Nghiên cứu quá trình tương tác oxi hóa của polyphenol chiết xuất từ chè xanh đến polyanilin và khả năng ứng dụng chống ăn mòn
- 130 trang
- file .pdf
1
TẬP ĐOÀN HOÁ CHẤT VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
MAI THANH NGA
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TƯƠNG TÁC OXI HÓA CỦA
POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ CHÈ XANH ĐẾN
POLYANILIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÒN
Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ
Mã số: 62 44 01 14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. LÊ XUÂN QUẾ
2. GS.TSKH. MAI TUYÊN
HÀ NỘI - 2013
2
TẬP ĐOÀN HOÁ CHẤT VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
MAI THANH NGA
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TƯƠNG TÁC OXI HÓA CỦA
POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ CHÈ XANH ĐẾN
POLYANILIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÒN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC
HÀ NỘI - 2013
3
MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Do có tính chất kháng oxi hóa mạnh, polyphenol tự nhiên tách từ chè
xanh được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm,
mỹ phẩm… Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác
dụng chống oxi hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ chè xanh. Các kết
quả nghiên cứu cho thấy polyphenol có khả năng chống lại quá trình oxi hóa
[32], thể hiện tác dụng kìm hãm đối với sự phát triển của khối u và làm chậm
giai đoạn phát sinh ung thư ở các mô động vật gây u thực nghiệm [77]. Hơn
nữa polyphenol còn có khả năng chống lại quá trình oxi hóa của lipit lớn hơn
so với các chất chống oxi hóa khác như vitamin C và vitamin E [32]. Các
polyphenol trong chè là chất quét gốc tự do hiệu quả vượt trội hơn so với các
polyphenol chiết xuất từ các loại cây khác như nho, đay....[72].
Có thể nói polyphenol chè xanh có rất nhiều tác dụng sinh học quý giá.
Ngoài ra hợp chất này còn được sử dụng như một chất ức chế ăn mòn thép CT3
trong axit có hiệu quả [28], [114]. Bên cạnh đó màng polyanilin (PANi) có thể
thụ động hóa kim loại, tự vá lại vết xước màng sơn bảo vệ và là lớp phủ bảo vệ
chống ăn mòn thông minh [28], [35]. Với hoạt tính của polyphenol chè xanh, sự
tương tác với PANi có thể tạo ra vật liệu có tính chất mới, bảo vệ tốt hơn. Đây là
nội dung nghiên cứu kết hợp đặc điểm của hai chất khác nhau nhằm hướng tới
một ứng dụng có hiệu quả hơn. Vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu quá
trình tương tác oxi hóa của polyphenol chiết xuất từ chè xanh đến polyanilin
và khả năng ứng dụng chống ăn mòn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát quá trình tương tác oxi hóa
của các hợp chất polyphenol và cafein phân lập được từ phụ phẩm chè xanh,
4
với điện cực nền polyanilin trong quá trình tổng hơp bằng phương pháp phân
cực điện hóa.
3. Nhiệm vụ của luận án
Chiết, tinh chế các catechin, cafein từ polyphenol chè xanh Thái Nguyên
và chế tạo màng polyme dẫn polyanilin.
Nghiên cứu tương tác oxi hóa của một số chất phân lập được từ
polyphenol chè xanh với polyme dẫn điện polyanilin.
4. Những đóng góp cơ bản của luận án
Công bố công nghệ mới phân tách catechin chè xanh với hiệu suất cao
và thời gian ngắn bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp điều chế bán công
nghiệp sử dụng cột sắc ký phối hợp Diaion HP20 và Sephadex LH20.
Đã sử dụng phương pháp vi phân nâng cao độ nhạy trong quá trình xử lý
số liệu thực nghiệm xác định chính xác các thông động học trên phổ phân cực
tuần hoàn, góp phần đánh giá chính xác hơn bản chất của quá trình tương tác
của các chất với polyanilin ngay ở gia đoạn khơi mào polyme hóa.
Khảo sát và đánh giá được cơ chế và tác động của epigallocatechingallat
đến quá trình tổng hợp màng polyanilin trên điện cực thép không gỉ. Xác định
được động học của các quá trình khơi mào, phát triển mạch và tắt mạch của
polyme hóa anilin, xác định được một số tính chất của lớp phủ polyanilin có
và không có tương tác epigallocatechingallat.
Đánh giá được cơ chế và động học tương tác của epigalocatechin và
epicatechin đến quá trình oxi hóa khử polyanilin.
Đánh giá được mức độ tương tác của cafein, đến quá trình oxi hóa khử
polyanilin và bước đầu đề xuất cơ chế tương tác giữa cafein và màng polyanilin.
5
- Xác định được khả năng ứng dụng nâng cao thời gian bảo vệ chống ăn
mòn của tương tác giữa các chất epigallocatechingallat, epigallocatechin,
cafein với polyanilin, màng phủ polyanilin có tác động của
epigallocatechingallat, epigallocatechin và cafein đều có thời gian bảo vệ lâu
hơn so với màng polyanilin thuần không có tác động của các hợp chất trên.
6
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Polyphenol chè xanh
1.1.1. Cây chè
1.1.1.1. Tên khoa học
Theo PGS. TS Lê Ngọc Công –Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
thì cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze
Cây chè thuộc ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan
(hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ chè Theales,
họ chè Theaceae, chi chè Camellia (Thea). Năm 1753 Carl Von.
Linnaeus nhà thực vật học nổi tiếng người Thụy Điển đã xác định tên
khoa học cây chè là Thea sinensis, được chia thành hai loại: Thea bokea
(chè đen) và Thea viritis (chè xanh) [13],[26].
1.1.1.2. Đặc điểm sinh thái học
Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam (Trung Quốc) sau đó được trồng phổ
biến ở Việt Nam, Nhật Bản, Ấn Độ và nhiều nước châu Á khác [24], [30].
Ở nước ta, chè được trồng chủ yếu ở các tỉnh Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái
Nguyên, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đắc Lắc, … với tổng diện tích 125.000 ha, sản
lượng hàng năm khoảng 577.000 tấn [30], [96]. Nước ta sản xuất 15 loại chè thương
phẩm khác nhau, trong đó 60% lượng chè xuất khẩu là chè đen [24], [30], [116].
Cây chè sống thích hợp ở vùng khí hậu gió mùa, nhiệt đới ẩm ướt như
vùng đông nam châu Á . Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện:
+ Nhiệt độ trung bình: 15- 250
+ Lượng mưa trung bình: 1500 – 2000 mm.
+ Độ ẩm tương đối của không khí: 80 – 85 %.
7
+ Đất chua: pH = 4.5-6.
+ Tầng đất dày 1m, nhiều mùn, giàu dinh dưỡng N, P, K kết cấu đất tơi
xốp, dốc thoải vừa thoáng vừa giữ được nước, thuộc loại đất thịt.
* Thân và cành: Cây chè sinh trưởng chỉ có một thân chính. Cành chè
do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài
biến đổi từ 1-10 cm. Đốt chè càng dài là biểu hiện của giống chè có năng suất
cao. Tùy theo chiều cao, độ to nhỏ của thân và cành người ta chia thành 3
loại: Cây bụi, cây gỗ nhỏ và cây gỗ vừa [6],[24].
* Lá: Lá chè mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích
thước thay đổi phụ thuộc vào giống chè. Chiều dài lá khoảng từ 4-15cm, chiều
rộng 2-5cm. Khi còn non mặt dưới lá có các sợi lông tơ màu trắng, các lá già có
màu lục sẫm. Lá chè có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa. Lá chè có màu xanh đến
vàng, thay đổi tùy theo giống, thời gian trồng, chế độ dinh dưỡng và mùa vụ. Lá
có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau: hình thuôn, mũi mác, ô van...
Chồi mọc ra từ nách lá, có hai loại chồi: Chồi dinh dưỡng về sau mọc lá
gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non. Lá chè già
(chè xanh) được tính từ lá thứ 4 trở đi (gồm các lá bánh tẻ và lá già). Chồi về
sau mọc ra nụ, hoa và quả [6], [24].
* Hoa, quả, hạt: Hoa chè hình thành trên cây 2-3 tuổi, màu trắng. Hoa
chè lưỡng tính. Quả hình tròn, tam giác hoặc vuông tùy theo số lượng hạt bên
trong. Vỏ quả màu xanh khi chín chuyển sang màu nâu và bị nứt ra. Hạt chè
màu nâu hoặc màu đen, hình cầu, bán cầu hay tam giác [6], [24].
* Rễ: Hệ thống rễ gồm rễ cọc ( rễ trụ), rễ dẫn ( rễ nhánh, rễ bên) và rễ
hút. Rễ nhánh dài trên 1mm có màu nâu hay nâu đỏ. Rễ hút hay còn gọi là rễ
hấp thụ có chiều dài dưới 1m, có màu vàng ngà [6], [13], [24].
8
Chè là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất dài có thể đạt 60-100 năm hoặc lâu
hơn. Tuổi thọ tối đa của một cây chè thương mại vào khoảng 50-65 năm tùy thuộc
điều kiện môi trường và phương pháp trồng trọt. Chè cho năng suất cao vào mùa
mưa từ tháng 5-11, sau 10-15 ngày thì thu hoạch một lần. hiện nay chè được sử
dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là chè búp (1 tôm và 2-3 lá non).
Hình 1.1: Hình ảnh cây chè
1.1.2. Thành phần hóa học của lá chè
1.1.2.1. Phân loại nhóm hợp chất trong chè
Chè là một loại thức uống truyền thống đã có lịch sử hàng ngàn năm.
Quá trình nghiên cứu về chè trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu. Cũng
như các loại thực vật bậc cao khác, trong chè xanh có nhiều loại hợp chất tự
nhiên, được chia thành hai nhóm lớn [13]:
- Nhóm chất trao đổi bậc 1: Là những chất tham gia vào quá trình trao đổi
chất và quá trình sinh trưởng của cây, như hydratcacbon, lipit và axit amin…là
thành phần không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng của thực vật.
- Nhóm chất trao đổi bậc 2: Là những chất không phải để nuôi sống và
phát triển cây cỏ, có thể có mặt ở loại cây này nhưng hoàn toàn không có ở
cây khác, là những hợp chất có hoạt tính sinh học cao.
9
Đối với cây chè, lá chè là bộ phận có giá trị nhất, nên cũng được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu. Có thể nói hiện nay thành phần hóa học của lá
chè đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học chủ yếu của lá chè [12],[13]
Thành phần Hàm lượng (%) khối lượng chất khô
Catechin 25 - 30
(-)- Epigallocatechingallate 8-12
(-)- Epicatechingallate 3-6
(-)- Epigallocatechin 3-6
(-)- Epicatechin 1-3
(+)- Catechin 1 -2
(+)- Gallocatechin 3 -4
Flavonol và flavonol glucozơ 3 -4
Axit polyphenolic and depside 2 -3
Diệp lục và các chất màu khác 0.5 - 0.6
Cafein 3 -4
Amino axit 4-5
Monosaccarit 4-5
Polysacccarit 14-22
Xenlulozơ và hemi xenlulozơ 4-7
Pectin 5-6
Lignin 5-6
Protein 14-17
Lipit 3-5
Các hợp chất dễ bay hơi 0,01 - 0,02
1.1.2.2. Một số nhóm hợp chất trong chè
* Ankaloit: Việc nghiên cứu ankaloit trong chè được bắt đầu vào năm
1827 (Bradfield, 1946), hợp chất trong nhóm ankaloit được quan tâm nghiên
cứu nhiều nhất là cafein nó chiếm khoảng 2-5 % về trọng lượng mẫu khô, lá
chè tươi chứa nhiều cafein có thể là một nhân tố quan trọng tạo nên chất lượng
10
của chè xanh (Bhatia, 1964) [12], [13], [29]. Hàm lượng này ít biến đổi trong
quá trình phát triển của lá chè. Điều đáng chú ý là hàm lượng cafein trong lá
chè cao hơn hàm lượng cafein tương ứng trong hạt cà phê (chiếm khoảng 1,5%
trọng lượng khô). Ngoài cafein, trong lá chè còn có các dẫn xuất khác của
metylxanthin như theobromin, theanin với hàm lượng thấp hơn (<0.1%).
O CH3 O CH3
NH2
H3C N H N N
N N COOH
O
O N N O N N
CH3 CH3
Cafein Theobromin Theanin
Hình 1.2. Cấu trúc của một số ankaloit có trong thành phần lá chè
* Vitamin
Lá chè tươi có nhiều loại vitamin như nhóm vitamin tan trong dầu bao
gồm: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin F… và nhóm vitamin tan
trong nước: vitamin B, vitamin PP, vitamin C…. Trong đó vitamin C chiếm
hàm lượng cao nhất, có thể đạt đến 280mg/100g (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin C trong lá chè [12]
Bộ phận Búp chè Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ 3 Lá già
mg/kg
7,03 9,99 10,44 7,88 4,83
chất khô
* Cacbonhydrat
Nhóm cacbonhydrat có mặt trong lá chè bao gồm hợp chất xenlulozơ,
hemi-xenlulozơ và đường tự do. Các gốc đường tự do có mặt trong lá chè bao
gồm glucozơ, fructozơ... Các polysaccarit bao gồm có galactozơ, arabinozơ,
axit galacturonic, ribozơ... Các đường tự do là nguồn nguyên liệu chính để
tổng hợp catechin trong lá chè. Những nghiên cứu sử dụng glucozơ đánh dấu
11
bằng nguyên tử 14C (đồng vị 12C) đã chỉ ra rằng glucozơ là một trong những
tiền chất của polyphenol và axit amin (ngoại trừ theanin) có trong thành phần
của lá chè [6], [12].
* Các nhóm hợp chất khác
Enzym: Trong búp chè có hầu hết các loại enzym nhưng chủ yếu gồm 2
nhóm: nhóm enzym thủy phân gồm amilaza, glucozidaza, proteaza…; nhóm
enzym oxi hóa khử gồm catalaza, polyphenol oxidaza và peroxidaza…Trong
số các enzym có trong lá chè, enzym polyphenol oxidaza có vai trò quan trọng
trong quá trình oxi hóa nhóm catechin của chè [6], [12].
Protein và axit amin: Hàm lượng protein phân bố không đều ở các thành
phần của búp chè và thay đổi theo giống cũng như điều kiện canh tác và các
yếu tố khác. Protein chiếm hàm lượng khoảng 15% khối lượng chất khô.
Ngày nay người ta tìm thấy trong chè 17 axit amin. Các axit amin cùng với
đường và tanin tạo thành ankaloit. Ankaloit chính là hợp chất tạo nên vị thơm
rất đặc biệt của chè [6].
Chất béo và các axit béo tự do: Các hợp chất lipit, photpholipit và các
axit béo chiếm khoảng 5-6 % khối lượng khô, hàm lượng này biến đổi khá
nhiều tuỳ theo từng giống chè. Các axit béo tự do tìm thấy trong lá chè như
linolenic, linoleic, oleic và panmitic…[6].
Carotenoit: Người ta đã tìm thấy β-caroten, lutein, violaxanthin và
neoxanthin trong lá chè.
Axit hữu cơ: Các axit như citric, tactaric, malic, oxalic, fumaric, cafeic,
quinic, gallic, sucxinic, chlorogenic, neo-chlorogenic, p-coumarylquinic,
ellagic… đã được nhận diện trong lá chè tươi [12].
12
Kim loại: Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô, trong đó
chất chiếm hàm lượng nhiều nhất là nhôm, mangan, magie…. Hàm lượng các
chất vô cơ trong lá chè cũng biến đổi nhiều tuỳ theo thổ nhưỡng vùng đất.
Một điều đáng lưu ý là một phần các kim loại, đặc biệt là nhôm, tìm thấy
trong chè dưới dạng phức chelat với các catechin [12].
Các chất dễ bay hơi (tinh dầu chè): Thành phần tinh dầu chè chiếm tỉ lệ
rất thấp trong tổng khối lượng của lá chè (<0.01%). Các thành phần đã được
nhận diện trong tinh dầu chè bao gồm linalol, delta-cardinene, geraniol,
nerolidol, anpha-terpinol, cis-jasmone, indol, betaionon, 1-octanal, indol-3-
cacbinol, beta-caryophyllen [12], [24].
1.1.3. Nhóm hợp chất polyphenol trong chè
1.1.3.1. Giới thiệu về polyphenol
Polyphenol là thành phần chính có trong chè và một số loại thực vật
khác, việc sử dụng polyphenol như một loại hóa chất dùng để chống lại sâu
bọ, côn trùng, chim và các loại động vật. Chè xanh không có các enzym oxi
hoá các polyphenol, nên trong quá trình chế biến (sấy, và lấy hương) không làm
thay đổi các polyphenol trong chè.
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất
trong lá chè. Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất
polyphenol được tìm thấy trong các loài thực vật khác. Trong đó thành phần
chủ yếu là các catechin chiếm hơn 25-30% trọng lượng mẫu khô bao gồm (C,
EC, EGCG, EGC, ECG…) [12], [98].
Ngoài ra trong thành phần polyphenol của chè còn có một số chất khác
với tỉ lệ thấp như các flavonol (quecetin, kaempferol, rutin…), các dẫn xuất
glucozơ như myricetin-3-glucozơ, kaempferol-3-glucozơ, myricetin-3-
rhamnoglucozơ, quercetin-3-rhamnoglucozơ, kaempferol-rhamnodiglucozơ...
13
các leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoit như theaflavin (theaflavin-
3-gallat, theaflavin-3’-gallat, theaflavin-3,3’-digallat), thearubigin
(procyanidin, procyanidin gallat). Các dạng hợp chất như theaflavin,
thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ
lệ trong các lá chè già hơn [6], [12].
1.1.3.2. Tính chất lý hoá của catechin
Nhóm hợp chất catechin trong chè đã được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu,
các dữ liệu về tính chất hóa học, phổ IR, NMR, MS, kết quả phân tích bằng các
phương pháp khác đã được công bố. Catechin của chè thuộc họ flavonoit, nhóm
flavan-3-ol, phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng 6 cacbon A và B được nối
bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử
oxi (hình 1.3). Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2 và 3,
không chứa nối đôi ở vị trí 2,3 và nhóm 4- oxo [12] [28].
Hình 1.3. Khung cơ bản của hợp chất catechin [12]
Trong thành phần của chè có 6 loại hợp chất catechin chính và một số
lượng nhỏ các dẫn xuất catechin (hình 1.4). Các catechin được chia thành 2
nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm C, GC, EC, EGC (vị trí cacbon số 3 có
chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị este hóa hay nhóm galloyl catechin:
ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon số 3 được thay bằng một nhóm
gallat).
14
OH OH
H OH H OH
HO O HO O
OH
HO HO OH
H H
(+) - Catechin C15H14O6 (-) - Epicatechin C15H14O6,
M = 290, t0nc=176oC, [α]D=+18o M = 290, t0nc = 242oC, [α]D = -69o
OH OH
H OH H OH
HO O HO O OH
OH
HO O OC OH HO OH
H H
OH
(-)- Epicatechin gallate, C22H14O10 (+) - Gallocatechin, C15H14O7
M = 442, t0nc =253oC, [α]D=-177o M = 306, t0nc = 188oC, [α]D = +15o
OH OH
H OH H OH
HO O OH HO O OH
OH
HO OH HO O OC OH
H H
OH
(-)-Epigallocatechin C15H14O7, (-)-Epigallocatechingallate C22H18O11
M = 306, t0nc = 276oC, [α]D = -50o M = 458, t0nc = 216oC, [α]D = -179o
Hình 1.4. Các hợp chất catechin chính trong chè [15],[26], [58]
(t0nc: Nhiệt độ nóng chảy, M: Khối lượng phân tử, [α]D: góc quay cực)
Các hợp chất catechin chính trong lá chè (hình 1.4) đã được tách ra từng
chất ở dạng tinh khiết, ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu hình
kim hoặc hình lăng trụ, có vị chát dịu hoặc hơi đắng, tác dụng với FeCl3 cho
kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong
phân tử. Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, axeton, etylaxetat tạo
15
thành dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực
hoặc ít phân cực như benzen hoặc clorofom.
Hàm lượng catechin trong búp chè cao nhất đạt khoảng 25-30% trọng
lượng khô. Trong số các hợp chất catechin có mặt trong lá chè, epigallocatechin
gallat (EGCG) là chất có hàm lượng lớn nhất (~ 9%) [83], đồng thời cũng là chất
có khả năng chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư cao nhất [45]. Tiếp
theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10-20% tổng catechin). Các hợp chất
catechin (C, EC, GC) còn lại có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc
trưng của chè do còn được tìm thấy trong ca cao, nho, táo, hành…
Hàm lượng của các catechin trong lá chè luôn luôn thay đổi, phụ thuộc
vào giống chè, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận cây chè, vị trí các lá trên búp chè
và các yếu tố khác về thổ nhưỡng, khí hậu, cách chăm bón…. Trong quá trình
phát triển của lá chè, dưới tác dụng của các enzym, các catechin bị chuyển
dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành
[12], [13], [38], [59].
Bảng 1.3. Hàm lượng catechin trong từng bộ phận của chè [12]
Catechin Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ ba Lá già Cọng búp
GC 32.15 31.04 28.34 25.36 68.9
EC 45.52 47.84 45.13 45.24 65.45
ECG 138.52 132.27 103.08 103.09 87.98
EGC 122.10 152.27 206.42 232.36 222.08
EGCG 580.57 577.93 435.78 432.04 293.45
Tổng 918.86 941.35 818.75 838.09 737.86
Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết bằng etylaxetat.
16
1.1.3.3. Sinh tổng hợp catechin trong lá chè
Hiện nay, cơ chế về quá trình sinh tổng hợp các catechin trong lá chè
vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ do thành phần tương đối đặc biệt
của các catechin trong lá chè. Xét theo khung cơ bản gồm 3 vòng A, B, C
(hình 1.3, 1.4), cấu trúc của họ flavonoit được chia làm 2 phần [6], [12]:
- Phần C6-C3 (Vòng B+3C), xuất phát theo chu trình axit shikimic dẫn đến
dẫn chất phenylpropan.
COOH COOH COOH
O P
ATP
+
H2C=C-COOH P O
HO OH P O OH O
OH Axit photpho enol pyruvic OH
OH C =CH2
Axit shikimic 5-photphoshikimic 3-enol pyruvyl shikimat-5- photphat
COOH
+H2O +H3PO4
CH=CH-COOH CH2-CH-COOH HOOC CH2COCOOH
HC OH + NH3
NH
CH - NH3 -CO2
HO
C
OH OH OH
O Axit paracoumaric Tyrosin
Hình 1.5. Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan
- Phần C6 (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị axetat dẫn đến axit triaxetic
CH3-COOH + HCH2-COOH CH3-CO-CH2-COOH + H2O
Axit axetoaxetic
CH3-CO-CH2-COOH +HCH2-COOH CH3-CO-CH2-CO-CH2-COOH + H2O
Axit triaxetic
Hai phần này đóng vòng ghép lại thành mạch chính chalcon. Từ chalcon
hình thành nhiều dẫn xuất khác nhau của họ flavonoit.
Trong trường hợp chalcon và các dẫn xuất của chalcon, mạch 3C
không đóng vòng. Còn phần lớn các trường hợp khác mạch 3C đóng vòng với
vòng A tạo thành vòng 6 dị thể chứa 1 nguyên tử oxi.
17
O O O O HC OH
HC OH
H-CH2
+ CH2 CH
HO CH
COOH C
C COOH
O
O
-H2O
H H
HO OH
Enol O O HC OH
A B OH
H
H CH
OH O H C
O
Chalcon O
Hình 1.6. Quá trình hình thành chalcon [12]
Qua các kết quả nghiên cứu, sơ đồ sinh tổng hợp sau được đề nghị cho
các hợp chất catechin trong lá chè.
3- Deoxi- D-arabino
hepurronic axit -7- Axit Axit Axit shikimic
photphat 5- Hehydroquiric 5- Dehydroshikimic
( Vòng B)
Axit t-cinamic
Axit phenyl Axit phenyl
Chu trình
axetic byruvic
Shikimic
(Tạo vòng B) Axit caffeic
Glucozơ p-Coumaric- CoA Axit gallic
Chu trình Axit
Axit axetic Protocatechic
Axit malonic
(Tạo vòng A)
2,4,4’,6’-
Pentahydroxichalcon (-)-EC (-)-EGC
Malonyl- Chalcon
CoA 2,4,4’,6’-
( Vòng A) (-)-EGC (-)-EGCG
Tetrahydroxichalcon-2- O-
glucozơ
Hình 1.7. Chu trình sinh tổng hợp hình thành các hợp chất catechin [12]
18
1.1.3.4. Biến đổi sinh hóa của nhóm hợp chất catechin
Quá trình biến đổi catechin trong chè đã được nghiên cứu và công bố,
quá trình chuyển hóa này bị chi phối bởi enzym polyphenol oxidase, được xác
định thông qua hiện tượng oxi hóa không cần oxi. Hiện nay enzym
polyphenol oxidase đã được tách ra ở dạng tự do với thành phần cấu trúc
chính là protein chứa nhân ion đồng [12], [59]. Enzym trong lá chè có cấu
trúc riêng, trong quá trình phát triển của lá chè, enzym sẽ chuyển hóa dần các
hợp chất catechin thành các tannin bậc cao (hình 1.8) [115].
OH
OH OH
OH
HO O
HO O OH
OH
OH HO
HO Gallocatechin
Catechin
PPO
O
PPO O O
O
HO O
HO O OH
OR2
OR1 HO
HO Gallocatechin quinon
Catechin quinon PPO
HO
OR1 R1, R2: Hydro/gallate
OH
OH
HO O OH - OOC OH
O OH
HO O ỎH
PPO: Polyphenol oxidase
OR2
HO
Theaflavin
+ catechin, gallocatechin
Thearubigin
Hình 1.8. Quá trình oxi hóa các hợp chất catechin trong chè [69]
Để sản xuất chè xanh, lá chè được vò và đem sấy để triệt tiêu hoạt tính của
các enzym trong lá chè bằng nhiệt hoặc hơi nước ngay khi bắt đầu chế biến nên
không xảy ra hiện tượng oxi hoá, do đó hàm lượng polyphenol hầu như không
thay đổi trong quá trình chế biến, không xảy ra hiện tượng oxi hóa các catechin.
19
Vì vậy nếu thực hiện quy trình tốt, hàm lượng các hợp chất catechin trong sản
phẩm chè xanh tương đương với chè nguyên liệu ban đầu.
1.1.3.5. Tác dụng chống oxi hóa của nhóm catechin
* Quá trình oxi hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxi hóa
Theo các nghiên cứu đã được công bố [70], [79], [97], [100], [108], một số
bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa …có liên hệ rất gần với các quy luật về quá
trình oxi hóa trong tế bào sống. Các quá trình oxi hóa, diễn ra dưới tác dụng của
các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá
trình tổng hợp axit nucleic, protein, hocmon....
Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể
trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay
vi rút. Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như
hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+), đồng hydroxit Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt
tính trung bình và yếu như superoxit anion O2., peroxyl (ROO.), hydrogen
peroxit H2O2, singlet oxi (O.), nitric oxit (NO.), peroxinitrit (ONOO.), ankoxyl
(RO.)….Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm
soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxi hóa nội tại bằng các hợp chất như
glutathion, vitamin E, vitamin C và enzym superoxit dismutat, ngoài ra cơ thể
còn có các tế bào như neutrophil, monoxit, B-cell… có khả năng chống lại các
yếu tố oxi hóa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được
tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên
ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, ozon, bức xạ UV, nhiễm phóng
xạ, do thuốc lá....Các gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để
ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipit không bão hoà của tế
bào, làm giảm khả năng bảo vệ tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân
20
gây bệnh từ bên ngoài, oxi hóa các nucleic bazơ làm thay đổi cấu trúc ADN,
dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu
trúc các protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò rất quan trọng
như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzym trong quá trình hô hấp), gây ra
các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp….
Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên
các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng chống oxi hóa, quét gốc
tự do trong quá trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng
ngăn chặn hoặc chữa bệnh.
* Tính kháng oxi hóa của nhóm hợp chất catechin
Công thức hóa học của các flavonoit với sự có mặt của các hydrogen
phenolic thể hiện khả năng kháng oxi hóa mạnh. Công thức cấu tạo catechin
với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm OH ở catechin, 6 nhóm OH ở
gallocatechin, 8 nhóm OH ở catechin gallate và 9 nhóm OH ở gallocatechin
gallat) đảm bảo khả kháng oxi hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin.
Khi thực hiện khảo sát khả năng kháng gốc tự do trên các gốc tự do tổng
hợp như DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl), các catechin thể hiện hoạt
tính vượt trội so với các chất kháng oxi hóa đối chứng như vitamin C, vitamin
E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn từ 3 đến 6 lần). [42], [51],
[54], [84], [113].
Hoạt tính kháng oxi hóa của nhóm catechin thể hiện một sự khác biệt về
mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất khác họ flavonoit. Khi so sánh
với hợp chất flavonoit có hoạt tính quét gốc tự do mạnh nhất trong môi trường
phân cực quercetin [59], các hợp chất C và EC, do trong công thức thiếu sự
liên hợp giữa vòng A và vòng B, có hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, các
gallat catechin như EGCG và ECG có hoạt tính trội hơn. Sự khác biệt về khả
TẬP ĐOÀN HOÁ CHẤT VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
MAI THANH NGA
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TƯƠNG TÁC OXI HÓA CỦA
POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ CHÈ XANH ĐẾN
POLYANILIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÒN
Chuyên ngành: HOÁ HỮU CƠ
Mã số: 62 44 01 14
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. LÊ XUÂN QUẾ
2. GS.TSKH. MAI TUYÊN
HÀ NỘI - 2013
2
TẬP ĐOÀN HOÁ CHẤT VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
MAI THANH NGA
NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TƯƠNG TÁC OXI HÓA CỦA
POLYPHENOL CHIẾT XUẤT TỪ CHÈ XANH ĐẾN
POLYANILIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CHỐNG ĂN MÒN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC
HÀ NỘI - 2013
3
MỞ ĐẦU
1. Sự cần thiết của đề tài
Do có tính chất kháng oxi hóa mạnh, polyphenol tự nhiên tách từ chè
xanh được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, dược phẩm,
mỹ phẩm… Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và tác
dụng chống oxi hóa của hợp chất polyphenol chiết xuất từ chè xanh. Các kết
quả nghiên cứu cho thấy polyphenol có khả năng chống lại quá trình oxi hóa
[32], thể hiện tác dụng kìm hãm đối với sự phát triển của khối u và làm chậm
giai đoạn phát sinh ung thư ở các mô động vật gây u thực nghiệm [77]. Hơn
nữa polyphenol còn có khả năng chống lại quá trình oxi hóa của lipit lớn hơn
so với các chất chống oxi hóa khác như vitamin C và vitamin E [32]. Các
polyphenol trong chè là chất quét gốc tự do hiệu quả vượt trội hơn so với các
polyphenol chiết xuất từ các loại cây khác như nho, đay....[72].
Có thể nói polyphenol chè xanh có rất nhiều tác dụng sinh học quý giá.
Ngoài ra hợp chất này còn được sử dụng như một chất ức chế ăn mòn thép CT3
trong axit có hiệu quả [28], [114]. Bên cạnh đó màng polyanilin (PANi) có thể
thụ động hóa kim loại, tự vá lại vết xước màng sơn bảo vệ và là lớp phủ bảo vệ
chống ăn mòn thông minh [28], [35]. Với hoạt tính của polyphenol chè xanh, sự
tương tác với PANi có thể tạo ra vật liệu có tính chất mới, bảo vệ tốt hơn. Đây là
nội dung nghiên cứu kết hợp đặc điểm của hai chất khác nhau nhằm hướng tới
một ứng dụng có hiệu quả hơn. Vì vậy chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu quá
trình tương tác oxi hóa của polyphenol chiết xuất từ chè xanh đến polyanilin
và khả năng ứng dụng chống ăn mòn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là khảo sát quá trình tương tác oxi hóa
của các hợp chất polyphenol và cafein phân lập được từ phụ phẩm chè xanh,
4
với điện cực nền polyanilin trong quá trình tổng hơp bằng phương pháp phân
cực điện hóa.
3. Nhiệm vụ của luận án
Chiết, tinh chế các catechin, cafein từ polyphenol chè xanh Thái Nguyên
và chế tạo màng polyme dẫn polyanilin.
Nghiên cứu tương tác oxi hóa của một số chất phân lập được từ
polyphenol chè xanh với polyme dẫn điện polyanilin.
4. Những đóng góp cơ bản của luận án
Công bố công nghệ mới phân tách catechin chè xanh với hiệu suất cao
và thời gian ngắn bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp điều chế bán công
nghiệp sử dụng cột sắc ký phối hợp Diaion HP20 và Sephadex LH20.
Đã sử dụng phương pháp vi phân nâng cao độ nhạy trong quá trình xử lý
số liệu thực nghiệm xác định chính xác các thông động học trên phổ phân cực
tuần hoàn, góp phần đánh giá chính xác hơn bản chất của quá trình tương tác
của các chất với polyanilin ngay ở gia đoạn khơi mào polyme hóa.
Khảo sát và đánh giá được cơ chế và tác động của epigallocatechingallat
đến quá trình tổng hợp màng polyanilin trên điện cực thép không gỉ. Xác định
được động học của các quá trình khơi mào, phát triển mạch và tắt mạch của
polyme hóa anilin, xác định được một số tính chất của lớp phủ polyanilin có
và không có tương tác epigallocatechingallat.
Đánh giá được cơ chế và động học tương tác của epigalocatechin và
epicatechin đến quá trình oxi hóa khử polyanilin.
Đánh giá được mức độ tương tác của cafein, đến quá trình oxi hóa khử
polyanilin và bước đầu đề xuất cơ chế tương tác giữa cafein và màng polyanilin.
5
- Xác định được khả năng ứng dụng nâng cao thời gian bảo vệ chống ăn
mòn của tương tác giữa các chất epigallocatechingallat, epigallocatechin,
cafein với polyanilin, màng phủ polyanilin có tác động của
epigallocatechingallat, epigallocatechin và cafein đều có thời gian bảo vệ lâu
hơn so với màng polyanilin thuần không có tác động của các hợp chất trên.
6
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN
1.1. Polyphenol chè xanh
1.1.1. Cây chè
1.1.1.1. Tên khoa học
Theo PGS. TS Lê Ngọc Công –Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên
thì cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis (L.) O.Kuntze
Cây chè thuộc ngành Hạt kín Angiospermatophyta, lớp Ngọc lan
(hai lá mầm) Magnoliopsida, phân lớp Sổ Dilleniidae, bộ chè Theales,
họ chè Theaceae, chi chè Camellia (Thea). Năm 1753 Carl Von.
Linnaeus nhà thực vật học nổi tiếng người Thụy Điển đã xác định tên
khoa học cây chè là Thea sinensis, được chia thành hai loại: Thea bokea
(chè đen) và Thea viritis (chè xanh) [13],[26].
1.1.1.2. Đặc điểm sinh thái học
Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam (Trung Quốc) sau đó được trồng phổ
biến ở Việt Nam, Nhật Bản, Ấn Độ và nhiều nước châu Á khác [24], [30].
Ở nước ta, chè được trồng chủ yếu ở các tỉnh Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái
Nguyên, Quảng Nam, Lâm Đồng, Đắc Lắc, … với tổng diện tích 125.000 ha, sản
lượng hàng năm khoảng 577.000 tấn [30], [96]. Nước ta sản xuất 15 loại chè thương
phẩm khác nhau, trong đó 60% lượng chè xuất khẩu là chè đen [24], [30], [116].
Cây chè sống thích hợp ở vùng khí hậu gió mùa, nhiệt đới ẩm ướt như
vùng đông nam châu Á . Cây chè sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện:
+ Nhiệt độ trung bình: 15- 250
+ Lượng mưa trung bình: 1500 – 2000 mm.
+ Độ ẩm tương đối của không khí: 80 – 85 %.
7
+ Đất chua: pH = 4.5-6.
+ Tầng đất dày 1m, nhiều mùn, giàu dinh dưỡng N, P, K kết cấu đất tơi
xốp, dốc thoải vừa thoáng vừa giữ được nước, thuộc loại đất thịt.
* Thân và cành: Cây chè sinh trưởng chỉ có một thân chính. Cành chè
do mầm sinh dưỡng phát triển thành, trên cành chia ra nhiều đốt, chiều dài
biến đổi từ 1-10 cm. Đốt chè càng dài là biểu hiện của giống chè có năng suất
cao. Tùy theo chiều cao, độ to nhỏ của thân và cành người ta chia thành 3
loại: Cây bụi, cây gỗ nhỏ và cây gỗ vừa [6],[24].
* Lá: Lá chè mọc cách trên cành, mỗi đốt có một lá, hình dạng và kích
thước thay đổi phụ thuộc vào giống chè. Chiều dài lá khoảng từ 4-15cm, chiều
rộng 2-5cm. Khi còn non mặt dưới lá có các sợi lông tơ màu trắng, các lá già có
màu lục sẫm. Lá chè có gân rất rõ, rìa lá có răng cưa. Lá chè có màu xanh đến
vàng, thay đổi tùy theo giống, thời gian trồng, chế độ dinh dưỡng và mùa vụ. Lá
có nhiều hình dạng và kích thước khác nhau: hình thuôn, mũi mác, ô van...
Chồi mọc ra từ nách lá, có hai loại chồi: Chồi dinh dưỡng về sau mọc lá
gồm có tôm (phần lá non trên đỉnh chưa xòe) và 2 hoặc 3 lá non. Lá chè già
(chè xanh) được tính từ lá thứ 4 trở đi (gồm các lá bánh tẻ và lá già). Chồi về
sau mọc ra nụ, hoa và quả [6], [24].
* Hoa, quả, hạt: Hoa chè hình thành trên cây 2-3 tuổi, màu trắng. Hoa
chè lưỡng tính. Quả hình tròn, tam giác hoặc vuông tùy theo số lượng hạt bên
trong. Vỏ quả màu xanh khi chín chuyển sang màu nâu và bị nứt ra. Hạt chè
màu nâu hoặc màu đen, hình cầu, bán cầu hay tam giác [6], [24].
* Rễ: Hệ thống rễ gồm rễ cọc ( rễ trụ), rễ dẫn ( rễ nhánh, rễ bên) và rễ
hút. Rễ nhánh dài trên 1mm có màu nâu hay nâu đỏ. Rễ hút hay còn gọi là rễ
hấp thụ có chiều dài dưới 1m, có màu vàng ngà [6], [13], [24].
8
Chè là cây lâu năm, có chu kỳ sống rất dài có thể đạt 60-100 năm hoặc lâu
hơn. Tuổi thọ tối đa của một cây chè thương mại vào khoảng 50-65 năm tùy thuộc
điều kiện môi trường và phương pháp trồng trọt. Chè cho năng suất cao vào mùa
mưa từ tháng 5-11, sau 10-15 ngày thì thu hoạch một lần. hiện nay chè được sử
dụng trong cộng nghiệp chế biến chủ yếu là chè búp (1 tôm và 2-3 lá non).
Hình 1.1: Hình ảnh cây chè
1.1.2. Thành phần hóa học của lá chè
1.1.2.1. Phân loại nhóm hợp chất trong chè
Chè là một loại thức uống truyền thống đã có lịch sử hàng ngàn năm.
Quá trình nghiên cứu về chè trên thế giới đã được thực hiện từ rất lâu. Cũng
như các loại thực vật bậc cao khác, trong chè xanh có nhiều loại hợp chất tự
nhiên, được chia thành hai nhóm lớn [13]:
- Nhóm chất trao đổi bậc 1: Là những chất tham gia vào quá trình trao đổi
chất và quá trình sinh trưởng của cây, như hydratcacbon, lipit và axit amin…là
thành phần không thể thiếu trong quá trình sinh trưởng của thực vật.
- Nhóm chất trao đổi bậc 2: Là những chất không phải để nuôi sống và
phát triển cây cỏ, có thể có mặt ở loại cây này nhưng hoàn toàn không có ở
cây khác, là những hợp chất có hoạt tính sinh học cao.
9
Đối với cây chè, lá chè là bộ phận có giá trị nhất, nên cũng được các nhà
khoa học quan tâm nghiên cứu. Có thể nói hiện nay thành phần hóa học của lá
chè đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ.
Bảng 1.1. Thành phần hóa học chủ yếu của lá chè [12],[13]
Thành phần Hàm lượng (%) khối lượng chất khô
Catechin 25 - 30
(-)- Epigallocatechingallate 8-12
(-)- Epicatechingallate 3-6
(-)- Epigallocatechin 3-6
(-)- Epicatechin 1-3
(+)- Catechin 1 -2
(+)- Gallocatechin 3 -4
Flavonol và flavonol glucozơ 3 -4
Axit polyphenolic and depside 2 -3
Diệp lục và các chất màu khác 0.5 - 0.6
Cafein 3 -4
Amino axit 4-5
Monosaccarit 4-5
Polysacccarit 14-22
Xenlulozơ và hemi xenlulozơ 4-7
Pectin 5-6
Lignin 5-6
Protein 14-17
Lipit 3-5
Các hợp chất dễ bay hơi 0,01 - 0,02
1.1.2.2. Một số nhóm hợp chất trong chè
* Ankaloit: Việc nghiên cứu ankaloit trong chè được bắt đầu vào năm
1827 (Bradfield, 1946), hợp chất trong nhóm ankaloit được quan tâm nghiên
cứu nhiều nhất là cafein nó chiếm khoảng 2-5 % về trọng lượng mẫu khô, lá
chè tươi chứa nhiều cafein có thể là một nhân tố quan trọng tạo nên chất lượng
10
của chè xanh (Bhatia, 1964) [12], [13], [29]. Hàm lượng này ít biến đổi trong
quá trình phát triển của lá chè. Điều đáng chú ý là hàm lượng cafein trong lá
chè cao hơn hàm lượng cafein tương ứng trong hạt cà phê (chiếm khoảng 1,5%
trọng lượng khô). Ngoài cafein, trong lá chè còn có các dẫn xuất khác của
metylxanthin như theobromin, theanin với hàm lượng thấp hơn (<0.1%).
O CH3 O CH3
NH2
H3C N H N N
N N COOH
O
O N N O N N
CH3 CH3
Cafein Theobromin Theanin
Hình 1.2. Cấu trúc của một số ankaloit có trong thành phần lá chè
* Vitamin
Lá chè tươi có nhiều loại vitamin như nhóm vitamin tan trong dầu bao
gồm: vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin F… và nhóm vitamin tan
trong nước: vitamin B, vitamin PP, vitamin C…. Trong đó vitamin C chiếm
hàm lượng cao nhất, có thể đạt đến 280mg/100g (Bảng 1.2).
Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin C trong lá chè [12]
Bộ phận Búp chè Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ 3 Lá già
mg/kg
7,03 9,99 10,44 7,88 4,83
chất khô
* Cacbonhydrat
Nhóm cacbonhydrat có mặt trong lá chè bao gồm hợp chất xenlulozơ,
hemi-xenlulozơ và đường tự do. Các gốc đường tự do có mặt trong lá chè bao
gồm glucozơ, fructozơ... Các polysaccarit bao gồm có galactozơ, arabinozơ,
axit galacturonic, ribozơ... Các đường tự do là nguồn nguyên liệu chính để
tổng hợp catechin trong lá chè. Những nghiên cứu sử dụng glucozơ đánh dấu
11
bằng nguyên tử 14C (đồng vị 12C) đã chỉ ra rằng glucozơ là một trong những
tiền chất của polyphenol và axit amin (ngoại trừ theanin) có trong thành phần
của lá chè [6], [12].
* Các nhóm hợp chất khác
Enzym: Trong búp chè có hầu hết các loại enzym nhưng chủ yếu gồm 2
nhóm: nhóm enzym thủy phân gồm amilaza, glucozidaza, proteaza…; nhóm
enzym oxi hóa khử gồm catalaza, polyphenol oxidaza và peroxidaza…Trong
số các enzym có trong lá chè, enzym polyphenol oxidaza có vai trò quan trọng
trong quá trình oxi hóa nhóm catechin của chè [6], [12].
Protein và axit amin: Hàm lượng protein phân bố không đều ở các thành
phần của búp chè và thay đổi theo giống cũng như điều kiện canh tác và các
yếu tố khác. Protein chiếm hàm lượng khoảng 15% khối lượng chất khô.
Ngày nay người ta tìm thấy trong chè 17 axit amin. Các axit amin cùng với
đường và tanin tạo thành ankaloit. Ankaloit chính là hợp chất tạo nên vị thơm
rất đặc biệt của chè [6].
Chất béo và các axit béo tự do: Các hợp chất lipit, photpholipit và các
axit béo chiếm khoảng 5-6 % khối lượng khô, hàm lượng này biến đổi khá
nhiều tuỳ theo từng giống chè. Các axit béo tự do tìm thấy trong lá chè như
linolenic, linoleic, oleic và panmitic…[6].
Carotenoit: Người ta đã tìm thấy β-caroten, lutein, violaxanthin và
neoxanthin trong lá chè.
Axit hữu cơ: Các axit như citric, tactaric, malic, oxalic, fumaric, cafeic,
quinic, gallic, sucxinic, chlorogenic, neo-chlorogenic, p-coumarylquinic,
ellagic… đã được nhận diện trong lá chè tươi [12].
12
Kim loại: Các chất vô cơ chiếm khoảng 5-6% khối lượng khô, trong đó
chất chiếm hàm lượng nhiều nhất là nhôm, mangan, magie…. Hàm lượng các
chất vô cơ trong lá chè cũng biến đổi nhiều tuỳ theo thổ nhưỡng vùng đất.
Một điều đáng lưu ý là một phần các kim loại, đặc biệt là nhôm, tìm thấy
trong chè dưới dạng phức chelat với các catechin [12].
Các chất dễ bay hơi (tinh dầu chè): Thành phần tinh dầu chè chiếm tỉ lệ
rất thấp trong tổng khối lượng của lá chè (<0.01%). Các thành phần đã được
nhận diện trong tinh dầu chè bao gồm linalol, delta-cardinene, geraniol,
nerolidol, anpha-terpinol, cis-jasmone, indol, betaionon, 1-octanal, indol-3-
cacbinol, beta-caryophyllen [12], [24].
1.1.3. Nhóm hợp chất polyphenol trong chè
1.1.3.1. Giới thiệu về polyphenol
Polyphenol là thành phần chính có trong chè và một số loại thực vật
khác, việc sử dụng polyphenol như một loại hóa chất dùng để chống lại sâu
bọ, côn trùng, chim và các loại động vật. Chè xanh không có các enzym oxi
hoá các polyphenol, nên trong quá trình chế biến (sấy, và lấy hương) không làm
thay đổi các polyphenol trong chè.
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất
trong lá chè. Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất
polyphenol được tìm thấy trong các loài thực vật khác. Trong đó thành phần
chủ yếu là các catechin chiếm hơn 25-30% trọng lượng mẫu khô bao gồm (C,
EC, EGCG, EGC, ECG…) [12], [98].
Ngoài ra trong thành phần polyphenol của chè còn có một số chất khác
với tỉ lệ thấp như các flavonol (quecetin, kaempferol, rutin…), các dẫn xuất
glucozơ như myricetin-3-glucozơ, kaempferol-3-glucozơ, myricetin-3-
rhamnoglucozơ, quercetin-3-rhamnoglucozơ, kaempferol-rhamnodiglucozơ...
13
các leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoit như theaflavin (theaflavin-
3-gallat, theaflavin-3’-gallat, theaflavin-3,3’-digallat), thearubigin
(procyanidin, procyanidin gallat). Các dạng hợp chất như theaflavin,
thearubigin chiếm tỉ lệ rất thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ
lệ trong các lá chè già hơn [6], [12].
1.1.3.2. Tính chất lý hoá của catechin
Nhóm hợp chất catechin trong chè đã được quan tâm nghiên cứu từ rất lâu,
các dữ liệu về tính chất hóa học, phổ IR, NMR, MS, kết quả phân tích bằng các
phương pháp khác đã được công bố. Catechin của chè thuộc họ flavonoit, nhóm
flavan-3-ol, phân tử có 15 cacbon bao gồm hai vòng 6 cacbon A và B được nối
bởi 3 đơn vị cacbon ở vị trí 2, 3, 4, hình thành một dị vòng C chứa một nguyên tử
oxi (hình 1.3). Cấu trúc của catechin có chứa hai cacbon bất đối ở vị trí 2 và 3,
không chứa nối đôi ở vị trí 2,3 và nhóm 4- oxo [12] [28].
Hình 1.3. Khung cơ bản của hợp chất catechin [12]
Trong thành phần của chè có 6 loại hợp chất catechin chính và một số
lượng nhỏ các dẫn xuất catechin (hình 1.4). Các catechin được chia thành 2
nhóm: nhóm catechin tự do bao gồm C, GC, EC, EGC (vị trí cacbon số 3 có
chứa nhóm thế hydroxyl) và nhóm đã bị este hóa hay nhóm galloyl catechin:
ECG, EGCG (nhóm hydroxyl ở vị trí cacbon số 3 được thay bằng một nhóm
gallat).
14
OH OH
H OH H OH
HO O HO O
OH
HO HO OH
H H
(+) - Catechin C15H14O6 (-) - Epicatechin C15H14O6,
M = 290, t0nc=176oC, [α]D=+18o M = 290, t0nc = 242oC, [α]D = -69o
OH OH
H OH H OH
HO O HO O OH
OH
HO O OC OH HO OH
H H
OH
(-)- Epicatechin gallate, C22H14O10 (+) - Gallocatechin, C15H14O7
M = 442, t0nc =253oC, [α]D=-177o M = 306, t0nc = 188oC, [α]D = +15o
OH OH
H OH H OH
HO O OH HO O OH
OH
HO OH HO O OC OH
H H
OH
(-)-Epigallocatechin C15H14O7, (-)-Epigallocatechingallate C22H18O11
M = 306, t0nc = 276oC, [α]D = -50o M = 458, t0nc = 216oC, [α]D = -179o
Hình 1.4. Các hợp chất catechin chính trong chè [15],[26], [58]
(t0nc: Nhiệt độ nóng chảy, M: Khối lượng phân tử, [α]D: góc quay cực)
Các hợp chất catechin chính trong lá chè (hình 1.4) đã được tách ra từng
chất ở dạng tinh khiết, ở thể rắn chúng là những chất kết tinh không màu hình
kim hoặc hình lăng trụ, có vị chát dịu hoặc hơi đắng, tác dụng với FeCl3 cho
kết tủa xanh thẫm hoặc xanh nhạt tuỳ theo số lượng nhóm hydroxyl trong
phân tử. Các catechin đều dễ tan trong nước nóng, rượu, axeton, etylaxetat tạo
15
thành dung dịch không màu, không tan trong các dung môi không phân cực
hoặc ít phân cực như benzen hoặc clorofom.
Hàm lượng catechin trong búp chè cao nhất đạt khoảng 25-30% trọng
lượng khô. Trong số các hợp chất catechin có mặt trong lá chè, epigallocatechin
gallat (EGCG) là chất có hàm lượng lớn nhất (~ 9%) [83], đồng thời cũng là chất
có khả năng chống oxi hóa, kháng viêm và chống ung thư cao nhất [45]. Tiếp
theo là EGC và ECG (chiếm khoảng 10-20% tổng catechin). Các hợp chất
catechin (C, EC, GC) còn lại có hàm lượng thấp và không phải là thành phần đặc
trưng của chè do còn được tìm thấy trong ca cao, nho, táo, hành…
Hàm lượng của các catechin trong lá chè luôn luôn thay đổi, phụ thuộc
vào giống chè, thời kỳ sinh trưởng, bộ phận cây chè, vị trí các lá trên búp chè
và các yếu tố khác về thổ nhưỡng, khí hậu, cách chăm bón…. Trong quá trình
phát triển của lá chè, dưới tác dụng của các enzym, các catechin bị chuyển
dần thành các hợp chất tannin và giảm dần hàm lượng trong lá trưởng thành
[12], [13], [38], [59].
Bảng 1.3. Hàm lượng catechin trong từng bộ phận của chè [12]
Catechin Lá thứ 1 Lá thứ 2 Lá thứ ba Lá già Cọng búp
GC 32.15 31.04 28.34 25.36 68.9
EC 45.52 47.84 45.13 45.24 65.45
ECG 138.52 132.27 103.08 103.09 87.98
EGC 122.10 152.27 206.42 232.36 222.08
EGCG 580.57 577.93 435.78 432.04 293.45
Tổng 918.86 941.35 818.75 838.09 737.86
Đơn vị: mg/g chế phẩm chiết bằng etylaxetat.
16
1.1.3.3. Sinh tổng hợp catechin trong lá chè
Hiện nay, cơ chế về quá trình sinh tổng hợp các catechin trong lá chè
vẫn chưa được giải thích một cách đầy đủ do thành phần tương đối đặc biệt
của các catechin trong lá chè. Xét theo khung cơ bản gồm 3 vòng A, B, C
(hình 1.3, 1.4), cấu trúc của họ flavonoit được chia làm 2 phần [6], [12]:
- Phần C6-C3 (Vòng B+3C), xuất phát theo chu trình axit shikimic dẫn đến
dẫn chất phenylpropan.
COOH COOH COOH
O P
ATP
+
H2C=C-COOH P O
HO OH P O OH O
OH Axit photpho enol pyruvic OH
OH C =CH2
Axit shikimic 5-photphoshikimic 3-enol pyruvyl shikimat-5- photphat
COOH
+H2O +H3PO4
CH=CH-COOH CH2-CH-COOH HOOC CH2COCOOH
HC OH + NH3
NH
CH - NH3 -CO2
HO
C
OH OH OH
O Axit paracoumaric Tyrosin
Hình 1.5. Chu trình sinh tổng hợp tạo thành phenylpropan
- Phần C6 (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị axetat dẫn đến axit triaxetic
CH3-COOH + HCH2-COOH CH3-CO-CH2-COOH + H2O
Axit axetoaxetic
CH3-CO-CH2-COOH +HCH2-COOH CH3-CO-CH2-CO-CH2-COOH + H2O
Axit triaxetic
Hai phần này đóng vòng ghép lại thành mạch chính chalcon. Từ chalcon
hình thành nhiều dẫn xuất khác nhau của họ flavonoit.
Trong trường hợp chalcon và các dẫn xuất của chalcon, mạch 3C
không đóng vòng. Còn phần lớn các trường hợp khác mạch 3C đóng vòng với
vòng A tạo thành vòng 6 dị thể chứa 1 nguyên tử oxi.
17
O O O O HC OH
HC OH
H-CH2
+ CH2 CH
HO CH
COOH C
C COOH
O
O
-H2O
H H
HO OH
Enol O O HC OH
A B OH
H
H CH
OH O H C
O
Chalcon O
Hình 1.6. Quá trình hình thành chalcon [12]
Qua các kết quả nghiên cứu, sơ đồ sinh tổng hợp sau được đề nghị cho
các hợp chất catechin trong lá chè.
3- Deoxi- D-arabino
hepurronic axit -7- Axit Axit Axit shikimic
photphat 5- Hehydroquiric 5- Dehydroshikimic
( Vòng B)
Axit t-cinamic
Axit phenyl Axit phenyl
Chu trình
axetic byruvic
Shikimic
(Tạo vòng B) Axit caffeic
Glucozơ p-Coumaric- CoA Axit gallic
Chu trình Axit
Axit axetic Protocatechic
Axit malonic
(Tạo vòng A)
2,4,4’,6’-
Pentahydroxichalcon (-)-EC (-)-EGC
Malonyl- Chalcon
CoA 2,4,4’,6’-
( Vòng A) (-)-EGC (-)-EGCG
Tetrahydroxichalcon-2- O-
glucozơ
Hình 1.7. Chu trình sinh tổng hợp hình thành các hợp chất catechin [12]
18
1.1.3.4. Biến đổi sinh hóa của nhóm hợp chất catechin
Quá trình biến đổi catechin trong chè đã được nghiên cứu và công bố,
quá trình chuyển hóa này bị chi phối bởi enzym polyphenol oxidase, được xác
định thông qua hiện tượng oxi hóa không cần oxi. Hiện nay enzym
polyphenol oxidase đã được tách ra ở dạng tự do với thành phần cấu trúc
chính là protein chứa nhân ion đồng [12], [59]. Enzym trong lá chè có cấu
trúc riêng, trong quá trình phát triển của lá chè, enzym sẽ chuyển hóa dần các
hợp chất catechin thành các tannin bậc cao (hình 1.8) [115].
OH
OH OH
OH
HO O
HO O OH
OH
OH HO
HO Gallocatechin
Catechin
PPO
O
PPO O O
O
HO O
HO O OH
OR2
OR1 HO
HO Gallocatechin quinon
Catechin quinon PPO
HO
OR1 R1, R2: Hydro/gallate
OH
OH
HO O OH - OOC OH
O OH
HO O ỎH
PPO: Polyphenol oxidase
OR2
HO
Theaflavin
+ catechin, gallocatechin
Thearubigin
Hình 1.8. Quá trình oxi hóa các hợp chất catechin trong chè [69]
Để sản xuất chè xanh, lá chè được vò và đem sấy để triệt tiêu hoạt tính của
các enzym trong lá chè bằng nhiệt hoặc hơi nước ngay khi bắt đầu chế biến nên
không xảy ra hiện tượng oxi hoá, do đó hàm lượng polyphenol hầu như không
thay đổi trong quá trình chế biến, không xảy ra hiện tượng oxi hóa các catechin.
19
Vì vậy nếu thực hiện quy trình tốt, hàm lượng các hợp chất catechin trong sản
phẩm chè xanh tương đương với chè nguyên liệu ban đầu.
1.1.3.5. Tác dụng chống oxi hóa của nhóm catechin
* Quá trình oxi hóa và nguyên nhân gây bệnh do mất cân bằng oxi hóa
Theo các nghiên cứu đã được công bố [70], [79], [97], [100], [108], một số
bệnh như ung thư, tim mạch, lão hóa …có liên hệ rất gần với các quy luật về quá
trình oxi hóa trong tế bào sống. Các quá trình oxi hóa, diễn ra dưới tác dụng của
các gốc tự do, trong tế bào là cần thiết để tạo ra năng lượng hoặc trong các quá
trình tổng hợp axit nucleic, protein, hocmon....
Gốc tự do là những hợp chất hoạt động mạnh, được tạo ra trong cơ thể
trong quá trình trao đổi chất hay được đưa vào từ bên ngoài do vi sinh vật hay
vi rút. Các gốc tự do được tạo thành gồm các gốc có hoạt tính cao như
hydroxyl (OH), ion sắt (Fe2+), đồng hydroxit Cu(OH)2, những gốc tự do hoạt
tính trung bình và yếu như superoxit anion O2., peroxyl (ROO.), hydrogen
peroxit H2O2, singlet oxi (O.), nitric oxit (NO.), peroxinitrit (ONOO.), ankoxyl
(RO.)….Gốc tự do trong tế bào sinh ra trong quá trình sinh dưỡng được kiểm
soát chặt chẽ thông qua quá trình kháng oxi hóa nội tại bằng các hợp chất như
glutathion, vitamin E, vitamin C và enzym superoxit dismutat, ngoài ra cơ thể
còn có các tế bào như neutrophil, monoxit, B-cell… có khả năng chống lại các
yếu tố oxi hóa ngoại lai xâm nhập.
Tuy nhiên, trong tế bào có thể xuất hiện hiện tượng các gốc tự do được
tạo ra quá nhiều do mất cân bằng trong hoạt động hoặc do các yếu tố bên
ngoài như các chất độc, do nhiễm vi sinh vật, ozon, bức xạ UV, nhiễm phóng
xạ, do thuốc lá....Các gốc tự do dư thừa, khi cơ thể thiếu các yếu tố bảo vệ để
ngăn chặn, có khả năng tương tác, phá hủy màng lipit không bão hoà của tế
bào, làm giảm khả năng bảo vệ tế bào, dẫn đến sự xâm nhập của các tác nhân
20
gây bệnh từ bên ngoài, oxi hóa các nucleic bazơ làm thay đổi cấu trúc ADN,
dẫn đến các quá trình đột biến, phát sinh các khối u, ung thư, làm hỏng cấu
trúc các protein mang nhóm SH (các protein này đóng vai trò rất quan trọng
như là chất mang hoặc chất hoạt hóa enzym trong quá trình hô hấp), gây ra
các bệnh nghiêm trọng về đường hô hấp….
Các gốc tự do dư thừa là nguồn gốc phát sinh các bệnh nguy hiểm nên
các nghiên cứu đều hướng tới việc khảo sát khả năng chống oxi hóa, quét gốc
tự do trong quá trình tìm kiếm các hợp chất trong thiên nhiên có khả năng
ngăn chặn hoặc chữa bệnh.
* Tính kháng oxi hóa của nhóm hợp chất catechin
Công thức hóa học của các flavonoit với sự có mặt của các hydrogen
phenolic thể hiện khả năng kháng oxi hóa mạnh. Công thức cấu tạo catechin
với nhiều nhóm hydroxyl (5 nhóm OH ở catechin, 6 nhóm OH ở
gallocatechin, 8 nhóm OH ở catechin gallate và 9 nhóm OH ở gallocatechin
gallat) đảm bảo khả kháng oxi hóa rất mạnh của nhóm hợp chất catechin.
Khi thực hiện khảo sát khả năng kháng gốc tự do trên các gốc tự do tổng
hợp như DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhidrazyl), các catechin thể hiện hoạt
tính vượt trội so với các chất kháng oxi hóa đối chứng như vitamin C, vitamin
E, trolox (các catechin thể hiện hoạt tính mạnh hơn từ 3 đến 6 lần). [42], [51],
[54], [84], [113].
Hoạt tính kháng oxi hóa của nhóm catechin thể hiện một sự khác biệt về
mối tương quan cấu trúc so với các hợp chất khác họ flavonoit. Khi so sánh
với hợp chất flavonoit có hoạt tính quét gốc tự do mạnh nhất trong môi trường
phân cực quercetin [59], các hợp chất C và EC, do trong công thức thiếu sự
liên hợp giữa vòng A và vòng B, có hoạt tính quét gốc tự do kém hơn, các
gallat catechin như EGCG và ECG có hoạt tính trội hơn. Sự khác biệt về khả