Nghiên cứu tác động dược lý hướng bảo vệ gan, thận của bí kỳ nam ( hydnophytum formicarum jack. , rubiaceae )
- 29 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC
NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƢỢC LÝ
HƢỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM
(Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020
.
Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM
.
.
1
.
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của nghiên cứu
Gan và thận là cửa ngõ tiếp xúc đồng thời là nơi chuyển
hóa, bài tiết các chất nên cũng là hai cơ quan chịu sự ảnh hưởng
của nhiều tác nhân gây tổn thương. Stress oxy hóa là một trong
các cơ chế chính dẫn đến tổn thương gan, thận cấp và mạn tính.
Nhiều dược liệu chứa các hợp chất chống oxy hóa đã chứng minh
tác dụng bảo vệ gan, thận một cách kinh tế và hiệu quả. Vườn
quốc gia Phú Quốc là trung tâm đa dạng sinh học của Việt Nam,
nơi có nhiều nguồn gen quý hiếm, trong đó có Bí kỳ nam
(Hydnophytum formicarum Jack.). Một số nghiên cứu cho thấy
loài cây này có các thành phần polyphenol, tác dụng chống oxy
hóa, kháng khuẩn, ức chế tăng trưởng tế bào in vitro. Tuy nhiên,
đến này chưa có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về tác
dụng dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu này. Với mong
muốn nghiên cứu một cách khoa học công dụng dân gian, tác
dụng dược lý và tính an toàn, góp phần tạo cơ sở cho việc bảo
tồn, phát triển dược liệu, “Nghiên cứu tác động dƣợc lý hƣớng
bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum
Jack., Rubiaceae)” được thực hiện với các nội dung cụ thể: 1.
Phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc
gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang; 2. Chiết xuất, sàng lọc các cao toàn
phần, lựa chọn cao tiềm năng và khảo sát chất lượng. Chiết xuất cao
phân đoạn, phân lập chất; 3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và
in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận; 4. Khảo sát độc tính cấp và độc
tính bán trường diễn đường uống của cao Bí kỳ nam.
.
2
.
2. Những đóng góp mới của nghiên cứu
Luận án đã đóng góp những dữ liệu khoa học mới như sau:
Lần đầu tiên các dữ liệu về mặt vi phẫu thực vật, đặc điểm mã
vạch ADN, chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bí kỳ nam thu hái tại
Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang được báo cáo giúp định danh, xác định độ
tinh khiết và phân biệt giữa Bí kỳ nam với các loài tương tự.
Luận án đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và tác động trên sự
tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư phổi người (NCI-H460),
tế bào ung thư vú người (MCF-7), tế bào ung thư cổ tử cung
người (HeLa), tế bào ung thư cơ vân người (RD), tế bào biểu mô
thận heo (LLC-PK1), tế bào biểu mô thận khỉ (Vero) và tế bào
ung thư gan người (HepG2) của các cao cồn toàn phần Bí kỳ
nam. Chất lượng cao cồn Bí kỳ nam được báo cáo, giúp đóng góp
dữ liệu cho chuyên luận về dược liệu này. Lần đầu tiên phân lập
catechin và acid protocatechuic từ cao cồn 50% Bí kỳ nam.
Luận án đã đánh giá tác động dược lý bảo vệ gan, thận của Bí kỳ
nam ở mức độ in vitro (trên tế bào) và in vivo (trên chuột nhắt) dựa
trên tiềm năng chống oxy hóa thông qua con đường tín hiệu protein
Nrf2 điều hòa stress oxy hóa.
Luận án đã khảo sát tính an toàn in vivo đường uống của cao chiết
Bí kỳ nam.
3. Bố cục luận án
Luận án gồm 150 trang. Luận án có 31 bảng, 31 hình, 329 tài
liệu tham khảo gồm 14 tài liệu tiếng việt, 315 tài liệu tiếng anh, 70
phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm.
.
3
.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bí kỳ nam: Bí kỳ nam, tên khoa học
Hydnophytum formicarum Jack., họ Cà phê (Rubiaceae), thuộc
nhóm cây Tổ kiến (ant-plants), thân phình thành củ lớn, bên trong
có những lỗ hổng do kiến sống cộng sinh. Bộ phận d ng là thân
củ. Một số nghiên cứu cho thấy dược liệu có các hợp chất
polyphenol và dụng dược lý in vitro như chống oxy hóa, kháng
khuẩn, ức chế tăng trưởng tế bào...
1.2. Tổng quan về stress oxy hóa: Stress oxy hóa là sự mất cân
đối giữa các gốc tự do và các chất phòng vệ. Đóng vai trò trung
tâm trong điều hóa stress oxy hóa là con đường
Keap1/Nrf2/ARE.
1.3. Tổng quan về stress oxy hóa và bệnh gan, thận: Stress
oxy hóa làm giảm hệ thống phòng vệ cơ thể, rối loạn nội môi,
peroxyd hóa lipid màng tế bào, tổn thương ADN, protein...; là
một trong các cơ chế chính của tổn thương gan do chất độc ngoại
sinh, do rượu, do thuốc, tổn thương thận cấp và mạn tính.
1.4. Các mô hình nghiên cứu tác động bảo vệ gan, thận: Mô
hình in vitro: các tế bào gan tươi, môi trường nuôi cấy tế bào sơ
cấp hay các dòng tế bào bất tử. Mô hình ex vivo: các lát cắt, các
cơ quan phân lập, lưu giữ trong 24 giờ. Mô hình in vivo: động vật
sống. Các mô hình gây tổn thương gan: tác nhân CCl4,
acetaminophen, rượu, D-galactosamin, thioacetamid. Các mô
hình gây tổn thương thận: tác nhân cisplatin, vancomycin,
gentamycin, acetaminophen.
.
4
.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát dƣợc liệu: Khảo sát đặc điểm hình thái bên
ngoài, đặc điểm giải phẫu, đặc điểm bột dược liệu. Khảo sát mã
vạch ADN: Doyle và Doyle (1990), phương pháp Sanger. So
sánh trên GenBank BLAST. Khảo sát chất lượng dược liệu:
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật. Khảo sát độ ẩm, độ tro
.
5
.
(DĐVNV). Định tính, định lượng polyphenol (pp Folin –
Ciocalteu).
2.2.2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần: cao nước,
cao cồn 50%, cồn 70%, cồn 96%. Tính hiệu suất chiết. Định
lượng polyphenol toàn phần. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in
vitro (pp DPPH, pp MDA). Khảo sát tác động lên sự tăng
trưởng tế bào in vitro (test MTT).
2.2.3. Cao phân đoạn Bí kỳ nam: cao EtOAc, cao n-butanol,
cao nước. Định lượng polyphenol toàn phần. Khảo sát hoạt tính
chống oxy hóa. Phân lập chất từ cao EtOAc thu BK1, BK2.
2.2.4. Khảo sát độc tính cấp đƣờng uống của cao cồn 50%
Bí kỳ nam: thể tích uống 0,2 ml/10 g (nồng độ tối đa có thể bơm
qua kim (500 mg/ml)). Theo dõi trong 72h và 14 ngày.
2.2.5. Khảo sát tác động dƣợc lý hƣớng bảo vệ gan
Khảo sát tác động bảo vệ gan in vitro: Đánh giá tác động
các mẫu thử lên tế bào gan HepG2 (1 x 105 tế bào/ml, 24h)
(MTT). Khảo sát tác động bảo vệ gan của các cao Bí kỳ nam,
chất phân lập và đối chứng silymarin 100 μg/ml, có hoặc không
bổ sung CCl4 2 mM: đánh giá sự tăng trưởng tế bào, hoại tử,
stress oxy hóa. Khảo sát yếu tố Nrf2 bằng phương pháp Western
blot.
Khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo: Chuột Swiss albino:
uống nước cất, silymarin 100 mg/kg, hay mẫu thử trong 14 ngày.
Ngày thứ 15, tiêm (i.p.) dầu ô liu hoặc CCl4 0,2% 10 ml/kg. Ngày
thứ 16, xét nghiệm ALT, AST, TNF-α, LDH, MDA, GSH và
quan sát mô bệnh học.
.
6
.
2.2.6. Tác động dƣợc lý hƣớng bảo vệ thận của Bí kỳ nam
Khảo sát tác động bảo vệ thận in vitro: Xây dựng mô hình in
vitro tế bào HEK 293 với cisplatin. Đánh giá mô hình. Khảo sát
tác động bảo vệ HEK 293: Xử lý tế bào với mẫu thử hoặc đối
chứng NAC 1000 mΜ, có hoặc không bổ sung cisplatin, đánh giá
sự tăng trưởng tế bào, tình trạng hoại tử và stress oxy hóa. Khảo
sát yếu tố Nrf2 bằng Western blot.
Khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo: Chuột Swiss albino:
uống nước cất, NAC 100 mg/kg, hay mẫu thử Bí kỳ nam. Ngày
11, tiêm i.p. cisplatin pha trong NaCl 0,9%, liều duy nhất 16
mg/kg (ngoài trừ lô sinh lý). Ngày 14, định lượng ure, creatinin,
TNF-α, LDH, GSH, phân tích đại thể, vi thể thận.
2.2.7. Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn đƣờng uống: trong
60 ngày liên tiếp, theo dõi tình trạng chung, cân nặng, chỉ số sinh
hóa, huyết học và giải phẫu bệnh.
2.3. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê: Kết quả
trình bày dạng Mean ± SEM, thống kê phần mềm SPSS 22.0,
phép kiểm Kruskal-wallis, Mann-Whitney, p < 0,05.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ
3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM
Đặc điểm thực vật: Bí kỳ nam thân phình to thành củ. Bề mặt
sần s i, bên trong mang đầy kiến (Hình 3.1).
a b c d đ e
Hình 3.1 (a) Bí kỳ nam trong rừng Phú Quốc; (b) Thân và
lá; (c) Thân mang lá; (d) Lá; (đ) Mặt ngoài; (e) Mặt trong
.
7
.
Đặc điểm giải phẫu: Vi phẫu rễ có lớp bần, mô mềm vỏ xen tế
bào mô cứng và các khuyết lớn; Vi phẫu thân có lớp bần, tế bào
vách dày, mô mềm vỏ, libe 1,
libe 2, gỗ 2 và gỗ 1; Vi phẫu lá: lớp biểu bì có cutin lồi, tế bào hạ
bì, 2 lớp tế bào mô giậu chứa diệp lục tố, gân chính có vòng libe -
gỗ với các tế bào mô cứng.
Hình 3.1 Thân Bí kỳ nam Hình 3.3 Rễ Bí kỳ nam
a b
Hình 3.4 Bột thân củ Bí kỳ nam
Hình 3.2 Lá Bí kỳ nam
Đặc điểm bột dược liệu: màu vàng nâu, không m i, không vị,
có tinh thể calci oxalat hình kim (1), tế bào mô cứng (2), sợi dài
(3), mảnh bần (4), tế bào mô mềm (5), mạch mạng (6).
Đặc điểm mã vạch ADN: Trình tự rbcL của mẫu thử tương
đồng 99% với mẫu đối chứng loài H. formicarum Jack. [mã số
X81099.1] trên Genbank.
a b
.
8
.
Hình 3.5 (a) Kết quả điện di ADN lá tƣơi Bí kỳ nam trên
gel aragose 1% và (b) sản phẩm PCR với cặp mồi rbcL
Bảng 3.1 Trình tự mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tm (0C) Tác giả
rbcL.F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC [96],
60
3.1.1. rbcL.R
C GTAAAATCAAGTCCACCRCG [182]
hất
lƣợng dƣợc liệu
Bảng 3.2 Thành phần hóa học dƣợc liệu Bí kỳ nam
Nhóm Phƣơng pháp ether cồn nƣớc
Alkaloid Mayer; Dragendoff - - -
Acid hữu cơ Thuốc thử Na2CO3 + + +
Coumarin Phản ứng phát quang - - -
Flavanoid Phản ứng cyanidin + + +
Glycosid tim Raymond, Xanthydrol - - -
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling + + +
Saponin Phản ứng tạo bọt + + +
Tanin Thuốc thử gelatin, FeCl3 - + +
Triterpenoid Salkowski + - -
Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dƣợc liệu Bí kỳ nam
M1 M2 M3 Trung bình
Độ ẩm (%) 13,0 12,9 13,1 13,0 ± 0,1
Độ tro toàn phần (%) 10,1 8,8 9,9 9,6 ± 0,4
Độ tro không tan trong HCl (%) 0,7 0,7 0,6 0,7 ± 0,03
Phản ứng với FeCl3 2% Phản ứng với NaOH 20% Phản ứng với(CH3COO)2Pb 1%
(1): mẫu thử, (2) mẫu thử bổ sung FeCl3 2%, (3) mẫu thử bổ sung NaOH 20%, (4)
mẫu thử bổ sung (CH3COO)2Pb 1%
Hình 3.6 Kết quả định tính polyphenol dƣợc liệu Bí kỳ nam
Bảng 3.4 Hàm lƣợng polyphenol toàn phần Bí kỳ nam
Polyphenol toàn phần trong 1 g Polyphenol trung bình
bột (mg pyrogallol/g bột) (mg pyrogallol/ g bột)
Lần 1 60,7
Lần 2 57,5 58,8 ± 1,7
Lần 3 58,3
.
9
.
3.2. CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM
Chiết xuất cao toàn phần: Cao nước, cao cồn 50%, cao
cồn 70% và cao cồn 96% có hiệu suất chiết: 14,4%, 26,1%,
21,5% và 18,4%; hàm lượng polyphenol toàn phần: 376,8 mg/g
cao, 703,2 mg/g cao, 669,5 mg/g cao và 820,0 mg/g cao.
Hình 3.7 Các cao toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam
Hoạt tính chống oxy hóa in vitro
Bảng 3.5 Phƣơng trình tuyến tính của các cao Bí kỳ nam (DPPH)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao nước y = 1,136x + 9,934 0,957 35,3
Cao cồn 50% y = 1,498x + 22,98 0,949 18,0
Cao cồn 70% y = 1,961x + 2,376 0,977 24,3
Cao cồn 96% y = 2,310x + 6,113 0,997 19,0
Quercetin y = 10,43x - 2,149 0,997 4,8
Bảng 3.6 Phƣơng trình tuyến tính của các cao Bí kỳ nam (MDA)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao nước y = 0,1516x + 9,6584 0,9758 266,1
Cao cồn 50% y = 0,4651x - 4,3469 0,9721 116,8
Cao cồn 70% y = 0,4360x + 2,8572 0,9995 108,1
Cao cồn 96% y = 0,5193x - 0,6565 0,9728 97,5
Quercetin y = 1855,4x - 31,984 0,9930 13,3
Tác động lên sự tăng trưởng của tế bào
Bảng 3.7 Tác động của Bí kỳ nam đối với các dòng tế bào
Tỷ lệ ức chế (%)
Dòng tế Cao Cao cồn Cao cồn Cao cồn
Nồng độ (µg/ml)
bào nƣớc 50% 70% 96%
1000 - 23,0 83,0 83,8 84,0
HeLa
500 - 13,1 54,5 47,5 59,0
.
10
.
250 - 17,7 - 18,0 - 18,4 - 2,9
100 2,3 10,4 - 1,2 3,9
50 4,2 5,7 1,5 5,1
PTX 10 µM 52,7
1000 29,0 42,4 33,5 27,6
500 24,5 32,1 37,9 32,1
250 16,7 25,8 30,7 35,3
RD
100 11,8 12,9 10,1 - 3,1
50 5,3 4,3 4,0 - 6,4
PTX 10 µM 47,6
1000 - 2,0 78,4 70,2 71,4
500 - 13,4 72,2 67,2 68,4
250 - 15,1 9,8 12,2 21,6
MCF-7
100 4,2 2,2 -9,9 - 10,1
50 4,5 3,0 -8,2 - 12,1
PTX 10 µM 29,5
1000 - 24,8 66,6 61,6 80,4
500 - 7,1 7,2 8,4 32,2
NCI- 250 - 8,8 - 12,1 - 17,2 - 16,3
H460 100 4,4 7,2 9,6 12,5
50 3,3 8,2 4,3 13,3
PTX 10 µM 34,8
1000 - 16,2 - 73,8 - 91,5 - 62,4
500 - 21,7 - 82,0 - 68,0 - 83,3
HepG2 250 - 15,1 - 43,9 - 21,2 - 60,8
100 - 18,2 - 2,8 - 5,3 - 19,3
PTX 10 µM 49,1
500 13,7 9,5 - 4,9 - 21,0
LLC- 250 13,9 5,0 5,5 - 6,8
PK1 100 4,0 6,0 7,7 - 10,2
PTX 10 µM 28,5
500 - 11,2 6,0 - 9,1 14,9
250 - 5,1 - 9,3 - 11,6 - 2,5
Vero
100 - 9,7 - 7,6 - 13,8 - 2,8
PTX 10 µM 30,5
Bảng 3.8 Giá trị IC50 các cao toàn phần
Tế bào Cao cồn 50% Cao cồn 70% Cao cồn 96%
IC50
HeLa 441,9 526,3 376,3
(µg/ml)
MCF-7 611,6 440,7 397,7
NCI-H460 901,3 893,1 655,5
.
11
.
3.3. CHIẾT XUẤT VÀ CHẤT LƢỢNG CAO TIỀM NĂNG
Cao cồn 50% đạt các tiêu chuẩn chất lượng theo DĐVN V;
không phát hiện các vi khuẩn: E. coli, Salmonella spp., S. aureus và
P. aeruginosa; polyphenol toàn phần 678,9 mg pyrogallol/g cao.
Hình 3.8 Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam
Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% Bí kỳ nam
M1 M2 M3 Trung bình
Độ ẩm (%) 7,2 7,4 7,4 7,3 ± 0,1
Độ tro toàn phần (%) 6,3 6,2 6,6 6,4 ± 0,1
Độ tro không tan trong HCl (%) 0,9 0,7 0,8 0,8 ± 0,1
3.4. CAO PHÂN ĐOẠN, HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN
Cao phân đoạn EtOAc, n-butanol và nước có hàm lượng
polyphenol toàn phần 365,4 ± 5,9 mg/g cao, 281,7 ± 5,7 mg/g cao
và 15,9 ± 1,8 mg/g cao. Cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa
mạnh nhất. Từ cao EtOAc phân lập được BK1 (2R,3S)-5,7,3’,4’-
tetrahydroxyflavan-3-ol hay (+)-catechin và BK2 acid 3,4-
dihydroxy benzoic hay acid protocatechuic.
Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao EtOAc y = 9,1494x – 9,5078 0,9998 5,6
Cao n-BuOH y = 3,0893x + 0,3133 0,9938 16,1
Cao nước y = 0,1157x + 7,858 0,9986 366,4
Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao EtOAc y = 2,3893x + 4,9393 0,9957 18, 9
Cao n-BuOH y = 1,3975x – 17,219 0,9794 48,1
Cao nước y = 0,0182x - 5,9997 0,9978 3076,8
. (A) (B)
12
.
Hình 3.9 Cấu tr c của hợp chất
BK1 (A) và BK2 (B)
3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƢỜNG
UỐNG CỦA CAO TIỀM NĂNG
Cao cồn 50% không gây
độc tính cấp đường uống ở liều 10
g cao khô/kg (tương đương với
Sơ đồ 1.1. Quy trình phân 32,3 g dược liệu khô/kg).
lập chất từ cao phân đoạn 3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN
CỦA BÍ KỲ NAM
Tác động bảo vệ gan in vitro: Sau 24 giờ, các mẫu thử Bí kỳ
nam không gây độc tế bào HepG2. Các mẫu thử và chất đối chiếu
silymarin phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng, tăng sinh gốc tự do
và hoại tử tế bào do CCl4 2 mM gây ra. Tế bào xử lý với CCl4 có
hình dạng co tròn và hoại tử.
Bảng 3.12 Tác động lên sự tăng trƣởng của tế bào gan HepG2
OD570nm ± SEM Phần trăm thay đổi so
Mẫu thử / Nồng độ (n=6)
với mẫu sinh lý (%)
Mẫu chứng sinh lý 0,602 ± 0,047
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,888 ± 0,053* + 47,44
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,907 ± 0,091* + 50,68
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,648 ± 0,057 + 7,62
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,779 ± 0,085 + 29,31
Catechin 10 µΜ 0,709 ± 0,063 + 17,75
Catechin 20 µΜ 0,702 ± 0,052 + 16,62
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,669 ± 0,045 + 11,13
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,683 ± 0,030 + 13,39
Bảng 3.13 Phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào gan HepG2
OD570nm trung Phần trăm phòng ngừa so
Mẫu (n=6)
bình ± SEM với mẫu chứng bệnh (%)
Sinh lý 0,602 ± 0,047
Chứng bệnh 0,427 ± 0,046*
.
13
.
Silymarin 100 µg/ml 0,655 ± 0,018## 130,43
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,759 ± 0,053## 189,55
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,786 ± 0,062##* 204,77
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,817 ± 0,043##*@ 222,81
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,852 ± 0,033##**@@ 242,98
Catechin 10 µΜ 0,695 ± 0,057# 152,96
Catechin 20 µΜ 0,738 ± 0,046## 177,73
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,699 ± 0,012## 155,50
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,721 ± 0,015##@ 167,75
a b c d
Hình 3.10 Tế bào HepG2 sau 24 giờ xử lý (a) với DMSO 0,1%;
(b) CCl4 2 mM; (c) Silymarin; (d) Cao cồn 50% 100 µg/ml
Bảng 3.14 Phòng
đ ngừa tình
e trạng hoạigtử tế bào gan HepG2
OD490nm trung Phần trăm phòng ngừa so
Mẫu (n=6)
bình ± SEM với mẫu chứng bệnh (%)
Sinh lý 0,309 ± 0,011
Chứng bệnh 0,397 ± 0,004**
##
Silymarin 100 µg/ml (SM) 0,284 ± 0,004 128,41
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,235 ± 0,003##@@ 183,74
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,233 ± 0,001##@@ 186,06
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,262 ± 0,006##@ 152,66
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,251 ± 0,007##@@ 166,18
Catechin 10 µΜ 0,237 ± 0,003##@@ 186,46
Catechin 20 µΜ 0,234 ± 0,004##@@ 183,40
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,244 ± 0,002##@@ 173,07
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,241 ± 0,008##@@ 177,30
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh; @: p < 0,05; @@: p < 0,01
so với chứng dương silymarin
Silymarin, cao cồn 50% Bí kỳ nam làm tăng biểu hiện protein
Nrf2, gợi ý tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan liên quan đến cơ
chế kích hoạt yếu tố chống oxy hóa Nrf2.
.
14
.
Hình 3.11 Kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HepG2
Tác động bảo vệ gan in vivo: Các mẫu thử không làm thay
đổi trọng lượng của chuột. Silymarin 100 mg/kg và mẫu thử Bí
kỳ nam (trừ EtOAc 25 mg/kg) làm giảm ALT, AST, giảm LDH,
TNF-α, tăng GSH và giảm MDA so với chứng bệnh CCl4.
Bảng 3.15 Trọng lƣợng chuột trong tác động bảo vệ gan
Lô (n = 8) Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13
21,11 23,95 26,45 28,89 29,73 32,08 34,85
Sinh lý
0,51 0,72 1.01 0,97 0,92 0,93
19,61 22,74 24,81 28,14 ± 29,91 29,49 33,59
Chứng bệnh
0,42 0,63 0,59 0,72 0,61 0,45 0,74
Silymarin 18,53 21,19 23,49 25,86 28,69 32,03 33,17
100 mg/kg 0,33 0,35 0,37 0,42 0,34 0,42 0,56
Cao cồn 50% 19,24 22,75 25,85 29.53 30,21 32,51 35,39
100 mg/kg 0,40 0,58 0,5 0,55 0,55 0,45 0,71
Cao EtOAc 20,04 22,95 25,40 27,90 30,30 31,78 33,36
100 mg/kg 0,34 0,45 0,33 0,49 0,49 0,42 0,22
Cao EtOAc 19,51 22,31 25,63 28,80 30,63 32,78 34,23
25 mg/kg 0,55 0,43 0,39 0,60 0,50 0,54 0,45
Catechin 19,76 22,79 25,26 28,23 30,24 32,53 33,38
10 mg/kg 0,38 0,30 0,56 0,55 0,42 0,36 0,36
Acid protocate- 19,26 21,61 24,58 28,91 31,19 31,56 34,14
chuic 10 mg/kg 0,28 0,47 0,33 0,49 0,50 1,02 0,52
*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; #: p <*: p < 0,01 so với sinh lý; #: p < 0,05; ## p
0,05: so với chứng bệnh < 0,01: so với chứng bệnh
Hình 3.12 Hoạt tính AST, ALT Hình 3.13 Hoạt tính LDH
trong tác động bảo vệ gan trong tác động bảo vệ gan
.
15
.
Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong tác động bảo vệ gan
Lô (n=6) TNF-α (pg/ml)
Sinh lý 197,5 ± 44,3
Chứng bệnh 1040,1 ± 50,2**
Silymarin 100 mg/kg 436,9 ± 68,6##
Cao cồn 50% 100 mg/kg 392,1 ± 44,9##
Cao EtOAc 100 mg/kg 544,8 ± 84,3##
Catechin 10 mg/kg 410,3 ± 56,5##
Acid protocatechuic 10 mg/kg 488,0 ± 82,7##
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05: so với chứng bệnh
Hình 3.14 Hàm lƣợng GSH Hình 3.15 Hàm lƣợng MDA
trong tác động bảo vệ gan trong tác động bảo vệ gan
Tác động trên đại thể và vi thể gan: Gan chuột CCl4 nhạt
màu, có nhiều chấm xuất huyết, chấm trắng đường kính 0,5 – 1
mm, hoại tử nhu mô gan, viêm quanh khoảng cửa, viêm nhu mô
gan. Mẫu thử và silymarin làm giảm tổn thương gan so với CCl4.
Sinh lý Chứng bệnh Silymarin Cao cồn 50% Cao EtOAc Cao EtOAc Catechin Acid
100 25 protocatechuic
Hình 3.16 Đại thể gan chuột trong tác động bảo vệ gan
Bảng 3.17 Vi thể gan chuột trong tác động bảo vệ gan
Lô (n=6) Kết quả phân tích vi thể
Sinh lý (SL) 6/6 mẫu: mô gan bình thường.
Chứng bệnh 1/6 mẫu: viêm quanh khoảng cửa. 5/6 mẫu:
viêm quanh khoảng cửa, viêm nhu mô gan,
hoại tử tiểu th y.
Silymarin 100 4/6 mẫu: bình thường 2/6 mẫu: viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
.
16
.
Cao cồn 50% 100 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu: viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
Cao EtOAc 100 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
Catechin 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu: viêm quanh
10 mg/kg khoảng cửa.
Acid protocatechuic 5/6 mẫu: bình thường; 1/6 mẫu: viêm quanh
10 mg/kg khoảng cửa.
Sinh lý Chứng bệnh Chứng bệnh Silymarin 100 Cao cồn 50% Cao EtOAc 100 Catechin 10 Acid
(Mô gan bình (Viêm và hoại (Viêm quanh mg/kg (Viêm quanh mg/kg mg/kg protocatechuic
thường) tử tiểu th y) khoảng cửa) (Viêm quanh khoảng cửa) (Viêm quanh (Viêm quanh 10 mg/kg
khoảng cửa) khoảng cửa) khoảng cửa) (Viêm quanh
khoảng cửa)
Hình 3.17 Vi thể mô gan trong tác động bảo vệ gan
3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM
Xây dựng mô hình mô phỏng tổn thương tế bào thận: Mô
hình với mật độ nuôi cấy tế bào HEK 293 là 2,0 x 105 tế bào/ml,
thời gian xử lý 24h với cisplatin nồng độ 25 µM. Cisplatin làm
giảm tỷ lệ sống tế bào, giảm GSH và tăng LDH so với mẫu sinh
lý, các tế bào co rút, giảm số lượng.
Hình 3.18 Tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293
Bảng 3.18 Tác động của cisplatin lên tế bào HEK 293
OD570nm ± SEM (n=4)
MẬT ĐỘ/ CIS 0,5 x 105 tế bào /ml 105 tế bào/ml 2 x 105 tế bào /ml
Xử lý tế bào trong 24 giờ
0 µM 0,195 ± 0,024 0,419 ± 0,026 0,833 ± 0,038
12,5 µM 0,151 ± 0,015 0,325 ± 0,021* 0,617 ± 0,054
25 µM 0,150 ± 0,016 0,245 ± 0,012* 0,399 ± 0,057*
50 µM 0,122 ± 0,005 0,186 ± 0,039* 0,342 ± 0,038*
.
17
.
100 µM 0,139 ± 0,012 0,208 ± 0,015* 0,292 ± 0,033*
Xử lý tế bào trong 48 giờ
0 µM 0,513 ± 0,044 1,426 ± 0,028 2,256 ± 0,146
12,5 µM 0,178 ± 0,015* 0,557 ± 0,039* 1,014 ± 0,048*
25 µM 0,189 ± 0,008* 0,388 ± 0,063* 0,842 ± 0,033*
*
50 µM 0,116 ± 0,009 0,253 ± 0,027* 0,892 ± 0,089*
100 µM 0,146 ± 0,007* 0,519 ± 0,227* 0,778 ± 0,072*
Xử lý tế bào trong 72 giờ
0 µM 0,580 ± 0,095 1,616 ± 0,073 1,850 ± 0,196
12,5 µM 0,147 ± 0,015* 0,299 ± 0,043* 0,528 ± 0,084*
25 µM 0,097 ± 0,011* 0,104 ± 0,019* 0,143 ± 0,027*
50 µM 0,223 ± 0,156 0,143 ± 0,025* 0,185 ± 0,027*
*
100 µM 0,081 ± 0,004 0,126 ± 0,013* 0,341 ± 0,078*
Bảng 3.19 Tác động của cisplatin lên tế bào HEK 293
OD570nm trung GSH trung bình LDH trung
Mẫu (n=6) bình ± SEM (nM/mg bình (mU/ml) ±
(n=6) protein) ± SEM SEM
Sinh lý 1,636 ± 0,089 77,2 ± 4,6 0,712 ± 0,012
Chứng bệnh 0,997 ± 0,054** 23,6 ± 4,5** 0,848 ± 0,008**
NAC 1000 µM 1,213 ± 0,092# 62,5 ± 9,9 ##
0,631 ± 0,006##
**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05,##: p < 0,01 so với mẫu chứng bệnh
Hình 3.19 Tế bào HEK 293 sinh lý và xử lý với cisplatin
Tác động bảo vệ thận in vitro: Sau 24 giờ, các mẫu thử Bí kỳ
nam không gây độc tế bào HEK 293. NAC hay Bí kỳ nam phòng
ngừa sự ức chế tăng trưởng, hoại tử tế bào và tăng sinh gốc tự do
do cisplatin gây ra.
Bảng 3.20 Tác động lên sự tăng trƣởng của tế bào HEK 293
Sự tăng trƣởng của tế bào
Mẫu thử / Nồng độ
(n=6) % thay đổi so với
OD570nm ± SEM
mẫu sinh lý
Mẫu chứng sinh lý 1,638 ± 0,098
Cao cồn 50% 100 µg/ml 1,989 ± 0,025* +21,4
Cao cồn 50% 200 µg/ml 2,027 ± 0,038* +23,8
Cao EtOAc 100 µg/ml 2,112 ± 0,260 +29,0
.
a b c d đ
18
.
Cao EtOAc 200 µg/ml 2,139 ± 0,142* +30,6
Catechin 10 µΜ 1,836 ± 0,100 +12,1
Catechin 20 µΜ 1,866 ± 0,052 +13,9
Acid protocatechuic 10 µΜ 1,995 ± 0,029* +21,8
Acid protocatechuic 20 µΜ 1,875 ± 0,112 +14,5
Hình 3.20 Tế bào HEK 293 sau 24 giờ xử lý với (a) DMSO 0,1%; (b)
cis 25 µM; (c) NAC 1000 µM; (d) cao cồn 50%; (đ) EtOAc
Bảng 3.21 Phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào HEK 293
OD570nm trung Phòng ngừa so với
Mẫu (n=6)
bình ± SEM chứng bệnh (%)
Sinh lý 1,638 ± 0,098
Chứng bệnh (Cis 25 µM) 0,997 ± 0,047**
NAC 1000 µM 1,213 ± 0,092#* 33,7
Cao cồn 50% 100 µg/ml 1,423 ± 0,018## 66,4
Cao cồn 50% 200 µg/ml 1,391 ± 0,040##* 61,4
Cao EtOAc 100 µg/ml 1,390 ± 0,087# 61,2
Cao EtOAc 200 µg/ml 1,358 ± 0,055##* 56,2
Catechin 10 µΜ 1,348 ± 0,039##* 54,8
Catechin 20 µΜ 1,329 ± 0,062##* 51,8
Acid protocatechuic 10 µΜ 1,288 ± 0,026##* 45,4
Acid protocatechuic 20 µΜ 1,226 ± 0,070#* 35,8
*
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh
Bảng 3.22 Phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293
Mẫu (n=6) OD490nm trung bình ± SEM
Sinh lý 0,712 ± 0,012
Cisplatin 25 µM 0,848 ± 0,008**
NAC 1000 µM 0,631 ± 0,006##
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,749 ± 0,015##
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,755 ± 0,012##
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,765 ± 0,024#
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,754 ± 0,021##
Catechin 10 µΜ 0,821 ± 0,009#
Catechin 20 µΜ 0,803 ± 0,011#
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,722 ± 0,011##
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,733 ± 0,016##
*: p < 0,01 so với sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
MAI NGUYỄN NGỌC TRÁC
NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG DƢỢC LÝ
HƢỚNG BẢO VỆ GAN, THẬN CỦA BÍ KỲ NAM
(Hydnophytum formicarum Jack., Rubiaceae)
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
TP. HỒ CHÍ MINH, Năm 2020
.
Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. HCM
.
.
1
.
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Tính cấp thiết của nghiên cứu
Gan và thận là cửa ngõ tiếp xúc đồng thời là nơi chuyển
hóa, bài tiết các chất nên cũng là hai cơ quan chịu sự ảnh hưởng
của nhiều tác nhân gây tổn thương. Stress oxy hóa là một trong
các cơ chế chính dẫn đến tổn thương gan, thận cấp và mạn tính.
Nhiều dược liệu chứa các hợp chất chống oxy hóa đã chứng minh
tác dụng bảo vệ gan, thận một cách kinh tế và hiệu quả. Vườn
quốc gia Phú Quốc là trung tâm đa dạng sinh học của Việt Nam,
nơi có nhiều nguồn gen quý hiếm, trong đó có Bí kỳ nam
(Hydnophytum formicarum Jack.). Một số nghiên cứu cho thấy
loài cây này có các thành phần polyphenol, tác dụng chống oxy
hóa, kháng khuẩn, ức chế tăng trưởng tế bào in vitro. Tuy nhiên,
đến này chưa có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước về tác
dụng dược lý cũng như tính an toàn của dược liệu này. Với mong
muốn nghiên cứu một cách khoa học công dụng dân gian, tác
dụng dược lý và tính an toàn, góp phần tạo cơ sở cho việc bảo
tồn, phát triển dược liệu, “Nghiên cứu tác động dƣợc lý hƣớng
bảo vệ gan, thận của Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum
Jack., Rubiaceae)” được thực hiện với các nội dung cụ thể: 1.
Phân tích thực vật và định danh loài Bí kỳ nam thu hái tại Vườn quốc
gia Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang; 2. Chiết xuất, sàng lọc các cao toàn
phần, lựa chọn cao tiềm năng và khảo sát chất lượng. Chiết xuất cao
phân đoạn, phân lập chất; 3. Khảo sát các tác dụng dược lý in vitro và
in vivo theo hướng bảo vệ gan, thận; 4. Khảo sát độc tính cấp và độc
tính bán trường diễn đường uống của cao Bí kỳ nam.
.
2
.
2. Những đóng góp mới của nghiên cứu
Luận án đã đóng góp những dữ liệu khoa học mới như sau:
Lần đầu tiên các dữ liệu về mặt vi phẫu thực vật, đặc điểm mã
vạch ADN, chỉ tiêu chất lượng của dược liệu Bí kỳ nam thu hái tại
Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang được báo cáo giúp định danh, xác định độ
tinh khiết và phân biệt giữa Bí kỳ nam với các loài tương tự.
Luận án đã đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và tác động trên sự
tăng trưởng của các dòng tế bào ung thư phổi người (NCI-H460),
tế bào ung thư vú người (MCF-7), tế bào ung thư cổ tử cung
người (HeLa), tế bào ung thư cơ vân người (RD), tế bào biểu mô
thận heo (LLC-PK1), tế bào biểu mô thận khỉ (Vero) và tế bào
ung thư gan người (HepG2) của các cao cồn toàn phần Bí kỳ
nam. Chất lượng cao cồn Bí kỳ nam được báo cáo, giúp đóng góp
dữ liệu cho chuyên luận về dược liệu này. Lần đầu tiên phân lập
catechin và acid protocatechuic từ cao cồn 50% Bí kỳ nam.
Luận án đã đánh giá tác động dược lý bảo vệ gan, thận của Bí kỳ
nam ở mức độ in vitro (trên tế bào) và in vivo (trên chuột nhắt) dựa
trên tiềm năng chống oxy hóa thông qua con đường tín hiệu protein
Nrf2 điều hòa stress oxy hóa.
Luận án đã khảo sát tính an toàn in vivo đường uống của cao chiết
Bí kỳ nam.
3. Bố cục luận án
Luận án gồm 150 trang. Luận án có 31 bảng, 31 hình, 329 tài
liệu tham khảo gồm 14 tài liệu tiếng việt, 315 tài liệu tiếng anh, 70
phụ lục thể hiện các kết quả thực nghiệm.
.
3
.
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Bí kỳ nam: Bí kỳ nam, tên khoa học
Hydnophytum formicarum Jack., họ Cà phê (Rubiaceae), thuộc
nhóm cây Tổ kiến (ant-plants), thân phình thành củ lớn, bên trong
có những lỗ hổng do kiến sống cộng sinh. Bộ phận d ng là thân
củ. Một số nghiên cứu cho thấy dược liệu có các hợp chất
polyphenol và dụng dược lý in vitro như chống oxy hóa, kháng
khuẩn, ức chế tăng trưởng tế bào...
1.2. Tổng quan về stress oxy hóa: Stress oxy hóa là sự mất cân
đối giữa các gốc tự do và các chất phòng vệ. Đóng vai trò trung
tâm trong điều hóa stress oxy hóa là con đường
Keap1/Nrf2/ARE.
1.3. Tổng quan về stress oxy hóa và bệnh gan, thận: Stress
oxy hóa làm giảm hệ thống phòng vệ cơ thể, rối loạn nội môi,
peroxyd hóa lipid màng tế bào, tổn thương ADN, protein...; là
một trong các cơ chế chính của tổn thương gan do chất độc ngoại
sinh, do rượu, do thuốc, tổn thương thận cấp và mạn tính.
1.4. Các mô hình nghiên cứu tác động bảo vệ gan, thận: Mô
hình in vitro: các tế bào gan tươi, môi trường nuôi cấy tế bào sơ
cấp hay các dòng tế bào bất tử. Mô hình ex vivo: các lát cắt, các
cơ quan phân lập, lưu giữ trong 24 giờ. Mô hình in vivo: động vật
sống. Các mô hình gây tổn thương gan: tác nhân CCl4,
acetaminophen, rượu, D-galactosamin, thioacetamid. Các mô
hình gây tổn thương thận: tác nhân cisplatin, vancomycin,
gentamycin, acetaminophen.
.
4
.
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Khảo sát dƣợc liệu: Khảo sát đặc điểm hình thái bên
ngoài, đặc điểm giải phẫu, đặc điểm bột dược liệu. Khảo sát mã
vạch ADN: Doyle và Doyle (1990), phương pháp Sanger. So
sánh trên GenBank BLAST. Khảo sát chất lượng dược liệu:
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật. Khảo sát độ ẩm, độ tro
.
5
.
(DĐVNV). Định tính, định lượng polyphenol (pp Folin –
Ciocalteu).
2.2.2. Chiết xuất và sàng lọc các cao toàn phần: cao nước,
cao cồn 50%, cồn 70%, cồn 96%. Tính hiệu suất chiết. Định
lượng polyphenol toàn phần. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in
vitro (pp DPPH, pp MDA). Khảo sát tác động lên sự tăng
trưởng tế bào in vitro (test MTT).
2.2.3. Cao phân đoạn Bí kỳ nam: cao EtOAc, cao n-butanol,
cao nước. Định lượng polyphenol toàn phần. Khảo sát hoạt tính
chống oxy hóa. Phân lập chất từ cao EtOAc thu BK1, BK2.
2.2.4. Khảo sát độc tính cấp đƣờng uống của cao cồn 50%
Bí kỳ nam: thể tích uống 0,2 ml/10 g (nồng độ tối đa có thể bơm
qua kim (500 mg/ml)). Theo dõi trong 72h và 14 ngày.
2.2.5. Khảo sát tác động dƣợc lý hƣớng bảo vệ gan
Khảo sát tác động bảo vệ gan in vitro: Đánh giá tác động
các mẫu thử lên tế bào gan HepG2 (1 x 105 tế bào/ml, 24h)
(MTT). Khảo sát tác động bảo vệ gan của các cao Bí kỳ nam,
chất phân lập và đối chứng silymarin 100 μg/ml, có hoặc không
bổ sung CCl4 2 mM: đánh giá sự tăng trưởng tế bào, hoại tử,
stress oxy hóa. Khảo sát yếu tố Nrf2 bằng phương pháp Western
blot.
Khảo sát tác động bảo vệ gan in vivo: Chuột Swiss albino:
uống nước cất, silymarin 100 mg/kg, hay mẫu thử trong 14 ngày.
Ngày thứ 15, tiêm (i.p.) dầu ô liu hoặc CCl4 0,2% 10 ml/kg. Ngày
thứ 16, xét nghiệm ALT, AST, TNF-α, LDH, MDA, GSH và
quan sát mô bệnh học.
.
6
.
2.2.6. Tác động dƣợc lý hƣớng bảo vệ thận của Bí kỳ nam
Khảo sát tác động bảo vệ thận in vitro: Xây dựng mô hình in
vitro tế bào HEK 293 với cisplatin. Đánh giá mô hình. Khảo sát
tác động bảo vệ HEK 293: Xử lý tế bào với mẫu thử hoặc đối
chứng NAC 1000 mΜ, có hoặc không bổ sung cisplatin, đánh giá
sự tăng trưởng tế bào, tình trạng hoại tử và stress oxy hóa. Khảo
sát yếu tố Nrf2 bằng Western blot.
Khảo sát tác động bảo vệ thận in vivo: Chuột Swiss albino:
uống nước cất, NAC 100 mg/kg, hay mẫu thử Bí kỳ nam. Ngày
11, tiêm i.p. cisplatin pha trong NaCl 0,9%, liều duy nhất 16
mg/kg (ngoài trừ lô sinh lý). Ngày 14, định lượng ure, creatinin,
TNF-α, LDH, GSH, phân tích đại thể, vi thể thận.
2.2.7. Khảo sát độc tính bán trƣờng diễn đƣờng uống: trong
60 ngày liên tiếp, theo dõi tình trạng chung, cân nặng, chỉ số sinh
hóa, huyết học và giải phẫu bệnh.
2.3. Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê: Kết quả
trình bày dạng Mean ± SEM, thống kê phần mềm SPSS 22.0,
phép kiểm Kruskal-wallis, Mann-Whitney, p < 0,05.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ
3.1. ĐỊNH DANH LOÀI BÍ KỲ NAM
Đặc điểm thực vật: Bí kỳ nam thân phình to thành củ. Bề mặt
sần s i, bên trong mang đầy kiến (Hình 3.1).
a b c d đ e
Hình 3.1 (a) Bí kỳ nam trong rừng Phú Quốc; (b) Thân và
lá; (c) Thân mang lá; (d) Lá; (đ) Mặt ngoài; (e) Mặt trong
.
7
.
Đặc điểm giải phẫu: Vi phẫu rễ có lớp bần, mô mềm vỏ xen tế
bào mô cứng và các khuyết lớn; Vi phẫu thân có lớp bần, tế bào
vách dày, mô mềm vỏ, libe 1,
libe 2, gỗ 2 và gỗ 1; Vi phẫu lá: lớp biểu bì có cutin lồi, tế bào hạ
bì, 2 lớp tế bào mô giậu chứa diệp lục tố, gân chính có vòng libe -
gỗ với các tế bào mô cứng.
Hình 3.1 Thân Bí kỳ nam Hình 3.3 Rễ Bí kỳ nam
a b
Hình 3.4 Bột thân củ Bí kỳ nam
Hình 3.2 Lá Bí kỳ nam
Đặc điểm bột dược liệu: màu vàng nâu, không m i, không vị,
có tinh thể calci oxalat hình kim (1), tế bào mô cứng (2), sợi dài
(3), mảnh bần (4), tế bào mô mềm (5), mạch mạng (6).
Đặc điểm mã vạch ADN: Trình tự rbcL của mẫu thử tương
đồng 99% với mẫu đối chứng loài H. formicarum Jack. [mã số
X81099.1] trên Genbank.
a b
.
8
.
Hình 3.5 (a) Kết quả điện di ADN lá tƣơi Bí kỳ nam trên
gel aragose 1% và (b) sản phẩm PCR với cặp mồi rbcL
Bảng 3.1 Trình tự mồi rbcL sử dụng trong phản ứng PCR
Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tm (0C) Tác giả
rbcL.F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC [96],
60
3.1.1. rbcL.R
C GTAAAATCAAGTCCACCRCG [182]
hất
lƣợng dƣợc liệu
Bảng 3.2 Thành phần hóa học dƣợc liệu Bí kỳ nam
Nhóm Phƣơng pháp ether cồn nƣớc
Alkaloid Mayer; Dragendoff - - -
Acid hữu cơ Thuốc thử Na2CO3 + + +
Coumarin Phản ứng phát quang - - -
Flavanoid Phản ứng cyanidin + + +
Glycosid tim Raymond, Xanthydrol - - -
Hợp chất khử Thuốc thử Fehling + + +
Saponin Phản ứng tạo bọt + + +
Tanin Thuốc thử gelatin, FeCl3 - + +
Triterpenoid Salkowski + - -
Bảng 3.3 Độ ẩm và độ tro của dƣợc liệu Bí kỳ nam
M1 M2 M3 Trung bình
Độ ẩm (%) 13,0 12,9 13,1 13,0 ± 0,1
Độ tro toàn phần (%) 10,1 8,8 9,9 9,6 ± 0,4
Độ tro không tan trong HCl (%) 0,7 0,7 0,6 0,7 ± 0,03
Phản ứng với FeCl3 2% Phản ứng với NaOH 20% Phản ứng với(CH3COO)2Pb 1%
(1): mẫu thử, (2) mẫu thử bổ sung FeCl3 2%, (3) mẫu thử bổ sung NaOH 20%, (4)
mẫu thử bổ sung (CH3COO)2Pb 1%
Hình 3.6 Kết quả định tính polyphenol dƣợc liệu Bí kỳ nam
Bảng 3.4 Hàm lƣợng polyphenol toàn phần Bí kỳ nam
Polyphenol toàn phần trong 1 g Polyphenol trung bình
bột (mg pyrogallol/g bột) (mg pyrogallol/ g bột)
Lần 1 60,7
Lần 2 57,5 58,8 ± 1,7
Lần 3 58,3
.
9
.
3.2. CÁC CAO TOÀN PHẦN BÍ KỲ NAM
Chiết xuất cao toàn phần: Cao nước, cao cồn 50%, cao
cồn 70% và cao cồn 96% có hiệu suất chiết: 14,4%, 26,1%,
21,5% và 18,4%; hàm lượng polyphenol toàn phần: 376,8 mg/g
cao, 703,2 mg/g cao, 669,5 mg/g cao và 820,0 mg/g cao.
Hình 3.7 Các cao toàn phần từ thân củ Bí kỳ nam
Hoạt tính chống oxy hóa in vitro
Bảng 3.5 Phƣơng trình tuyến tính của các cao Bí kỳ nam (DPPH)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao nước y = 1,136x + 9,934 0,957 35,3
Cao cồn 50% y = 1,498x + 22,98 0,949 18,0
Cao cồn 70% y = 1,961x + 2,376 0,977 24,3
Cao cồn 96% y = 2,310x + 6,113 0,997 19,0
Quercetin y = 10,43x - 2,149 0,997 4,8
Bảng 3.6 Phƣơng trình tuyến tính của các cao Bí kỳ nam (MDA)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao nước y = 0,1516x + 9,6584 0,9758 266,1
Cao cồn 50% y = 0,4651x - 4,3469 0,9721 116,8
Cao cồn 70% y = 0,4360x + 2,8572 0,9995 108,1
Cao cồn 96% y = 0,5193x - 0,6565 0,9728 97,5
Quercetin y = 1855,4x - 31,984 0,9930 13,3
Tác động lên sự tăng trưởng của tế bào
Bảng 3.7 Tác động của Bí kỳ nam đối với các dòng tế bào
Tỷ lệ ức chế (%)
Dòng tế Cao Cao cồn Cao cồn Cao cồn
Nồng độ (µg/ml)
bào nƣớc 50% 70% 96%
1000 - 23,0 83,0 83,8 84,0
HeLa
500 - 13,1 54,5 47,5 59,0
.
10
.
250 - 17,7 - 18,0 - 18,4 - 2,9
100 2,3 10,4 - 1,2 3,9
50 4,2 5,7 1,5 5,1
PTX 10 µM 52,7
1000 29,0 42,4 33,5 27,6
500 24,5 32,1 37,9 32,1
250 16,7 25,8 30,7 35,3
RD
100 11,8 12,9 10,1 - 3,1
50 5,3 4,3 4,0 - 6,4
PTX 10 µM 47,6
1000 - 2,0 78,4 70,2 71,4
500 - 13,4 72,2 67,2 68,4
250 - 15,1 9,8 12,2 21,6
MCF-7
100 4,2 2,2 -9,9 - 10,1
50 4,5 3,0 -8,2 - 12,1
PTX 10 µM 29,5
1000 - 24,8 66,6 61,6 80,4
500 - 7,1 7,2 8,4 32,2
NCI- 250 - 8,8 - 12,1 - 17,2 - 16,3
H460 100 4,4 7,2 9,6 12,5
50 3,3 8,2 4,3 13,3
PTX 10 µM 34,8
1000 - 16,2 - 73,8 - 91,5 - 62,4
500 - 21,7 - 82,0 - 68,0 - 83,3
HepG2 250 - 15,1 - 43,9 - 21,2 - 60,8
100 - 18,2 - 2,8 - 5,3 - 19,3
PTX 10 µM 49,1
500 13,7 9,5 - 4,9 - 21,0
LLC- 250 13,9 5,0 5,5 - 6,8
PK1 100 4,0 6,0 7,7 - 10,2
PTX 10 µM 28,5
500 - 11,2 6,0 - 9,1 14,9
250 - 5,1 - 9,3 - 11,6 - 2,5
Vero
100 - 9,7 - 7,6 - 13,8 - 2,8
PTX 10 µM 30,5
Bảng 3.8 Giá trị IC50 các cao toàn phần
Tế bào Cao cồn 50% Cao cồn 70% Cao cồn 96%
IC50
HeLa 441,9 526,3 376,3
(µg/ml)
MCF-7 611,6 440,7 397,7
NCI-H460 901,3 893,1 655,5
.
11
.
3.3. CHIẾT XUẤT VÀ CHẤT LƢỢNG CAO TIỀM NĂNG
Cao cồn 50% đạt các tiêu chuẩn chất lượng theo DĐVN V;
không phát hiện các vi khuẩn: E. coli, Salmonella spp., S. aureus và
P. aeruginosa; polyphenol toàn phần 678,9 mg pyrogallol/g cao.
Hình 3.8 Cao cồn 50% từ thân củ Bí kỳ nam
Bảng 3.9 Độ ẩm và độ tro của cao cồn 50% Bí kỳ nam
M1 M2 M3 Trung bình
Độ ẩm (%) 7,2 7,4 7,4 7,3 ± 0,1
Độ tro toàn phần (%) 6,3 6,2 6,6 6,4 ± 0,1
Độ tro không tan trong HCl (%) 0,9 0,7 0,8 0,8 ± 0,1
3.4. CAO PHÂN ĐOẠN, HOẠT TÍNH CAO PHÂN ĐOẠN
Cao phân đoạn EtOAc, n-butanol và nước có hàm lượng
polyphenol toàn phần 365,4 ± 5,9 mg/g cao, 281,7 ± 5,7 mg/g cao
và 15,9 ± 1,8 mg/g cao. Cao EtOAc có hoạt tính chống oxy hóa
mạnh nhất. Từ cao EtOAc phân lập được BK1 (2R,3S)-5,7,3’,4’-
tetrahydroxyflavan-3-ol hay (+)-catechin và BK2 acid 3,4-
dihydroxy benzoic hay acid protocatechuic.
Bảng 3.10 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (DPPH)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao EtOAc y = 9,1494x – 9,5078 0,9998 5,6
Cao n-BuOH y = 3,0893x + 0,3133 0,9938 16,1
Cao nước y = 0,1157x + 7,858 0,9986 366,4
Bảng 3.11 Giá trị IC50 của các cao phân đoạn Bí kỳ nam (MDA)
Mẫu thử Phƣơng trình tuyến tính R2 IC50 (μg/ml)
Cao EtOAc y = 2,3893x + 4,9393 0,9957 18, 9
Cao n-BuOH y = 1,3975x – 17,219 0,9794 48,1
Cao nước y = 0,0182x - 5,9997 0,9978 3076,8
. (A) (B)
12
.
Hình 3.9 Cấu tr c của hợp chất
BK1 (A) và BK2 (B)
3.5. ĐỘC TÍNH CẤP ĐƢỜNG
UỐNG CỦA CAO TIỀM NĂNG
Cao cồn 50% không gây
độc tính cấp đường uống ở liều 10
g cao khô/kg (tương đương với
Sơ đồ 1.1. Quy trình phân 32,3 g dược liệu khô/kg).
lập chất từ cao phân đoạn 3.6. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ GAN
CỦA BÍ KỲ NAM
Tác động bảo vệ gan in vitro: Sau 24 giờ, các mẫu thử Bí kỳ
nam không gây độc tế bào HepG2. Các mẫu thử và chất đối chiếu
silymarin phòng ngừa sự ức chế tăng trưởng, tăng sinh gốc tự do
và hoại tử tế bào do CCl4 2 mM gây ra. Tế bào xử lý với CCl4 có
hình dạng co tròn và hoại tử.
Bảng 3.12 Tác động lên sự tăng trƣởng của tế bào gan HepG2
OD570nm ± SEM Phần trăm thay đổi so
Mẫu thử / Nồng độ (n=6)
với mẫu sinh lý (%)
Mẫu chứng sinh lý 0,602 ± 0,047
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,888 ± 0,053* + 47,44
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,907 ± 0,091* + 50,68
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,648 ± 0,057 + 7,62
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,779 ± 0,085 + 29,31
Catechin 10 µΜ 0,709 ± 0,063 + 17,75
Catechin 20 µΜ 0,702 ± 0,052 + 16,62
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,669 ± 0,045 + 11,13
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,683 ± 0,030 + 13,39
Bảng 3.13 Phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào gan HepG2
OD570nm trung Phần trăm phòng ngừa so
Mẫu (n=6)
bình ± SEM với mẫu chứng bệnh (%)
Sinh lý 0,602 ± 0,047
Chứng bệnh 0,427 ± 0,046*
.
13
.
Silymarin 100 µg/ml 0,655 ± 0,018## 130,43
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,759 ± 0,053## 189,55
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,786 ± 0,062##* 204,77
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,817 ± 0,043##*@ 222,81
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,852 ± 0,033##**@@ 242,98
Catechin 10 µΜ 0,695 ± 0,057# 152,96
Catechin 20 µΜ 0,738 ± 0,046## 177,73
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,699 ± 0,012## 155,50
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,721 ± 0,015##@ 167,75
a b c d
Hình 3.10 Tế bào HepG2 sau 24 giờ xử lý (a) với DMSO 0,1%;
(b) CCl4 2 mM; (c) Silymarin; (d) Cao cồn 50% 100 µg/ml
Bảng 3.14 Phòng
đ ngừa tình
e trạng hoạigtử tế bào gan HepG2
OD490nm trung Phần trăm phòng ngừa so
Mẫu (n=6)
bình ± SEM với mẫu chứng bệnh (%)
Sinh lý 0,309 ± 0,011
Chứng bệnh 0,397 ± 0,004**
##
Silymarin 100 µg/ml (SM) 0,284 ± 0,004 128,41
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,235 ± 0,003##@@ 183,74
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,233 ± 0,001##@@ 186,06
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,262 ± 0,006##@ 152,66
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,251 ± 0,007##@@ 166,18
Catechin 10 µΜ 0,237 ± 0,003##@@ 186,46
Catechin 20 µΜ 0,234 ± 0,004##@@ 183,40
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,244 ± 0,002##@@ 173,07
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,241 ± 0,008##@@ 177,30
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh; @: p < 0,05; @@: p < 0,01
so với chứng dương silymarin
Silymarin, cao cồn 50% Bí kỳ nam làm tăng biểu hiện protein
Nrf2, gợi ý tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan liên quan đến cơ
chế kích hoạt yếu tố chống oxy hóa Nrf2.
.
14
.
Hình 3.11 Kích hoạt protein Nrf2 ở tế bào HepG2
Tác động bảo vệ gan in vivo: Các mẫu thử không làm thay
đổi trọng lượng của chuột. Silymarin 100 mg/kg và mẫu thử Bí
kỳ nam (trừ EtOAc 25 mg/kg) làm giảm ALT, AST, giảm LDH,
TNF-α, tăng GSH và giảm MDA so với chứng bệnh CCl4.
Bảng 3.15 Trọng lƣợng chuột trong tác động bảo vệ gan
Lô (n = 8) Ngày 1 Ngày 3 Ngày 5 Ngày 7 Ngày 9 Ngày 11 Ngày 13
21,11 23,95 26,45 28,89 29,73 32,08 34,85
Sinh lý
0,51 0,72 1.01 0,97 0,92 0,93
19,61 22,74 24,81 28,14 ± 29,91 29,49 33,59
Chứng bệnh
0,42 0,63 0,59 0,72 0,61 0,45 0,74
Silymarin 18,53 21,19 23,49 25,86 28,69 32,03 33,17
100 mg/kg 0,33 0,35 0,37 0,42 0,34 0,42 0,56
Cao cồn 50% 19,24 22,75 25,85 29.53 30,21 32,51 35,39
100 mg/kg 0,40 0,58 0,5 0,55 0,55 0,45 0,71
Cao EtOAc 20,04 22,95 25,40 27,90 30,30 31,78 33,36
100 mg/kg 0,34 0,45 0,33 0,49 0,49 0,42 0,22
Cao EtOAc 19,51 22,31 25,63 28,80 30,63 32,78 34,23
25 mg/kg 0,55 0,43 0,39 0,60 0,50 0,54 0,45
Catechin 19,76 22,79 25,26 28,23 30,24 32,53 33,38
10 mg/kg 0,38 0,30 0,56 0,55 0,42 0,36 0,36
Acid protocate- 19,26 21,61 24,58 28,91 31,19 31,56 34,14
chuic 10 mg/kg 0,28 0,47 0,33 0,49 0,50 1,02 0,52
*: p < 0,05 so với mẫu sinh lý; #: p <*: p < 0,01 so với sinh lý; #: p < 0,05; ## p
0,05: so với chứng bệnh < 0,01: so với chứng bệnh
Hình 3.12 Hoạt tính AST, ALT Hình 3.13 Hoạt tính LDH
trong tác động bảo vệ gan trong tác động bảo vệ gan
.
15
.
Bảng 3.16 Hoạt tính TNF-α trong tác động bảo vệ gan
Lô (n=6) TNF-α (pg/ml)
Sinh lý 197,5 ± 44,3
Chứng bệnh 1040,1 ± 50,2**
Silymarin 100 mg/kg 436,9 ± 68,6##
Cao cồn 50% 100 mg/kg 392,1 ± 44,9##
Cao EtOAc 100 mg/kg 544,8 ± 84,3##
Catechin 10 mg/kg 410,3 ± 56,5##
Acid protocatechuic 10 mg/kg 488,0 ± 82,7##
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh
**
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05: so với chứng bệnh
Hình 3.14 Hàm lƣợng GSH Hình 3.15 Hàm lƣợng MDA
trong tác động bảo vệ gan trong tác động bảo vệ gan
Tác động trên đại thể và vi thể gan: Gan chuột CCl4 nhạt
màu, có nhiều chấm xuất huyết, chấm trắng đường kính 0,5 – 1
mm, hoại tử nhu mô gan, viêm quanh khoảng cửa, viêm nhu mô
gan. Mẫu thử và silymarin làm giảm tổn thương gan so với CCl4.
Sinh lý Chứng bệnh Silymarin Cao cồn 50% Cao EtOAc Cao EtOAc Catechin Acid
100 25 protocatechuic
Hình 3.16 Đại thể gan chuột trong tác động bảo vệ gan
Bảng 3.17 Vi thể gan chuột trong tác động bảo vệ gan
Lô (n=6) Kết quả phân tích vi thể
Sinh lý (SL) 6/6 mẫu: mô gan bình thường.
Chứng bệnh 1/6 mẫu: viêm quanh khoảng cửa. 5/6 mẫu:
viêm quanh khoảng cửa, viêm nhu mô gan,
hoại tử tiểu th y.
Silymarin 100 4/6 mẫu: bình thường 2/6 mẫu: viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
.
16
.
Cao cồn 50% 100 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu: viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
Cao EtOAc 100 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu viêm quanh
mg/kg khoảng cửa.
Catechin 4/6 mẫu: bình thường; 2/6 mẫu: viêm quanh
10 mg/kg khoảng cửa.
Acid protocatechuic 5/6 mẫu: bình thường; 1/6 mẫu: viêm quanh
10 mg/kg khoảng cửa.
Sinh lý Chứng bệnh Chứng bệnh Silymarin 100 Cao cồn 50% Cao EtOAc 100 Catechin 10 Acid
(Mô gan bình (Viêm và hoại (Viêm quanh mg/kg (Viêm quanh mg/kg mg/kg protocatechuic
thường) tử tiểu th y) khoảng cửa) (Viêm quanh khoảng cửa) (Viêm quanh (Viêm quanh 10 mg/kg
khoảng cửa) khoảng cửa) khoảng cửa) (Viêm quanh
khoảng cửa)
Hình 3.17 Vi thể mô gan trong tác động bảo vệ gan
3.7. TÁC ĐỘNG BẢO VỆ THẬN CỦA BÍ KỲ NAM
Xây dựng mô hình mô phỏng tổn thương tế bào thận: Mô
hình với mật độ nuôi cấy tế bào HEK 293 là 2,0 x 105 tế bào/ml,
thời gian xử lý 24h với cisplatin nồng độ 25 µM. Cisplatin làm
giảm tỷ lệ sống tế bào, giảm GSH và tăng LDH so với mẫu sinh
lý, các tế bào co rút, giảm số lượng.
Hình 3.18 Tỷ lệ ức chế tế bào HEK 293
Bảng 3.18 Tác động của cisplatin lên tế bào HEK 293
OD570nm ± SEM (n=4)
MẬT ĐỘ/ CIS 0,5 x 105 tế bào /ml 105 tế bào/ml 2 x 105 tế bào /ml
Xử lý tế bào trong 24 giờ
0 µM 0,195 ± 0,024 0,419 ± 0,026 0,833 ± 0,038
12,5 µM 0,151 ± 0,015 0,325 ± 0,021* 0,617 ± 0,054
25 µM 0,150 ± 0,016 0,245 ± 0,012* 0,399 ± 0,057*
50 µM 0,122 ± 0,005 0,186 ± 0,039* 0,342 ± 0,038*
.
17
.
100 µM 0,139 ± 0,012 0,208 ± 0,015* 0,292 ± 0,033*
Xử lý tế bào trong 48 giờ
0 µM 0,513 ± 0,044 1,426 ± 0,028 2,256 ± 0,146
12,5 µM 0,178 ± 0,015* 0,557 ± 0,039* 1,014 ± 0,048*
25 µM 0,189 ± 0,008* 0,388 ± 0,063* 0,842 ± 0,033*
*
50 µM 0,116 ± 0,009 0,253 ± 0,027* 0,892 ± 0,089*
100 µM 0,146 ± 0,007* 0,519 ± 0,227* 0,778 ± 0,072*
Xử lý tế bào trong 72 giờ
0 µM 0,580 ± 0,095 1,616 ± 0,073 1,850 ± 0,196
12,5 µM 0,147 ± 0,015* 0,299 ± 0,043* 0,528 ± 0,084*
25 µM 0,097 ± 0,011* 0,104 ± 0,019* 0,143 ± 0,027*
50 µM 0,223 ± 0,156 0,143 ± 0,025* 0,185 ± 0,027*
*
100 µM 0,081 ± 0,004 0,126 ± 0,013* 0,341 ± 0,078*
Bảng 3.19 Tác động của cisplatin lên tế bào HEK 293
OD570nm trung GSH trung bình LDH trung
Mẫu (n=6) bình ± SEM (nM/mg bình (mU/ml) ±
(n=6) protein) ± SEM SEM
Sinh lý 1,636 ± 0,089 77,2 ± 4,6 0,712 ± 0,012
Chứng bệnh 0,997 ± 0,054** 23,6 ± 4,5** 0,848 ± 0,008**
NAC 1000 µM 1,213 ± 0,092# 62,5 ± 9,9 ##
0,631 ± 0,006##
**: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05,##: p < 0,01 so với mẫu chứng bệnh
Hình 3.19 Tế bào HEK 293 sinh lý và xử lý với cisplatin
Tác động bảo vệ thận in vitro: Sau 24 giờ, các mẫu thử Bí kỳ
nam không gây độc tế bào HEK 293. NAC hay Bí kỳ nam phòng
ngừa sự ức chế tăng trưởng, hoại tử tế bào và tăng sinh gốc tự do
do cisplatin gây ra.
Bảng 3.20 Tác động lên sự tăng trƣởng của tế bào HEK 293
Sự tăng trƣởng của tế bào
Mẫu thử / Nồng độ
(n=6) % thay đổi so với
OD570nm ± SEM
mẫu sinh lý
Mẫu chứng sinh lý 1,638 ± 0,098
Cao cồn 50% 100 µg/ml 1,989 ± 0,025* +21,4
Cao cồn 50% 200 µg/ml 2,027 ± 0,038* +23,8
Cao EtOAc 100 µg/ml 2,112 ± 0,260 +29,0
.
a b c d đ
18
.
Cao EtOAc 200 µg/ml 2,139 ± 0,142* +30,6
Catechin 10 µΜ 1,836 ± 0,100 +12,1
Catechin 20 µΜ 1,866 ± 0,052 +13,9
Acid protocatechuic 10 µΜ 1,995 ± 0,029* +21,8
Acid protocatechuic 20 µΜ 1,875 ± 0,112 +14,5
Hình 3.20 Tế bào HEK 293 sau 24 giờ xử lý với (a) DMSO 0,1%; (b)
cis 25 µM; (c) NAC 1000 µM; (d) cao cồn 50%; (đ) EtOAc
Bảng 3.21 Phòng ngừa ức chế tăng trƣởng tế bào HEK 293
OD570nm trung Phòng ngừa so với
Mẫu (n=6)
bình ± SEM chứng bệnh (%)
Sinh lý 1,638 ± 0,098
Chứng bệnh (Cis 25 µM) 0,997 ± 0,047**
NAC 1000 µM 1,213 ± 0,092#* 33,7
Cao cồn 50% 100 µg/ml 1,423 ± 0,018## 66,4
Cao cồn 50% 200 µg/ml 1,391 ± 0,040##* 61,4
Cao EtOAc 100 µg/ml 1,390 ± 0,087# 61,2
Cao EtOAc 200 µg/ml 1,358 ± 0,055##* 56,2
Catechin 10 µΜ 1,348 ± 0,039##* 54,8
Catechin 20 µΜ 1,329 ± 0,062##* 51,8
Acid protocatechuic 10 µΜ 1,288 ± 0,026##* 45,4
Acid protocatechuic 20 µΜ 1,226 ± 0,070#* 35,8
*
: p < 0,01 so với mẫu sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với mẫu chứng bệnh
Bảng 3.22 Phòng ngừa hoại tử tế bào thận HEK 293
Mẫu (n=6) OD490nm trung bình ± SEM
Sinh lý 0,712 ± 0,012
Cisplatin 25 µM 0,848 ± 0,008**
NAC 1000 µM 0,631 ± 0,006##
Cao cồn 50% 100 µg/ml 0,749 ± 0,015##
Cao cồn 50% 200 µg/ml 0,755 ± 0,012##
Cao EtOAc 100 µg/ml 0,765 ± 0,024#
Cao EtOAc 200 µg/ml 0,754 ± 0,021##
Catechin 10 µΜ 0,821 ± 0,009#
Catechin 20 µΜ 0,803 ± 0,011#
Acid protocatechuic 10 µΜ 0,722 ± 0,011##
Acid protocatechuic 20 µΜ 0,733 ± 0,016##
*: p < 0,01 so với sinh lý; #: p < 0,05; ##: p < 0,01: so với chứng bệnh
.