Nghiên cứu xác định phương pháp phá vỡ tế bào nấm men để thu được dịch chiết có khả năng chống oxy hóa

  • 110 trang
  • file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGUYỄN THỊ LOAN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP
PHÁ VỠ TẾ BÀO NẤM MEN ĐỂ THU
ĐƢỢC DỊCH CHIẾT CÓ KHẢ NĂNG
CHỐNG OXY HÓA
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Th.S. PHẠM HỒNG NGỌC THÙY
Nha Trang – 2014
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung thực hiện của đồ án này là kết quả nghiên
cứu của bản thân, không sao chép kết quả nghiên cứu của người khác. Tôi xin chịu
hoàn toàn trách nhiệm nếu có bất kì sự gian dối nào.
Ngƣời cam đoan
Nguyễn Thị Loan
ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đợt thực tập này ngoài nỗ lực không ngừng của bản thân em còn
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè .
Trước hết em xin gửi tới Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nha Trang, Ban Chủ
Nhiệm khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Phòng Đào tạo Đại học niềm kính trọng, sự tự
hào được học tập tại tường trong những năm qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho cô Phạm Hồng Ngọc Thùy –
người đã tận tình truyền đạt những kiến thức trong quá trình học tập và trực tiếp
hướng dẫn, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành tốt đồ án tốt
nghiệp này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn, tôn trọng đến Thầy Vũ Ngọc Bội – chủ nhiệm khoa
Công Nghệ Thực Phẩm, các thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm, các thầy cô
phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Bộ môn Hóa – Vi sinh
đã cho em những lời khuyên quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt
thời gian thực tập.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ nhiệt tình của cô Nguyễn Thị
Thanh Hải và thầy Nguyễn Xuân Duy trong suốt thời gian em thực hiện đồ án này.
Xin chân thành cảm ơn các bạn đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng con xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ và anh chị em thân yêu
đã tạo điều kiện, động viên khích lệ con vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học
tập vừa qua.
Sinh viên
Nguyễn Thị Loan
iii
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ...................................................................................................v
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ....................................................................... vi
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT .....................................................3
1.1. Nấm men ..........................................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu về nấm men [5]: .....................................................................3
1.1.2. Phân loại nấm men [5]: ...........................................................................4
1.1.3. Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men [2],[5]: ......................................6
1.1.4. Thành phần hóa học của tế bào nấm men [5] ....................................13
1.2. Quá trình oxy hóa ........................................................................................14
1.2.1. Gốc tự do ................................................................................................14
1.2.2. Chất chống oxy hóa .................................................................................16
1.2.3 Một số chất chống oxy hóa trong thực phẩm [3] .....................................17
Hình 1.5. Công thức cấu tạo của axit phytic .....................................................19
Hình 1.6: Công thức cấu tạo của tanin ..............................................................19
1.2.4. Chất chống oxy hóa trong nấm men ......................................................20
1.3. Một số phương pháp phá vỡ tế bào ................................................................22
1.4. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến26
1.4.1. In vitro ....................................................................................................26
1.3.1. In vivo ...................................................................................................29
1.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................31
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước[32] .....................................................31
1.5.2. Tình hình nghiên cứu ngòai nước [32]....................................................32
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................33
2.1. Đối tượng nghiên cứu : .............................................................................33
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát...........................................................34
2.2.2. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian nghiền thích hợp để thu được dịch
chiết nấm men có hoạt tính chống oxy hóa cao ................................................35
iv
2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian đồng hóa thích hợp để thu được
dịch chiết nấm men có hoạt tính chống oxy hóa cao ........................................37
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ethanol sử dụng để chiết nấm men .39
2.2.7. Hóa chất .................................................................................................41
2.3. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................41
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................59
4.1. Kết luận ..........................................................................................................59
4.2. Đề xuất ý kiến .................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................60
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 3. 1: Tỉ lệ phá vỡ tế bào nấm men khô của phƣơng pháp nghiền bi và
đồng hóa ..................................................................................................... 42
Hình 3. 2: Tỉ lệ phá vỡ tế bào nấm men tƣơi của phƣơng pháp nghiền bi và đồng
hóa. ....................................................................................................................... 43
Hình 3. 3: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền bi đến giá trị IC50 của dịch chiết nấm
men khô ............................................................................................................... 44
Hình 3. 4: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền bi đến giá trị IC50 của dịch chiết nấm
men tƣơi .............................................................................................................. 45
Hình 3. 5: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa đến giá trị IC50 DPPH của dịch
chiết nấm men khô ............................................................................................. 46
Hình 3. 6: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa đến giá trị IC50 của dịch chiết nấm
men tƣơi .............................................................................................................. 47
Hình 3. 7: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền tới hàm lƣợng polyphenol của dịch
chiết nấm men khô ............................................................................................. 48
Hình 3. 8: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền tới hàm lƣợng polyphenol của dịch
chiết nấm men tƣơi ............................................................................................. 49
Hình 3. 9: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa tới hàm lƣợng polyphenol của dịch
chiết nấm men khô ............................................................................................. 50
Hình 3. 10: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa tới hàm lƣợng polyphenol trong
dịch chiết nấm men tƣơi .................................................................................... 51
Hình 3. 11: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền tới hàm lƣợng protein hòa tan trong
dịch chiết nấm men khô ..................................................................................... 52
Hình 3. 12: Ảnh hƣởng của thời gian nghiền tới hàm lƣợng protein hòa tan của
dịch chiết nấm men tƣơi .................................................................................... 53
Hình 3. 13: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa tới hàm lƣợng protein hòa tan của
dịch chiết nấm men khô ..................................................................................... 54
Hình 3. 14: Ảnh hƣởng của thời gian đồng hóa tới hàm lƣợng protein hòa tan của
dịch chiết nấm men tƣơi .................................................................................... 55
Hình 3. 15: Ảnh hƣởng của nồng độ ethanol đến giá trị IC50 của dịch chiết nấm
men....................................................................................................................... 58
vi
DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
Kí hiệu viết tắt Diễn giải
DPPH 2,2 diphenyl-1picrylhydrazyl
GTTB Giá trị trung bình
UV – Vis Ultraviolet – visible spectroscopy
Số lượng tb/ml Số lượng tế bào/ml
1
LỜI MỞ ĐẦU
Khi xã hội ngày càng phát triển, con người đang phải đối mặt với nguy cơ mắc
những căn bệnh mãn tính nguy hiểm do tình trạng ô nhiễm môi trường, stress, tiếp
xúc với hóa chất độc hại. Nhiều nghiên cứu dịch tễ học ra rằng việc sử dụng thường
xuyên các chất kháng oxy hóa tự nhiên có khả năng ngăn ngừa các bệnh nguy hiểm
như tim mạch hay ung thư [25]. Con người ngày một nhận thức rõ được tầm quan
trọng của thực phẩm tự nhiên trong việc phòng chống bệnh tật. Vì vậy những chất
kháng oxy hóa tự nhiên ngày càng thu hút được sự quan tâm của người tiêu dùng
cũng như các nhà khoa học.
Theo công bố của các nhà khoa học tại cuộc họp thường niên ở Washington cho
thấy nấm là nguồn dưỡng chất tự nhiên quan trọng, chống oxy hóa cao.
Việc sản xuất nấm men không bị ảnh hưởng của thời tiết, khí hậu, quá trình
công nghệ dễ cơ khi hóa và tự động hóa, chi phí lao động ít, sử dụng các nguồn
nguyên liệu rẻ tiền (phế phẩm phụ phẩm của các nghành khác như rỉ đường, nấm
men bia, dịch kiềm sulfit, paraffin dầu mỏ…) và hiệu suất chuyển hóa cao. Nấm
men sinh sản nhanh chóng với sinh khối giàu protein, vitamin, acid amin và peptit
[5][22]… nên việc tái sử dụng nguồn sinh khối nấm men ,sản xuất nấm men là công
việc cần thiết đã được triển khai khá phổ biến trong những năm gần đây.
Hiện nay, nguồn nấm men này chỉ được dùng làm thức ăn cho gia súc là chủ
yếu, phần còn lại được đem thải bỏ khi theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hồng
Ngân (2012), Anusha và cộng sự (1986) thì các protein hòa tan, các peptit ngắn
mạch, axit amin và một số vitamin có khả năng chống oxy hóa[4][8], trong khi tế
bào nấm men rất giàu protein, peptit, axit amin, vitamin nhưng màng glucan của tế
bào nấm men rất dai nên rất khó để phá vỡ tế bào nấm men.
Do đó để có thể thu được các protein, peptit, axit amin và các chất có khả năng
chống oxy hóa có trong tế bào nấm men em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định
phương pháp phá vỡ tế bào nấm men để thu dịch chiết có khả năng chống oxy hóa ”.
2
Mục đích của đề tài
Nghiên cứu phương pháp phá vỡ tế bào để thu được dịch chiết có khả năng
chống oxy hóa
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp nghiền và phương
pháp đồng hóa để thu dịch chiết có khả năng chống oxy hóa.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cồn khi chiết tế bào nấm men đến khả
năng chống oxy hóa của dịch chiết.
Ý nghĩa của đề tài
Ý nghĩa khoa học:
- Bổ sung nguồn tài liệu về nấm men, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết
nấm men.
- Là cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu.
Ý nghĩa thực tiễn:
- Đề xuất phương pháp phá vỡ tế bào nấm men để thu dịch chiết có hoạt tính
chống oxy hóa để ứng dụng vào ngành công nghệ thực phẩm, dược phẩm.
- Tận dụng nguồn nấm men được thải bỏ từ quá trình sản xuất bia.
- Đưa ra phương pháp để phá vỡ tế bào nấm men thích hợp.
Do điều kiện thí nghiệm và thời gian nghiên cứu còn hạn chế nên đề tài
không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự góp ý của qúy thầy cô
để đề tài được hoàn chỉnh hơn. Em xin chân thành cảm ơn.
Nha Trang, ngày 7 tháng 6 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Loan
3
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN VỀ LÝ THUYẾT
1.1. Nấm men
1.1.1. Giới thiệu về nấm men [5]:
Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và
và thường sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi.
Phần lớn các loại nấm men thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), mặc dù một số
loài thuộc về ngành nấm đảm (Basidiomycota)
Nấm men phân bố hết sức rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực
phẩm, rau quả. Đặc biệt, chúng hiện diện nhiều ở các đất trồng nho và cây ăn quả.
Nấm men sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein và vitamin vì vậy chúng
được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thức ăn bổ sung cho con người và
gia súc. Nấm men còn được dùng làm nở bột mì, gây hương nước chấm, làm dược
phẩm, lên men rượu.
Nấm men được con người sử dụng từ rất lâu, trước khi chữ viết ra đời. Những
chữ viết tượng hình cổ xưa cho thấy người Ai Cập cổ xưa đã sử dụng nấm men cho
lên men rượu từ cách đây hơn 5000 năm. Tuy nhiên vào thời đó con người chưa
hiểu được cơ chế sinh học của quá trình lên men, thậm chí người Ai Cập cổ xưa cho
rằng đó là một hiện tượng siêu nhiên.
Người ta cho rằng quy trình lên men rượu là do sự nhiễm vi sinh vật tự nhiên
vào bột, ngũ cốc và từ trái cây có chứa đường. Quần thể vi sinh vật bao gồm nấm
men và vi khuẩn lên men lactic được tìm thấy trên đại mạch và trái cây.
Chất men trong kinh thánh được coi là một dạng bột nhão. Người ta sử dụng
một phần bột này để lên men từng mẻ rượu. Sau một thời gian con người biết lựa
chọn những mẻ lên men tốt và giữ lại cho lần lên men tiếp theo.
Mãi cho đến khi kính hiển vi ra đời, nấm men đã được định nghĩa là một vi
sinh vật sống và là tác nhân của quá trình lên men rượu. Một thời gian ngắn sau
4
khám phá này người ta đã có thể nuôi nấm men trong môi trường thuần khiết. Vào
đầu thế kỉ 20 con người đã sản xuất được nấm men thương mại.
 Giá trị dinh dưỡng:
Nấm men là nguồn thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa một hàm lượng
protein khoảng 52%, gồm nhiều axit amin cần thiết cho cơ thể. Theo Mitchell và
cộng sự (1927, 1945) thực phẩm nấm men chưa hàm lượng protein ngang bằng
hoặc cao hơn so với thực phẩm khác như bột đậu nành thô (21,4%), yến mạch xay
(10,6%), đậu (5%), bột bắp (3,5%).
 Vai trò của nấm men trong đời sống [34]:
- Cung cấp các chất dinh dưỡng: do giàu protein, vitamin, các axit amin cần
thiết, chất khoáng… mà nấm men được sử dụng trong thực phẩm bổ sung chất dinh
dưỡng, thực phẩm chức năng, sử dụng như chất điều vị trong công nghệ thực phẩm,
có mặt trong các loại thực phẩm có tính năng chữa bệnh, mỹ phẩm…
- Đối với sức khỏe cây trồng: dịch tự phân của nấm men có khả năng giúp
thực vật chống lại một số bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra bằng cách tăng cường
khả năng bảo vệ tự nhiên của thực vật.
- Đối với vật nuôi: nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men bổ sung thêm
vào thức ăn của vật nuôi sẽ giúp tăng cường hệ vi sinh vật đường ruột, giúp vật nuôi
kháng lại các bệnh về đường ruột. Ngoài ra các nhà nghiên cứu cũng nhận thấy sự
tăng trọng, tăng sản lượng trứng sữa…..khi bổ sung nấm men hoặc các sản phẩm từ
nấm men vào thức ăn của vật nuôi.
1.1.2. Phân loại nấm men [5]:
Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển
vi. Nấm men có thể thuộc 2 lớp nấm: nấm túi (Ascomynetes) và nấm bất toàn
(Deutero-mecctes hoặc Fungi imferfect).
Đơn vị cơ bản phân loại nấm men trong sản xuất lên men là nòi hoặc chủng.
Đây là các bào thuần chủng của một loài xác định. Các nòi (chủng) được hợp nhất
5
thành loài (Species), các loài hợp thành giống (genus, genera), các giống hợp thành
họ, các họ hợp thành bộ, các bộ hợp thành lớp và các lớp hợp thành giới.
Eumycophyta(nấm) Giới
Ascomynetes (Fungi imferfect) Lớp
Deutero-mecctes
Endomycete Moniliales
Endomyceteaceae Sacccharomycetaceqe Cryptoccaceae Rhodotorulaceae Họ
Endomyce Saccharomyces Crytococus Rhodotorula Giống
Schisacchoromyces Zygosaccharomyces Kloeskera2
Toruiaspora Mycodemar
Pichica1 Cannida1
Hasenula1 Georichum3
Debaryomyces Trichosporum
x x x x Loài
x x x x Chủng
Hình 1. 1: Sơ đồ phân loại nấm men (theo W.Carol Frazier)
6
1. Nấm men tạo thành màng
2. Nấm men hình chùy
3. Nấm men tạo thành khuẩn ti thất hoặc khuản ti giả
1.1.3. Hình thái và cấu tạo tế bào nấm men [2],[5]:
 Hình thái tế bào nấm men [5]
Nấm men thường có cấu tạo đơn bào, hình dạng tế bào nấm men thường thay
đổi tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện
ngoại cảnh.
Nói chung, thường nấm men có dạng trứng hay bầu dục (saccharomyces
cerevisiae), hình cầu (cadida utillis), hình ống (Pychia), hình bình, hình quả chanh,
hình tam giác và một số hình dạng đặc biệt.
Một số tế bào nấm men có hình dài nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là
khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Thường gặp ở các giống
Endomycopsis, cadida, Trichosporon. Nhiều loại nấm men chỉ sinh khuẩn ty giả khi
không được cung cấp đầy đủ oxy.
Tuy nhiên, hình dạng nấm men không ổn định mà còn phụ thuộc vào tuổi
giống và điều kiện ngoại cảnh.
Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn [2].
Kích thước trung bình :
Chiều dài: 9-10 mm
Chiều rộng 2-7mm
Trọng lượng riêng của tế bào vi khuẩn không khác mấy so với tế bào vi khuẩn
(ở nấm men chỉ số này là 1,055-1,060, ở vi khuẩn: 1,050-1,112).
 Cấu tạo tế bào nấm men [5]:
Nấm men là vi sinh vật đơn bào hiển vi, tế bào cơ bản giống như ở động ,
thực vật. So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có sự tiến hóa nhảy
vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn. Cùng với sự tiến hóa về nhân và cơ chế phân chia
nhân (nhân có màng, có các thể nhiễm sắc, lục lạp…)
7
Tế bào nấm men có thành phần và cấu tạo phức tạp. Trong tế bào có các cấu
tử - tiểu thể và có thể chia thành: các cơ quan nội bào hay cơ quan tử của tế bào và
các chất chứa trong tế bào hay các thể vùi của tế bào (inclusion).
Hình 1.2 Hình ảnh cấu tạo tế bào nấm men
Vỏ tế bào:[5]
Bao quanh tế bào nấm men là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại có thể
đàn hồi để định hình cũng như bảo vệ tế bào chống lại tác động bên ngoài và chất
độc. Vỏ tế bào nấm men mang điện. Nó còn có tác dụng giữ áp suất thẩm thấu nội
bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng là các hợp chất có phân tử lượng thấp và các
muối khoáng qua các lỗ nhỏ vào trong tế bào.
Thành phần hóa học của vỏ tế bào gồm có các phức chất protein-polysacartit,
photphat và lipit. Vỏ tế bào dày khoảng 25nm và chiếm khoảng 25% khối lượng tế
bào. Trong thành phần polysacarit thấy có glucan (chủ yếu) và mannan. Tổng hai
hợp chất này chiếm tới 90% chất khô của vỏ tế bào.
Glucan là một polyme của đường mannanoza, chủ yếu nằm ở phần ngoài vỏ,
chứa 80 -90 % là các chuỗi β-(1,3)-glucan và vài nhánh β-(1,6)-glucan nhưng không
phải thành phần quyết định vỏ tế bào. Nếu bỏ phần mannan hình dáng tế bào không
8
bị biến đổi. Đại thể ta thấy lượng mannan trong tế bào là rất nhỏ, như ở
Saccharomyces guttulata và Endomycopis caponlaris hoặc hoàn toàn vắng mặt ở
Nadsonia fulvescens, Schizosaccharomyces. Vỏ tế bào nấm men còn có chitin.
Chitin là loại hydrocacbon, là polyme của N- axetyl-gluccozamin, chỉ chiếm rất nhỏ
từ 1 – 2% nhưng có vai trò rất quan trọng, có tác dụng giúp tạo độ cứng cơ học, độ
đàn hồi cho tế bào [10], và tạo nên tính không thấm của các cấu trúc dạng sợi [18].
Thành phần thường nằm sát ở nấm men nảy chồi.
Tế bào chất[5]:
Ở vùng giữa thành tế bào với màng tế bào chất ta thấy hàng loạt enzyme, chủ
yếu là những enzyme thủy phân, như β-fructofuranozidaza (invectaza) và
phosphataza axit.
Thành phần protein có trong vỏ tế bào chiếm khoảng 10% chất khô. Trong này
có một phần là các enzym liên kết với vỏ thành bào. Trong các enzym kể trên
invectaza có bản chất mannoproiein. Mannan ở enzym chiếm tới 50% và đóng một
vai trò quan trọng làm bền vững cho phân tử enzym.
Phần nhiều các protein còn lại ở đây kết hợp với mannan. Như vậy mannan
đóng vai trò cấu trúc enzym trong vỏ tế bào. Ngoài ra, tính kết chùm và lắng của
các tế bào nấm men cũng chịu ảnh hưởng bởi cấu trúc mannanoprotein của thành tế
bào. Thông thường thành phần này của vỏ tế bào có liên quan đến hiện tượng tạo
thành dạng sợi bông (kết tủa lắng xốp-flocculus) của nấm men. Đối với nấm men
cũng như vi khuẩn người ta đã khẳng định rằng khuẩn lạc của chúng chuyển từ
dạng S (dạng nhẵn-smooth) sang dạng R (xù xì, sần sùi-rough) và tạo thành sợi
bông trong môi trường là do biến đổi các nhóm ưa nước (hydrophite) ở trong vỏ tế
bào thành các nhóm kị nước (hydrophobe). Song, qua phân tích vỏ tế bào nấm men
S.cerevisiae và S.carlsbergenis (một chủng không tạo thành dạng bông) được nuôi
trên môi trường tổng hợp không thấy sự khác biệt về hàm lượng các chất cơ bản
theo thời gian sinh trưởng, còn hàm lượng mannan giảm từ từ và glucan- được tăng
9
lên. Mối liên kết hoạt động giữa phosphomannan với ion canxi (Ca2+) của hai tế bào
dạng bông tạo thành kết tủa xốp.
Hàm lượng protein ở vỏ tế bào với các phức hợp protein-polysaccarit, phosphat
và lipit. Trong đó một số phức protein-polysaccarit là thành phần của hai enzym
gluconaza và mannanaza. Hai enzym này thường tập trung ở chỗ nảy chồi của nấm
men. Chúng làm mền vỏ tạo điều kiện cho chồi sẹo nảy thành chồi. Enzym
invectaza ở đây có bản chất là mannoprotein. Phần protein còn lại không phải là
enzym kết hợp thành phức với mannan và polysaccarit khác đóng vai trò cấu trúc
của vỏ. Tính tạo bông của tế bào cũng chịu ảnh hưởng cuả cấu trúc mannoprotein
của vỏ tế bào.
Màng tế bào chất [5]:
Xung quanh tế bào chất được bao quanh một lớp màng rất mỏng, chiều dày
không quá 0.1nm (1nm =10-9m) dính chặt vào tế bào chất. Có thể quan sát lấy lớp
màng này dưới kính hiển vi trường tối: thấy màng là lớp viền sáng rất mỏng quanh
tế bào chất.
Màng tế bào chất có bốn chức năng cơ bản: tác dụng như rào chắn thẩm thấu,
điều chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho các sản
phẩm trao đổi chất ra ngoài tế bào; thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào
(các cấu tử của vỏ tế bào); nơi khu trú của một số enzymphospholipaza và lipaza.
- Tế bào chất [5]:
Tế bào chất còn gọi là nguyên sinh chất. Nó có cấu trúc không đồng nhất và ở
thể keo, chứa tất cả các cấu trúc của bào tử: ti thể, riboxom, mạng lưới nội chất, các
chất dự trữ và các thể vùi của hợp chất lipit và hydratcacbon tự nhiên trong nội bào.
Nhờ kính hiển vi điện tử chúng ta biết được tế bào chất là hệ keo được cấu tạo
từ protein (đặc tính keo dính là đặc tính của protein), hydratcacbon, lipit, chất
khoáng, nước và các hợp chất khác nữa. Nước trong tế bào chiếm 90% ở dạng tự do
để hòa tan các chất trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi chất và dạng liên
10
kết. Tế bào chất có độ nhớt cao tương ứng với glyxerin hoặc xiro đặc (gấp 800-8000
lần so với nước). Khi tế bào già độ nhớt này giảm.
Trong tế bào chất chứa đầy đủ các cơ quan tử của tế bào, như ti thể, nhân, các
khoang không bào, các hạt chất dự trữ dạng tinh bột, dạng chất béo, cũng như dạng
lưới nội chất và các thể vùi khác (trong đó có hạt riboxom)…
Cấu trúc của tế bào chất thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh
trưởng của tế bào. Sự thay đổi này có thể là thuận nghịch và không thuận nghịch là
do mức độ tác động của các yếu tố bên ngoài. Các tế bào trẻ có chất nguyên sinh
đồng nhất, khi già chất này xuất hiện không bào, các giọt chất béo, các hạt
polyphosphat và lipoit. Như vậy, tế bào trở nên dị nguyên (không đồng nhất).
Ngoài các cơ quan tử của tế bào có trong tế bào chất ở dạng ti thể hay thể vùi (ti
thể, microxom, không bào…), còn có những chất xúc tác sinh học rất quan trọng là
enzym tham gia vào tất cả các phản ứng hóa sinh.
- Microxom hay lipoxom [5]
Đây là thể vùi có dạng hạt siêu hiển vi, được cấu tạo từ lipit, protit và axit
ribonucleic (ARN).
Các thành phần này ta thấy hàm lượng protit và ARN hầu như bằng nhau còn
lipit là rất nhỏ. Ở đây sẽ xảy ra các qui trình sinh tổng hợp protein cho tế bào từ các
axit amin đã được hoạt hóa ở hệ thống ti thể. Các axit amin này được nối với nhau
theo lệnh của nhân được chuyển qua ARN đi vào các phản ứng tổng hợp protein .
- Ti thể (Mitochondria hay Chondrixom)[5]
Ti thể có dạng hạt nhỏ, dạng que hoặc dạng sợi mảnh phân bố trong tế bào chất
ở khoảng giữa vỏ tế bào và không bào. Có thể thấy chúng ở tất cả các giai đoạn sinh
trưởng của tế bào nấm men: thời kì yên tĩnh, nảy chồi, sinh bào tử…chiều dài của
sợi ti thể là 0,2-7,5 µm. Hình dáng nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, có
thể là từ các hạt hoặc que hay sợi đơn kết thành chuỗi.
11
Bình thường lượng ti thể trong tế bào nấm men giao động rất lớn từ 1 đến 50.
Nếu trong tế bào chỉ có 1 ti thể thì thể tích của nó chiếm không nhỏ hơn 20% thể
tích tế bào, ở S.cerevisiae có 1 tỉ chiếm tới 88% thể tích tế bào. Trong môi trường
có nồng độ glucoza thấp tế bào nấm men có tới 100-200 ti thể, nhưng ở nồng độ cao
chỉ thấy 30-40.
Những chất dinh dưỡng thấm vào nội bào được hấp thụ và tích lũy bởi ti thể sẽ
nhanh chóng thành dạng đậm đặc nhờ các enzym tương ứng tham gia. Các phản
ứng năng lượng quan trọng – quá trình phosphosyl hóa có oxy tham gia và các phản
ứng của chu trình Krebs xảy ra hoàn toàn trong ti thể. Có thể xem ti thể là “các trạm
năng lượng của tế bào”. Ở đây xảy ra hàng lọt các phản ứng hoạt hóa các axit amin
đi vào Riboxom để tham gia quá trình tổng hợp protein, hoạt hóa các chất béo và
nhiều hơp chất khác nữa để sẵn sàng thực hiện các phản ứng hóa sinh trong trao đổi
chất của tế bào, các ti thể đều có mặt ở các vị trí khu trú nhất định của mình.
Ti thể của nấm men có cấu tạo chủ yếu từ khoảng 30% chất béo và 60 – 70%
protein. Trong số protein này có khoảng 25 – 75% ở dạng protein cấu trúc.
- Không bào (vacuole)[5]:
Không bào là một cơ quan nội bào có dạng hang (hốc) chứa đầy dịch bào và
được tách ra từ tế bào chất thành màng không bào, hình dạng không bào thay đổi
liên tục, chuyển dịch và tiếp xúc với tế bào chất. Trong dịch bào ngoài các chất điện
ly hòa tan trong nước còn có các hợp chất dạng keo như protein, chất béo,
hydratcacbon và enzym chứa trong bào quan này. Trong dịch bào còn có mặt Na, K,
Mg, Cl, SO4 và PO4 ở dạng các nguyên tử riêng biệt hoặc muối không làm cho nồng
độ của chúng ở đây cao hơn nhiều lần hàm lượng muối ở môi trường xung quanh.
Kích thước và hình dáng không bào thay đổi rất nhiều. Một tế bào nấm men có
thể có một vài hoặc một không bào ở trung tâm. Không bào chứa các ti thể vùi rất
đa dạng, có thể là các chất ở dạng hòa tan, ở dạng tinh thể hsy ở dạng hạt hoặc giọt.
pH trong dịch bào là 5,9 – 6,0, áp suất thẩm thấu của dịch bào gần với dung dịch
muối NaCl 2,5 – 3,5%. Thông thường các chất chứa trong dịch bào không phản
12
quang, các thể kết tinh và lipit chuyển động mới bắt sáng. Các quá trình oxy hóa –
khử xảy ra trong dịch bào.
Không bào nấm men trưởng thành thường lớn hơn khi ở tế bào trẻ. Tuy nhiên, ở
một thời điểm của vòng đời khi nẩy chồi mới bắt đầu thì hình như không bào được
chia thành nhiều không bào nhỏ và một trong số đó được chuyển sang tế bào con.
Sau đó các không bào còn lại có xu hướng tái hợp thành một không bào duy nhất.
Sự tạo thành không bào ở tế bào nấm men đến nay vẫn chưa biết được đầy đủ.
Nhưng chắc chắn là không bào có chứa các enzym thủy phân, enzym oxy hóa –
khử, các polyphosphat, lipit, các hợp chất trung gian của tế bào có phân tử lượng
thấp và các ion kim loại.
- Mạng lưới nội chất (dictyosome)[5]
Trong tế bào của nấm men còn chứa một hệ thống màng hai lớp, được gọi là
mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng có
kết hợp với riboxom. Đôi khi đầu màng chuốt thành các bọng tròn và có thể từ đây
rồi tạo thành không bào. Mạng lưới này còn được gọi là thể golgi hay bộ máy golgi.
- Nhân tế bào [5]:
Nhân là cấu tạo bất biến của tế bào nấm men. Ta thấy rõ nhân tế bào nấm men
trong trường hợp giữ tế bào nước trong nước vô trùng vài giây. Lúc này tế bào chất
trở thành đồng nhất và trong suốt do bị đói. Với kính hiển vi thông thường ta có thể
quan sát rất rõ ràng nhân tế bào hoặc dưới kính hiển vi huỳnh quang hay kính hiển
vi đối pha sau khi xử lí dung dịch fluorocrom.
Nhân tế bào của nấm men có màng, hạch nhân (thể nhiễm sắc – karyokon) và
chất nhân (karyoplasma). Vỏ nhân tham gia vào vào điều hòa các quy trình trong
nhân bằng cách thay đổi tính thấm và thông báo trực tiếp giữa nhân với môi trường
bên ngoài tế bào, cũng như giữa nhân và tế bào chất.
Đường kính của nhân tế bào nấm men vào khoảng 2µm. Phần lớn nhân có dạng
hình cầu hoặc elip. Sự phân bố của chúng trong nội bào có thể thay đổi trong suốt
13
quá trình sống của tế bào. Kích thước nhân tế bào nấm men không đồng nhất không
những ở các tế bào khác giống, mà ở tế bào cùng một giống trong các trạng thái
sinh lý khác nhau. Nhân to ở các giống sacharomyces, Schizosaccharomyces,
Saccharomycodes và dễ dàng nhìn thấy dưới kính hiển vi. Còn ở các giống lên men
hoặc không lên men như Torulopsis pulcharrina, T.utilis…thường cá nhân nhỏ. Ở
tế bào nấm men đang sinh trưởng nhân rất giàu axit nucleic và vùng sinh sản được
hoạt hóa (nơi sẽ mọc chồi và phân cắt tế bào).
Thành phần hóa học cơ bản của nhân là axit dezoxinucleic (DNA). Với nó và
chỉ với nó (DNA) liên quan đến sự truyền thông tin di truyền từ thế hệ này tới thế
hệ tiếp sau. Nhân còn có protein nhưng không liên kết với các axit nucleic.
- Các thể vùi và các chất dự trữ trong tế bào nấm men:
Các thể vùi nằm trong tế bào chất và dịch không bào. Chúng có thể thay đổi
trong quá trình sống của tế bào. Các thể vùi và các chất dự trữ của nấm men là
những hạt glycogen (gần giống với tinh bột), metacromatin (volutin), các chất giống
chất béo và các hạt chất béo, lưu huỳnh tích tụ, hạt axit và đường tinh thể. Các loại
chất này trong tế bào không hoạt động và thường không ta trong nước.
1.1.4. Thành phần hóa học của tế bào nấm men [5]
Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần cơ bản và chủ yếu của tế bào nấm
men là nước - khoảng 75% khối lượng chung. Thành phần sinh khối khô của nấm
men đại thể là như sau:
Chất vô cơ 5 – 10
Cacbon 25 – 50
Nitơ 4,8 – 12
Protein (Nx6,25) 30 – 75
Lipit 2–5