lại dự đoán của mô hình ..................... 53
VIII
Hình 3.15: Kết quả so sánh hoạt lực NK và độ nhớt giữa chủng B.
amyloliquefacines TVY.04 và chủng đối chứng B. subtilis D ............................. 54
Hình 3.16: Các thông số vận hành lên men thiết bị 2 L chứa 1 L môi trường tối ưu
.............................................................................................................................. 55
Hình 3.17: Kết quả lên men theo mẻ chủng B. amyloliquefaciens TVY.04 ở quy mô
thiết bị 2 L với 1 L môi trường. ............................................................................ 56
IX
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt
NK Nattokinase
γ-PGA Poly-γ-glutamic acid
FU Fibrin degradation unit Đơn vị phân giải fibrin
cP Centipoise
Tris-HCl Tris (hydroxymethyl)
aminomethane hydrochloride
TPMT Thành phần môi trường lên men
ĐKLM Điều kiện lên men
KLPT Khối lượng phân tử
RSM Response surface methodolody Phương pháp đáp ứng bề mặt
SDS– Sodium dodecyl sulfate-
PAGE polyacrylamide gel
electrophoresis
APS Ammonium persulfate solution
Temed Tetramethylethylenediamine
RPM Round per minute Vòng trên phút
DNS 3,5-Dinitrosalicylic axit
GTT γ-glutamyl transpeptidase
X
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Xu hướng nghiên cứu trong và ngoài nước
Từ tên đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn chủng Bacillus sp. sinh
tổng hợp nattokinase và tạo độ nhớt thấp”, các từ khóa liên quan đã được xác
định bao gồm: nattokinase, isolation (phân lập), screening (sàng lọc), Bacillus,
viscosity (độ nhớt), poly-gamma-glutamic acid (γ-PGA). Dựa vào các từ khóa này,
tiến hành tìm kiếm trong tiêu đề, tóm tắt và từ khóa (title, keywords, abstract) trên
cơ sở dữ liệu Science Direct để xác định các công bố khoa học có liên quan đến
nội dung nghiên cứu. Kết quả tìm kiếm được phân tích thống kê theo nhiều tiêu
chí khác nhau. Đồ thị thống kê số lượng công bố được trình bày trên Hình 1.1
Hình 1.1: Thông kê số lượng các nghiên cứu (cộng dồn) với từ khóa “Nattokinase” trên
cơ sở dữ liệu Science Direct trong khoảng thời gian từ 1988 – 2022.
Từ đồ thị Hình 1.1 cho thấy số lượng các nghiên cứu tăng dần theo từng năm,
qua đó phản ánh sự quan tâm của giới khoa học đến enzyme nattokinase (NK).
Tính từ năm 1988 tới đầu năm 2022 có tất cả 82 công bố của các nhà nghiên cứu
trên thế giới liên quan tới loại enzyme nattokinase. Mặc dù số lượng công bố không
quá nhiều nhưng có thể thấy sự hấp dẫn của các đề tài liên quan tới nattokinase đối
với các nhà khoa học. Tuy nhiên khi tiến hành tìm kiếm đồng thời hai từ khóa
“nattokinase, poly-gamma-glutamic acid” với cách thức như trên trên cơ sở dữ liệu
Science Direct thì kết quả trả về chỉ có duy nhất một bài báo được công bố. Như
vậy các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào enzyme nattokinase mà chưa đề cập đồng
thời đến quá trình sinh tổng hợp enzyme và sản phẩm phụ, trong trường hợp này
là γ-PGA, một tác nhân làm tăng độ nhớt canh trường lên men lỏng.
1
Bên cạnh cơ sở dữ liệu khoa học Science Direct, các cơ sở dữ liệu uy tín khác
bao gồm: NCBI, BMC Biotechnology, JMB, Nature, Europe PMC, Tạp chí Sinh
học cũng được sử dụng để tìm kiếm các tài liệu tham khảo bằng các từ khóa nêu
trên. Với các tài liệu tham khảo tìm được tiến hành sàng lọc hai cấp. Quá trình
sàng lọc sơ cấp dựa từ khóa và tiêu đề để chọn lựa các công bố phù hợp với đề tài
nghiên cứu và sàng lọc thứ cấp dựa trên nội dung tóm tắt của các nghiên cứu được
lựa chọn ở bước sàng lọc sơ cấp để tìm ra những nghiên cứu thích hợp nhất, gần
nhất với đề tài luận văn. Quá trình sàng lọc hai cấp trên đã xác định được 70 nghiên
cứu từ trong và ngoài nước phù hợp với đề tài phân lập và tuyển chọn chủng
Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Các công bố này đến từ nhiều quốc gia khác
nhau trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Sự phân bố các nghiên cứu của các quốc
gia theo địa lí được trình bày trên Hình 1.2
Hình 1.2: Infographic phân bố các nghiên cứu về nattokinase theo quốc gia
Hình 1.2 cho thấy hầu hết các quốc gia có sự quan tâm tới đề tài nattokinase
đến từ Châu Á và chỉ có một công bố tới từ Châu Âu. Lí giải cho sự phân bổ không
đồng đều này có thể do các loại thực phẩm lên men từ đậu tương phổ biến và được
sử dụng rộng rãi ở các nước Châu Á hơn Châu Âu. Đối với các quốc gia Châu Á,
Trung Quốc là nước thể hiện mối quan tâm nhiều nhất tới nattokinase với 25
nghiên cứu. Việt Nam với 9 nghiên cứu tuy không nhiều so với Trung Quốc nhưng
cũng phần nào thể hiện sự quan tâm của các tác giả tới chủ đề “Nattokinase”. Đối
với 9 công bố của Việt Nam về nattokinase, phần lớn những công bố này đều được
đăng trên Tạp chí Sinh học và trên các tạp chí khoa học công nghệ khác, số lượng
các nghiên cứu về NK được đăng trên các tạp chí uy tín trên thế giới còn ít, chưa
thực sự nhiều.
2
Từ 70 nghiên cứu được sàng lọc ở trên, tiến hành phân tích nội dung kết quả
và đã chọn ra được 42 nghiên cứu có liên quan gần nhất tới đề tài nghiên cứu phân
lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp nattokinase từ các nguồn phân lập
khác nhau. Hình 1.3 mô tả phân bố theo quốc gia thống kê trên 42 nghiên cứu này.
Hình 1.3: Thống kê tỷ lệ các nghiên cứu về phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK
theo quốc gia trên tổng số 42 bài báo khoa học
Hình 1.3 cho thấy, chiếm tỷ lệ lớn nhất là các nghiên cứu tới từ Trung Quốc
với 26% (11 nghiên cứu), theo sau là Ấn Độ và Hàn Quốc cùng có 7 nghiên cứu
chiếm 17% và theo sau các nước trên là Việt Nam chiếm 14% số nghiên cứu về
nattokinase. Chiếm 26% tổng số nghiên cứu là những công bố đến từ các quốc gia
khác, trong đó gồm các nước đến từ Châu Âu và một số nước Châu Á với số lượng
công bố ít hơn những nước kể trên. Từ đồ thị trên có thể thấy rằng Trung Quốc,
Hàn Quốc, Ấn Độ và Việt Nam là những nước quan tâm nhiều nhất tới việc nghiên
cứu và phát triển các sản phẩm chứa NK.
Để có thể chủ động được nguyên liệu NK cho sản xuất thì những năm gần đây
trong nước đã có nhiều hướng nghiên cứu về NK được đưa ra và bước đầu đạt
được những kết quả khá khả quan. Bảng 1.1 thể hiện một số nghiên cứu về đề tài
nattokinase trong những năm gần đây ở Việt Nam.
Bảng 1.1: Một số nghiên cứu về nattokinase ở Việt Nam
TLTK Nội dung Kết quả thu được
[1] Phân lập vi khuẩn cho hoạt tính 11 chủng có hoạt tính tiêu
nattokinase cao và khảo sát ảnh hưởng huyết. Hoạt lực NK cao nhất là
một số yếu tố đối với quá trình lên 8,6 FU/mL.
men thu nhận nattokinase.
3
[2] Sàng lọc và xác định Bacillus sp. phân Bốn chủng Bacillus
lập từ sản phẩm đậu tương lên men amyloliquefaciens với hoạt lực
truyền thống của Việt Nam để sản enzyme cao nhất 77,9 FU/g.
xuất enzyme tiêu huyết khối.
[3] Tinh sạch và đặc điểm của Thông số động học của NK.
Nattokinase từ chủng Bacillus subtilis
DB104 tái tố hợp
[4] Tối ưu hóa thành phần lên men thu Hiệu suất NK cao nhất đạt 69,3
nhận nattokinase từ chủng Bacillus ± 0,2 FU/mL.
subtilis natto.
[5] Tối ưu hóa thành phần lên men để đạt Hiệu suất NK cao nhất đạt
năng suất sinh khối cao nhất từ chủng được sau khi tối ưu là 31,06 ±
Bacillus subtilis natto và bước đầu 0,297 FU/mL.
khảo sát năng suất nattokinase.
[6] Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ Phân lập 2 chủng: B.subtilis
natto Nhật Bản làm giống sản xuất N18 và B.subtilis N441.
natto.
[7] Phân lập và tuyển chọn một số chủng Hai chủng Bacillus sp.7.2 và
Bacillus sinh tổng hợp nattokinase. Bacillus sp.NP3 với hoạt lực
NK cao nhất 470 FU/g.
[8] Tối ưu môi trường lên men chìm thu Hoạt lực NK đạt 242 FU/mL
nhận enzyme nattokinase từ chủng B. trong lên men theo mẻ.
Subtilis M1 và D. Lên men fed-batch hoạt lực
tăng gấp 7 lần so với lên men
theo mẻ.
[9] Tăng cường sản xuất enzyme phân 48 chủng trong số 64 chủng
giải fibrin bởi Bacillus sp. phân lập từ phân lập được có hoạt lực phân
đậu tương lên men truyền thống của giải fibrin.
Việt Nam (Tương bần) bằng chiếu xạ Đột biến chủng bằng chiếu tia
tia UV và hóa chất. UV và hoá chất thu được
chủng Bacillus sp. ES4 cho
hoạt lực sau đột biến là 404
FU/mL.
Qua các nghiên cứu trong nước về nattokinase (Bảng 1.1), các tác giả và nhóm
tác giả ở Việt Nam chủ yếu quan tâm đến phân lập các chủng vi khuẩn từ sản phẩm
natto thương mại cũng như khảo sát các yếu tố ảnh hưởng, tiến hành tối ưu hóa
môi trường giúp tăng khả năng sinh tổng hợp NK của chủng. Ngược lại, số nghiên
cứu phân lập chủng vi khuẩn sinh NK từ thực phẩm đậu tương lên men (tương) chỉ
chiếm tỉ lệ nhỏ (khoảng 22% tương đương với 2 công bố) trong số các nghiên cứu
nêu trên.
4
1.2. Enzyme Nattokinase
1.2.1. Lịch sử
Natto (Hình 1.4) hay đậu nành (đậu tương) lên men là một món ăn truyền thống
của người Nhật Bản được làm từ những hạt đậu nành lên men tự nhiên trong môi
trường chứa Bacillus subtilis natto ở nhiệt độ 40⁰C trong vòng 18 đến 24 tiếng
thậm chí lâu hơn. Natto có độ nhớt khá cao và mùi của nó khá khó ngửi đối với
những người lần đầu tiên tiếp xúc do đó loại thực phẩm này khá kén người tiêu
dùng. Người Nhật Bản thường sử dụng natto như một món ăn kèm trong các bữa
ăn, thông thường bữa sáng.
Natto nhận được sự quan tâm lớn của được giới khoa học và các nhà nghiên
cứu vào năm 1980 khi GS. Sumi Hiroyuki phát hiện ra rằng natto có thể hòa tan
fibrin nhân tạo. Sumi và nhóm nghiên cứu của ông đã tách chiết được một loại
enzyme có khả năng phân hủy fibrin từ natto. Sau đó, ông đặt tên cho enzyme mới
này là enzyme tan huyết khối hay còn được gọi là enzyme tiêu sợi huyết
“Nattokinase” [10]. Năm 1986, Sumi và cộng sự đã công bố toàn bộ kết quả nghiên
cứu về NK sau khi thử nghiệm hơn 173 loại thực phẩm khác nhau để so sánh và
xác định rằng nattokinase là một enzyme có khả năng phân giải các cục máu đông
(do sự hình thành một cách bất thường bởi các sợi fibrin và tiểu cầu [11]) một cách
hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzyme [12]. Khi đó, NK được coi là enzyme
phân giải fibrin đầu tiên từ Bacillus subtilis.
Hình 1.4: Natto-Đậu nành lên men [10]
1.2.2. Cấu trúc và đặc điểm của nattokinase
Nattokinase (NK) hay subtilisin NAT (E.C.3.4.21.62) là một protease serine
thuộc họ subtilisin gồm 275 axit amin, không chứa các liên kết cầu disulfide và có
hoạt tính tiêu sợi huyết mạnh, hoạt tính của NK mạnh gấp 4 lần plasmin [13-15].
NK hoạt động trong dải nhiệt độ 30-50⁰C, bền ở nhiệt độ 60⁰C, nhiệt độ tối ưu là
40⁰C. Hoạt động của NK chủ yếu ở pH 6 – 12 tuy nhiên thiếu ổn định trong môi
5
trường kiềm. Một số nghiên cứu khác cho thấy hoạt tính của NK có thời gian hiệu
lực trong máu cao, duy trì hoạt lực được 8 đến 12 giờ trong cơ thể dài hơn so với
urokinase (4-20 phút) và hơn chất hoạt hóa plasminogen (tissue plasminogen
activator, t-PA) (3-6 giờ) [16, 17]. Ngoài ra NK có tính tương đồng cao với
subtilisins E (99,5%) và subtilisins J (Amylosacchariticus, 99,3%) [18].
Hình 1.5: Cấu trúc không gian nattokinase [15]
1.3. Chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase
NK được biết đến là enzyme phân giải fibrin đầu tiên được tìm thấy từ Bacillus
subtilis natto. Ngoài ra, các enzyme phân giải firbin có thể được sinh tổng hợp từ
nhiều chi vi khuẩn khác nhau như: Streptococcus, Staphylococcus, Vibrio,
Paenibacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas [19]. Tuy nhiên, chi Bacillus là
nhóm vi sinh vật chính được biết đến là chủng sản xuất enzyme phân giải fibrin
tốt hơn cả [20]. Các enzyme phân giải fibrin từ các loài vi khuẩn khác nhau cùng
khối lượng phân tử của chúng được trình bày trong Bảng 1.2 dưới đây.
Bảng 1.2: Enzyme phân giải fibrin từ các chủng vi khuẩn khác nhau
Enzyme phân Khối lượng
Chủng vi khuẩn TLTK
giải fibrin phân tử (kDa)
Bacillus subtilis Nattokinase 27,7 [12]
B. amyloliquefaciens DC-4 Subtilisin DFE 28 [21]
Bacillus sp. CK11-4 CK 28,2 [22]
B. amyloliquefaciens MJ5-41 AprE5-41 27 [23]
6
Virgibacillus halodenitrificans
/ 20 và 36 [24]
SK1-3-7
Paenibacillus polymyxa EJS-3 / 63,3 [25]
B. amyloliquefaciens LSSE-62 Subtilisin DJ-4 / [26]
Bacillus subtilis LD-8547 Subtilisin DFE / [27]
Thông qua Bảng 1.3 có thể thấy được rằng các vi khuẩn thuộc chi Bacillus
chiếm đa số trong số các nhóm vi khuẩn kể trên. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus,
chủ yếu là Bacillus subtilis và Bacillus amyloliquefaciens, đã được các nhà nghiên
cứu trước đó chứng minh khả năng sinh tổng hợp enzyme phân giải fibrin. Đồng
thời hai loài này được chứng minh là có mặt trong nhiều thực phẩm lên men như
natto, tofuyo, tương cheonggukjang (Hàn Quốc), douchi (Trung Quốc), tempeh
(Indonesia) [28]. Khối lượng phân tử của các enzyme phân giải fibrin khác nhau
phụ thuộc vào chủng vi khuẩn sinh tổng hợp. Đối với các enzyme phân giải fibrin
từ các chủng thuộc chi Bacillus, khối lượng phân tử của chúng nằm trong khoảng
từ 27 đến 28 kDa.
1.4. Nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase
1.4.1. Thực phẩm lên men
Vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác
nhau. Tuy nhiên, thực phẩm lên men được coi là nguồn phân lập các chủng vi
khuẩn sinh tổng hợp NK tốt nhất [29]. Các nước Châu Á đã đạt được rất nhiều
thành công trong việc tìm ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp NK
từ các loại thực phẩm lên men. Natto là một ví dụ điển hình khi món ăn này chính
là nguồn phân lập để tìm ra nattokinase lần đầu tiên vào năm 1986. Chungkook-
jang, một loại nước chấm lên men từ đậu tương của Hàn Quốc, cũng là một nguồn
phân lập chủng sinh NK rất phổ biến. Các nghiên cứu phân lập chủng vi khuẩn từ
chungkook-jang đã được thực hiện từ khá sớm, vào năm 1996. Qua đó thấy được
rằng, thực phẩm lên men từ đậu tương rất được ưa chuộng làm nguồn phân lập
chủng sinh tổng hợp NK. Một số loại thực phẩm lên men từ đậu tương khác được
sử dụng làm đối tượng phân lập như: meju, doenjang (Hàn Quốc), douchi (Trung
Quốc), thua nao (Thái Lan), gembus (Indonesia), tempe (Ấn Độ) [20, 29, 30]. Tại
Việt Nam, có một sản phẩm tương tự như các sản phẩm kể trên vừa được dùng
như một loại nước chấm, vừa được dùng như một gia vị nấu ăn đã xuất hiện từ thế
kỷ 19 và vẫn được sử dụng cho đến ngày nay, đó là tương.
7
Tương là một thực phẩm truyền thống được lên men từ đậu tương – một nguyên
liệu giàu protein, do đó từ tương có thể tìm ra các vi sinh vật sinh protease và từ
đó phân lập ra chủng có khả năng sinh tổng hợp NK (do NK là một protease serine).
Chính vì vậy, việc phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất NK từ tương
sẽ làm tăng sự đa dạng sinh học các chủng vi sinh vật ở Việt Nam.
Ngoài các sản phẩm đậu tương lên men, NK còn được tìm thấy trong các loại
thực phẩm lên men từ tôm (jotgal), cá (skipjack Shiokara), rau (kim chi) [30]. Bảng
1.3 trình bày tóm tắt các nguồn phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng
hợp NK từ thực phẩm lên men.
Bảng 1.3: Các nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK từ thực phẩm lên men
Nguồn phân lập Chủng vi khuẩn TLTK
Natto (Nhật Bản) B. subtilis natto [12]
Thua nao (Thái Lan) B. subtilis [31]
Meju (Hàn Quốc) B. amyloliquefaciens MJ5-41 [23]
Chungkook jang (Hàn Quốc) Bacillus sp. CK 11-4 [32]
Douchi (Trung Quốc) B. subtilis LD-8547 [33]
Douchi (Trung Quốc) B. amyloliquefaciens DC-4 [34]
Doenjang (Hàn Quốc) B. amyloliquefaciens RSB34 [35]
Gembus (Indonesia) B. licheniformis RO3 [36]
Tương bần (Việt Nam) B. amyloliquefaciens [2]
Tương bần (Việt Nam) Bacillus sp. ES4 [9]
Jotgal (Hàn Quốc) B. subtilis JS2 [37]
Kim chi (Hàn Quốc) B. subtilis ZA400 [38]
Từ Bảng 1.3 cho thấy, phần lớn nguồn phân lập các chủng vi khuẩn sinh NK
được sử dụng nhiều nhất là thực phẩm lên men từ đậu tương. Điều này một lần nữa
đã khẳng định lại nhận định rằng thực phẩm lên men tương tự như natto là nguồn
phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nattokinase tốt nhất. Đồng thời các chủng
phân lập được từ thực phẩn lên men đều thuộc chi Bacillus.
1.4.2. Nguồn phân lập khác
Bên cạnh các sản phẩm thực phẩm lên men, xu hướng gần đây cho thấy các
mẫu đất và nước biển là những nguồn phân lập đầy hứa hẹn được các nhóm nghiên
cứu lựa chọn để tìm ra chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK. Qua đó thấy được rằng,
8
nguồn phân lập chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK rất đa dạng và phong phú. Hình
1.6 biểu diễn các nguồn phân lập vi khuẩn sinh NK khác nhau.
Hình 1.6: Sự phân bố các nguồn phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp NK [39]
BFFs: Thực phẩm lên men; Soils: Đất, Seawaters: Nước biển; Others: Nguồn khác
Thông qua biểu đồ Hình 1.6 nhận thấy rằng mặc dù xu hướng gần đây đã mở
rộng các nguồn phân lập vi khuẩn sinh NK nhưng thực phẩm lên men (BFFs) vẫn
chiếm tỉ lệ lớn nhất (hơn 50% tổng số các nguồn phân lập). Điều này một lần nữa
đã khẳng định lại rằng thực phẩm lên men là đối tượng được lựa chọn để phân lập
chủng vi khuẩn sinh tổng hợp NK nhiều hơn cả [39].
1.4.3. Tương Việt Nam
Tương (Hình 1.7) là một loại nước chấm lên men phổ biến trong ẩm thực Việt
Nam, được làm từ gạo nếp đồ xôi, đậu tương, nước sạch và muối. Những địa
phương làm nước tương nổi tiếng phải kể đến như tương Bần (Hưng Yên), tương
Cự Đà (Hà Tây), tương Nam Đàn (Nghệ An). Mỗi địa phương tuy có một bí quyết
làm tương truyền thống riêng nhưng tựu chung lại đều có một số nét chung trong
cách làm như sau:
Thứ nhất: đậu tương được rang lên cho có mùi thơm rồi xay nhỏ hoặc giã vỡ
nhỏ (tùy theo từng địa phương mà độ nhỏ khác nhau). Sau đó đem ngâm nước
muối cho mềm.
Thứ hai: gạo nếp sau khi ngâm được nấu thành thôi thì đem ủ lên mốc vàng
hoa cau. Khi đã lên mốc và thành phẩm có mùi thơm ngọt rồi thì cho ngâm cùng
đậu tương. Hỗn hợp được cho vào vật đựng (hũ) kín và ngăn được ánh sáng.
Thứ ba: đem hũ đựng hỗn hợp phơi nắng vài ngày để lợi dụng nhiệt lượng của
ánh sáng mặt trời làm cho tương tiếp tục lên men và chín.
9