Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu lan kim tuyến (anoectochilus formosanus hayata)
- 151 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------
TRẦN VĨNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA
QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN VĨNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 8720202
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1 TS. LÊ THỊ HỒNG VÂN
2 TS. LÊ MINH QUÂN
TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Lê Thị Hồng Vân và TS. Lê Minh Quân. Các số liệu và
kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu khoa học nào.
Tác giả luận văn
Trần Vĩnh Nguyên
.
.
TÓM TẮT
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2019 – 2021
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS
HAYATA)
Trần Vĩnh Nguyên
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hồng Vân
TS. Lê Minh Quân
Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây xu hướng sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng tăng lên.
Việt Nam là nước có nhiều kiểu địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng. Do đó Việt Nam rất đa
dạng về tài nguyên sinh vật. Nhiều loài thực vật ở Việt Nam có giá trị làm thuốc cao,
một trong số này là Lan kim tuyến. Lan kim tuyến là dược liệu quý, đã được sử dụng ở
một số nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan để trị nhiều bệnh như bảo
vệ gan, kháng đái tháo đường. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược
lý của Lan kim tuyến. Tại Việt Nam Lan kim tuyến bị khai thác quá mức và đã được
đưa vào sách đỏ. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để
xây dựng quy trình chiết xuất và hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim
tuyến. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu
Lan kim tuyến Anoectochilus sp.” đã được thực hiện nhằm xây dựng quy trình định
lượng hoạt chất chính trong Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết và xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở cho cao được chiết từ quy trình này.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Toàn thân dược liệu Lan Kim Tuyến nuôi cấy được cung cấp bởi Việc sinh học nhiệt
đới (Giấy xác nhận loài Anoectochillus formosanus Hayata kèm theo). Dược liệu được
rửa sạch, để ráo nước, dùng mẫu tươi hoặc sấy ở 50oC cho đến khô rồi xay thành bột
tùy mục đích của từng công đoạn nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất chính trong dược Lan kim
tuyến. Sau đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu này.
Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất bằng việc sử dụng phần mềm thông
minh Design Expert v12.0.
.
.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết với các tiêu chí tính chất, định tính, mất khối
lượng do làm khô, kim loại nặng và định lượng.
Kết quả
Xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng kinsenosid trong dược liệu Lan kim
tuyến. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu Lan kim tuyến.
Quy trình chiết tối ưu: Cân khoảng 950 g bột dược liệu khô Lan kim tuyến (đạt tiêu
chuẩn cơ sở bao gồm cả chỉ tiêu kích thước, phân bố kích thước dược liệu thô) cho vào
bồn chiết, thêm 30 L ethanol 96% vào bồn và đun hồi lưu ở 78-80oC trong hai giờ. Kết
thúc giai đoạn chiết bằng ethanol, thu hồi dịch chiết và cô thu hồi dung môi bằng thiết
bị cô áp suất giảm thu được cao lỏng A. Trong bồn chiết đang chứa bã dược liệu, thêm
30 L nước và chiết hồi lưu ở nhiệt độ 100oC trong hai giờ. Kết thúc giai đoạn chiết
nước, dịch chiết thu được được cô trong bồn cô áp suất giảm đến khi thu được cao
lỏng B. Trộn lẫn cao A và cao B và cô đến thể chất cao đặc (hàm ẩm không quá 20%).
Cao chiết được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở với các tiêu chí tính chất, định tính, mất
khối lượng do làm khô, kim loại nặng và định lượng.
Kết luận
Đề tài đã định lượng hoạt chất chính trong Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết và
xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao được chiết từ quy trình này.
Từ khóa
Lan kim tuyến, cao chiết, kinsenosid, polysaccharid, tối ưu hóa.
.
.
ABSTRACT
Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019-2021
RESEARCH FOR OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION PROCESS OF
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
Tran Vinh Nguyen
Instructor: Ph.D. Le Thi Hong Van
Ph.D. Le Minh Quan
Introduction
Anoectochillus formosanus is a small perennial and terrestrial orchid with high
medicinal value grown in China Southeast, Japan, Taiwan and other countries
including Vietnam. This species is distributed in several regions in Vietnam including
Gia Lai, Kontum, Quang Tri, Ha Tay, Vinh Phuc, Ha Giang, Lao Cai. In addition to
their beautiful appearance, some recent studies revealed that A. formosanus have some
beneficial effects such as anti-inflammatory activity, antioxidant and hepatoprotective,
anti-tumor and immune-stimulating and antihyperglycemic effects. This study was
conducted to develop a procedure for the quantification of the main active ingredients
in Anoectochilus formosanus, optimize the extraction process and develop a standard
for the extracts.
Materials and methods
Material
Fresh material of Anoectochilus formosanus was purchased from Insitute of Tropical
Biology, Vietnam. Whole plant of Anoectochilus formosanus is fresh or dried powder.
Method
Developing and validate the process of quantifying the main active ingredients in
Anoectochilus formosanus. Then develop a standard for this medicinal herb.
Optimize the extraction process using the Design Expert v12.0 software.
Develop a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on drying,
heavy metals and quantification.
Results
Develop and evaluate the process of quantifying the main active ingredients in
Anoectochilus formosanus. Develop a standard for this medicinal herb.
Optimal extraction process: Weigh about 950g of dried material powder into the
extraction tank, add 30 L of ethanol 96% into the bath and reflux at 78-80oC for two
hours. At the end of the ethanol extraction phase, the extract was collected and the
solvent was recovered using a reduced-pressure evaporator to obtain extract A. In the
extraction tank containing residues, add 30 L of water and reflux at heat. 100oC for
.
.
two hours. At the end of the water extraction phase, the extract obtained was
concentrated in a reduced-pressure evaporator until extract B was obtained. Mix A and
B and thicken to a dense consistency (moisture content not more than 20%).
Established a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on
drying, heavy metals and quantification.
Conclusion
The thesis quantifies the main activity in Anoectochilus formosanus, optimizes the
extraction process and establishes a standard for extraction from this process.
Key words:
Anoectochillus formosanus, kinsenoside, polysaccharide, optimization.
.
.
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................... i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT..................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................. ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN ........................................... 3
1.2. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU .................................................. 21
1.3. TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT....................................................... 27
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 31
2.1. HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ..................................................................... 31
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 32
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................................ 51
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT
CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN ........................................................................ 51
3.2. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN
HÓA .......................................................................................................................... 72
3.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DÀNH CHO CAO CHUẨN HÓA ........... 85
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 103
4.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT
CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN ...................................................................... 103
4.2. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN
HÓA ........................................................................................................................ 106
4.3. XÂY DỰNG BỘ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO CAO CHUẨN HÓA ............... 110
.
.
4.4. TRIỂN VỌNG CỦA ĐỀ TÀI ........................................................................... 111
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 112
5.1. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 112
5.2. ĐỀ NGHỊ.......................................................................................................... 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 1
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 6
.
.i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết Tiếng Việt
STT Từ nguyên
tắt
1 ACN Acetonitril
2 CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn
lạc
3 Dd Dung dịch
4 DDA Detector diod array Đầu dò quét chồng phổ
5 DĐVN Dược điển Việt Nam
6 DMSO Dimethyl sulfoxide
7 EtOH Ethanol
8 HPLC High Performance Liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Chromatography
9 IUCN International Union for Conservation Liên minh Bảo tồn Thiên
of Nature nhiên Quốc tế
10 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
11 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng
12 MeOH Methanol
13 RI Refractive index Chỉ số khúc xạ
14 Rs Resolution Độ phân giải
15 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
16 RSM Response surface methodology Phương pháp đáp ứng bề
mặt
17 SKLM Sắc ký lớp mỏng
.
.
18 TB Trung bình
19 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
20 TN Thí nghiệm
21 tR Retention time Thời gian lưu
22 UPLC Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu
Chromatography năng
23 UV Ultra violet Tử ngoại
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mẫu dược liệu Lan kim tuyến....................................................................... 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của kinsenosid ............................................................... 14
Hình 2.1. Quy trình định lượng polysaccharid cho dược liệu Lan kim tuyến .............. 34
Hình 2.2. Sắc ký đồ và phổ UV của kinsenosid.......................................................... 35
Hình 3.1. Lan kim tuyến (A, B: Toàn cây C. Mặt trên và mặt dưới lá) ....................... 52
Hình 3.2. Cấu tạo vi phẫu thân ................................................................................... 52
Hình 3.3. Các mô trong vi phẫu thân.......................................................................... 53
Hình 3.4. Cấu tạo vi phẫu lá....................................................................................... 54
Hình 3.5. A. Mảnh biểu bì được bóc tách, B. Lỗ khí kiểu hỗn bào ............................. 54
Hình 3.6. Cấu tạo vi phẫu phiến lá ............................................................................. 54
Hình 3.7. Cấu tạo vi phẫu cuống lá ............................................................................ 55
Hình 3.8. Cấu tạo vi phẫu bẹ lá Lan kim tuyến .......................................................... 55
Hình 3.9. Vi phẫu rễ Lan Kim tuyến .......................................................................... 56
Hình 3.10. Hình ảnh cảm quan bột toàn cây Lan Kim tuyến ...................................... 56
Hình 3.11. Cấu tử trong bột Lan kim tuyến quan sát được dưới kính hiển vi .............. 57
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu thử với chương trình rửa giải lựa chọn .............................. 59
Hình 3.13. Phổ UV và độ tinh khiết các pic cần định lượng ....................................... 59
Hình 3.14. Kết quả khảo sát tốc độ dòng.................................................................... 59
Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột.................................................................... 60
Hình 3.16. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu ................................................... 61
Hình 3.17. Sắc ký đồ phân tích kinsenosid ở các nồng độ khác nhau ......................... 62
Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống............................................ 64
Hình 3.19. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu .................................................................... 65
Hình 3.20. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại .................................................................... 67
Hình 3.21. Kết quả LOD (trái) và LOQ (phải) ........................................................... 69
.
i.
Hình 3.22. Biến thiên hiệu suất chiết cao giai đoạn 1 theo biến số quy trình chiết ...... 78
Hình 3.23. Ảnh chụp màn hình kết quả phân tích liên quan nhân quả giữa biến số quy
trình và hàm lượng kinsenosid. .................................................................................. 79
Hình 3.24. Biến thiên hàm lượng kinsenosid theo thời gian chiết và nồng độ ethanol 80
Hình 3.25. Các điều kiện ràng buộc trong quá trình tối ưu hóa................................... 81
Hình 3.26. Thông số chiết xuất và dự đoán tính chất cao bán thành phẩm tạo thành .. 82
Hình 3.27. Biến thiên hàm lượng polysaccharid trong cao theo thời gian chiết .......... 84
Hình 3.28. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan nồng độ và tỉ lệ diện tích pic
kinsenosid so với nội chuẩn ....................................................................................... 89
Hình 3.29. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan nồng độ glucose và độ hấp thụ ... 97
.
.i
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Anoectochilus ................................................................. 3
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu ............................... 31
Bảng 2.2. Danh sách dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm .................................... 31
Bảng 2.3. Các thí nghiệm khảo sát dung môi chiết ..................................................... 36
Bảng 2.4. Nồng độ giai mẫu ...................................................................................... 38
Bảng 2.5. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích ...................... 39
Bảng 2.6. Danh mục các biến phụ thuộc thiết lập trong thiết kế thực nghiệm ............. 42
Bảng 2.7. Công thức pha mẫu thử độ đặc hiệu quy trình định lượng kinsenosid trong
cao chuẩn hóa ............................................................................................................ 44
Bảng 2.8. Công thức pha dung dịch chuẩn ................................................................. 45
Bảng 2.9. Các yêu cầu và phương pháp đánh giá các chỉ tiêu thẩm định .................... 47
Bảng 2.10. Công thức pha dung dịch chuẩn ............................................................... 48
Bảng 2.11. Các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng polysaccharid ...................... 50
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tinh khiết mẫu dược liệu khô Lan kim tuyến ........................ 57
Bảng 3.2. Kết quả định lượng polysaccharid có trong dược liệu khô .......................... 58
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ dược liệu : dung môi ................................................ 63
Bảng 3.4. Kết quả tương thích hệ thống ..................................................................... 64
Bảng 3.5. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của chất đối chiếu .............. 66
Bảng 3.6. Kết quả xử lí thống kê phương trình hồi quy tuyến tính kinsenosid ............ 66
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại ......................................................................... 67
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng ........................................................................... 68
Bảng 3.9. Kết quả định lượng 6 mẫu Dược liệu ......................................................... 70
Bảng 3.10. Thành phần hóa thực vật trong Lan Kim tuyến ........................................ 71
Bảng 3.11. Lượng chất chiết được trong mẫu cao chiết bằng EtOH 70% (n=3).......... 72
Bảng 3.12. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu cao chiết từ dược liệu tươi và dược liệu
khô ............................................................................................................................ 74
.
ii
.
Bảng 3.13. Kết quả phân tích cao chiết bằng các dung môi khác nhau ....................... 75
Bảng 3.14. Các biến độc lập trong thiết kế thực nghiệm............................................. 76
Bảng 3.15. Các biến phụ thuộc trong thiết kế thực nghiệm ........................................ 76
Bảng 3.16. Không gian thực nghiệm và kết quả của từng nghiệm thức ...................... 77
Bảng 3.17. Kết quả quá trình tối ưu hóa quy trình chiết cao bán thành phẩm ............. 82
Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu cao thu được từ các nghiệm thức .......................... 83
Bảng 3.19. Dung dịch chuẩn gốc với các hệ số pha loãng khác nhau ......................... 87
Bảng 3.20. Đáp ứng diện tích mẫu trắng so với dung dịch chuẩn ............................... 88
Bảng 3.21. Kết quả tương thích hệ thống của Kinsenosid .......................................... 88
Bảng 3.22. Kết quả tính tuyến tính của kinsenosid ..................................................... 89
Bảng 3.23. Lượng phối hợp trong các mẫu tự tạo....................................................... 90
Bảng 3.24. Kết quả độ đúng Kinsenosid .................................................................... 90
Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng kinsenosid ..... 91
Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian trong định lượng kinsenosid.. 92
Bảng 3.27. Tính tương thích hệ thống thẩm định quy trình định lượng polysaccharid 96
Bảng 3.28. Kết quả tính tuyến tính của glucose.......................................................... 97
Bảng 3.29. Kết quả độ lặp lại của quy trình định lượng polysaccharid ....................... 98
Bảng 3.30. Kết quả độ chính xác trung gian của quy trình định lượng polysaccharid . 99
Bảng 3.31. Kết quả thẩm định độ đúng quy trình định lượng polycaccarid ................ 99
Bảng 3.32. Kết quả kiểm nghiệm cao chuẩn hóa ...................................................... 102
Bảng 4.1. Một số quy trình định lượng kinsenosid trong chi Anoectochilus ............. 105
.
.
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Quy trình hòa tan- chiết xuất ..................................................................... 21
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết cao tối ưu hóa ................................................................... 84
.
.1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, xu hướng trên thế giới dùng thuốc từ dược liệu
ngày càng tăng lên, việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để
ngành công nghiệp Dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y
học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược
liệu. Nước ta có điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nguồn nước, địa hình đa dạng… dẫn
đến nguồn tài nguyên thực vật được xếp vào loại phong phú, nhiều tiềm năng, trong
đó, nhiều loài đã và đang được sử dụng làm thuốc. Luật Dược 2016 ra đời như một
bước đột phá, bắt kịp xu thế phát triển của thế giới, đưa dược liệu thành lĩnh vực
mũi nhọn cho sự phát triển của ngành dược hiện đại Việt Nam.
Lan Kim tuyến (Anoectochilus sp.), hay còn gọi là Lan gấm, được biết đến
như một loài dược liệu quý. Bên cạnh kiểu dáng đẹp, một số nghiên cứu trên thế
giới cũng cho thấy các loài Lan Kim tuyến có một số tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh
trên động vật thí nghiệm như hoạt tính chống viêm [39], chống oxy hóa và bảo vệ
gan [61], [67], [68], tác dụng chống khối u [55], tác dụng kích thích hệ miễn dịch
[65] với hai hoạt chất chính là kinsenosid và polysaccharid.
Do có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, những năm gần đây, Lan Kim
tuyến mọc tự nhiên đã bị khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm trọng phạm vi
phân bố của loài. Đến năm 2008, Sách đỏ Việt Nam 2007 được xuất bản và xếp Lan
Kim tuyến vào nhóm IA thực vật rừng đang nguy cấp (Theo Điều 9, nghị định
32/2006/NĐ-CP, loài thực vật này chỉ được phép chế biến, kinh doanh vì mục đích
thương mại khi có nguồn gốc trồng cấy nhân tạo; không được khai thác vì mục đích
thương mại nếu mẫu vật mọc hoang dại trong tự nhiên). Để góp phần bảo tồn và
phát triển loài này, cũng như tạo nguồn nguyên liệu nuôi trồng cho việc làm thuốc
(không sử dụng cây mọc trong tự nhiên), nhiều dự án nuôi trồng Lan Kim tuyến đã
được đầu tư từ ngân sách Nhà Nước. Điển hình là:
Dự án “Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen dược liệu Lan Gấm
(Anoectochilus formosanus Hayata) tại Thanh Hóa và một số tỉnh Bắc Trung Bộ”
được phê duyệt thực hiện với kinh phí 5,5 tỷ đồng theo Quyết định số 4317/QĐ-
.
.2
UBND (do UBND tỉnh Thanh Hóa ký có hiệu lực thực hiện từ tháng 9/2016 đến
tháng 2/2020).
Đề tài nghiên cứu cấp thành phố (do Sở KHCN TPHCM cấp kinh phí) “Xây dựng
quy trình sản xuất sinh khối cây lan gấm (Anoectochilus formosanus) sử dụng hợp
chất hữu cơ bằng kỹ thuật bioreactor” (Thời gian thực hiện từ tháng 1/2017).
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh Đắk Nông “Ứng dụng công nghệ sinh học
nhân giống và sản xuất cây Lan Gấm (Anoectochilus roxburghii) tại tỉnh Đắk
Nông” (nghiệm thu tháng 3/2017)
Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống và trồng thử nghiệm cây Kim
Tuyến (Anoectochilus sp.)” do Sở KHCN tỉnh Kon Tum cấp kinh phí (thực
hiện trong năm 2017)
Có thể thấy rằng việc phát triển công nghệ nuôi trồng sinh khối loài Lan Kim
tuyến để đưa vào khai thác phục vụ nhu cầu điều trị, hỗ trợ điều trị, bảo vệ và tăng
cường sức khỏe cho người dân đang là nhiệm vụ khoa học được ưu tiên. Dù đã có
các tài liệu nghiên cứu công bố thành phần hóa học chính và tác dụng dược lý trên
động vật thử nghiệm của các loại cao chiết từ Lan Kim tuyến, nhưng cho đến nay
chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để xây dựng quy trình chiết
xuất và hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim tuyến. Do đó, đề tài
“Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Lan kim tuyến
(Anoectochilus formosanus Hayata).” được thực hiện với những nội dung cụ thể
như sau:
Xây dựng quy trình định lượng hợp chất chính trong Lan kim tuyến.
Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao chuẩn hóa từ toàn cây Lan
kim tuyến.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dành cho cao chuẩn hóa.
.
.3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
1.1.1. Tổng quan thực vật học
1.1.1.1. Vị trí phân loại loài Anoectochilus formosanus
Lan kim tuyến có tên khoa học là Anoectochilus formosanus Theo hệ thống
phân loại thực vật Takhtajan (2009) và dữ liệu thực vật của Bộ Nông nghiệp Hoa Kì
(USDA), vị trí phân loại của cây Lan kim tuyến (Anoectochilus sp.) như sau [52],
[56]:
Giới: Plantae (Thực vật)
Bộ: Asparagales (Bộ Măng tây)
Họ: Orchidaceae (Họ Lan)
Chi: Anoectochilus
Loài: Anoectochilus formosanus
1.1.1.2. Đặc điểm chi Anoectochilus
Theo thống kê của The Plant List chi Anoectochilus có 43 loài được chấp
nhận [54], trong đó có 2 loài đang ở mức sắp nguy cấp và nguy cấp (The IUCN Red
List of Threatened Species) [41].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Anoectochilus
STT Tên loài
Loài không thuộc danh sách IUCN
1 Anoectochilus albolineatus E.C.Parish & Rchb.f.
2 Anoectochilus albomarginatus Loudon
3 Anoectochilus annamensis Aver.
4 Anoectochilus baotingensis (K.Y.Lang) Ormerod
5 Anoectochilus brevilabris Lindl.
6 Anoectochilus burmannicus Rolfe
7 Anoectochilus calcareus Aver.
8 Anoectochilus chapaensis Gagnep.
9 Anoectochilus dewildeorum Ormerod
.
.4
STT Tên loài
Loài không thuộc danh sách IUCN
10 Anoectochilus elatus Lindl.
11 Anoectochilus emeiensis K.Y.Lang
12 Anoectochilus falconis Ormerod
13 Anoectochilus flavescens Blume
14 Anoectochilus formosanus Hayata
15 Anoectochilus geniculatus Ridl.
16 Anoectochilus grandiflorus Lindl.
17 Anoectochilus hainanensis H.Z.Tian, F.W.Xing & L.Li
18 Anoectochilus imitans Schltr.
19 Anoectochilus insignis Schltr.
20 Anoectochilus integrilabris Carr
21 Anoectochilus kinabaluensis (Rolfe) J.J.Wood & Ormerod
22 Anoectochilus klabatensis (Schltr.) S.Thomas, Schuit. & de Vogel
23 Anoectochilus koshunensis Hayata
24 Anoectochilus longicalcaratus J.J.Sm.
25 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie
26 Anoectochilus malipoensis W.H.Chen & Y.M.Shui
27 Anoectochilus monicae J.J.Wood
28 Anoectochilus narasimhanii Sumathi & al.
29 Anoectochilus nicobaricus N.P.Balakr. & P.Chakra.
30 Anoectochilus papillosus Aver.
31 Anoectochilus papuanus (Schltr.) W.Kittr.
32 Anoectochilus pectinatus (Hook.f.) Ridl.
33 Anoectochilus pingbianensis K.Y.Lang
34 Anoectochilus reinwardtii Blume
35 Anoectochilus rhombilabius Ormerod
36 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
37 Anoectochilus setaceus Blume
38 Anoectochilus subregularis (Rchb.f.) Ormerod
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
-----------------
TRẦN VĨNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA
QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRẦN VĨNH NGUYÊN
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH
CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 8720202
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1 TS. LÊ THỊ HỒNG VÂN
2 TS. LÊ MINH QUÂN
TP HỒ CHÍ MINH – NĂM 2022
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự
hướng dẫn khoa học của TS. Lê Thị Hồng Vân và TS. Lê Minh Quân. Các số liệu và
kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu khoa học nào.
Tác giả luận văn
Trần Vĩnh Nguyên
.
.
TÓM TẮT
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa 2019 – 2021
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT
DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN (ANOECTOCHILUS FORMOSANUS
HAYATA)
Trần Vĩnh Nguyên
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Thị Hồng Vân
TS. Lê Minh Quân
Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây xu hướng sử dụng thuốc từ dược liệu ngày càng tăng lên.
Việt Nam là nước có nhiều kiểu địa hình, khí hậu, thổ nhưỡng. Do đó Việt Nam rất đa
dạng về tài nguyên sinh vật. Nhiều loài thực vật ở Việt Nam có giá trị làm thuốc cao,
một trong số này là Lan kim tuyến. Lan kim tuyến là dược liệu quý, đã được sử dụng ở
một số nước châu Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan để trị nhiều bệnh như bảo
vệ gan, kháng đái tháo đường. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược
lý của Lan kim tuyến. Tại Việt Nam Lan kim tuyến bị khai thác quá mức và đã được
đưa vào sách đỏ. Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để
xây dựng quy trình chiết xuất và hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim
tuyến. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu
Lan kim tuyến Anoectochilus sp.” đã được thực hiện nhằm xây dựng quy trình định
lượng hoạt chất chính trong Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết và xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở cho cao được chiết từ quy trình này.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Toàn thân dược liệu Lan Kim Tuyến nuôi cấy được cung cấp bởi Việc sinh học nhiệt
đới (Giấy xác nhận loài Anoectochillus formosanus Hayata kèm theo). Dược liệu được
rửa sạch, để ráo nước, dùng mẫu tươi hoặc sấy ở 50oC cho đến khô rồi xay thành bột
tùy mục đích của từng công đoạn nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng hoạt chất chính trong dược Lan kim
tuyến. Sau đó xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu này.
Tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao giàu hoạt chất bằng việc sử dụng phần mềm thông
minh Design Expert v12.0.
.
.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết với các tiêu chí tính chất, định tính, mất khối
lượng do làm khô, kim loại nặng và định lượng.
Kết quả
Xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng kinsenosid trong dược liệu Lan kim
tuyến. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu Lan kim tuyến.
Quy trình chiết tối ưu: Cân khoảng 950 g bột dược liệu khô Lan kim tuyến (đạt tiêu
chuẩn cơ sở bao gồm cả chỉ tiêu kích thước, phân bố kích thước dược liệu thô) cho vào
bồn chiết, thêm 30 L ethanol 96% vào bồn và đun hồi lưu ở 78-80oC trong hai giờ. Kết
thúc giai đoạn chiết bằng ethanol, thu hồi dịch chiết và cô thu hồi dung môi bằng thiết
bị cô áp suất giảm thu được cao lỏng A. Trong bồn chiết đang chứa bã dược liệu, thêm
30 L nước và chiết hồi lưu ở nhiệt độ 100oC trong hai giờ. Kết thúc giai đoạn chiết
nước, dịch chiết thu được được cô trong bồn cô áp suất giảm đến khi thu được cao
lỏng B. Trộn lẫn cao A và cao B và cô đến thể chất cao đặc (hàm ẩm không quá 20%).
Cao chiết được xây dựng tiêu chuẩn cơ sở với các tiêu chí tính chất, định tính, mất
khối lượng do làm khô, kim loại nặng và định lượng.
Kết luận
Đề tài đã định lượng hoạt chất chính trong Lan kim tuyến, tối ưu hóa quy trình chiết và
xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho cao được chiết từ quy trình này.
Từ khóa
Lan kim tuyến, cao chiết, kinsenosid, polysaccharid, tối ưu hóa.
.
.
ABSTRACT
Graduation thesis of Pharmacy Master’s degree – Academic year 2019-2021
RESEARCH FOR OPTIMIZATION OF THE EXTRACTION PROCESS OF
(ANOECTOCHILUS FORMOSANUS HAYATA)
Tran Vinh Nguyen
Instructor: Ph.D. Le Thi Hong Van
Ph.D. Le Minh Quan
Introduction
Anoectochillus formosanus is a small perennial and terrestrial orchid with high
medicinal value grown in China Southeast, Japan, Taiwan and other countries
including Vietnam. This species is distributed in several regions in Vietnam including
Gia Lai, Kontum, Quang Tri, Ha Tay, Vinh Phuc, Ha Giang, Lao Cai. In addition to
their beautiful appearance, some recent studies revealed that A. formosanus have some
beneficial effects such as anti-inflammatory activity, antioxidant and hepatoprotective,
anti-tumor and immune-stimulating and antihyperglycemic effects. This study was
conducted to develop a procedure for the quantification of the main active ingredients
in Anoectochilus formosanus, optimize the extraction process and develop a standard
for the extracts.
Materials and methods
Material
Fresh material of Anoectochilus formosanus was purchased from Insitute of Tropical
Biology, Vietnam. Whole plant of Anoectochilus formosanus is fresh or dried powder.
Method
Developing and validate the process of quantifying the main active ingredients in
Anoectochilus formosanus. Then develop a standard for this medicinal herb.
Optimize the extraction process using the Design Expert v12.0 software.
Develop a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on drying,
heavy metals and quantification.
Results
Develop and evaluate the process of quantifying the main active ingredients in
Anoectochilus formosanus. Develop a standard for this medicinal herb.
Optimal extraction process: Weigh about 950g of dried material powder into the
extraction tank, add 30 L of ethanol 96% into the bath and reflux at 78-80oC for two
hours. At the end of the ethanol extraction phase, the extract was collected and the
solvent was recovered using a reduced-pressure evaporator to obtain extract A. In the
extraction tank containing residues, add 30 L of water and reflux at heat. 100oC for
.
.
two hours. At the end of the water extraction phase, the extract obtained was
concentrated in a reduced-pressure evaporator until extract B was obtained. Mix A and
B and thicken to a dense consistency (moisture content not more than 20%).
Established a extract standard with the criteria of properties, qualitative, loss on
drying, heavy metals and quantification.
Conclusion
The thesis quantifies the main activity in Anoectochilus formosanus, optimizes the
extraction process and establishes a standard for extraction from this process.
Key words:
Anoectochillus formosanus, kinsenoside, polysaccharide, optimization.
.
.
MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................... i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT..................................................................................... iii
DANH MỤC HÌNH..................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vii
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................. ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN ........................................... 3
1.2. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU .................................................. 21
1.3. TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT....................................................... 27
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 31
2.1. HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ..................................................................... 31
2.2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................. 32
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 32
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................................ 51
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT
CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN ........................................................................ 51
3.2. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN
HÓA .......................................................................................................................... 72
3.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DÀNH CHO CAO CHUẨN HÓA ........... 85
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 103
4.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG HỢP CHẤT
CHÍNH TRONG LAN KIM TUYẾN ...................................................................... 103
4.2. XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU HÓA QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CAO CHUẨN
HÓA ........................................................................................................................ 106
4.3. XÂY DỰNG BỘ TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CHO CAO CHUẨN HÓA ............... 110
.
.
4.4. TRIỂN VỌNG CỦA ĐỀ TÀI ........................................................................... 111
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN- ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 112
5.1. KẾT LUẬN ...................................................................................................... 112
5.2. ĐỀ NGHỊ.......................................................................................................... 113
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 1
PHỤ LỤC .................................................................................................................... 6
.
.i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết Tiếng Việt
STT Từ nguyên
tắt
1 ACN Acetonitril
2 CFU Colony forming unit Đơn vị hình thành khuẩn
lạc
3 Dd Dung dịch
4 DDA Detector diod array Đầu dò quét chồng phổ
5 DĐVN Dược điển Việt Nam
6 DMSO Dimethyl sulfoxide
7 EtOH Ethanol
8 HPLC High Performance Liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao
Chromatography
9 IUCN International Union for Conservation Liên minh Bảo tồn Thiên
of Nature nhiên Quốc tế
10 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
11 LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng
12 MeOH Methanol
13 RI Refractive index Chỉ số khúc xạ
14 Rs Resolution Độ phân giải
15 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
16 RSM Response surface methodology Phương pháp đáp ứng bề
mặt
17 SKLM Sắc ký lớp mỏng
.
.
18 TB Trung bình
19 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở
20 TN Thí nghiệm
21 tR Retention time Thời gian lưu
22 UPLC Ultra Performance Liquid Sắc ký lỏng siêu hiệu
Chromatography năng
23 UV Ultra violet Tử ngoại
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Mẫu dược liệu Lan kim tuyến....................................................................... 6
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của kinsenosid ............................................................... 14
Hình 2.1. Quy trình định lượng polysaccharid cho dược liệu Lan kim tuyến .............. 34
Hình 2.2. Sắc ký đồ và phổ UV của kinsenosid.......................................................... 35
Hình 3.1. Lan kim tuyến (A, B: Toàn cây C. Mặt trên và mặt dưới lá) ....................... 52
Hình 3.2. Cấu tạo vi phẫu thân ................................................................................... 52
Hình 3.3. Các mô trong vi phẫu thân.......................................................................... 53
Hình 3.4. Cấu tạo vi phẫu lá....................................................................................... 54
Hình 3.5. A. Mảnh biểu bì được bóc tách, B. Lỗ khí kiểu hỗn bào ............................. 54
Hình 3.6. Cấu tạo vi phẫu phiến lá ............................................................................. 54
Hình 3.7. Cấu tạo vi phẫu cuống lá ............................................................................ 55
Hình 3.8. Cấu tạo vi phẫu bẹ lá Lan kim tuyến .......................................................... 55
Hình 3.9. Vi phẫu rễ Lan Kim tuyến .......................................................................... 56
Hình 3.10. Hình ảnh cảm quan bột toàn cây Lan Kim tuyến ...................................... 56
Hình 3.11. Cấu tử trong bột Lan kim tuyến quan sát được dưới kính hiển vi .............. 57
Hình 3.12. Sắc ký đồ mẫu thử với chương trình rửa giải lựa chọn .............................. 59
Hình 3.13. Phổ UV và độ tinh khiết các pic cần định lượng ....................................... 59
Hình 3.14. Kết quả khảo sát tốc độ dòng.................................................................... 59
Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ cột.................................................................... 60
Hình 3.16. Kết quả khảo sát dung môi hòa tan mẫu ................................................... 61
Hình 3.17. Sắc ký đồ phân tích kinsenosid ở các nồng độ khác nhau ......................... 62
Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống............................................ 64
Hình 3.19. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu .................................................................... 65
Hình 3.20. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại .................................................................... 67
Hình 3.21. Kết quả LOD (trái) và LOQ (phải) ........................................................... 69
.
i.
Hình 3.22. Biến thiên hiệu suất chiết cao giai đoạn 1 theo biến số quy trình chiết ...... 78
Hình 3.23. Ảnh chụp màn hình kết quả phân tích liên quan nhân quả giữa biến số quy
trình và hàm lượng kinsenosid. .................................................................................. 79
Hình 3.24. Biến thiên hàm lượng kinsenosid theo thời gian chiết và nồng độ ethanol 80
Hình 3.25. Các điều kiện ràng buộc trong quá trình tối ưu hóa................................... 81
Hình 3.26. Thông số chiết xuất và dự đoán tính chất cao bán thành phẩm tạo thành .. 82
Hình 3.27. Biến thiên hàm lượng polysaccharid trong cao theo thời gian chiết .......... 84
Hình 3.28. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan nồng độ và tỉ lệ diện tích pic
kinsenosid so với nội chuẩn ....................................................................................... 89
Hình 3.29. Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan nồng độ glucose và độ hấp thụ ... 97
.
.i
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Anoectochilus ................................................................. 3
Bảng 2.1. Danh sách hóa chất, dung môi dùng trong nghiên cứu ............................... 31
Bảng 2.2. Danh sách dụng cụ, thiết bị dùng trong thí nghiệm .................................... 31
Bảng 2.3. Các thí nghiệm khảo sát dung môi chiết ..................................................... 36
Bảng 2.4. Nồng độ giai mẫu ...................................................................................... 38
Bảng 2.5. Mối liên quan giữa tỷ lệ phục hồi và nồng độ chất phân tích ...................... 39
Bảng 2.6. Danh mục các biến phụ thuộc thiết lập trong thiết kế thực nghiệm ............. 42
Bảng 2.7. Công thức pha mẫu thử độ đặc hiệu quy trình định lượng kinsenosid trong
cao chuẩn hóa ............................................................................................................ 44
Bảng 2.8. Công thức pha dung dịch chuẩn ................................................................. 45
Bảng 2.9. Các yêu cầu và phương pháp đánh giá các chỉ tiêu thẩm định .................... 47
Bảng 2.10. Công thức pha dung dịch chuẩn ............................................................... 48
Bảng 2.11. Các chỉ tiêu thẩm định quy trình định lượng polysaccharid ...................... 50
Bảng 3.1. Kết quả kiểm tinh khiết mẫu dược liệu khô Lan kim tuyến ........................ 57
Bảng 3.2. Kết quả định lượng polysaccharid có trong dược liệu khô .......................... 58
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỉ lệ dược liệu : dung môi ................................................ 63
Bảng 3.4. Kết quả tương thích hệ thống ..................................................................... 64
Bảng 3.5. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của chất đối chiếu .............. 66
Bảng 3.6. Kết quả xử lí thống kê phương trình hồi quy tuyến tính kinsenosid ............ 66
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại ......................................................................... 67
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng ........................................................................... 68
Bảng 3.9. Kết quả định lượng 6 mẫu Dược liệu ......................................................... 70
Bảng 3.10. Thành phần hóa thực vật trong Lan Kim tuyến ........................................ 71
Bảng 3.11. Lượng chất chiết được trong mẫu cao chiết bằng EtOH 70% (n=3).......... 72
Bảng 3.12. Kết quả phân tích một số chỉ tiêu cao chiết từ dược liệu tươi và dược liệu
khô ............................................................................................................................ 74
.
ii
.
Bảng 3.13. Kết quả phân tích cao chiết bằng các dung môi khác nhau ....................... 75
Bảng 3.14. Các biến độc lập trong thiết kế thực nghiệm............................................. 76
Bảng 3.15. Các biến phụ thuộc trong thiết kế thực nghiệm ........................................ 76
Bảng 3.16. Không gian thực nghiệm và kết quả của từng nghiệm thức ...................... 77
Bảng 3.17. Kết quả quá trình tối ưu hóa quy trình chiết cao bán thành phẩm ............. 82
Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu cao thu được từ các nghiệm thức .......................... 83
Bảng 3.19. Dung dịch chuẩn gốc với các hệ số pha loãng khác nhau ......................... 87
Bảng 3.20. Đáp ứng diện tích mẫu trắng so với dung dịch chuẩn ............................... 88
Bảng 3.21. Kết quả tương thích hệ thống của Kinsenosid .......................................... 88
Bảng 3.22. Kết quả tính tuyến tính của kinsenosid ..................................................... 89
Bảng 3.23. Lượng phối hợp trong các mẫu tự tạo....................................................... 90
Bảng 3.24. Kết quả độ đúng Kinsenosid .................................................................... 90
Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ lặp lại của phương pháp định lượng kinsenosid ..... 91
Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian trong định lượng kinsenosid.. 92
Bảng 3.27. Tính tương thích hệ thống thẩm định quy trình định lượng polysaccharid 96
Bảng 3.28. Kết quả tính tuyến tính của glucose.......................................................... 97
Bảng 3.29. Kết quả độ lặp lại của quy trình định lượng polysaccharid ....................... 98
Bảng 3.30. Kết quả độ chính xác trung gian của quy trình định lượng polysaccharid . 99
Bảng 3.31. Kết quả thẩm định độ đúng quy trình định lượng polycaccarid ................ 99
Bảng 3.32. Kết quả kiểm nghiệm cao chuẩn hóa ...................................................... 102
Bảng 4.1. Một số quy trình định lượng kinsenosid trong chi Anoectochilus ............. 105
.
.
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Quy trình hòa tan- chiết xuất ..................................................................... 21
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết cao tối ưu hóa ................................................................... 84
.
.1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, xu hướng trên thế giới dùng thuốc từ dược liệu
ngày càng tăng lên, việc nghiên cứu và phát triển thuốc từ dược liệu tạo thuận lợi để
ngành công nghiệp Dược nước ta phát triển theo hướng hiện đại hóa các thuốc y
học cổ truyền, thuốc có nguồn gốc dược liệu và tận dụng nguồn tài nguyên dược
liệu. Nước ta có điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu, nguồn nước, địa hình đa dạng… dẫn
đến nguồn tài nguyên thực vật được xếp vào loại phong phú, nhiều tiềm năng, trong
đó, nhiều loài đã và đang được sử dụng làm thuốc. Luật Dược 2016 ra đời như một
bước đột phá, bắt kịp xu thế phát triển của thế giới, đưa dược liệu thành lĩnh vực
mũi nhọn cho sự phát triển của ngành dược hiện đại Việt Nam.
Lan Kim tuyến (Anoectochilus sp.), hay còn gọi là Lan gấm, được biết đến
như một loài dược liệu quý. Bên cạnh kiểu dáng đẹp, một số nghiên cứu trên thế
giới cũng cho thấy các loài Lan Kim tuyến có một số tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh
trên động vật thí nghiệm như hoạt tính chống viêm [39], chống oxy hóa và bảo vệ
gan [61], [67], [68], tác dụng chống khối u [55], tác dụng kích thích hệ miễn dịch
[65] với hai hoạt chất chính là kinsenosid và polysaccharid.
Do có nhiều tác dụng có lợi cho sức khỏe, những năm gần đây, Lan Kim
tuyến mọc tự nhiên đã bị khai thác quá mức làm suy giảm nghiêm trọng phạm vi
phân bố của loài. Đến năm 2008, Sách đỏ Việt Nam 2007 được xuất bản và xếp Lan
Kim tuyến vào nhóm IA thực vật rừng đang nguy cấp (Theo Điều 9, nghị định
32/2006/NĐ-CP, loài thực vật này chỉ được phép chế biến, kinh doanh vì mục đích
thương mại khi có nguồn gốc trồng cấy nhân tạo; không được khai thác vì mục đích
thương mại nếu mẫu vật mọc hoang dại trong tự nhiên). Để góp phần bảo tồn và
phát triển loài này, cũng như tạo nguồn nguyên liệu nuôi trồng cho việc làm thuốc
(không sử dụng cây mọc trong tự nhiên), nhiều dự án nuôi trồng Lan Kim tuyến đã
được đầu tư từ ngân sách Nhà Nước. Điển hình là:
Dự án “Nghiên cứu khai thác và phát triển nguồn gen dược liệu Lan Gấm
(Anoectochilus formosanus Hayata) tại Thanh Hóa và một số tỉnh Bắc Trung Bộ”
được phê duyệt thực hiện với kinh phí 5,5 tỷ đồng theo Quyết định số 4317/QĐ-
.
.2
UBND (do UBND tỉnh Thanh Hóa ký có hiệu lực thực hiện từ tháng 9/2016 đến
tháng 2/2020).
Đề tài nghiên cứu cấp thành phố (do Sở KHCN TPHCM cấp kinh phí) “Xây dựng
quy trình sản xuất sinh khối cây lan gấm (Anoectochilus formosanus) sử dụng hợp
chất hữu cơ bằng kỹ thuật bioreactor” (Thời gian thực hiện từ tháng 1/2017).
Đề tài nghiên cứu khoa học cấp tỉnh Đắk Nông “Ứng dụng công nghệ sinh học
nhân giống và sản xuất cây Lan Gấm (Anoectochilus roxburghii) tại tỉnh Đắk
Nông” (nghiệm thu tháng 3/2017)
Đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống và trồng thử nghiệm cây Kim
Tuyến (Anoectochilus sp.)” do Sở KHCN tỉnh Kon Tum cấp kinh phí (thực
hiện trong năm 2017)
Có thể thấy rằng việc phát triển công nghệ nuôi trồng sinh khối loài Lan Kim
tuyến để đưa vào khai thác phục vụ nhu cầu điều trị, hỗ trợ điều trị, bảo vệ và tăng
cường sức khỏe cho người dân đang là nhiệm vụ khoa học được ưu tiên. Dù đã có
các tài liệu nghiên cứu công bố thành phần hóa học chính và tác dụng dược lý trên
động vật thử nghiệm của các loại cao chiết từ Lan Kim tuyến, nhưng cho đến nay
chưa có nghiên cứu nào ở Việt Nam được thực hiện để xây dựng quy trình chiết
xuất và hướng đến sản xuất chế phẩm từ cao chiết Lan Kim tuyến. Do đó, đề tài
“Nghiên cứu xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất dược liệu Lan kim tuyến
(Anoectochilus formosanus Hayata).” được thực hiện với những nội dung cụ thể
như sau:
Xây dựng quy trình định lượng hợp chất chính trong Lan kim tuyến.
Xây dựng và tối ưu hóa quy trình chiết xuất cao chuẩn hóa từ toàn cây Lan
kim tuyến.
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dành cho cao chuẩn hóa.
.
.3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU LAN KIM TUYẾN
1.1.1. Tổng quan thực vật học
1.1.1.1. Vị trí phân loại loài Anoectochilus formosanus
Lan kim tuyến có tên khoa học là Anoectochilus formosanus Theo hệ thống
phân loại thực vật Takhtajan (2009) và dữ liệu thực vật của Bộ Nông nghiệp Hoa Kì
(USDA), vị trí phân loại của cây Lan kim tuyến (Anoectochilus sp.) như sau [52],
[56]:
Giới: Plantae (Thực vật)
Bộ: Asparagales (Bộ Măng tây)
Họ: Orchidaceae (Họ Lan)
Chi: Anoectochilus
Loài: Anoectochilus formosanus
1.1.1.2. Đặc điểm chi Anoectochilus
Theo thống kê của The Plant List chi Anoectochilus có 43 loài được chấp
nhận [54], trong đó có 2 loài đang ở mức sắp nguy cấp và nguy cấp (The IUCN Red
List of Threatened Species) [41].
Bảng 1.1. Các loài thuộc chi Anoectochilus
STT Tên loài
Loài không thuộc danh sách IUCN
1 Anoectochilus albolineatus E.C.Parish & Rchb.f.
2 Anoectochilus albomarginatus Loudon
3 Anoectochilus annamensis Aver.
4 Anoectochilus baotingensis (K.Y.Lang) Ormerod
5 Anoectochilus brevilabris Lindl.
6 Anoectochilus burmannicus Rolfe
7 Anoectochilus calcareus Aver.
8 Anoectochilus chapaensis Gagnep.
9 Anoectochilus dewildeorum Ormerod
.
.4
STT Tên loài
Loài không thuộc danh sách IUCN
10 Anoectochilus elatus Lindl.
11 Anoectochilus emeiensis K.Y.Lang
12 Anoectochilus falconis Ormerod
13 Anoectochilus flavescens Blume
14 Anoectochilus formosanus Hayata
15 Anoectochilus geniculatus Ridl.
16 Anoectochilus grandiflorus Lindl.
17 Anoectochilus hainanensis H.Z.Tian, F.W.Xing & L.Li
18 Anoectochilus imitans Schltr.
19 Anoectochilus insignis Schltr.
20 Anoectochilus integrilabris Carr
21 Anoectochilus kinabaluensis (Rolfe) J.J.Wood & Ormerod
22 Anoectochilus klabatensis (Schltr.) S.Thomas, Schuit. & de Vogel
23 Anoectochilus koshunensis Hayata
24 Anoectochilus longicalcaratus J.J.Sm.
25 Anoectochilus lylei Rolfe ex Downie
26 Anoectochilus malipoensis W.H.Chen & Y.M.Shui
27 Anoectochilus monicae J.J.Wood
28 Anoectochilus narasimhanii Sumathi & al.
29 Anoectochilus nicobaricus N.P.Balakr. & P.Chakra.
30 Anoectochilus papillosus Aver.
31 Anoectochilus papuanus (Schltr.) W.Kittr.
32 Anoectochilus pectinatus (Hook.f.) Ridl.
33 Anoectochilus pingbianensis K.Y.Lang
34 Anoectochilus reinwardtii Blume
35 Anoectochilus rhombilabius Ormerod
36 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
37 Anoectochilus setaceus Blume
38 Anoectochilus subregularis (Rchb.f.) Ormerod
.