Nghiên cứu về đặc điểm thực vật , thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây nhân trần tía adenosma bracteosum bonati scrophulariaceae
- 27 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN NGỌC QUỲNH
NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA
ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI -
SCROPHULARIACEAE
Ngành: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
Mã số: 62720406
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2019
.
.
Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Trần Hùng
Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC
Trường Đại học Tôn Đức Thắng
Phản biện 2: PGS.TS. TRẦN HỮU DŨNG
Trường Đại học Y Dược Huế
Phản biện 3: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC VINH
Đại học QUỐC GIA TPHCM
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
vào hồi 8 giờ 00 ngày 22 tháng 11 năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
.
.
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam hiện nay có nhiều loài dược liệu thuộc chi Adenosma
được sử dụng trong việc phòng và điều trị viêm gan như Nhân trần
(Adenosma caeruleum R. Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.) Merr.),
Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati). Cả ba loài dược liệu trên
đều được đưa vào các chuyên luận Dược điển Việt Nam và các tài liệu
chính thống về cây thuốc Việt Nam. Trong đó dược liệu Bồ bồ, được
nghiên cứu khá nhiều về thành phần cũng như tác dụng sinh học của tinh
dầu có trong dược liệu này và được sử dụng khá phổ biến ở miền Bắc. Tuy
nhiên ở miền Nam, Nhân trần tía hay còn được gọi là Nhân trần Tây Ninh
được sử dụng khá phổ biến. Trên lâm sàng cũng cho thấy có tác dụng trong
điều trị viêm gan, bệnh viện Nhiệt Đới đã từng dùng dược liệu này chữa
cho hơn 4.000 trường hợp viêm gan do virus và đạt kết quả tốt, bệnh viện
Y học Dân tộc Tây Ninh đã dùng để chữa hơn 100 trường hợp xơ gan cổ
trướng cho kết quả khỏi bệnh là 24% và tiến triển khá tốt là 46,6%. Thêm
vào đó nhóm nghiên cứu Đại Học Y Dược TPHCM đã nghiên cứu sàng
lọc 56 dược liệu, trong đó dược liệu Nhân trần tía cho tác dụng chống oxy
hoá cao, trên cả 4 mô hình thử nghiệm.
Bên cạnh các nghiên cứu được đánh giá cao về tác dụng trị liệu, thì việc
nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi,
đánh giá thành phần, hàm lượng các hợp chất chính, để có thể đánh giá,
đảm bảo hợp chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu, sử dụng trong chăm
sóc sức khỏe một cách an toàn, hiệu quả và khoa học vẫn có rất ít nghiên
cứu.
Để nâng cao giá trị cũng như hiểu biết về dược liệu Nhân trần tía, đề
tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng
sinh học về cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Botani-
Scrophulariacea)” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Nhân trần tía
2. Nghiên cứu về hóa học của cây Nhân trần tía
.
.
- Khảo sát thành phần hóa thực vật dược liệu Nhân trần tía.
- Phân lập hợp chất hoá học có trong tinh dầu và trong dược liệu
Nhân trần tía
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
3. Xây dựng quy trình định lượng
- Xây dựng quy trình định lượng hai flavonoid có trong dược liệu
- Xây dựng quy trình định lượng carvacrol có trong tinh dầu Nhân
trần tía.
4. Khảo sát tác dụng sinh học
- Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao chiết và một số
hợp chất phân lập được từ Nhân trần tía bằng mô hình DPPH
- Khảo sát tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
2. Tính cấp thiết của đề tài
Nước ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. với trên 12000
loài là nguồn dược liệu quý dùng trong các bệnh. Nhân trần tía là một trong
những dược liệu được dùng để điều trị bệnh viêm gan, tuy nhiên các nghiên
cứu về thực vật thành phần hoá học của Nhân trần hầu như rất ít các nghiên
cứu ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Do những lý do trên, đề tài được
thực hiện trên loài Adenosma bracteosum nhằm làm sáng tỏ thêm về thực
vật, thành phần hoá học, kiểm soát hàm lượng flavonoid có trong dược
liệu, cũng như carvacrol có trong tinh dầu Nhân trần tía, cũng như tác dụng
dược lý của dược liệu này.
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Khảo sát về hình thái và vi học của Nhân trần tía:
Có so sánh sự khác nhau về hình thái và giải phẫu học từng bộ phận
dùng (rễ, thân, lá) của Nhân trần ở những giai đoạn khác nhau. Bên cạnh
đó thực hiện soi bột bộ phận trên mặt đất, tìm thấy được 18 cấu tử.
3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong dược liệu Nhân trần tía
Phân lập các nhóm hợp chất từ các cao chiết thu được 18 hợp chất và
được định danh bằng các phương pháp phổ hoc, trong đó có một hợp chất
mới: AB12.
.
.
3.3. Xây dựng và đánh giá quy trình định lương AB9 và AB18 có trong
Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời hai
flavonoid có trong Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
3.4. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong tinh
dầu Nhân trần tía bàng GC-FID
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong
tinh dầu Nhân trần tía bằng GC-FID.
3.5. Thử tác dụng chống oxy của Nhân trần tía
3.5.1. Thử tác dụng chống oxy hoá trên cao chiết và hợp chất phân lập
được.
Các hợp chất phân lập từ Nhân trần tía (AB2, AB6; AB16, AB17,
AB18) được thử tác dụng chống oxy hoá trên UV-Vis. Trong đó các các
hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau (0,01 – 1,5 mg/mL).
Ở tất cả các mẫu ở các nồng độ khác nhau đều có khả năng chống oxy hoá.
Tuy nhiên đa số các các mẫu cho tác dụng chống oxy hoá cao nhất ở nồng
độ 1,5 mg/mL.
3.5.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
Tinh dầu Nhân trần tía được thử tác dụng kháng khuẩn với 6 chủng
vi khuẩn, trong đó có 5 vi khuẩn Gram dương (Pseudomonas
aeruginosam, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis,
Streptococcus pyogennes, Streptococcus pneumoniae) và một vi khuẩn
Gram âm (Haemophilus influenzae).Kết quả nhận thấy các tinh dầu có khả
năng kháng 5 loại vi khuẩn thử nghiệm, trong đó loài Streptococcus
pneumoniae có đường kính kháng khuẩn 62 mm. Tinh dầu không có khả
năng kháng loài Pseudomonas aeruginosam.
Khi thử MIC thì tinh dầu rất nhạy (có MIC thấp nhất 0,025 %) với loài
Streptococcus pneumoniae, một loại cầu khuẩn sinh mủ.
4. Bố cục luận án
Luận án gồm 140 trang: Mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 26
trang, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16 trang, kết quả nghiên
.
.
cứu 82 trang, bàn luận 11 trang, kết luận và đề nghị 3 trang. Luận án có
55 bảng, 68 hình, 6 sơ đồ, 114 tài liệu tham khảo gồm 21 tài liệu tiếng Việt
và 92 tài liệu tiếng nước ngoài, 1 trang web, 149 phụ lục thể hiện các kết
quả thực nghiệm.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NHÂN TRẦN TÍA
1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Nhân trần tía (Adenosma bracteosum)
Tên Việt Nam: Nhân trần Tây Ninh, Nhân trần (nhiều) lá bắc,
nhân trần cái (miền Nam).
Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati, họ Hoa mõm chó
(Scrophulariaceae).
Đặc điểm hình thái: cây thảo nhất niên, mọc đứng, không lông, rất
thơm, cao 20-70 cm; thân hình trụ ở gốc, phần thân ở trên và cành vuông,
có 4 cạnh ở góc. Thân và cành màu tím đỏ hoặc màu xanh. Lá không
cuống, mỏng, thường cuốn lại và dễ rụng, phiến thon, dài 2-2,5 cm, rộng
0,6-0,9 cm, mép lá có răng cưa, mặt dưới có ít lông, có tuyến. Cụm hoa có
dạng gié đứng, dài 1,5-5 cm, có nhiều lá bắc ở gốc tạo thành tổng bao lá
bắc. Các lá bắc phía trên lợp lên nhau, dạng màng trong suốt hình tim có
chóp nhọn, mép nguyên, có ít lông, có tuyến ở mặt ngoài. Lá đài 5, không
bằng nhau, đài hoa dạng màng. Tràng hoa có màu trắng hoặc màu xanh
tím, có ống cao 6 mm, môi dưới có 3 thuỳ bằng nhau, có lông ở mặt trên,
cánh hoa thường rụng, chỉ còn lại hai lá bắc và đài. Quả nang cao 3 mm,
không lông, chứa nhiều hạt nhỏ li ti màu nâu hay đen. Dược liệu có mùi
thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
Phân bố: trong số 3 loài thuộc chi Adenosma R. Br. được sử dụng
làm thuốc ở Việt Nam, loài Nhân trần tía có phạm vi phân bố hạn chế và
chỉ phát hiện thấy ở một vài tỉnh phía Nam, như Tây Ninh, Bình Dương,
khu vực Vũng Tàu, các đảo như: Phú Quốc và Côn Đảo. Có tài liệu còn
ghi nhận ở cả Kon Tum, Đắc Lắc. Cây cũng phân bố khá phổ biến ở Lào
và Campuchia.
Bộ phận dùng: thân, cành mang lá và hoa phơi hay sấy khô. Thu hái
lúc cây đang ra hoa, phơi hay sấy ở 40-50 °C đến khô. Dược liệu có mùi
.
.
thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.2.1. Nhân trần tía (Adenosma brateosum)
1.2.1.1. Tinh dầu
Từ năm 2015 các nghiên cứu phân tích thành phần tinh dầu khá
trùng khớp nhau về kết quả, trong đó thành phần chính carvacrol (27-
37,2%), carvarol methyl ether (23,2% - 28%), α-bisabolen (15,9%-30,4%)
và γ-terpinen (9,2%). Trong đó loài Nhân trần tía thu hái ở vùng miền khác
nhau, có thành phần và hàm lượng khác nhau
1.2.1.2. Thành phần khác
Nguyễn Minh Đức và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được 3 hợp
chất từ Nhân trần tía là bracteosid A, bracteosid B và bracteosid C.
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC
1.3.1. Tác dụng sinh học của Nhân trần tía
1.3.1.1. Tác dụng kháng khuẩn
Carvacrol trong tinh dầu Nhân trần tía đã được chứng minh có tác dụng
kháng khuẩn khá mạnh.
1.3.1.2. Tác dụng trên gan
Một số bệnh viên y học cổ truyên đã sử dụng Nhân trần tía để điều
trị viêm gan cho bệnh nhân và đạt kết quả tốt.
1.3.1.3. Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2010, Nhóm nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hồng, Trần Hùng
thực hiện sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của 56 loài dược liệu.
Adenosma bracteosum là một trong những dược liệu có hoạt tính mạnh
nhất so với 56 loài dược liệu nghiên cứu.
1.3.1.4. Tác dụng chống viêm
Nhân trần tía ở Tây Ninh, chứa hàm lượng carvacrol rất cao
(27%). Carvacrol là một trong những hợp chất có tác dụng như hợp chất
ức chế COX-II, rất giống hợp chất chống viêm nonsteroid (NSAIDs) như
thuốc ibuprofen.
1.3.1.5. Độc tính
Toàn cây chặt nhỏ phơi khô, chiết cồn 40%, rồi cô cách thủy đến
.
.
dịch đậm đặc. Chuột nhắt trắng không chết ở liều 300 g/kg quy ra dược
liệu khô.
1.4. TÁC DỤNG THEO Y HOC CỔ TRUYỀN
1.4.1. Nhân trần tía
Nhân trần tía có vị đắng, mùi thơm do chứa tinh dầu, song hàm
lượng thấp hơn Nhân trần, toàn cây Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan,
vàng da, ăn uống kém tiêu, sốt, cảm cúm, ngộ độc, 4000 trường hợp viêm
gan siêu vi được điều trị bằng bài thuốc có vị Nhân trần tía ở bệnh viện
Chợ Quán Tp. Hồ Chí Minh (1977-1984), cho kết quả tốt.
Bệnh viện Y học dân tộc Tây Ninh đã sử dụng bài thuốc Nhân trần để điều
trị 100 trường hợp xơ gan cổ trướng, trong đó khỏi bệnh 24%, đáp ứng khá
tốt 46,6%.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nhân trần tía
Nguyên liệu cây Nhân trần tía được thu hái và xác định loài
Adenosma bracteosum Bonati, Scrophulariaceae dựa trên đặc điểm hình
thái và so sánh với tài liệu chuyên ngành. Nguyên liệu Nhân trần tía sau
khi thu hái được phơi khô trong mát, loại tạp cơ học lẫn vào, được xay
thành bột với cỡ hạt ≤ 2 mm, bột dược liệu được bảo quản trong thùng
nhựa chống ẩm, để nơi khô, mát, được kiểm tra đạt yêu cầu về độ ẩm theo
DĐVN V trước khi sử dụng.
2.1.2. Vi khuẩn thử nghiệm
1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
2. Staphylococcus aureus ATCC 29213
3. Streptococcus pneumoniae ATCC 29212
4. Streptococcus pyogennes ATCC 12344
5. Moraxella catarrhalis ATCC 25238
6. Haemophilus influenzae ATCC 33533
2.2. CHẤT ĐỐI CHIẾU
Acid ascorbic (Vitamin C) dùng trong thử nghiệm chống oxy hóa.
(Viện Kiểm Nghiệm TPHCM) số lô: QT016070614 đạt độ tinh khiết
99,17%.
.
.
Chất đối chiếu đã được nhóm nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và
xác định độ tinh khiết: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) đạt
độ tinh khiết 97,51%/HPLC-PDA; isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid
(AB18) đạt độ tinh khiết 99,17%/HPLC-PDA; carvarol đạt độ tinh khiết
97,30%/GC-FID.
2.3. TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Hệ máy HPLC Waters 600S/626, đầu dò PDA 996, cột Merck RP-
18 (4,6×150 mm; 5 µm);
Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi và Gene Quant 1300/);
Máy HPLC Hitachi L – 2000 với đầu dò PDA L – 2455, cột Merck
RP-18 (4,6×150 mm; 5 µm); Hệ thống máy GC Agilent 7890B ghép với
detector FID, Cột HB-5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm film thickness); Khối
phổ được đo bằng máy Micromass Quattro microTM API, ở chế độ ESI+
hay ESI-; NMR: Bruker Avance 500 MHz.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu sau khi được thu hái sẽ được khảo sát về đặc điểm thực
vật để xác định mẫu nghiên cứu và góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm Nhân trần tía (Khảo sát hình thái, giải phẫu học, soi bột dược liệu).
Mẫu, sau đó được khảo sát về thành phần hoá học, chiết xuất và phân lập
các hợp chất hoá học bằng các kỹ thuật sắc ký. Các hợp chất phân lập
được, được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ học thông dụng
như: UV, IR, MS, NMR. Trong dược liệu có hai thành phần chính là phần
bay hơi và không bay hơi. Những hợp chất có hàm lượng cao trong cây
sẽ được xây dựng quy trình định lượng (flavonoid sẽ được xây dựng quy
trình định lượng bằng HPLC-PDA, carvacrol được xây dựng quy trình
định lượng bằng GC-FID theo hướng dẫn ICH. Tiến hành khảo sát tác
dụng sinh học trên mô hình in vitro một số hợp chất chiếm hàm lượng cao
trong cây (6 flavonoid flavonoid được khảo sát tác dụng chống oxy hoá,
tinh dầu được khảo sát tác dụng kháng khuẩn trên 6 vi khuẩn thử nghiệm:
Nội dung nghiên cứu được trình bày ở Sơ đồ
.
.
• Chiết xuất, phân lập, tinh chế. • Quy trình định lượng Flavonoid
• Xác định cấu trúc hóa học. • Quy trình định lượng tinh dầu.
Khảo sát thực vật Khảo sát hóa học Kiểm nghiệm
Khảo sát tác dụng sinh học
• Flavonoid: tác dụng chống oxy-hóa.
• Tinh dầu: tác dụng kháng khuẩn.
Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC
3.1.1. Hình thái thực vật
Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati, họ
Scrophulariaceae) là loài thân thảo, cao khoảng 30 – 40 cm. Cành toả ra
ngang hay thẳng đứng. Thân có tiết diện tròn hơi nhô 4 góc, thân non màu
xanh có bốn cánh toả ra, thân già đỏ tía, lông tơ thưa, nhiều ở phần mắt lá,
ở gốc thân có màu nâu tía. Cành mọc thẳng đứng hoặc tỏa ngang. Rễ ngắn,
dài 1-4 cm, rễ chùm.
Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
A.Toàn cây B. Lá đơn mọc đối C. Lá tím và xanh D. Lá chứa túi tiết E. Cụm hoa F. Cụm hoa dạng
gié G. Bao phấn hai buồng H. Hoa I. Bầu noãn, vòi nhuỵ, đầu nhuỵ K. hạt L. bầu noãn thượng có
hai lá noãn dính nhau, đính noãn trung trụ
Hình 3.1. Toàn cây Nhân trần tía và hoa
3.1.2. Vi phẫu thực vật
3.1.2.1. Rễ cây
Mặt cắt ngang rễ thân lá của A. bracteosum cũng giống những cây
hai lá mầm khác, tuy nhiên phần thân non có 4 cạnh và bị tiêu biến đi khi
về già.
.
.
Rễ non, lớp ngoài cùng mang nhiều lông hút. Ở rễ già, lớp ngoài
cùng là lớp bần gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật và bị bong tróc từng
phần.
Hình 3.2. Vi phẫu Hình 3.3. Vi phẫu thân Hình 3.4. Vi phẫu
rễ cây A. cây A. bracteosum lá cây A.
bracteosum bracteosum
3.1.3. Soi bột
Bột có màu nâu hơi tím hơi, mùi thơm đặc trưng. Trong bột thân
đã tìm thấy mảnh mô mềm, mám tế bào mô cứng, sợi mô cứng, mạch
mạng, mạch chấm đồng tiền, mạch xoắn, lông tiết chân đơn bào, đầu đa
bào, hạt tinh bột, hạt, phấn, bao phấn, mảnh cánh hoa.
A. Bao phấn mang hạt phấn B. Quả C.Mảnh cánh I.Mạch mạng K.Mô cứng L.Mạch chấm
hoa D. Hạt phấn có rãnh dọc E. Biểu bì mang lổ đồng tiền M.Mảnh bần N.Mạch vạch
khí F. Lổ khí G. Lông tiết đầu đa bào H. Lông che P.Mảnh mô mềm Q. Bó sợi U.Mạch soắn
chở đa bào V.Hạt tinh bột
Hình 3.5. Các cấu tử của bột A. bracteosum
3.2. THỬ TINH KHIẾT NGUYÊN LIỆU A. BRACTEOSUM
Dược liệu được tiến hành thử tinh khiết với độ ẩm, độ tro và hợp
chất chiết được trong cồn 96%. Kết quả độ ẩm, độ tro và chất chiết được
thể hiện trên
Bảng 3.1.
.
.
Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của mẫu bột dược liệu Nhân trần tía phần
trên mặt đất (n=3)
Hàm lượng
Tro
Độ Hàm lượng chất chất chiết
Tro toàn không
ẩm chiết được (%) được (%)
phần (%) tan / HCl
(%) Dung môi nước Dung môi cồn
(%)
96%
9,74 5,38 0,5 24,02 12
3.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH DẦU TRONG THÂN
CÀNH VÀ HOA NHÂN TRẦN TÍA
Hoa và thân cành được tách ra và chiết xuất cất và có sự khác
nhau đáng kể về hàm lượng tinh dầu trong hoa và thân cành. Tinh dầu thu
được, được xác định tỷ trọng dựa theo DĐVN V.
Bảng 3.2. Tính chất và hàm lượng tinh dầu có trong Nhân trần tía
Bộ phận Hàm lượng Màu sắc Tỷ trọng
dùng (%)
Thân cành và lá 0,28 Màu vàng nhạt 0,8984
Hoa 1,94 Màu vàng nhạt 0,8984
3.4. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN TRÊN
MẶT ĐẤT CỦA A. BRACTEOSUM
3.4.1. Chiết xuất
3.4.1.1. Chiết xuất tinh dầu
Phần dược liệu trên mặt đất (5 kg) được chiết xuất bằng phương
pháp cất kéo hơi nước thu được 14g tinh dầu.
3.4.1.2. Chiết xuất hợp chất không bay hơi
Phần trên mặt đất của cây Nhân trần tía (5 kg) được ngấm kiệt với
85 L ethanol. Dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm thu được cao lỏng.
Cao chiết được tiến hành chiết phân bố với các laoij dung môi có độ phân
cực tăng dần, đòng thời kết hợp với thay đổi pH để thu được các phân đoạn
có thành phần hoá học đơn giản. Các cao chiết thu được, được tiến hành
sắc ký cột (12 cột pha thuận, 3 cột pha đảo, hai cột Sephadex LH20 và một
.
.
cột Diaion). Các chất phân lập được (18 hợp chất được đặt tên lần lượt
AB1 (20 mg), AB2 (10 mg), AB4 (15 mg), AB5 (5 mg), AB6 12 (mg)
AB7 (3,7 mg), AB9 (20 mg), AB10 (4 mg), AB11 (5 mg), AB12 (4 mg),
AB13 (10 mg), AB14 12 mg), AB15 (8 mg), AB16 (12 mg), AB17 (6 mg),
AB18 (20 mg), AB19 (4 mg), AB22 (5 mg)). Trong đó có 4 hợp chất có
cấu trúc đơn giản (AB11, AB12, AB14, AB15), một hợp chất monoterpen
thuộc thành phần tinh dầu (AB1), 1 hợp chất là triterpen AB5 và hai hợp
chất nhân sterol (AB4, , AB7), 10 flavonoid, 4 flavonoid (AB6, AB10,
AB16, AB17) một flavonoid gắn hai đường (AB22), 5 flavonoid có gắn
một đường (4 gắn đường glucuropyranosid: AB2, AB9, AB13, AB19; 1
gắn đường glucopyranosid: AB18), được xác định cấu trúc bằng UV, IR,
MS, NMR.
3.4.1.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập
3.4.1.4. Hợp chất monoterpen AB1
AB1 là hợp chất lỏng có màu vàng nhạt, tỷ trọng 0,9772 g/cm3 ở
20 °C, điểm sôi 237,7 °C, không tan trong nước sôi, dung môi hòa tan:
ethanol, diethyl ether, carbon tetrachlorid, aceton. Được phân lập từ tinh
dầu Nhân trần tía
15,3
2,20
10 CH3
2 121,0
OH
130,9
7,01 3 1 153,8
6
4
118,9 5 113,1
6,71 6,64
148,6
8 7 9
H3C 33,9 CH3
24,0 2,80 24,0
1,20 1,20
Hình 3.6. Công thức và tương tác HMBC chính của hợp chất AB1
3.4.1.5. Hợp chất flavonoid
Hợp chất có khung flavon (AB6, AB10, AB16, AB17)
116,1 116,1
6,93
j=8,5 6,97
128,2 OH 61,9 J=7,0
7,86
j=8,0 5' 3,92 128,5 161,5 OH
162,1
OCH3 7,96 6' 5'
6' 4' J=7,0
94,3 61,4 4'
6,40 120,5 1' 3' 116,1 4,02
HO O 2' 132,6
8
161,3 163,4 6,93
j=8,5 H3CO 152,4 O 164,2
1' 3' 116,1
149,3 2 6,97
164,7 7 9 2 128,2 8 121,0 2'
7,86 9 J=7,0
j=8,0 7
99,5 10 3 128,5
6,11 5 4 6 102,6 7,96
6 102,3
102,3
6,65 10 3 6,88 J=7,0
157,4 181,3 135,8 106,2 4
H3CO 148,5 5
182,5
OH O 60,5
3,82
OH O
.
.
Hình 3.7. Công thức và các Hình 3.8. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của tương tác chính trên HMBC của
AB10 AB17
110,2 115,9
7,59 6,98
j=9,0 61,8 j=8,5
150,8 OH 3,92 120,3 161,5 OH
120,4 5' OCH3 7,59
3'
7,59 2'
6' 4' 61,4 j=7,2 4'
56,6 j=9 4,02
3,93 91,6 132,5
6,94 121,4 1' 3' 148,0 H3CO 152,4 O 164,0 1' 5'
H3CO 158,6 O 8
145,2
6'
2 2' OCH3 9 121,0
8 2 OCH3
7 9 163,9 56,0 7 110,0
115,7 3,90 55,7
6,95 135,7 6 10 102,9 7,58
60,5 3 7,00 3,89
56,5 131,9 6 10 3 3,81 5 4
3,93 5 4 103,3 106,4
H3CO 148,5 182,5
H3CO 152,0 105,1 182,2 6,93
OH O
OH O
Hình 3.9. Công thức và các Hình 3.10. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của tương tác chính trên HMBC của
AB6 AB16
H
H
5'
4' OH
AB10: R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H
AB6: R1=OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3,
6'
R4
R4=H
8
1' 3'
R3 7 9 O 2
2' R1
6 5
10
4 3
H AB16: R1= OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3,
R2 H
OH O
R4= OCH3
AB17: R1=H, R2= OCH3, R3= OCH3, R4=
OCH3
Hình 3.11. Cấu trúc hoá học của các hợp chất flavon
Hợp chất có khung flavon-O-β-glucuronid (AB2, AB9, AB13, AB19)
60,5 169,9
4,68 3,66 HOOC
69,1
3,16 3,36
3,59 OH HO 71,5
H3CO
77,3 3,49
3,23 76,1 O
O HO 73,7 116,0
HO 3,79 3,47 106,3
4,80 6,90
75,9 106,4 75,3 128,9 J=9,0
74,1 4,67 115,9 J=7,5 OH
3,30 3,44 OH 3,33 C 8,06 161,1
j=8,0 129,1 6,94
C
8,14 j=9,0 OH O J=9,0
j=8,5 161,3 OH
H 125,1
O H
149,2
O 163,9 116,0
125,3
HO 6,90
HO 157,2 O 164,0 115,9 157,3 121,1 J=9,0
6,94
157,2 121,1 j=9,0
(Z) 128,9
129,1 102,4 8,06
8,14 98,9 6,80 J=9,0
149,4 102,3
j=8,5 6,26 103,3
H 99,0 103,4 H 157,1 181,7
181,8
OH O
OH O
Hình 3.12. Cấu trúc và tương tác Hình 3.13. Cấu trúc và tương tác
HMBC chính của AB2 HMBC chính của AB9
H 115,9
128,4 115,9 6,90
71,4HOOC 7,92, 6,94 129,0 j=8,5
170,2 j=9 171,9 OH
3,37 6'' 3' j= 8,5 8,15 160,9
HO H OH 72,5 HOOC j=9,0 3'
4'' 2' 4' 3,57 6'' 76,6
H HO 2'
75,1 5'' O 4'
161,2 4'' 6,60 100,2
HO 3,93
115,9 HO 6,03
3''
93,7 1 1' 5''
O O 163,2 1' 5' 115,9
75,4 2'' 1'' 8 6,98
164,0 5' 6,94 HO 106,6 7 149,3
O 151,1 O j= 8,5 3'' 2'' 4,65
2 6' 6,90
3,37 72,81 C 2 157,2
8 121,3
3,37 OH 100,2 121,2 H 72,9 j=7,5 9 j=8,5
7 76,5
5,16 9 6'128,4 3,24 3,44 C 129,0
j=8,0 O 6 102,0 8,15
H 130,48 10
102,4
3 6,08
7,92, OH 1'' 10 3
6,68 j=9,0
H j=9 126,1 5 102,0 4
4
6 105,8 H 157,2 181,1
HO 182,3 H
146,8 5
OH O OH O
.
.
Hình 3.14. Cấu trúc và tương tác Hình 3.15. Cấu trúc và tương
HMBC chính của hợp chất AB13 tác HMBC chính của hợp chất
AB19
R1
OH
AB9: R1=β-glucuronic, R2=OH, R3=H
O
AB2: R1= β -glucuronic 6''methylester,
R2 R2=OH, R3=H
AB13: R1=OH, R2= β -glucuronic,
R3 R3=OH
OH O
AB19: R1=H, R2=OH, R3= β -
glucuronic
Hình 3.16. Cấu trúc hoá học hợp chất flavon-O-β-glucuronid
Hợp chất flavon-O-β- glucopyranosid (AB18)
60,4
3,66; 3,59
69,0 HOH C 6''
3,35 2
77,2
HO 4'' 3,25
O 115,8
HO 3'' 5''
2'' 106,4 6,94
4,68 129,1 8,5
75,9 74,0 8,0 8,15 161,2 OH
3,30 3,43 1'' C 3'
OH O J=8,8
2'
4'
H 125,2 5'
149,3
O 163,9 1'
115,8
HO 8 6'
6,94
156,9 2 121,1
7 9 8,5
129,1
6 10 102,3 8,15
3 J=8,8
98,8 5 6,81
103,4 4
6,27
157,1 181,8
OH O
Hình 3.17. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất AB18
Hợp chất flavonoid có cấu trúc di-glycosid (AB22)
Hình 3.18. Cấu trúc của hợp chất AB22
3.4.1.6. Hợp chất không phải flavonoid
24 29
23
20
19 22 26
18 30 19
29 20 22
21 25 13
11
17 25 26 17 OH
11
28 27 28
13
1 1 15
9 9 O
2
14 3 5 27
8 7
HO
3
5
HO 24 23
Hình 3.20. Cấu trúc và tương
Hình 3.19. Cấu trúc của hợp
tác chính trên HMBC của
chất AB4
hợp chất AB5
.
.
.
Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất AB7
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR của hợp chất AB5 và AB7
Hợp chất AB12
Tan trong EA, dễ tan trong DMSO, MeOH; ít tan trong CHCl3;
không tan trong n-hexan, PE; Không phát quang dưới UV 365 nm, tắt
quang dưới UV 254 nm, cho màu tím đen khi phun thuốc thử FeCl3 5%,
không hiện màu khi phun thuốc thử VS; UV/methanol: l max(nm) = 279
nm; IR (KBr): υcm-1: : thể hiện các băng hấp thu (cm-1) trong vùng 1450-
1650, đây là tín hiệu của vòng g -pyron; các băng hấp thu 3200 - 3550,
đây là tín hiệu của OH linh động; các băng từ 1500 - 1700, đây là tín hiệu
của các liên kết C = C vòng thơm; ESI-MS (-): m/z = 237 [M+H]. Phổ 1H-
NMR của hợp chất AB12 . cho thấy vùng trường thấp có tín hiệu của hai
cặp proton thơm ghép ortho với nhau [δH 7,04 (2H; d; 8,0 Hz); H-2' và H-
6'] và [δH 6,68 (2H; d; 8,5 Hz); H-3' và H-5'], chứng tỏ trên vòng thơm
của khung flavonoid có cấu trúc đối xứng. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR
còn cho thấy một proton olefin [δH 6,15 (1H; s) H-3], hai proton -CH2-
[δH 4,24 (2H; s) H-8], hai proton thuộc nhóm -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0;
H-7]. Tuy nhiên trên vòng thơm còn có hai proton thuộc nhóm thế hydroxy
gắn trên vòng thơm [δH 9,27; s; H-5] và [δH 8,86; s; H-4]. Phổ 13C-NMR
hợp chất AB12, cho tín hiệu của 15 carbon trong đó có tín hiệu cộng hưởng
ở vùng trường thấp (δc 115,5-167,1 ppm). Ở vùng trường thấp còn có tín
hiệu carbonyl của nhóm keton [δC 167,1; C-4]. kết hợp dữ liệu 13C-NMR
và 1H-NMR, hợp chất AB12 có một vòng thơm và một nhân pyran. Quan
sát tuơng tác HMBC cho tín hiệu proton -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7]
có tương tác với C-6 [δC 141,5 ppm]. Tín hiệu proton của hydroxy 8,86
ppm tương tác C-5. Điều này chứng tỏ -CH2OH gắn vào vị trí C-6 và -OH
.
.
gắn vào vị trí C-5 trên công thức. Bên cạnh đó tín hiệu proton [δH 3,81
ppm] của -CH2- có tương tác với C-2 [δC 167,1 ppm] và C-1' [ δC 127,0
ppm]. Điều đó chứng tỏ -CH2-, nối giữa một vòng thơm và một vòng
pyran.
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR, HMBC (DMSO-d6;
125/500MHz) của hợp chất AB12
δc Phổ δH
Stt HMBC
(ppm) DEPT ppm, mult., J (Hz)
2 167,1 =C=
3 109,0 =CH- 6,27 s C-7; C-6; C-2; C-4
4 173,6 =C=
5 150,3 =C=
6 141,5 =C=
-
7 59,5 4,24 (d; 6,0) C-3; C-2
CH2-
- C-2’; C-4’; C-2; C-1’; C-6;
8 32,7 3,80 s
CH2- C-5;
1' 127,0 =C=
2' 129,4 =CH- 7,03 (t; 2,5; 8,5) C-8; C-2’; C-4’; C-3’
3' 115,3 =CH= 6,69 (t; 2,5; 8,5) C-2’; C-4’; C-3’; C-1’
4' 156,1 =C=
5' 115,3 =CH= 6,69 (t; 2,5; 8,5) C-2’; C-4’; C-3’; C-1’
6' 129,4 =CH- 7,03 (t; 2,5; 8,5) C-8; C-2’; C-4’; C-3’
4-OH' 9,27 s C-3'; C-4'
5-OH 8,86 s C-5; C-6
OH-7-CH2OH- 5,61 s C-2; C-7
Hợp chất AB12 được đề nghị là (2-(4-hydroxybenzyl)-3 hydroxy-
6-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4on) lần đầu tiên được báo cáo (kết quả tra
www.scifinder.cas.gov, ngày 13/2/2017. Cấu trúc và các tương quan trong
HMBC của AB12
Hình 3.22 Cấu trúc và tương tác chính trên HMBC của hợp chất AB12
.
.
Hợp chất AB14
H H 26,3
O 167,2 OH
115,3 2,58
H H
6,68
j=8,5 156,1 OH 9,27 O 198,4 CH8 3 7
7
H 139,2
8,01 O 168,0
129,4
59,4 115,3 7 161,6
6 2 4,28 OH H
7,04
j=8 6,68
j=8,5
115,1
4 115,1
6,81
59,2 129,7 5 6,81
145,7 H 127,0
j=8,5 3 j=8,5
5
4,24
H2 C 129,4 H 115,5
3 j-6
O 167,1 32,7 7,04
6,94 4 115,5
131,5 2
4 109,8 j=8
5 6,94 6
HO H HO 141,5 3,81 j=8,0 3 j=8,0 7,78 1 131,5
173,9 6,33 5,61 H j=8,5 7,78
109,0 j=8,5
6,28 2 121,3
131,2 6 131,2
O HO 150,3
OH 7,91 1 7,91
8,86
173,6
j=8,5
161,2
j=8,5 OH
O
OH
Hình 3.23. Hình 3.24. Hình 3.25. Hình 3.26.
Công thức Công thức của Công thức Công thức
của hợp chất hợp chất AB12 của hợp chất của hợp chất
AB11 AB14 AB15
3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI
FLAVONOID TRONG A. BRACTEOSUM BẰNG HPLC-PDA
Hợp chất có khung isoscutellarein và gắn đường glucuropyranosid
và glucopyranosid thường xuyên xuất hiện trong Nhân trần tía. Vì vậy,
xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid và sử dụng
isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) và isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid (AB18) chất đối chiếu là cần thiết cho việc kiểm nghiệm
nguyên liệu này.
3.5.1. Xây dựng quy trình định, xác định độ tinh khiết AB9 và AB18
bằng HPLC-PDA
Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid cũng được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC-
PDA với điều kiện sắc ký như sau: Hệ thống máy: Máy HPLC Hitachi L-
2000, đầu dò DAD L-2455.; Pha tĩnh: Cột LiChroCart RP C18 (250 mm
x 4 mm, 5µm); Nhiệt độ cột: 25 C ̊ ; Thể tích tiêm mẫu: 20 µL; Tốc độ
dòng: 1,4 mL/ phút; Bước sóng phát hiện: 270 nm; Pha động: ACN –
H3PO4, pH = 2,5 (30 : 70)
Kết quả: Tính tương thích hệ thống của isoscutellarein 8-O-β-
glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid có RSD lần
lượt là 1,7% và 2%. Sắc ký đồ AB9 và AB18 đạt về tính tương tính hệ
thống, AB9 và AB18 tiếp tục được xác định độ tinh khiết pic. AB9 (97,51),
.
.
AB18 (99,17). Với độ tinh khiết trên AB9 và AB18 có sử dụng làm chất
đánh dấu trong phân tích định lượng Nhân trần tía.
3.5.2. Khảo sát điều kiện sắc ký AB9 và AB18
3.5.2.1. Khảo sát điều kiện chiết xuất AB9 và AB18 từ A. bracteosum
dùng trong định lượng
Dược liệu được khảo sát quy trình chiết xuất như: dung môi, thời
gian, nhiệt độ, thể tích dung môi, số lần chiết xuất: Vậy điều kiện chiết
xuất được lựa chọn: Dược liệu được chiết xuất bằng sóng siêu âm, dung
môi chiết xuất là methanol, nhiệt độ 60 0C, thời gian 40 phút, thể tích dung
môi 100 mL, số lần chiết xuất 3 lần. Sau đó cao chiết tiếp tục được xử lý
mẫu dùng cho quá trình phân tích định lượng.
3.5.3. Đánh giá quy trình định lượng bằng HPLC-PDA
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một quy trình
định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
3.5.4. Áp dụng quy trình định lượng đồng thời isoscutellarein 8-O-
β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid trong
nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Thực hiện định lượng 9 mẫu Nhân trần tía với điều kiện sắc ký đã
khảo sát. Trong đó hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid cao
nhất mẫu cây bắt đầu ra hao và thu hái tại Binh Dương. Mẫu cây chưa ra
hoa, thu hái tại Tây Ninh có hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid thấp nhất.
Bảng 3.5 Hàm lượng các chất AB9 và AB18 trong A. bracteosum được
định lượng bằng HPLC-PDA
M Hàm lượng
Nơi thu hái Thời kỳ S (mAU*phút)
ẫ (mg/100g)
sinh trưởng
u AB9 AB18 AB9 AB18
Chưa ra hoa 0,08 0,5
1 262339 1830616
6 46
Bắt đầu có 0,59 1,0
Tây Ninh 2 2168069 3425899
hoa 1 26
Hoa nở rộ 0,69 1,0
3 2553276 3242888
3 01
.
.
Chưa ra hoa 0,55 0,7
4 2092237 2654476
0 89
Bình Bắt đầu có 0,75 3,5
5 1359266 5744926
Dương hoa 8 58
Hoa nở rộ 0,71 1,2
6 2727167 4255423
6 74
Trước ra hoa 0,33 1,1
7 1222481 3924170
1 72
An Giang
Bắt đầu ra 0,33 1,6
8 1234222 5387962
hoa 4 09
BV.YHCT. Mẫu khô 0,63 1,0
9 2267742 3505149
CT 3 91
AB9: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid;
AB18: isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid
Hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất ở mẫu cây bắt đầu ra hoa và Bình
Dương cho hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất.
3.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CARVACROL
CÓ TRONG TINH DẦU NHÂN TRẦN TÍA BẰNG GC-FID
3.6.1. Kiểm tra độ tinh khiết carvacrol bằng Sắc ký lớp mỏng và GC-
FID
Carvacrol còn được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng GC-FID
với điều kiện sắc ký như sau: nhiệt độ tiêm mẫu: 280oC, tỷ lệ chia dòng 1
: 70; Cột phân tích: HP-5 (30 m x 320 µm x 0,25 µm); Detector ion hóa
ngọn lửa (FID); Nhiệt độ detector: 250 oC, tốc độ dòng khí H2: 30
mL/phút, dòng không khí: 300 mL/phút, dòng khí bổ trợ: 45 mL/phút; Thể
tích tiêm mẫu: 1 µL; Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút; Thời gian phân tích mấu:
30,5 phút
Kết quả: tham khảo sắc ký đồ và kết quả khảo sát tính tương thích
hệ thống các phép đo độ tinh khiết. Tính tương thích hệ thống của các
thông số thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), RSD<2%. Dựa vào sắc ký
đồ kiểm tra độ tinh khiết pic, carvacrol là một pic lớn nhất. Từ đó, áp dụng
phương pháp quy về 100% diện tích pic để xác định độ tinh khiết. Độ tinh
khiết carvacrol được xác định là 97,3%
3.6.2. Đánh giá quy trình định lượng bằng GC-FID
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một quy
trình định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN NGỌC QUỲNH
NGHIÊN CỨU VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG
SINH HỌC CỦA CÂY NHÂN TRẦN TÍA
ADENOSMA BRACTEOSUM BONATI -
SCROPHULARIACEAE
Ngành: DƯỢC LIỆU - DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN
Mã số: 62720406
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2019
.
.
Công trình được hoàn thành tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS Trần Hùng
Phản biện 1: PGS.TS. NGUYỄN MINH ĐỨC
Trường Đại học Tôn Đức Thắng
Phản biện 2: PGS.TS. TRẦN HỮU DŨNG
Trường Đại học Y Dược Huế
Phản biện 3: PGS.TS. NGUYỄN NGỌC VINH
Đại học QUỐC GIA TPHCM
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại:
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
vào hồi 8 giờ 00 ngày 22 tháng 11 năm 2019
Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
.
.
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề
Ở Việt Nam hiện nay có nhiều loài dược liệu thuộc chi Adenosma
được sử dụng trong việc phòng và điều trị viêm gan như Nhân trần
(Adenosma caeruleum R. Br.), Bồ bồ (Adenosma indianum (Lour.) Merr.),
Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati). Cả ba loài dược liệu trên
đều được đưa vào các chuyên luận Dược điển Việt Nam và các tài liệu
chính thống về cây thuốc Việt Nam. Trong đó dược liệu Bồ bồ, được
nghiên cứu khá nhiều về thành phần cũng như tác dụng sinh học của tinh
dầu có trong dược liệu này và được sử dụng khá phổ biến ở miền Bắc. Tuy
nhiên ở miền Nam, Nhân trần tía hay còn được gọi là Nhân trần Tây Ninh
được sử dụng khá phổ biến. Trên lâm sàng cũng cho thấy có tác dụng trong
điều trị viêm gan, bệnh viện Nhiệt Đới đã từng dùng dược liệu này chữa
cho hơn 4.000 trường hợp viêm gan do virus và đạt kết quả tốt, bệnh viện
Y học Dân tộc Tây Ninh đã dùng để chữa hơn 100 trường hợp xơ gan cổ
trướng cho kết quả khỏi bệnh là 24% và tiến triển khá tốt là 46,6%. Thêm
vào đó nhóm nghiên cứu Đại Học Y Dược TPHCM đã nghiên cứu sàng
lọc 56 dược liệu, trong đó dược liệu Nhân trần tía cho tác dụng chống oxy
hoá cao, trên cả 4 mô hình thử nghiệm.
Bên cạnh các nghiên cứu được đánh giá cao về tác dụng trị liệu, thì việc
nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các phương pháp theo dõi,
đánh giá thành phần, hàm lượng các hợp chất chính, để có thể đánh giá,
đảm bảo hợp chất lượng, tiêu chuẩn hóa dược liệu, sử dụng trong chăm
sóc sức khỏe một cách an toàn, hiệu quả và khoa học vẫn có rất ít nghiên
cứu.
Để nâng cao giá trị cũng như hiểu biết về dược liệu Nhân trần tía, đề
tài:“Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng
sinh học về cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Botani-
Scrophulariacea)” được thực hiện với các mục tiêu:
1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật của cây Nhân trần tía
2. Nghiên cứu về hóa học của cây Nhân trần tía
.
.
- Khảo sát thành phần hóa thực vật dược liệu Nhân trần tía.
- Phân lập hợp chất hoá học có trong tinh dầu và trong dược liệu
Nhân trần tía
- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
3. Xây dựng quy trình định lượng
- Xây dựng quy trình định lượng hai flavonoid có trong dược liệu
- Xây dựng quy trình định lượng carvacrol có trong tinh dầu Nhân
trần tía.
4. Khảo sát tác dụng sinh học
- Khảo sát tác dụng chống oxy hóa in vitro của cao chiết và một số
hợp chất phân lập được từ Nhân trần tía bằng mô hình DPPH
- Khảo sát tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
2. Tính cấp thiết của đề tài
Nước ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú. với trên 12000
loài là nguồn dược liệu quý dùng trong các bệnh. Nhân trần tía là một trong
những dược liệu được dùng để điều trị bệnh viêm gan, tuy nhiên các nghiên
cứu về thực vật thành phần hoá học của Nhân trần hầu như rất ít các nghiên
cứu ở trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Do những lý do trên, đề tài được
thực hiện trên loài Adenosma bracteosum nhằm làm sáng tỏ thêm về thực
vật, thành phần hoá học, kiểm soát hàm lượng flavonoid có trong dược
liệu, cũng như carvacrol có trong tinh dầu Nhân trần tía, cũng như tác dụng
dược lý của dược liệu này.
3. Những đóng góp mới của luận án
3.1. Khảo sát về hình thái và vi học của Nhân trần tía:
Có so sánh sự khác nhau về hình thái và giải phẫu học từng bộ phận
dùng (rễ, thân, lá) của Nhân trần ở những giai đoạn khác nhau. Bên cạnh
đó thực hiện soi bột bộ phận trên mặt đất, tìm thấy được 18 cấu tử.
3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất có trong dược liệu Nhân trần tía
Phân lập các nhóm hợp chất từ các cao chiết thu được 18 hợp chất và
được định danh bằng các phương pháp phổ hoc, trong đó có một hợp chất
mới: AB12.
.
.
3.3. Xây dựng và đánh giá quy trình định lương AB9 và AB18 có trong
Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng đồng thời hai
flavonoid có trong Nhân trần tía bằng HPLC-PDA
3.4. Xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong tinh
dầu Nhân trần tía bàng GC-FID
Đề tài xây dựng và đánh giá quy trình định lượng carvacrol có trong
tinh dầu Nhân trần tía bằng GC-FID.
3.5. Thử tác dụng chống oxy của Nhân trần tía
3.5.1. Thử tác dụng chống oxy hoá trên cao chiết và hợp chất phân lập
được.
Các hợp chất phân lập từ Nhân trần tía (AB2, AB6; AB16, AB17,
AB18) được thử tác dụng chống oxy hoá trên UV-Vis. Trong đó các các
hợp chất được thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau (0,01 – 1,5 mg/mL).
Ở tất cả các mẫu ở các nồng độ khác nhau đều có khả năng chống oxy hoá.
Tuy nhiên đa số các các mẫu cho tác dụng chống oxy hoá cao nhất ở nồng
độ 1,5 mg/mL.
3.5.2. Thử tác dụng kháng khuẩn của tinh dầu Nhân trần tía
Tinh dầu Nhân trần tía được thử tác dụng kháng khuẩn với 6 chủng
vi khuẩn, trong đó có 5 vi khuẩn Gram dương (Pseudomonas
aeruginosam, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis,
Streptococcus pyogennes, Streptococcus pneumoniae) và một vi khuẩn
Gram âm (Haemophilus influenzae).Kết quả nhận thấy các tinh dầu có khả
năng kháng 5 loại vi khuẩn thử nghiệm, trong đó loài Streptococcus
pneumoniae có đường kính kháng khuẩn 62 mm. Tinh dầu không có khả
năng kháng loài Pseudomonas aeruginosam.
Khi thử MIC thì tinh dầu rất nhạy (có MIC thấp nhất 0,025 %) với loài
Streptococcus pneumoniae, một loại cầu khuẩn sinh mủ.
4. Bố cục luận án
Luận án gồm 140 trang: Mở đầu 2 trang, tổng quan tài liệu 26
trang, nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16 trang, kết quả nghiên
.
.
cứu 82 trang, bàn luận 11 trang, kết luận và đề nghị 3 trang. Luận án có
55 bảng, 68 hình, 6 sơ đồ, 114 tài liệu tham khảo gồm 21 tài liệu tiếng Việt
và 92 tài liệu tiếng nước ngoài, 1 trang web, 149 phụ lục thể hiện các kết
quả thực nghiệm.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ NHÂN TRẦN TÍA
1.1. THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Nhân trần tía (Adenosma bracteosum)
Tên Việt Nam: Nhân trần Tây Ninh, Nhân trần (nhiều) lá bắc,
nhân trần cái (miền Nam).
Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati, họ Hoa mõm chó
(Scrophulariaceae).
Đặc điểm hình thái: cây thảo nhất niên, mọc đứng, không lông, rất
thơm, cao 20-70 cm; thân hình trụ ở gốc, phần thân ở trên và cành vuông,
có 4 cạnh ở góc. Thân và cành màu tím đỏ hoặc màu xanh. Lá không
cuống, mỏng, thường cuốn lại và dễ rụng, phiến thon, dài 2-2,5 cm, rộng
0,6-0,9 cm, mép lá có răng cưa, mặt dưới có ít lông, có tuyến. Cụm hoa có
dạng gié đứng, dài 1,5-5 cm, có nhiều lá bắc ở gốc tạo thành tổng bao lá
bắc. Các lá bắc phía trên lợp lên nhau, dạng màng trong suốt hình tim có
chóp nhọn, mép nguyên, có ít lông, có tuyến ở mặt ngoài. Lá đài 5, không
bằng nhau, đài hoa dạng màng. Tràng hoa có màu trắng hoặc màu xanh
tím, có ống cao 6 mm, môi dưới có 3 thuỳ bằng nhau, có lông ở mặt trên,
cánh hoa thường rụng, chỉ còn lại hai lá bắc và đài. Quả nang cao 3 mm,
không lông, chứa nhiều hạt nhỏ li ti màu nâu hay đen. Dược liệu có mùi
thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
Phân bố: trong số 3 loài thuộc chi Adenosma R. Br. được sử dụng
làm thuốc ở Việt Nam, loài Nhân trần tía có phạm vi phân bố hạn chế và
chỉ phát hiện thấy ở một vài tỉnh phía Nam, như Tây Ninh, Bình Dương,
khu vực Vũng Tàu, các đảo như: Phú Quốc và Côn Đảo. Có tài liệu còn
ghi nhận ở cả Kon Tum, Đắc Lắc. Cây cũng phân bố khá phổ biến ở Lào
và Campuchia.
Bộ phận dùng: thân, cành mang lá và hoa phơi hay sấy khô. Thu hái
lúc cây đang ra hoa, phơi hay sấy ở 40-50 °C đến khô. Dược liệu có mùi
.
.
thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
1.2. THÀNH PHẦN HOÁ HỌC
1.2.1. Nhân trần tía (Adenosma brateosum)
1.2.1.1. Tinh dầu
Từ năm 2015 các nghiên cứu phân tích thành phần tinh dầu khá
trùng khớp nhau về kết quả, trong đó thành phần chính carvacrol (27-
37,2%), carvarol methyl ether (23,2% - 28%), α-bisabolen (15,9%-30,4%)
và γ-terpinen (9,2%). Trong đó loài Nhân trần tía thu hái ở vùng miền khác
nhau, có thành phần và hàm lượng khác nhau
1.2.1.2. Thành phần khác
Nguyễn Minh Đức và cộng sự đã chiết xuất và phân lập được 3 hợp
chất từ Nhân trần tía là bracteosid A, bracteosid B và bracteosid C.
1.3. TÁC DỤNG SINH HỌC
1.3.1. Tác dụng sinh học của Nhân trần tía
1.3.1.1. Tác dụng kháng khuẩn
Carvacrol trong tinh dầu Nhân trần tía đã được chứng minh có tác dụng
kháng khuẩn khá mạnh.
1.3.1.2. Tác dụng trên gan
Một số bệnh viên y học cổ truyên đã sử dụng Nhân trần tía để điều
trị viêm gan cho bệnh nhân và đạt kết quả tốt.
1.3.1.3. Tác dụng chống oxy hóa
Năm 2010, Nhóm nghiên cứu Nguyễn Ngọc Hồng, Trần Hùng
thực hiện sàng lọc hoạt tính chống oxy hoá của 56 loài dược liệu.
Adenosma bracteosum là một trong những dược liệu có hoạt tính mạnh
nhất so với 56 loài dược liệu nghiên cứu.
1.3.1.4. Tác dụng chống viêm
Nhân trần tía ở Tây Ninh, chứa hàm lượng carvacrol rất cao
(27%). Carvacrol là một trong những hợp chất có tác dụng như hợp chất
ức chế COX-II, rất giống hợp chất chống viêm nonsteroid (NSAIDs) như
thuốc ibuprofen.
1.3.1.5. Độc tính
Toàn cây chặt nhỏ phơi khô, chiết cồn 40%, rồi cô cách thủy đến
.
.
dịch đậm đặc. Chuột nhắt trắng không chết ở liều 300 g/kg quy ra dược
liệu khô.
1.4. TÁC DỤNG THEO Y HOC CỔ TRUYỀN
1.4.1. Nhân trần tía
Nhân trần tía có vị đắng, mùi thơm do chứa tinh dầu, song hàm
lượng thấp hơn Nhân trần, toàn cây Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan,
vàng da, ăn uống kém tiêu, sốt, cảm cúm, ngộ độc, 4000 trường hợp viêm
gan siêu vi được điều trị bằng bài thuốc có vị Nhân trần tía ở bệnh viện
Chợ Quán Tp. Hồ Chí Minh (1977-1984), cho kết quả tốt.
Bệnh viện Y học dân tộc Tây Ninh đã sử dụng bài thuốc Nhân trần để điều
trị 100 trường hợp xơ gan cổ trướng, trong đó khỏi bệnh 24%, đáp ứng khá
tốt 46,6%.
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Nhân trần tía
Nguyên liệu cây Nhân trần tía được thu hái và xác định loài
Adenosma bracteosum Bonati, Scrophulariaceae dựa trên đặc điểm hình
thái và so sánh với tài liệu chuyên ngành. Nguyên liệu Nhân trần tía sau
khi thu hái được phơi khô trong mát, loại tạp cơ học lẫn vào, được xay
thành bột với cỡ hạt ≤ 2 mm, bột dược liệu được bảo quản trong thùng
nhựa chống ẩm, để nơi khô, mát, được kiểm tra đạt yêu cầu về độ ẩm theo
DĐVN V trước khi sử dụng.
2.1.2. Vi khuẩn thử nghiệm
1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
2. Staphylococcus aureus ATCC 29213
3. Streptococcus pneumoniae ATCC 29212
4. Streptococcus pyogennes ATCC 12344
5. Moraxella catarrhalis ATCC 25238
6. Haemophilus influenzae ATCC 33533
2.2. CHẤT ĐỐI CHIẾU
Acid ascorbic (Vitamin C) dùng trong thử nghiệm chống oxy hóa.
(Viện Kiểm Nghiệm TPHCM) số lô: QT016070614 đạt độ tinh khiết
99,17%.
.
.
Chất đối chiếu đã được nhóm nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc và
xác định độ tinh khiết: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) đạt
độ tinh khiết 97,51%/HPLC-PDA; isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid
(AB18) đạt độ tinh khiết 99,17%/HPLC-PDA; carvarol đạt độ tinh khiết
97,30%/GC-FID.
2.3. TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
Hệ máy HPLC Waters 600S/626, đầu dò PDA 996, cột Merck RP-
18 (4,6×150 mm; 5 µm);
Máy quang phổ UV-Vis U2800 Hitachi và Gene Quant 1300/);
Máy HPLC Hitachi L – 2000 với đầu dò PDA L – 2455, cột Merck
RP-18 (4,6×150 mm; 5 µm); Hệ thống máy GC Agilent 7890B ghép với
detector FID, Cột HB-5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm film thickness); Khối
phổ được đo bằng máy Micromass Quattro microTM API, ở chế độ ESI+
hay ESI-; NMR: Bruker Avance 500 MHz.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu sau khi được thu hái sẽ được khảo sát về đặc điểm thực
vật để xác định mẫu nghiên cứu và góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm
nghiệm Nhân trần tía (Khảo sát hình thái, giải phẫu học, soi bột dược liệu).
Mẫu, sau đó được khảo sát về thành phần hoá học, chiết xuất và phân lập
các hợp chất hoá học bằng các kỹ thuật sắc ký. Các hợp chất phân lập
được, được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ học thông dụng
như: UV, IR, MS, NMR. Trong dược liệu có hai thành phần chính là phần
bay hơi và không bay hơi. Những hợp chất có hàm lượng cao trong cây
sẽ được xây dựng quy trình định lượng (flavonoid sẽ được xây dựng quy
trình định lượng bằng HPLC-PDA, carvacrol được xây dựng quy trình
định lượng bằng GC-FID theo hướng dẫn ICH. Tiến hành khảo sát tác
dụng sinh học trên mô hình in vitro một số hợp chất chiếm hàm lượng cao
trong cây (6 flavonoid flavonoid được khảo sát tác dụng chống oxy hoá,
tinh dầu được khảo sát tác dụng kháng khuẩn trên 6 vi khuẩn thử nghiệm:
Nội dung nghiên cứu được trình bày ở Sơ đồ
.
.
• Chiết xuất, phân lập, tinh chế. • Quy trình định lượng Flavonoid
• Xác định cấu trúc hóa học. • Quy trình định lượng tinh dầu.
Khảo sát thực vật Khảo sát hóa học Kiểm nghiệm
Khảo sát tác dụng sinh học
• Flavonoid: tác dụng chống oxy-hóa.
• Tinh dầu: tác dụng kháng khuẩn.
Sơ đồ trình tự các nội dung nghiên cứu
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC
3.1.1. Hình thái thực vật
Cây Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati, họ
Scrophulariaceae) là loài thân thảo, cao khoảng 30 – 40 cm. Cành toả ra
ngang hay thẳng đứng. Thân có tiết diện tròn hơi nhô 4 góc, thân non màu
xanh có bốn cánh toả ra, thân già đỏ tía, lông tơ thưa, nhiều ở phần mắt lá,
ở gốc thân có màu nâu tía. Cành mọc thẳng đứng hoặc tỏa ngang. Rễ ngắn,
dài 1-4 cm, rễ chùm.
Dược liệu có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng.
A.Toàn cây B. Lá đơn mọc đối C. Lá tím và xanh D. Lá chứa túi tiết E. Cụm hoa F. Cụm hoa dạng
gié G. Bao phấn hai buồng H. Hoa I. Bầu noãn, vòi nhuỵ, đầu nhuỵ K. hạt L. bầu noãn thượng có
hai lá noãn dính nhau, đính noãn trung trụ
Hình 3.1. Toàn cây Nhân trần tía và hoa
3.1.2. Vi phẫu thực vật
3.1.2.1. Rễ cây
Mặt cắt ngang rễ thân lá của A. bracteosum cũng giống những cây
hai lá mầm khác, tuy nhiên phần thân non có 4 cạnh và bị tiêu biến đi khi
về già.
.
.
Rễ non, lớp ngoài cùng mang nhiều lông hút. Ở rễ già, lớp ngoài
cùng là lớp bần gồm nhiều hàng tế bào hình chữ nhật và bị bong tróc từng
phần.
Hình 3.2. Vi phẫu Hình 3.3. Vi phẫu thân Hình 3.4. Vi phẫu
rễ cây A. cây A. bracteosum lá cây A.
bracteosum bracteosum
3.1.3. Soi bột
Bột có màu nâu hơi tím hơi, mùi thơm đặc trưng. Trong bột thân
đã tìm thấy mảnh mô mềm, mám tế bào mô cứng, sợi mô cứng, mạch
mạng, mạch chấm đồng tiền, mạch xoắn, lông tiết chân đơn bào, đầu đa
bào, hạt tinh bột, hạt, phấn, bao phấn, mảnh cánh hoa.
A. Bao phấn mang hạt phấn B. Quả C.Mảnh cánh I.Mạch mạng K.Mô cứng L.Mạch chấm
hoa D. Hạt phấn có rãnh dọc E. Biểu bì mang lổ đồng tiền M.Mảnh bần N.Mạch vạch
khí F. Lổ khí G. Lông tiết đầu đa bào H. Lông che P.Mảnh mô mềm Q. Bó sợi U.Mạch soắn
chở đa bào V.Hạt tinh bột
Hình 3.5. Các cấu tử của bột A. bracteosum
3.2. THỬ TINH KHIẾT NGUYÊN LIỆU A. BRACTEOSUM
Dược liệu được tiến hành thử tinh khiết với độ ẩm, độ tro và hợp
chất chiết được trong cồn 96%. Kết quả độ ẩm, độ tro và chất chiết được
thể hiện trên
Bảng 3.1.
.
.
Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của mẫu bột dược liệu Nhân trần tía phần
trên mặt đất (n=3)
Hàm lượng
Tro
Độ Hàm lượng chất chất chiết
Tro toàn không
ẩm chiết được (%) được (%)
phần (%) tan / HCl
(%) Dung môi nước Dung môi cồn
(%)
96%
9,74 5,38 0,5 24,02 12
3.3. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TINH DẦU TRONG THÂN
CÀNH VÀ HOA NHÂN TRẦN TÍA
Hoa và thân cành được tách ra và chiết xuất cất và có sự khác
nhau đáng kể về hàm lượng tinh dầu trong hoa và thân cành. Tinh dầu thu
được, được xác định tỷ trọng dựa theo DĐVN V.
Bảng 3.2. Tính chất và hàm lượng tinh dầu có trong Nhân trần tía
Bộ phận Hàm lượng Màu sắc Tỷ trọng
dùng (%)
Thân cành và lá 0,28 Màu vàng nhạt 0,8984
Hoa 1,94 Màu vàng nhạt 0,8984
3.4. CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC THÀNH PHẦN TRÊN
MẶT ĐẤT CỦA A. BRACTEOSUM
3.4.1. Chiết xuất
3.4.1.1. Chiết xuất tinh dầu
Phần dược liệu trên mặt đất (5 kg) được chiết xuất bằng phương
pháp cất kéo hơi nước thu được 14g tinh dầu.
3.4.1.2. Chiết xuất hợp chất không bay hơi
Phần trên mặt đất của cây Nhân trần tía (5 kg) được ngấm kiệt với
85 L ethanol. Dung môi được bốc hơi dưới áp suất giảm thu được cao lỏng.
Cao chiết được tiến hành chiết phân bố với các laoij dung môi có độ phân
cực tăng dần, đòng thời kết hợp với thay đổi pH để thu được các phân đoạn
có thành phần hoá học đơn giản. Các cao chiết thu được, được tiến hành
sắc ký cột (12 cột pha thuận, 3 cột pha đảo, hai cột Sephadex LH20 và một
.
.
cột Diaion). Các chất phân lập được (18 hợp chất được đặt tên lần lượt
AB1 (20 mg), AB2 (10 mg), AB4 (15 mg), AB5 (5 mg), AB6 12 (mg)
AB7 (3,7 mg), AB9 (20 mg), AB10 (4 mg), AB11 (5 mg), AB12 (4 mg),
AB13 (10 mg), AB14 12 mg), AB15 (8 mg), AB16 (12 mg), AB17 (6 mg),
AB18 (20 mg), AB19 (4 mg), AB22 (5 mg)). Trong đó có 4 hợp chất có
cấu trúc đơn giản (AB11, AB12, AB14, AB15), một hợp chất monoterpen
thuộc thành phần tinh dầu (AB1), 1 hợp chất là triterpen AB5 và hai hợp
chất nhân sterol (AB4, , AB7), 10 flavonoid, 4 flavonoid (AB6, AB10,
AB16, AB17) một flavonoid gắn hai đường (AB22), 5 flavonoid có gắn
một đường (4 gắn đường glucuropyranosid: AB2, AB9, AB13, AB19; 1
gắn đường glucopyranosid: AB18), được xác định cấu trúc bằng UV, IR,
MS, NMR.
3.4.1.3. Xác định cấu trúc các chất phân lập
3.4.1.4. Hợp chất monoterpen AB1
AB1 là hợp chất lỏng có màu vàng nhạt, tỷ trọng 0,9772 g/cm3 ở
20 °C, điểm sôi 237,7 °C, không tan trong nước sôi, dung môi hòa tan:
ethanol, diethyl ether, carbon tetrachlorid, aceton. Được phân lập từ tinh
dầu Nhân trần tía
15,3
2,20
10 CH3
2 121,0
OH
130,9
7,01 3 1 153,8
6
4
118,9 5 113,1
6,71 6,64
148,6
8 7 9
H3C 33,9 CH3
24,0 2,80 24,0
1,20 1,20
Hình 3.6. Công thức và tương tác HMBC chính của hợp chất AB1
3.4.1.5. Hợp chất flavonoid
Hợp chất có khung flavon (AB6, AB10, AB16, AB17)
116,1 116,1
6,93
j=8,5 6,97
128,2 OH 61,9 J=7,0
7,86
j=8,0 5' 3,92 128,5 161,5 OH
162,1
OCH3 7,96 6' 5'
6' 4' J=7,0
94,3 61,4 4'
6,40 120,5 1' 3' 116,1 4,02
HO O 2' 132,6
8
161,3 163,4 6,93
j=8,5 H3CO 152,4 O 164,2
1' 3' 116,1
149,3 2 6,97
164,7 7 9 2 128,2 8 121,0 2'
7,86 9 J=7,0
j=8,0 7
99,5 10 3 128,5
6,11 5 4 6 102,6 7,96
6 102,3
102,3
6,65 10 3 6,88 J=7,0
157,4 181,3 135,8 106,2 4
H3CO 148,5 5
182,5
OH O 60,5
3,82
OH O
.
.
Hình 3.7. Công thức và các Hình 3.8. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của tương tác chính trên HMBC của
AB10 AB17
110,2 115,9
7,59 6,98
j=9,0 61,8 j=8,5
150,8 OH 3,92 120,3 161,5 OH
120,4 5' OCH3 7,59
3'
7,59 2'
6' 4' 61,4 j=7,2 4'
56,6 j=9 4,02
3,93 91,6 132,5
6,94 121,4 1' 3' 148,0 H3CO 152,4 O 164,0 1' 5'
H3CO 158,6 O 8
145,2
6'
2 2' OCH3 9 121,0
8 2 OCH3
7 9 163,9 56,0 7 110,0
115,7 3,90 55,7
6,95 135,7 6 10 102,9 7,58
60,5 3 7,00 3,89
56,5 131,9 6 10 3 3,81 5 4
3,93 5 4 103,3 106,4
H3CO 148,5 182,5
H3CO 152,0 105,1 182,2 6,93
OH O
OH O
Hình 3.9. Công thức và các Hình 3.10. Công thức và các
tương tác chính trên HMBC của tương tác chính trên HMBC của
AB6 AB16
H
H
5'
4' OH
AB10: R1=H, R2=H, R3=OH, R4=H
AB6: R1=OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3,
6'
R4
R4=H
8
1' 3'
R3 7 9 O 2
2' R1
6 5
10
4 3
H AB16: R1= OCH3, R2= OCH3, R3= OCH3,
R2 H
OH O
R4= OCH3
AB17: R1=H, R2= OCH3, R3= OCH3, R4=
OCH3
Hình 3.11. Cấu trúc hoá học của các hợp chất flavon
Hợp chất có khung flavon-O-β-glucuronid (AB2, AB9, AB13, AB19)
60,5 169,9
4,68 3,66 HOOC
69,1
3,16 3,36
3,59 OH HO 71,5
H3CO
77,3 3,49
3,23 76,1 O
O HO 73,7 116,0
HO 3,79 3,47 106,3
4,80 6,90
75,9 106,4 75,3 128,9 J=9,0
74,1 4,67 115,9 J=7,5 OH
3,30 3,44 OH 3,33 C 8,06 161,1
j=8,0 129,1 6,94
C
8,14 j=9,0 OH O J=9,0
j=8,5 161,3 OH
H 125,1
O H
149,2
O 163,9 116,0
125,3
HO 6,90
HO 157,2 O 164,0 115,9 157,3 121,1 J=9,0
6,94
157,2 121,1 j=9,0
(Z) 128,9
129,1 102,4 8,06
8,14 98,9 6,80 J=9,0
149,4 102,3
j=8,5 6,26 103,3
H 99,0 103,4 H 157,1 181,7
181,8
OH O
OH O
Hình 3.12. Cấu trúc và tương tác Hình 3.13. Cấu trúc và tương tác
HMBC chính của AB2 HMBC chính của AB9
H 115,9
128,4 115,9 6,90
71,4HOOC 7,92, 6,94 129,0 j=8,5
170,2 j=9 171,9 OH
3,37 6'' 3' j= 8,5 8,15 160,9
HO H OH 72,5 HOOC j=9,0 3'
4'' 2' 4' 3,57 6'' 76,6
H HO 2'
75,1 5'' O 4'
161,2 4'' 6,60 100,2
HO 3,93
115,9 HO 6,03
3''
93,7 1 1' 5''
O O 163,2 1' 5' 115,9
75,4 2'' 1'' 8 6,98
164,0 5' 6,94 HO 106,6 7 149,3
O 151,1 O j= 8,5 3'' 2'' 4,65
2 6' 6,90
3,37 72,81 C 2 157,2
8 121,3
3,37 OH 100,2 121,2 H 72,9 j=7,5 9 j=8,5
7 76,5
5,16 9 6'128,4 3,24 3,44 C 129,0
j=8,0 O 6 102,0 8,15
H 130,48 10
102,4
3 6,08
7,92, OH 1'' 10 3
6,68 j=9,0
H j=9 126,1 5 102,0 4
4
6 105,8 H 157,2 181,1
HO 182,3 H
146,8 5
OH O OH O
.
.
Hình 3.14. Cấu trúc và tương tác Hình 3.15. Cấu trúc và tương
HMBC chính của hợp chất AB13 tác HMBC chính của hợp chất
AB19
R1
OH
AB9: R1=β-glucuronic, R2=OH, R3=H
O
AB2: R1= β -glucuronic 6''methylester,
R2 R2=OH, R3=H
AB13: R1=OH, R2= β -glucuronic,
R3 R3=OH
OH O
AB19: R1=H, R2=OH, R3= β -
glucuronic
Hình 3.16. Cấu trúc hoá học hợp chất flavon-O-β-glucuronid
Hợp chất flavon-O-β- glucopyranosid (AB18)
60,4
3,66; 3,59
69,0 HOH C 6''
3,35 2
77,2
HO 4'' 3,25
O 115,8
HO 3'' 5''
2'' 106,4 6,94
4,68 129,1 8,5
75,9 74,0 8,0 8,15 161,2 OH
3,30 3,43 1'' C 3'
OH O J=8,8
2'
4'
H 125,2 5'
149,3
O 163,9 1'
115,8
HO 8 6'
6,94
156,9 2 121,1
7 9 8,5
129,1
6 10 102,3 8,15
3 J=8,8
98,8 5 6,81
103,4 4
6,27
157,1 181,8
OH O
Hình 3.17. Cấu trúc và tương tác HMBC chính của hợp chất AB18
Hợp chất flavonoid có cấu trúc di-glycosid (AB22)
Hình 3.18. Cấu trúc của hợp chất AB22
3.4.1.6. Hợp chất không phải flavonoid
24 29
23
20
19 22 26
18 30 19
29 20 22
21 25 13
11
17 25 26 17 OH
11
28 27 28
13
1 1 15
9 9 O
2
14 3 5 27
8 7
HO
3
5
HO 24 23
Hình 3.20. Cấu trúc và tương
Hình 3.19. Cấu trúc của hợp
tác chính trên HMBC của
chất AB4
hợp chất AB5
.
.
.
Hình 3.21. Cấu trúc của hợp chất AB7
Bảng 3.3. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR của hợp chất AB5 và AB7
Hợp chất AB12
Tan trong EA, dễ tan trong DMSO, MeOH; ít tan trong CHCl3;
không tan trong n-hexan, PE; Không phát quang dưới UV 365 nm, tắt
quang dưới UV 254 nm, cho màu tím đen khi phun thuốc thử FeCl3 5%,
không hiện màu khi phun thuốc thử VS; UV/methanol: l max(nm) = 279
nm; IR (KBr): υcm-1: : thể hiện các băng hấp thu (cm-1) trong vùng 1450-
1650, đây là tín hiệu của vòng g -pyron; các băng hấp thu 3200 - 3550,
đây là tín hiệu của OH linh động; các băng từ 1500 - 1700, đây là tín hiệu
của các liên kết C = C vòng thơm; ESI-MS (-): m/z = 237 [M+H]. Phổ 1H-
NMR của hợp chất AB12 . cho thấy vùng trường thấp có tín hiệu của hai
cặp proton thơm ghép ortho với nhau [δH 7,04 (2H; d; 8,0 Hz); H-2' và H-
6'] và [δH 6,68 (2H; d; 8,5 Hz); H-3' và H-5'], chứng tỏ trên vòng thơm
của khung flavonoid có cấu trúc đối xứng. Bên cạnh đó, trên phổ 1H-NMR
còn cho thấy một proton olefin [δH 6,15 (1H; s) H-3], hai proton -CH2-
[δH 4,24 (2H; s) H-8], hai proton thuộc nhóm -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0;
H-7]. Tuy nhiên trên vòng thơm còn có hai proton thuộc nhóm thế hydroxy
gắn trên vòng thơm [δH 9,27; s; H-5] và [δH 8,86; s; H-4]. Phổ 13C-NMR
hợp chất AB12, cho tín hiệu của 15 carbon trong đó có tín hiệu cộng hưởng
ở vùng trường thấp (δc 115,5-167,1 ppm). Ở vùng trường thấp còn có tín
hiệu carbonyl của nhóm keton [δC 167,1; C-4]. kết hợp dữ liệu 13C-NMR
và 1H-NMR, hợp chất AB12 có một vòng thơm và một nhân pyran. Quan
sát tuơng tác HMBC cho tín hiệu proton -CH2-OH [δH 4,26; d; 6,0; H-7]
có tương tác với C-6 [δC 141,5 ppm]. Tín hiệu proton của hydroxy 8,86
ppm tương tác C-5. Điều này chứng tỏ -CH2OH gắn vào vị trí C-6 và -OH
.
.
gắn vào vị trí C-5 trên công thức. Bên cạnh đó tín hiệu proton [δH 3,81
ppm] của -CH2- có tương tác với C-2 [δC 167,1 ppm] và C-1' [ δC 127,0
ppm]. Điều đó chứng tỏ -CH2-, nối giữa một vòng thơm và một vòng
pyran.
Bảng 3.4. Dữ liệu phổ 1H –NMR và 13C-NMR, HMBC (DMSO-d6;
125/500MHz) của hợp chất AB12
δc Phổ δH
Stt HMBC
(ppm) DEPT ppm, mult., J (Hz)
2 167,1 =C=
3 109,0 =CH- 6,27 s C-7; C-6; C-2; C-4
4 173,6 =C=
5 150,3 =C=
6 141,5 =C=
-
7 59,5 4,24 (d; 6,0) C-3; C-2
CH2-
- C-2’; C-4’; C-2; C-1’; C-6;
8 32,7 3,80 s
CH2- C-5;
1' 127,0 =C=
2' 129,4 =CH- 7,03 (t; 2,5; 8,5) C-8; C-2’; C-4’; C-3’
3' 115,3 =CH= 6,69 (t; 2,5; 8,5) C-2’; C-4’; C-3’; C-1’
4' 156,1 =C=
5' 115,3 =CH= 6,69 (t; 2,5; 8,5) C-2’; C-4’; C-3’; C-1’
6' 129,4 =CH- 7,03 (t; 2,5; 8,5) C-8; C-2’; C-4’; C-3’
4-OH' 9,27 s C-3'; C-4'
5-OH 8,86 s C-5; C-6
OH-7-CH2OH- 5,61 s C-2; C-7
Hợp chất AB12 được đề nghị là (2-(4-hydroxybenzyl)-3 hydroxy-
6-(hydroxymethyl)-4H-pyran-4on) lần đầu tiên được báo cáo (kết quả tra
www.scifinder.cas.gov, ngày 13/2/2017. Cấu trúc và các tương quan trong
HMBC của AB12
Hình 3.22 Cấu trúc và tương tác chính trên HMBC của hợp chất AB12
.
.
Hợp chất AB14
H H 26,3
O 167,2 OH
115,3 2,58
H H
6,68
j=8,5 156,1 OH 9,27 O 198,4 CH8 3 7
7
H 139,2
8,01 O 168,0
129,4
59,4 115,3 7 161,6
6 2 4,28 OH H
7,04
j=8 6,68
j=8,5
115,1
4 115,1
6,81
59,2 129,7 5 6,81
145,7 H 127,0
j=8,5 3 j=8,5
5
4,24
H2 C 129,4 H 115,5
3 j-6
O 167,1 32,7 7,04
6,94 4 115,5
131,5 2
4 109,8 j=8
5 6,94 6
HO H HO 141,5 3,81 j=8,0 3 j=8,0 7,78 1 131,5
173,9 6,33 5,61 H j=8,5 7,78
109,0 j=8,5
6,28 2 121,3
131,2 6 131,2
O HO 150,3
OH 7,91 1 7,91
8,86
173,6
j=8,5
161,2
j=8,5 OH
O
OH
Hình 3.23. Hình 3.24. Hình 3.25. Hình 3.26.
Công thức Công thức của Công thức Công thức
của hợp chất hợp chất AB12 của hợp chất của hợp chất
AB11 AB14 AB15
3.5. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI
FLAVONOID TRONG A. BRACTEOSUM BẰNG HPLC-PDA
Hợp chất có khung isoscutellarein và gắn đường glucuropyranosid
và glucopyranosid thường xuyên xuất hiện trong Nhân trần tía. Vì vậy,
xây dựng quy trình định lượng đồng thời hai flavonoid và sử dụng
isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AB9) và isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid (AB18) chất đối chiếu là cần thiết cho việc kiểm nghiệm
nguyên liệu này.
3.5.1. Xây dựng quy trình định, xác định độ tinh khiết AB9 và AB18
bằng HPLC-PDA
Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid cũng được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC-
PDA với điều kiện sắc ký như sau: Hệ thống máy: Máy HPLC Hitachi L-
2000, đầu dò DAD L-2455.; Pha tĩnh: Cột LiChroCart RP C18 (250 mm
x 4 mm, 5µm); Nhiệt độ cột: 25 C ̊ ; Thể tích tiêm mẫu: 20 µL; Tốc độ
dòng: 1,4 mL/ phút; Bước sóng phát hiện: 270 nm; Pha động: ACN –
H3PO4, pH = 2,5 (30 : 70)
Kết quả: Tính tương thích hệ thống của isoscutellarein 8-O-β-
glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid có RSD lần
lượt là 1,7% và 2%. Sắc ký đồ AB9 và AB18 đạt về tính tương tính hệ
thống, AB9 và AB18 tiếp tục được xác định độ tinh khiết pic. AB9 (97,51),
.
.
AB18 (99,17). Với độ tinh khiết trên AB9 và AB18 có sử dụng làm chất
đánh dấu trong phân tích định lượng Nhân trần tía.
3.5.2. Khảo sát điều kiện sắc ký AB9 và AB18
3.5.2.1. Khảo sát điều kiện chiết xuất AB9 và AB18 từ A. bracteosum
dùng trong định lượng
Dược liệu được khảo sát quy trình chiết xuất như: dung môi, thời
gian, nhiệt độ, thể tích dung môi, số lần chiết xuất: Vậy điều kiện chiết
xuất được lựa chọn: Dược liệu được chiết xuất bằng sóng siêu âm, dung
môi chiết xuất là methanol, nhiệt độ 60 0C, thời gian 40 phút, thể tích dung
môi 100 mL, số lần chiết xuất 3 lần. Sau đó cao chiết tiếp tục được xử lý
mẫu dùng cho quá trình phân tích định lượng.
3.5.3. Đánh giá quy trình định lượng bằng HPLC-PDA
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một quy trình
định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
3.5.4. Áp dụng quy trình định lượng đồng thời isoscutellarein 8-O-
β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid trong
nhân trần tía bằng HPLC-PDA
Thực hiện định lượng 9 mẫu Nhân trần tía với điều kiện sắc ký đã
khảo sát. Trong đó hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid cao
nhất mẫu cây bắt đầu ra hao và thu hái tại Binh Dương. Mẫu cây chưa ra
hoa, thu hái tại Tây Ninh có hàm lượng isoscutellarein 8-O-β-
glucopyranosid thấp nhất.
Bảng 3.5 Hàm lượng các chất AB9 và AB18 trong A. bracteosum được
định lượng bằng HPLC-PDA
M Hàm lượng
Nơi thu hái Thời kỳ S (mAU*phút)
ẫ (mg/100g)
sinh trưởng
u AB9 AB18 AB9 AB18
Chưa ra hoa 0,08 0,5
1 262339 1830616
6 46
Bắt đầu có 0,59 1,0
Tây Ninh 2 2168069 3425899
hoa 1 26
Hoa nở rộ 0,69 1,0
3 2553276 3242888
3 01
.
.
Chưa ra hoa 0,55 0,7
4 2092237 2654476
0 89
Bình Bắt đầu có 0,75 3,5
5 1359266 5744926
Dương hoa 8 58
Hoa nở rộ 0,71 1,2
6 2727167 4255423
6 74
Trước ra hoa 0,33 1,1
7 1222481 3924170
1 72
An Giang
Bắt đầu ra 0,33 1,6
8 1234222 5387962
hoa 4 09
BV.YHCT. Mẫu khô 0,63 1,0
9 2267742 3505149
CT 3 91
AB9: isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid;
AB18: isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid
Hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất ở mẫu cây bắt đầu ra hoa và Bình
Dương cho hàm lượng AB9 và AB18 cao nhất.
3.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CARVACROL
CÓ TRONG TINH DẦU NHÂN TRẦN TÍA BẰNG GC-FID
3.6.1. Kiểm tra độ tinh khiết carvacrol bằng Sắc ký lớp mỏng và GC-
FID
Carvacrol còn được thực hiện kiểm tra độ tinh khiết bằng GC-FID
với điều kiện sắc ký như sau: nhiệt độ tiêm mẫu: 280oC, tỷ lệ chia dòng 1
: 70; Cột phân tích: HP-5 (30 m x 320 µm x 0,25 µm); Detector ion hóa
ngọn lửa (FID); Nhiệt độ detector: 250 oC, tốc độ dòng khí H2: 30
mL/phút, dòng không khí: 300 mL/phút, dòng khí bổ trợ: 45 mL/phút; Thể
tích tiêm mẫu: 1 µL; Tốc độ dòng: 1,3 mL/phút; Thời gian phân tích mấu:
30,5 phút
Kết quả: tham khảo sắc ký đồ và kết quả khảo sát tính tương thích
hệ thống các phép đo độ tinh khiết. Tính tương thích hệ thống của các
thông số thời gian lưu (tR), diện tích đỉnh (S), RSD<2%. Dựa vào sắc ký
đồ kiểm tra độ tinh khiết pic, carvacrol là một pic lớn nhất. Từ đó, áp dụng
phương pháp quy về 100% diện tích pic để xác định độ tinh khiết. Độ tinh
khiết carvacrol được xác định là 97,3%
3.6.2. Đánh giá quy trình định lượng bằng GC-FID
Quy trình định lượng đã thỏa mãn đầy đủ các yêu cầu của một quy
trình định lượng theo hướng dẫn của ICH và AOAC.
.