Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn mycobacterium tuberculosis tại thành phố cần thơ
- 186 trang
- file .pdf
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Trần Nhân Dũng và
PGS.TS. Trần Ngọc Dung, hai ngƣời đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận tình,
động viên giúp đỡ, cung cấp tài liệu, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện thuận
lợi và tốt nhất để tôi hoàn thành quyển luận án này.
Tôi muốn gửi lời cám ơn đến Bác sĩ chuyên khoa I Nguyễn Thị Thanh
Nhàn, Giám đốc Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành phố Cần Thơ, Bác sĩ
Nguyễn Ngọc Thủy, phó trƣởng phòng xét nghiệm, các Bác sĩ phòng khám, các
Anh chị em nhân viên y tế của Bệnh viện lao và bệnh phổi Cần Thơ, nhân viên y
tế của các Trung tâm phòng chống lao Quận Ninh Kiều, Cái Răng, Phong Điền đã
giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi đƣợc tiếp xúc với bệnh nhân, từ đó, tôi có cơ hội
chọn đƣợc các mẫu đạt tiêu chuẩn cho mục tiêu nghiên cứu của luận án.
Về phía Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ, tôi vô cùng biết ơn lãnh đạo nhà
trƣờng, đặc biêt, tôi vô cùng biết ơn GS.TS. Phạm Văn Lình đã cho phép, ủng hộ,
tạo cơ hội tốt nhất trong thời gian vừa qua để tôi có điều kiện học tập, nghiên cứu
và hoàn thành luận án nghiên cứu sinh này.
Tôi sẽ không bao giờ quên tập thể Bộ môn Sinh Lý Bệnh-Miễn dịch, Khoa
Y, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ, nơi đã động viên, chia sẽ, khích lệ, an ủi tôi
trong suốt quá trình 4 năm học tập, nghiên cứu, giúp đỡ để tôi có thể vừa hoàn
thành công tác, vừa hoàn thành nhiệm vụ học tập, nghiên cứu và hoàn thành
quyển luận án này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến Ths. Đỗ Tấn Khang và Em Trần Văn Bé
Năm của phòng Sinh học phân tử, thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công
nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tích cực hổ trợ, không ngại khó khăn
cùng với tôi thực hiện các kỹ thuật PCR, gửi sản phẩm PCR giải trình tự, nhằm
giúp tôi hoàn tất mục tiêu phát hiện các đột biến gen của những chủng vi khuẩn
lao trên các bệnh nhân tại Thành phố Cần Thơ.
Xin cám ơn các cán bộ của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp
đỡ tôi thực hiện xét nghiệm xác định các tế bào miễn dịch bằng kỹ thuật đếm
dòng chảy tế bào tại viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các cán bộ của phòng Thí nghiệm chuyên sâu đã
nhiệt tình giúp đỡ khi tôi thực hiện kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, chụp ảnh
vi khuẩn lao dƣới kính hiển vi điện tử.
i
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã yêu thƣơng, thông cảm, chia sẽ,
an ủi, khích lệ tôi trong những lúc khó khăn khi thực hiện đề tài, giúp tôi có thêm
động lực để hoàn tất quá trình học tập và thực hiện luận án nghiên cứu sinh . Đây
chính là niềm vui, là phần thƣởng vô giá cho bản thân tôi.
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn
Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ“ đƣợc thực hiện tại phòng xét
nghiệm Sinh học phân tử, khoa Y - Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ; phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học,
phòng Thí nghiệm chuyên sâu, Trƣờng Đại học Cần Thơ; phòng Xét nghiệm vi sinh
thuộc bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ; Viện Pasteur thành phố Hồ
Chí Minh, trong thời gian từ tháng 6.2010 đến tháng 1.2014.
Đề tài đƣợc thực hiện với các mục tiêu (i) Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở
bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, (ii) Tìm hiểu một số yếu tố ảnh
hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao gồm: (iia) Xác định các kiểu gen
đột biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao, (iib) Xác định nồng độ thuốc
rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân lao phổi tái trị (iic) Xác định số
lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc.
Việc xác định tỷ lệ kháng thuốc đƣợc thực hiện với 246 bệnh nhân mắc lao
phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ có mẫu đàm đƣợc thu thập, đem nhuộm bằng
phƣơng pháp Ziehl-Neelsen, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng Lowenstein-
Jensen, thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ trên môi trƣờng đặc theo phƣơng pháp
tỷ lệ. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng thuốc chung là 63,8%, trong đó, tỷ
lệ đa kháng thuốc là 23,2%, tỷ lệ kháng đơn thuốc lần lƣợt với streptomycin:
52,4%; isoniazid: 47,2%; rifampicin: 25,2%; ethambutol: 11,8% và kháng
pyrazinamid: 9,8%; tỷ lệ kháng kết hợp thuốc gồm kháng với 1 loại thuốc là
21,5%; kháng 2 loại thuốc là 17,1%; kháng 3 loại thuốc là 13,1%; kháng 4 loại
thuốc là 8,5%; kháng cả 5 loại thuốc là 3,3%.
Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin đƣợc tiến hành trên 42 chủng
vi khuẩn đã đƣợc nuôi cấy từ các mẫu đàm của 40 bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc và 2 bệnh nhân mắc lao phổi còn nhạy trong số 246 bệnh nhân mắc lao
phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, ADN đƣợc ly trích để làm khuôn cho phản ứng
PCR nhằm khuếch đại đoạn gen rpoB với chiều dài 411bp chứa đoạn gen 81bp là
vùng có trình tự xác định kháng rifampicin (RRDR: rifampicin resistance
determining region), đoạn gen đƣợc giải trình tự và so sánh với chủng hoang dại
từ dữ liệu trên ngân hàng gen, việc so sánh đƣợc thực hiện tại vị trí từ codon 507
đến 534, kết quả cho thấy có 30/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu xảy ra đột biến
thay thế base chiếm 75% và 10/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu không tìm thấy đột
biến gen trên vùng 81bp của gen rpoB, chiếm tỷ lệ 25% .
Nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân đƣợc đo bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả khảo sát cho thấy có 92,4% số
iii
bệnh nhân ở nhóm lao phổi tái trị và 90% của nhóm lao phổi mới có nồng độ
thuốc rifampicin huyết tƣơng rất thấp <8 µg/ml (so với nồng độ điều trị chuẩn
phải đạt từ 8-24µg/ml theo khuyến cáo).
Số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào thông qua các dấu
ấn kháng nguyên đặc hiệu tế bào, từng loại dấu ấn đƣợc phát hiện bằng các kháng
thể đơn dòng có đánh dấu chất huỳnh quang. Kết quả cho thấy có sự giảm một
cách có ý nghĩa (p<0,05) số lƣợng các tế bào lympho T chung, lympho T giúp đỡ,
lympho T gây độc và tế bào diệt tự nhiên ở nhóm bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc. Trong khi đó, số lƣợng monocyte trong công thức bạch cầu ở nhóm lao
phổi đa kháng thuốc lại tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm lao mới và
nhóm ngƣời bình thƣờng với p<0,05.
Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy: kiểu đột biến gen của vi khuẩn
lao, nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng và số lƣợng các tế bào miễn dịch
trong máu bệnh nhân, có thể là các yếu tố ảnh hƣởng đến việc kháng thuốc của vi
khuẩn lao.
Từ khóa: bệnh lao phổi, lao phổi đa kháng thuốc, lao phổi tái điều trị,
rifampicin, sắc ký lỏng hiệu năng cao, tế bào miễn dịch.
iv
ABSTRACT
The study entitled “Some factors affecting drug resistance of the
Mycobacterrium tuberculosis in the Can Tho city”. This study was carried out at
(1) The Molecular Biology Laboratory - Faculty of Medicine – Can Tho
University of Medicine and Pharmacy (CTUMP), (2) The Biotechnology
Research and Development Institute of Can Tho University (CTU), (3) the
Advanced Laboratory of CTU; (4) The Microbiology laboratory of the Can Tho
Tuberculosis and Pulmonary Disease Hospital (CTPDH); and at (5) The Pasteur
Institute of Ho Chi Minh City. Duration of the study was from June 2010 to
January 2014.
The objectives of the study were to (i) Determine the percentage of
retreated pulmonary tuberculosis patients who resists to drug; (ii) understand
factors affecting drug resistance of the Mycobacterrium tuberculosis. The
objective (ii) consists of: (1) Determine the mutated genotype of rifampicin-
resistant Mycobacterrium tuberculosis strains isolated from patients who live in
the Can Tho city; (2) Investigate concentration of rifampicin drug in plasma of
retreated pulmonary tuberculosis patients and (3) Determine the immunocytes in
blood of patients who got multi-drug resistant tuberculosis.
Percentage of patients who resisted to drug at the CTPDH was determined
from 246 retreated tuberculosis patients. Sputum samples were collected and
dyed by Ziehl-Neelsen method. Drug susceptibility testing was performed on
Lowenstein-Jensen medium according to the proportion method. Results showed
that prevalence of any anti-tuberculosis drug resistance was 63.8%; multidrug-
resistant tuberculosis was 23.2%, monoresistance drug in which streptomycin was
52.4%; isoniazid was 47.2%; rifampicin was 25.2%; ethambutol was 11.8%;
pyrazinamid was 9.8%. Patients who resisted with one, two or more type of
drugs: 21.5% found with one type of drug, two types of drug were 17.1%; three
types of drug were 13.1%; four types of drug were 8.5% and five types of drug
were 3.3%.
Determination of mutated genotypes was carried out on 42 strains of
Mycobacterium tuberculosis in which 40 patients were multidrug-resistant
tuberculosis and 2 patients were still sensitive with drug and positive with
tuberculosis. DNA was extracted and used as template to amplify the rpoB gen by
PCR method. The rpoB gen length (411bp) in which contains 81bp fragment (a
rifampicin resistance determining region). The DNA were sequenced and
compared with DNA from the gene bank. This activity was aimed to find
v
mutation from the codon 507 to 534. The results showed that there were 30 over
40 strains showing base substitutions mutation (75%) and in 10 over 40 strains
(25%) showed phenotypically rifampicin-resistance, but no nucleotide changes
were detected at the rpoB gene.
The concentration of rifampicin in plasma of retreated pulmonary
tuberculosis patients was determined by high performance liquid chromatography
(HPLC). The results showed that 92.4% of retreated pulmonary tuberculosis and
90% of new pulmonary tuberculosis having low concentration of rifampicin in
plasma (<8 µg/ml), while recommended concentration of drugs should be
between 8 to 24µg/ml in plasma.
The immunocytes in blood of multidrug-resistant tuberculosis patients were
investigated. The Flow cytometry method was used to determine the number of
immunocytes by antigen markers in leucocytes and these antigen combine with
the monoclonal antibody was recognized with fluorescence method. The results
showed that the number of T lymphocyte, helper T cells, cytotoxic T cells and
natural killer cells signicficantly decreased (p<0,05) in multidrug-resistant
tuberculosis (MDR-TB) patients, while number of monocytes in multidrug-
resistant tuberculosis patients significantly increased (p<0.05) in comparision
with new pulmonary tuberculosis and the healthy people.
Results from this study showed: mutated genotype of the Mycobacterrium
tuberculosis, drug concentration in plasma and number of immunocytes in blood
of patients indicating the factors that affect to drug resistance.
Keywords: high performance liquid chromatography, immunocytes, multidrug-
resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, retreated pulmonary tuberculosis,
rifampicin,
vi
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên
cứu của tôi. Các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án
cùng cấp nào khác.
vii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ..................................................................................................................... I
TÓM TẮT ........................................................................................................................ III
ABSTRACT ...................................................................................................................... V
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ..................................................................................... VII
MỤC LỤC ..................................................................................................................... VIII
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................... X
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... XI
DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................................... XII
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU ................................................................................................ 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1
1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án .................................... 2
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án ........................... 4
1.4 Kết cấu của luận án .................................................................................................. 5
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................ 6
2.1 Sơ lƣợc về lịch sử phát hiện bệnh lao ...................................................................... 6
2.2 Vi khuẩn lao ............................................................................................................. 7
2.2.1 Phân loại vi khuẩn lao ....................................................................................... 7
2.2.2 Cấu tạo của vi khuẩn lao ................................................................................... 7
2.2.3 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao ...................................................... 8
2.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao .................................................................................. 11
2.2.5 Đặc tính đột biến kháng thuốc ở các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lao
nói riêng ................................................................................................................... 12
2.3 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao và khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong cơ
thể vật chủ .................................................................................................................... 16
2.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu chống vi khuẩn lao ................................. 18
2.3.2 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao sau đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu .... 23
2.3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống vi khuẩn lao ............................................ 24
2.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong lao phổi kháng thuốc .............................................. 28
2.4 Điều trị bệnh lao phổi............................................................................................. 28
2.4.1 Thuốc chống lao .............................................................................................. 29
2.4.2 Phác đồ điều trị bệnh lao ................................................................................. 31
2.4.3 Thuốc chống lao rifampicin ............................................................................ 32
2.5 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc ..................................................................... 34
2.5.1 Những điều kiện thuận lợi gây bệnh lao phổi kháng thuốc ............................ 34
2.5.2 Một số định nghĩa, phân loại về bệnh lao phổi và bệnh lao phổi kháng thuốc
.................................................................................................................................. 34
2.5.3 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc trên thế giới và tại Việt nam ................ 36
2.6 Kỹ thuật xác định nồng độ thuốc chống lao và đếm số lƣợng các tế bào miễn dịch
trong máu bệnh nhân .................................................................................................... 38
viii
2.6.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong xác định nồng độ thuốc chống
lao ............................................................................................................................. 38
2.6.2 Phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào trong xác định số lƣợng các tế bào miễn
dịch trong máu bệnh nhân lao phổi .......................................................................... 38
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 40
3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.................................................................................... 40
3.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 41
3.2.1 Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ
.................................................................................................................................. 41
3.2.2 Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại
thành phố Cần Thơ ................................................................................................... 45
3.3 Vấn đề y đức .......................................................................................................... 58
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 60
4.1 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ .................. 60
4.1.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu ............................................................. 60
4.1.2 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ ........... 60
4.2 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nghiên cứu ...... 66
4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao tại thành
phố Cần Thơ ............................................................................................................. 66
4.2.2 Sự giảm nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân
lao phổi tái trị so sánh với nhóm bệnh nhân lao phổi mới ....................................... 86
4.2.3 Sự giảm số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa
kháng thuốc so với nhóm lao phổi mới và nhóm đối chứng ngƣời bình thƣờng ... 101
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... 114
5.1 Kết luận ................................................................................................................ 114
5.1.1 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ ......................... 114
5.1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành phố
Cần Thơ .................................................................................................................. 114
5.2 Đề xuất ................................................................................................................. 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 116
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 127
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Giá trị nội kiểm tham chiếu cho bộ thuốc thử BD Multitest 6-color TBNK sử
dụng với các ống BD Trucount ........................................................................................ 57
Bảng 4.1 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu ............................... 60
Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ mắc lao phổi kháng thuốc chung ở các nghiên cứu trong và ngoài
nƣớc .................................................................................................................................. 61
Bảng 4.3 So sánh kết quả tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc với các nghiên cứu khác .......... 63
Bảng 4.4 Các kiểu đột biến thay thế base có thay đổi acid amin ..................................... 69
Bảng 4.5 Các kiểu đột biến thay thế base không gây thay đổi acid amin ........................ 79
Bảng 4.6 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có đột biến tại 1 codon ........................... 80
Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 2 codon .................... 81
Bảng 4.8 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 3 codon .................... 82
Bảng 4.9 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 4 codon .................... 83
Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 7 codon .................. 84
Bảng 4.11 Sự khác nhau về kiểu đột biến của vi khuẩn lao kháng RMP ở các nghiên cứu....... 85
Bảng 4.12 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi và cân nặng của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu
.......................................................................................................................................... 87
Bảng 4.13 Liều điều trị RMP trung bình theo cân nặng ở 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu
.......................................................................................................................................... 89
Bảng 4.14 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tƣơng đo ở thời điểm 2 giờ của 2 nhóm bệnh
nhân nghiên cứu ............................................................................................................... 90
Bảng 4.15 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tƣơng đo ở thời điểm 3 giờ của 2 nhóm bệnh
nhân nghiên cứu ............................................................................................................... 91
Bảng 4.16 Nồng độ RMP trung bình trong huyết tƣơng ở cả 2 thời điểm của 2 nhóm
bệnh nhân nghiên cứu ...................................................................................................... 92
Bảng 4.17 Nồng độ tối đa trong huyết tƣơng của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu ........... 93
Bảng 4.18 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với giới tính ở nhóm
bệnh nhân lao phổi mới .................................................................................................... 99
Bảng 4.19 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với giới tính ở nhóm
bệnh nhân lao phổi tái điều trị .......................................................................................... 99
Bảng 4.20 Đặc điểm chung của các nhóm bệnh nhân nghiên cứu ................................. 101
Bảng 4.21 Số lƣợng bạch cầu chung và các loại bạch cầu ở các nhóm nghiên cứu ...... 102
Bảng 4.22 Số lƣợng tế bào bạch cầu momo ở các nhóm nghiên cứu ............................ 104
Bảng 4.23 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho T chung (CD3+) ............................. 106
Bảng 4.24 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho T giúp đỡ (Th - CD4+) ................... 107
Bảng 4.25 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho Tc (CD8+) ...................................... 108
Bảng 4.26 Tỷ số tế bào lympho Th / Tc (T CD4+/ T CD8+) ........................................... 109
Bảng 4.27 Số lƣợng trung bình của tế bào diệt tự nhiên (NK) ...................................... 110
Bảng 4.28 Phân tích tƣơng quan đơn biến giữa số lƣợng một số bạch cầu trong máu
ngoại vi với tình trạng kháng thuốc của bệnh lao phổi .................................................. 111
Bảng 4.29 Phân tích tƣơng quan đa biến giữa số lƣợng một số bạch cầu trong máu vi với
tình trạng kháng thuốc của bệnh nhân lao phổi.............................................................. 112
x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn lao................................................................. 8
Hình 2.2 Vi khuẩn lao nhuộm bằng phƣơng pháp Ziehl-Neelsen ..................................... 9
Hình 2.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn lao trên môi trƣờng nuôi cấy Lowenstein Jensen ......... 9
Hình 2.4 Vi khuẩn lao chụp phóng đại x7.500 qua KHV điện tử quét (SEM-JSM 5550)
.......................................................................................................................................... 10
Hình 2.5 Đƣờng lây truyền của vi khuẩn lao ................................................................... 10
Hình 2.6 Quá trình nhiễm lao........................................................................................... 11
Hình 2.7 Bản đồ nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao ............................................................. 12
Hình 2.8 Các loại đột biến điểm....................................................................................... 14
Hình 2.9 Kiểu đột biến thay thế base ............................................................................... 14
Hình 2.10 Các dạng ảnh hƣởng của đột biến điểm .......................................................... 15
Hình 2.11 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn........................................... 16
Hình 2.12 Sự hình thành u hạt (granuloma) và hoại tử bã đậu (caseum) trong nhiễm lao
.......................................................................................................................................... 17
Hình 2.13 Vi trí gắn kết của vi khuẩn lao và các tế bào thực bào.................................... 18
Hình 2.14 Vai trò của IFN-γ và TNF-α ............................................................................ 20
Hình 2.15 Sự chết lập trình và hoại tử của các đại thực bào nhiễm vi khuẩn lao ............ 21
Hình 2.16 Cơ chế miễn dịch tự nhiên trong nhiễm lao .................................................... 22
Hình 2.17 Vai trò của CD4 và CD8 của miễn dịch thích nghi trong nhiễm vi khuẩn lao26
Hình 2.18 Quá trình nhiễm lao và các đáp ứng miễn dịch trong nhiễm lao .................... 27
Hình 2.19 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hạng 1 trên vi khuẩn lao................ 30
Hình 2.20 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hàng 2 trên vi khuẩn lao................ 31
Hình 2.21 Công thức hóa học của RMP .......................................................................... 32
Hình 2.22 Sự gắn kết của RMP vào vị trí hoạt động tổng hợp RNA polymerase ........... 32
Hình 2.23 Các nƣớc có lao phổi kháng thuốc cao ở những bệnh nhân tái điều trị .......... 37
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................................... 40
Hình 4.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao ........................................................ 61
Hình 4.2 Tỷ lệ mắc lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu ............................ 62
Hình 4.3 Tỷ lệ mắc lao phổi đơn kháng thuốc ................................................................. 64
Hình 4.4 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc kết hợp ..................................................... 66
Hình 4.5 Sản phẩm PCR có chiều dài 411bp trên bảng gel ............................................. 67
Hình 4.6 Các đỉnh của các nucleotid trên biểu đồ giải trình tự ........................................ 67
Hình 4.7 Tỷ lệ đột biến kháng RMP của các chủng vi khuẩn lao đa kháng .................... 68
Hình 4.8 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi mới .......................................................................................... 95
Hình 4.9 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi mới .......................................................................................... 96
Hình 4.10 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị ....................................................................................... 96
Hình 4.11 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị ....................................................................................... 97
Hình 4.12 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với độ tuổi của nhóm
bệnh nhân lao phổi mới .................................................................................................... 98
Hình 4.13 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với độ tuổi của nhóm
bệnh nhân lao phổi tái trị .................................................................................................. 98
xi
DANH MỤC VIẾT TẮT
AFB Acid Fast Bacilli: trực khuẩn kháng acid
ATSH An toàn sinh học
APC antigen presentation cell: tế bào trình diện kháng nguyên
BAL broncoalveolar lavage liquid: dịch rửa phế quản
BC bạch cầu
BYT Bộ Y tế
BK Bacilli de Koch: trực khuẩn Kock
BSC Bio – Safety – Cabinet: tủ an toàn sinh học
Cmax maximium concentration: nồng độ tối đa
CD cluster differentiation: cụm biệt hóa
CMI cell mediated immunity: miễn dịch qua trung gian tế bào
CTLs cytotoxic T lymphocytes: lympho T gây độc tế bào
CR complement receptor: thụ thể của bổ thể
CTCLQG chƣơng trình chống lao quốc gia
DC dendritic cell: tế bào tua
DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
Grabbing Non-integrin
DOTS Directly Observed Treatment, Short-course: phác đồ điều trị
ngắn ngày có kiểm soát
EMB ethambutol
FDC fixed dose combination: sự kết hợp liều thuốc cố định
FMH functional mutant homozygotes: đồng hợp tử đột biến chức
năng
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor: yếu tố
kích thích đại thực bào - bạch cầu hạt
GKO gene knoch out
HLA human leukocyte antigen system: hệ thống kháng nguyên
bạch cầu ở ngƣời- hệ HLA
HNP1-3 human neutrophile peptides 1-3
HLPC high-performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu
năng cao
ICAM Intercellular Adhesion Molecule: phân tử dính nội bào
IFN interferon
IL interleukin
iNOS2 inducible nitric oxide synthase 2
xii
IUATLD International Union Against Tuberculosis and Lung Disease:
Hiệp hội chống lao và bệnh phổi quốc tế
INH (H) isoniazid
LAM lipoarabino mannan
LJ Lowenstein-Jensen: môi trƣờng đặc nuôi cấy vi khuẩn lao
MAC Mycobacterium avium complexes
MBL Mannose binding lectin: chất lectin gắn đƣờng mannose
MCP monocyte chemoattractant protein: protein hấp dẫn bạch cầu
đơn nhân
MDR-TB multidrug resistant tuberculosis: lao đa kháng thuốc
MHC major histocompatibility complexes: phức hợp hòa hợp mô
chủ yếu
MIP macrophage inflammatory protein: protein viêm đại thực bào
MTB Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn lao
MR mannose receptor: thụ thể đƣờng mannose
NFkB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells
NALC N – acetyl L-cysteine): hóa chất làm tan đàm
NO nitric oxide
NK natural killer: diệt tự nhiên
NTM Non tuberculosis mycobacteria: không phải lao
NTP National Tuberculosis Program: chƣơng trình chống lao
quốc gia
PAS para-aminosalicylic acid
PIM phosphatidylinositol mannoside
PZA pyrazinamid
PBMCs peripheral blood mononuclear cells: các tế bào đơn nhân ở
máu ngoại vi
PMN polymorphonuclear: bạch cầu đa nhân
KN kháng nguyên
KSĐ kháng sinh đồ
KTC khoảng tin cậy
RANTES regulated on activation normal T cell expressed and secreted
RNI reactive nitrogen intermediate: chất trung gian nitơ hoạt hóa
ROI reactive oxygen intermediate: chất trung gian oxy hoạt hóa
RMP rifampicin
xiii
RHZ thuốc kháng lao hỗn hợp 3 thành phần RMP-INH-PZA
SD Standard Deviation: độ lệch chuẩn
SM streptomycin
SP-TB sensitive positive tuberculosis: bệnh lao còn nhạy thuốc
TB tế bào
TCYTTG tổ chức y tế thế giới
TCR T cell receptor: thụ thể tế bào lympho T
TLR toll like receptor
TNF tumor necrosis factor: yếu tố gây hoại tử khối u
VDR vitamine D receptor: thụ thể vitamin D
VK vi khuẩn
WHO world heath organization: tổ chức y tế thế giới
XDR-TB extensively drug-tuberculosis: bệnh lao cực kháng
ZN Ziehl - Neelson
(-) âm tính
(+) dƣơng tính
xiv
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh lao đã đƣợc biết rõ từ hơn một thế kỷ nay và đƣợc xem là bệnh nan y
của thời đại, cho đến những năm 1950, các loại thuốc kháng sinh dùng chữa trị
bệnh lao tỏ ra rất có hiệu quả (Iseman, 2002), thì bệnh lao đã đƣợc các thầy thuốc
khống chế và kiểm soát bệnh một cách dễ dàng. Tuy nhiên, từ thập niên 1990 trở
lại đây, trên thế giới đã xuất hiện nhiều chủng trực khuẩn lao kháng thuốc, rất khó
chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh trong cộng đồng và hiện nay, lao
kháng thuốc đang trở thành một thách thức lớn đối với chƣơng trình phòng chống
lao toàn cầu và trong y học (Raja et al, 2011) vì nó làm gia tăng tỉ lệ tử vong ở
ngƣời bệnh.
Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính có một phần ba dân số
tƣơng đƣơng với 2 tỷ ngƣời trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao, trong đó có 8,6 triệu
ngƣời mắc bệnh lao với 1,3 triệu ngƣời chết. Hàng năm, trong số những ngƣời
nhiễm vi khuẩn lao, có khoảng 450.000 bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (cụ
thể là thể lao phổi có vi khuẩn kháng với 2 loại thuốc chống lao hàng đầu
rifampicin và isoniazid), gây ra cái chết cho 170.000 ngƣời (WHO, 2013). Điều
này đã khiến bệnh lao trở thành một bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất so
với các loại bệnh nhiễm trùng khác trên thế giới (Truscott, 1993), (Daniel, 2006).
Hiện nay, tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn lao đã và đang là mối quan
tâm hàng đầu trong việc điều trị cho bệnh nhân lao, do mối tƣơng quan phức tạp
giữa yếu tố gây bệnh, ngƣời bệnh và nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ảnh hƣởng
rất lớn đến kết quả điều trị. Có nhiều yếu tố góp phần tác động gây kháng thuốc
đã đƣợc đề cập đến, từ việc sử dụng thuốc không đúng cách của các bác sĩ điều trị
không chuyên nghiệp hoặc do nhận thức sai lầm của chính bản thân ngƣời bệnh,
bệnh nhân không tuân thủ chặt chẽ qui trình điều trị, nhƣ uống thuốc không đủ
liều, không đúng cách, không đủ thời gian hay tự ý ngƣng thuốc (Sharma and
Mohan, 2004) làm cho nồng độ thuốc chống lao trong huyết tƣơng bệnh nhân
không đủ cao để có thể tiêu diệt vi khuẩn lao và các quần thể vi khuẩn lao không
đƣợc tiêu diệt hết, thƣờng sẽ biến đổi, nhằm kháng với các thuốc chống lao bằng
nhiều cách, trong đó có việc thay đổi cấu trúc một số gen dẫn đến thất bại trong
điều trị (Faustini et al, 2006). Hiện nay, phác đồ điều trị bệnh lao đƣợc WHO đƣa
ra bao gồm 5 loại thuốc kết hợp với nhau đó là isoniazid (INH), rifampicin
(RMP), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM) và ethambutol (EMB). Với các
thuốc chống lao này, việc chữa khỏi bệnh lao có thể đạt đƣợc trên 95%; thêm vào
đó, việc kết hợp các thuốc trong phác đồ điều trị đã đem lại kết quả rất lớn trong
1
việc giải quyết vấn đề khẩn cấp về tình hình lao kháng thuốc hiện nay (Iseman,
2002). Tuy nhiên, trên thực tế, theo WHO cảnh báo, vẫn còn những bệnh nhân
điều trị bằng thuốc chống lao nhƣng không đem lại hiệu quả, điều này sẽ dẫn đến
là làm tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân lao, tăng gánh nặng bệnh tật cho cộng
đồng và xã hội. Tại sao lại xảy ra điều đó? Để trả lời câu hỏi này là vấn đề lớn
cho xã hội, đặc biệt cho ngành y tế và trên cơ sở đó, việc nghiên cứu tìm hiểu các
yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là rất cần
thiết, nhằm có thể đề xuất biện pháp can thiệp đạt kết quả cao, giúp cho việc điều
trị bệnh nhân lao ngày càng có hiệu quả.
1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 quốc gia có tỷ lệ bệnh lao xuất hiện cao,
cũng là một trong 14/27 nƣớc có bệnh lao phổi đa kháng thuốc cao trên thế giới.
Theo nhận định của Raja (2011), thuốc chống lao giống nhƣ con dao hai lƣỡi,
thuốc có tác dụng diệt vi khuẩn, mặt khác thuốc cũng là nguyên nhân gây kháng
thuốc (Raja et al, 2011). Có nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lao có khả năng
chống lại với các thuốc dùng để điều trị bệnh lao bằng cách thay đổi kiểu gen hoặc
làm bất hoạt hệ thống bảo vệ cơ thể của túc chủ thông qua cơ chế trốn thoát hiện tƣợng
thực bào hoặc làm giảm số lƣợng và chức năng các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch
chống vi khuẩn lao, khi nồng độ thuốc chống lao không đạt nồng độ chuẩn trong huyết
tƣơng theo khuyến cáo của chƣơng trình chống lao Quốc gia, có thể xảy ra đột biến
kháng thuốc dẫn đến hậu quả là thất bại trong điều trị chống lao (Williamson et al,
2011).
Mối lo ngại trong kiểm soát bệnh lao chính là làm thế nào để phát hiện sớm
bệnh lao kháng thuốc (Gillespie, 2002) và quản lý tốt việc điều trị bệnh nhân;
Việc này hiện nay đang gặp rất nhiều khó khăn. Năm 2012, có khoảng 75% số
bệnh nhân tại 27 quốc gia có bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới chƣa đƣợc
phát hiện và quản lý điều trị (WHO, 2013). Hiện nay, các quốc gia phát triển có
nền công nghệ sinh học hiện đại, đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong
chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc nhằm khắc phục việc phát triển rất chậm của vi
khuẩn lao trong nuôi cấy, rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định lao kháng thuốc
từ 4-10 tuần (qua cách nuôi cấy tự nhiên) xuống còn 1 ngày. Việc phát hiện sớm
các chủng lao kháng thuốc có ý nghĩa rất lớn trong điều trị bệnh, vì có thể áp
dụng phác đồ điều trị đúng, nhằm đạt tỷ lệ thành công cao trong điều trị bệnh
nhân lao kháng thuốc. Bên cạnh đó, mặc dù các vùng, miền khắp nơi trên thế giới
đều áp dụng phác đồ điều trị do WHO đƣa ra, nhƣng kết quả điều trị ở các nơi lại
rất khác nhau, do hiện tƣợng đột biến của vi khuẩn ở các nơi cũng khác nhau. Sự
2
khác nhau này có thể xảy ra ngay cả trong cùng một quốc gia (Sandgren et al,
2009), (Lishi Qian et al, 2002). Theo Sandgren et al (2009) cần có thêm nhiều
nghiên cứu về kiểu gen gây kháng thuốc của vi khuẩn lao, để có nhận định chính
xác hơn, đƣa ra khuyến cáo phù hợp hơn trong công tác phòng, chống bệnh lao
nói chung và lao đa kháng thuốc nói riêng; trong đó, xét nghiệm phát hiện kháng
thuốc rifampicin (RMP) đối với vi khuẩn lao là bắt buộc, bởi vì trong các loại
thuốc kết hợp điều trị bệnh lao, RMP là thuốc quan trọng ƣu tiên hàng đầu trong
chỉ định thuốc chống lao của các bác sĩ. Do đó, nếu vi khuẩn lao kháng với thuốc
RMP thì sẽ có đến trên 95% số bệnh nhân thuộc nhóm lao đa kháng thuốc
(Ormerod, 2005)
Việt Nam đã thực hiện các kỹ thuật nêu trên trong việc phát hiện nhanh
bệnh lao kháng thuốc (Đinh Ngọc Sỹ, 2011), trong đó, có phát hiện lao phổi đề
kháng thuốc RMP. Bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ là đơn vị đã
và đang sử dụng một máy Gene-Xpert có khả năng phát hiện lao phổi đề kháng
với thuốc RMP chỉ trong vòng 3 giờ bằng kỹ thuật nhận dạng các đột biến gây
kháng RMP. Tuy nhiên, hiện nay chƣa có công trình nghiên cứu nào để đánh giá
về việc phát hiện kiểu gen kháng thuốc RMP của vi khuẩn lao tại thành phố Cần
Thơ.
Mặt khác, nồng độ thuốc chống lao RMP không đạt chuẩn trong huyết
tƣơng có thể là điều kiện thuận lợi gây ra những kiểu gen đột biến kháng thuốc
khác nhau của vi khuẩn lao, điều này lại ít đƣợc các bác sĩ điều trị quan tâm.
Ngoài ra, theo WHO cảnh báo, lao kháng thuốc cũng đã xuất hiện với mức độ khá
cao trên những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(HIV/AIDS); ở những bệnh nhân này, có sự giảm thiểu về số lƣợng và chất lƣợng
tế bào lympho T giúp đỡ, là tế bào miễn dịch đóng vai trò chính trong điều hòa
đáp ứng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tình trạng cơ thể trở nên đáp ứng kém với
thuốc chống lao và tạo điều kiện thuận lợi cho tính kháng thuốc của vi khuẩn lao
phát triển. Đây là cơ sở cho việc đặt vấn đề nghiên cứu về số lƣợng các tế bào
miễn dịch nhƣ là một yếu tố ảnh hƣởng đến sự kháng thuốc của vi khuẩn lao ở
bệnh nhân lao kháng thuốc. Từ các giả thuyết nghiên cứu trên, đề tài đƣợc thực
hiện nhằm các mục tiêu sau:
a. Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố
Cần Thơ.
b. Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn
lao qua việc xác định (i) Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin của
vi khuẩn lao. (ii) Nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tƣơng
3
của bệnh nhân lao phổi tái điều trị (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới).
(iii) Số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới và ngƣời bình thƣờng làm đối
chứng).
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án
Luận án đã cung cấp những số liệu cụ thể góp phần làm rõ tình hình dịch tễ
bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là dịch tễ học phân tử của lao phổi đa kháng thuốc
tại thành phố Cần Thơ. Ngoài ra, đề tài cũng cung cấp thêm những cơ sở khoa
học cho những giả thuyết về sinh bệnh học kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành
phố Cần Thơ, cụ thể:
Kết quả đề tài cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân tái
trị tại thành phố Cần Thơ cao hơn so với kết quả đã đƣợc chƣơng trình chống lao
Quốc gia công bố.
Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp số liệu về tần suất và các kiểu gen đột
biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại Cần Thơ; tần
suất đột biến và các kiểu gen đột biến rất khác nhau khi so sánh với các công
trình nghiên cứu khác. Kết quả còn cho thấy, ngoài những kiểu gen đột biến đã
đƣợc công bố, chúng tôi còn phát hiện thêm 2 đột biến mới tại codon 510 và
codon 532 trên đoạn gen rpoB ở chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại thành phố
Cần Thơ. Đặc biệt, chúng tôi cũng đã phát hiện có 1 chủng vi khuẩn lao có sự
xuất hiện đột biến trên cả 7 codon, đây là kiểu đột biến mà chúng tôi chƣa thấy
công bố trên các tài liệu tham khảo nào cả trong cũng nhƣ ngoài nƣớc.
Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm thiểu rất đáng lo ngại
về nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng ở các bệnh nhân đang điều trị
thuốc chống lao và sự giảm đáng kể số lƣợng các tế bào lympho T chung, tế bào
T gây độc, tế bào T giúp đỡ và cả tế bào diệt tự nhiên ở các bệnh nhân lao đặc
biệt là lao phổi đa kháng thuốc. Từ đó, gợi ý rằng có thể đây là những yếu tố
thuận lợi làm phát triển đột biến kháng thuốc trên các bệnh nhân; và tình trạng
đột biến gây kháng thuốc này sẽ đƣợc duy trì và nhân lên theo sự phát triển của vi
khuẩn lao kháng thuốc.
Những kết quả này có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp sau để khẳng
định sự ảnh hƣởng của các yếu tố nêu trên, góp phần cung cấp thêm thông tin
trong việc đánh giá, tiên lƣợng bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc trong tƣơng
lai.
4
1.4 Kết cấu của luận án
Luận án dài 115 trang, nội dung chính của luận án gồm 5 chƣơng: (i)
chƣơng 1: Giới thiệu (5 trang với 4 tiểu mục); (ii) chƣơng 2: Lƣợc khảo tài liệu
(34 trang với 6 tiểu mục); (iii) chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu (20 trang có 2
tiểu mục); (iv) chƣơng 4: Kết quả và thảo luận (54 trang với 2 tiểu mục); (v)
chƣơng 5: Kết luận và đề nghị (2 trang với 2 tiểu mục).
Số bảng và hình trong nội dung chính gồm: 30 bảng và 37 hình, bài viết sử
dụng 113 tài liệu tham khảo, bao gồm 18 tài liệu tham khảo tiếng Việt và 95 tài
liệu tham khảo tiếng Anh.
5
Chƣơng 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc về lịch sử phát hiện bệnh lao
Bệnh lao đã có từ rất lâu cùng với lịch sử phát triển của xã hội loài ngƣời,
bệnh do một loại vi khuẩn có tên là Mycobacterium tuberculosis gây ra, đây là
loại vi khuẩn đã giết chết nhiều ngƣời hơn bất cứ loại vi khuẩn gây bệnh nào khác
trên khắp thế giới (Daniel, 2006). Chi Mycobacterium đã có từ hơn 150 triệu năm
trƣớc, nó đƣợc chứng minh đã hiện diện rất sớm từ 5000 năm trƣớc đây ở Ai Cập,
3300 năm ở Ấn Độ và 2300 năm ở Trung Hoa (Daniel, 2006). Lần đầu tiên trên
các tài liệu của Hy Lạp, bệnh lao xuất hiện dƣới tên gọi là “Phthisis hay
Consumption” Vào khoảng năm 460 trƣớc công nguyên, Hyppocrates đã khẳng
định bệnh lao là bệnh gây lây lan cho nhiều ngƣời nhất trong thời gian đó, những
bệnh nhân mắc phải căn bệnh này đều ở lứa tuổi từ 18 đến 35 và hầu hết đều tử
vong. Lúc bấy giờ, Hyppocrates cũng đã cảnh báo các bác sĩ không nên thăm
khám cho những bệnh nhân lao trong giai đoạn bệnh đang tiến triển, để bảo vệ
cho chính bản thân của các bác sĩ. Mặc dù Aristotle (384-322 BC) đã lƣu ý đây là
bệnh truyền nhiễm, nhƣng những ngƣời Hy Lạp lúc đó vẫn cho rằng bệnh lao là
do di truyền. Về sau, Clarissimus Galen (131-201 AD), một bác sĩ nổi tiếng sau
Hypopcrates, đã xác định bệnh lao là do ổ loét trong phổi, ngực hoặc họng đi kèm
ho, sốt nhẹ và khạc ra mủ, ông cũng mô tả đây là một bệnh của tình trạng suy
dinh dƣỡng (Pease, 1940 trích dẫn của Juan Carlos Palomino, 2007).
Tại Châu Âu, do việc bùng nổ dân số và sự phát triển quá nhanh của các
thành phố lớn, đã khiến châu lục này trở thành trung tâm của dịch bệnh lao có lẽ
từ đầu thế kỷ thứ 17 và tiếp tục cho đến 200 năm sau đó, bệnh lao đƣợc biết đến
nhƣ “Great White Plague” là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tử vong và cái chết do
bệnh lao là điều không thể tránh khỏi. Ở Châu Âu và Bắc Mỹ, những đặc điểm
phổ biến của các thành phố lớn lúc bấy giờ nhƣ mật độ dân cƣ đông đúc, điều
kiện vệ sinh thiếu thốn, chính là những nguyên nhân tạo ra dịch bệnh lao tại hai
châu lục trên, dịch bệnh này tiếp tục âm ỉ lan rộng ra những châu lục khác do xu
hƣớng thực dân hóa và phong trào thám hiểm để khám phá các vùng đất mới của
ngƣời Châu Âu. Những ngƣời Châu Âu di cƣ đã mang bệnh lao cùng với họ tới
những vùng đất mà họ mới đến (Juan Carlos Palomino, 2007). Có khoảng một
phần tƣ dân số Châu Âu đã chết vì bệnh lao, nghiên cứu ở một bệnh viện tại Paris
đã ghi nhận, trong số 696 thi hài đƣợc khám nghiệm đã có đến 250 thi hài chết do
mắc phải bệnh lao (Dubos, R and J. Dubos, 1952 trích dẫn của Smith Issar, 2003).
Trƣớc khi Columbus phát hiện ra Châu Mỹ, có rất ít ngƣời dân địa phƣơng
mắc bệnh lao. Mãi cho đến năm 1880, bệnh lao bùng phát chủ yếu trong số những
6
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Trần Nhân Dũng và
PGS.TS. Trần Ngọc Dung, hai ngƣời đã dành nhiều thời gian hƣớng dẫn tận tình,
động viên giúp đỡ, cung cấp tài liệu, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện thuận
lợi và tốt nhất để tôi hoàn thành quyển luận án này.
Tôi muốn gửi lời cám ơn đến Bác sĩ chuyên khoa I Nguyễn Thị Thanh
Nhàn, Giám đốc Bệnh viện Lao và Bệnh phổi Thành phố Cần Thơ, Bác sĩ
Nguyễn Ngọc Thủy, phó trƣởng phòng xét nghiệm, các Bác sĩ phòng khám, các
Anh chị em nhân viên y tế của Bệnh viện lao và bệnh phổi Cần Thơ, nhân viên y
tế của các Trung tâm phòng chống lao Quận Ninh Kiều, Cái Răng, Phong Điền đã
giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi đƣợc tiếp xúc với bệnh nhân, từ đó, tôi có cơ hội
chọn đƣợc các mẫu đạt tiêu chuẩn cho mục tiêu nghiên cứu của luận án.
Về phía Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ, tôi vô cùng biết ơn lãnh đạo nhà
trƣờng, đặc biêt, tôi vô cùng biết ơn GS.TS. Phạm Văn Lình đã cho phép, ủng hộ,
tạo cơ hội tốt nhất trong thời gian vừa qua để tôi có điều kiện học tập, nghiên cứu
và hoàn thành luận án nghiên cứu sinh này.
Tôi sẽ không bao giờ quên tập thể Bộ môn Sinh Lý Bệnh-Miễn dịch, Khoa
Y, Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ, nơi đã động viên, chia sẽ, khích lệ, an ủi tôi
trong suốt quá trình 4 năm học tập, nghiên cứu, giúp đỡ để tôi có thể vừa hoàn
thành công tác, vừa hoàn thành nhiệm vụ học tập, nghiên cứu và hoàn thành
quyển luận án này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến Ths. Đỗ Tấn Khang và Em Trần Văn Bé
Năm của phòng Sinh học phân tử, thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công
nghệ sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ, đã tích cực hổ trợ, không ngại khó khăn
cùng với tôi thực hiện các kỹ thuật PCR, gửi sản phẩm PCR giải trình tự, nhằm
giúp tôi hoàn tất mục tiêu phát hiện các đột biến gen của những chủng vi khuẩn
lao trên các bệnh nhân tại Thành phố Cần Thơ.
Xin cám ơn các cán bộ của Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp
đỡ tôi thực hiện xét nghiệm xác định các tế bào miễn dịch bằng kỹ thuật đếm
dòng chảy tế bào tại viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các cán bộ của phòng Thí nghiệm chuyên sâu đã
nhiệt tình giúp đỡ khi tôi thực hiện kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, chụp ảnh
vi khuẩn lao dƣới kính hiển vi điện tử.
i
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình đã yêu thƣơng, thông cảm, chia sẽ,
an ủi, khích lệ tôi trong những lúc khó khăn khi thực hiện đề tài, giúp tôi có thêm
động lực để hoàn tất quá trình học tập và thực hiện luận án nghiên cứu sinh . Đây
chính là niềm vui, là phần thƣởng vô giá cho bản thân tôi.
ii
TÓM TẮT
Đề tài “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn
Mycobacterium tuberculosis tại thành phố Cần Thơ“ đƣợc thực hiện tại phòng xét
nghiệm Sinh học phân tử, khoa Y - Trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ; phòng thí
nghiệm Sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học,
phòng Thí nghiệm chuyên sâu, Trƣờng Đại học Cần Thơ; phòng Xét nghiệm vi sinh
thuộc bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ; Viện Pasteur thành phố Hồ
Chí Minh, trong thời gian từ tháng 6.2010 đến tháng 1.2014.
Đề tài đƣợc thực hiện với các mục tiêu (i) Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở
bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, (ii) Tìm hiểu một số yếu tố ảnh
hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao gồm: (iia) Xác định các kiểu gen
đột biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao, (iib) Xác định nồng độ thuốc
rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân lao phổi tái trị (iic) Xác định số
lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc.
Việc xác định tỷ lệ kháng thuốc đƣợc thực hiện với 246 bệnh nhân mắc lao
phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ có mẫu đàm đƣợc thu thập, đem nhuộm bằng
phƣơng pháp Ziehl-Neelsen, nuôi cấy vi khuẩn trong môi trƣờng Lowenstein-
Jensen, thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ trên môi trƣờng đặc theo phƣơng pháp
tỷ lệ. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng thuốc chung là 63,8%, trong đó, tỷ
lệ đa kháng thuốc là 23,2%, tỷ lệ kháng đơn thuốc lần lƣợt với streptomycin:
52,4%; isoniazid: 47,2%; rifampicin: 25,2%; ethambutol: 11,8% và kháng
pyrazinamid: 9,8%; tỷ lệ kháng kết hợp thuốc gồm kháng với 1 loại thuốc là
21,5%; kháng 2 loại thuốc là 17,1%; kháng 3 loại thuốc là 13,1%; kháng 4 loại
thuốc là 8,5%; kháng cả 5 loại thuốc là 3,3%.
Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin đƣợc tiến hành trên 42 chủng
vi khuẩn đã đƣợc nuôi cấy từ các mẫu đàm của 40 bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc và 2 bệnh nhân mắc lao phổi còn nhạy trong số 246 bệnh nhân mắc lao
phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ, ADN đƣợc ly trích để làm khuôn cho phản ứng
PCR nhằm khuếch đại đoạn gen rpoB với chiều dài 411bp chứa đoạn gen 81bp là
vùng có trình tự xác định kháng rifampicin (RRDR: rifampicin resistance
determining region), đoạn gen đƣợc giải trình tự và so sánh với chủng hoang dại
từ dữ liệu trên ngân hàng gen, việc so sánh đƣợc thực hiện tại vị trí từ codon 507
đến 534, kết quả cho thấy có 30/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu xảy ra đột biến
thay thế base chiếm 75% và 10/40 chủng vi khuẩn lao nghiên cứu không tìm thấy đột
biến gen trên vùng 81bp của gen rpoB, chiếm tỷ lệ 25% .
Nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân đƣợc đo bằng
phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, kết quả khảo sát cho thấy có 92,4% số
iii
bệnh nhân ở nhóm lao phổi tái trị và 90% của nhóm lao phổi mới có nồng độ
thuốc rifampicin huyết tƣơng rất thấp <8 µg/ml (so với nồng độ điều trị chuẩn
phải đạt từ 8-24µg/ml theo khuyến cáo).
Số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào thông qua các dấu
ấn kháng nguyên đặc hiệu tế bào, từng loại dấu ấn đƣợc phát hiện bằng các kháng
thể đơn dòng có đánh dấu chất huỳnh quang. Kết quả cho thấy có sự giảm một
cách có ý nghĩa (p<0,05) số lƣợng các tế bào lympho T chung, lympho T giúp đỡ,
lympho T gây độc và tế bào diệt tự nhiên ở nhóm bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc. Trong khi đó, số lƣợng monocyte trong công thức bạch cầu ở nhóm lao
phổi đa kháng thuốc lại tăng cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm lao mới và
nhóm ngƣời bình thƣờng với p<0,05.
Các kết quả trong nghiên cứu này cho thấy: kiểu đột biến gen của vi khuẩn
lao, nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng và số lƣợng các tế bào miễn dịch
trong máu bệnh nhân, có thể là các yếu tố ảnh hƣởng đến việc kháng thuốc của vi
khuẩn lao.
Từ khóa: bệnh lao phổi, lao phổi đa kháng thuốc, lao phổi tái điều trị,
rifampicin, sắc ký lỏng hiệu năng cao, tế bào miễn dịch.
iv
ABSTRACT
The study entitled “Some factors affecting drug resistance of the
Mycobacterrium tuberculosis in the Can Tho city”. This study was carried out at
(1) The Molecular Biology Laboratory - Faculty of Medicine – Can Tho
University of Medicine and Pharmacy (CTUMP), (2) The Biotechnology
Research and Development Institute of Can Tho University (CTU), (3) the
Advanced Laboratory of CTU; (4) The Microbiology laboratory of the Can Tho
Tuberculosis and Pulmonary Disease Hospital (CTPDH); and at (5) The Pasteur
Institute of Ho Chi Minh City. Duration of the study was from June 2010 to
January 2014.
The objectives of the study were to (i) Determine the percentage of
retreated pulmonary tuberculosis patients who resists to drug; (ii) understand
factors affecting drug resistance of the Mycobacterrium tuberculosis. The
objective (ii) consists of: (1) Determine the mutated genotype of rifampicin-
resistant Mycobacterrium tuberculosis strains isolated from patients who live in
the Can Tho city; (2) Investigate concentration of rifampicin drug in plasma of
retreated pulmonary tuberculosis patients and (3) Determine the immunocytes in
blood of patients who got multi-drug resistant tuberculosis.
Percentage of patients who resisted to drug at the CTPDH was determined
from 246 retreated tuberculosis patients. Sputum samples were collected and
dyed by Ziehl-Neelsen method. Drug susceptibility testing was performed on
Lowenstein-Jensen medium according to the proportion method. Results showed
that prevalence of any anti-tuberculosis drug resistance was 63.8%; multidrug-
resistant tuberculosis was 23.2%, monoresistance drug in which streptomycin was
52.4%; isoniazid was 47.2%; rifampicin was 25.2%; ethambutol was 11.8%;
pyrazinamid was 9.8%. Patients who resisted with one, two or more type of
drugs: 21.5% found with one type of drug, two types of drug were 17.1%; three
types of drug were 13.1%; four types of drug were 8.5% and five types of drug
were 3.3%.
Determination of mutated genotypes was carried out on 42 strains of
Mycobacterium tuberculosis in which 40 patients were multidrug-resistant
tuberculosis and 2 patients were still sensitive with drug and positive with
tuberculosis. DNA was extracted and used as template to amplify the rpoB gen by
PCR method. The rpoB gen length (411bp) in which contains 81bp fragment (a
rifampicin resistance determining region). The DNA were sequenced and
compared with DNA from the gene bank. This activity was aimed to find
v
mutation from the codon 507 to 534. The results showed that there were 30 over
40 strains showing base substitutions mutation (75%) and in 10 over 40 strains
(25%) showed phenotypically rifampicin-resistance, but no nucleotide changes
were detected at the rpoB gene.
The concentration of rifampicin in plasma of retreated pulmonary
tuberculosis patients was determined by high performance liquid chromatography
(HPLC). The results showed that 92.4% of retreated pulmonary tuberculosis and
90% of new pulmonary tuberculosis having low concentration of rifampicin in
plasma (<8 µg/ml), while recommended concentration of drugs should be
between 8 to 24µg/ml in plasma.
The immunocytes in blood of multidrug-resistant tuberculosis patients were
investigated. The Flow cytometry method was used to determine the number of
immunocytes by antigen markers in leucocytes and these antigen combine with
the monoclonal antibody was recognized with fluorescence method. The results
showed that the number of T lymphocyte, helper T cells, cytotoxic T cells and
natural killer cells signicficantly decreased (p<0,05) in multidrug-resistant
tuberculosis (MDR-TB) patients, while number of monocytes in multidrug-
resistant tuberculosis patients significantly increased (p<0.05) in comparision
with new pulmonary tuberculosis and the healthy people.
Results from this study showed: mutated genotype of the Mycobacterrium
tuberculosis, drug concentration in plasma and number of immunocytes in blood
of patients indicating the factors that affect to drug resistance.
Keywords: high performance liquid chromatography, immunocytes, multidrug-
resistant tuberculosis, pulmonary tuberculosis, retreated pulmonary tuberculosis,
rifampicin,
vi
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên
cứu của tôi. Các kết quả của nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án
cùng cấp nào khác.
vii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ..................................................................................................................... I
TÓM TẮT ........................................................................................................................ III
ABSTRACT ...................................................................................................................... V
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ..................................................................................... VII
MỤC LỤC ..................................................................................................................... VIII
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................... X
DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... XI
DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................................... XII
CHƢƠNG 1: GIỚI THIỆU ................................................................................................ 1
1.1 Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................................... 1
1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án .................................... 2
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án ........................... 4
1.4 Kết cấu của luận án .................................................................................................. 5
CHƢƠNG 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................ 6
2.1 Sơ lƣợc về lịch sử phát hiện bệnh lao ...................................................................... 6
2.2 Vi khuẩn lao ............................................................................................................. 7
2.2.1 Phân loại vi khuẩn lao ....................................................................................... 7
2.2.2 Cấu tạo của vi khuẩn lao ................................................................................... 7
2.2.3 Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao ...................................................... 8
2.2.4 Hệ gen của vi khuẩn lao .................................................................................. 11
2.2.5 Đặc tính đột biến kháng thuốc ở các loài vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lao
nói riêng ................................................................................................................... 12
2.3 Đáp ứng miễn dịch trong bệnh lao và khả năng tồn tại của vi khuẩn lao trong cơ
thể vật chủ .................................................................................................................... 16
2.3.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu chống vi khuẩn lao ................................. 18
2.3.2 Khả năng tồn tại của vi khuẩn lao sau đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu .... 23
2.3.3 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống vi khuẩn lao ............................................ 24
2.3.4 Đáp ứng miễn dịch trong lao phổi kháng thuốc .............................................. 28
2.4 Điều trị bệnh lao phổi............................................................................................. 28
2.4.1 Thuốc chống lao .............................................................................................. 29
2.4.2 Phác đồ điều trị bệnh lao ................................................................................. 31
2.4.3 Thuốc chống lao rifampicin ............................................................................ 32
2.5 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc ..................................................................... 34
2.5.1 Những điều kiện thuận lợi gây bệnh lao phổi kháng thuốc ............................ 34
2.5.2 Một số định nghĩa, phân loại về bệnh lao phổi và bệnh lao phổi kháng thuốc
.................................................................................................................................. 34
2.5.3 Tình hình bệnh lao phổi kháng thuốc trên thế giới và tại Việt nam ................ 36
2.6 Kỹ thuật xác định nồng độ thuốc chống lao và đếm số lƣợng các tế bào miễn dịch
trong máu bệnh nhân .................................................................................................... 38
viii
2.6.1 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong xác định nồng độ thuốc chống
lao ............................................................................................................................. 38
2.6.2 Phƣơng pháp đếm dòng chảy tế bào trong xác định số lƣợng các tế bào miễn
dịch trong máu bệnh nhân lao phổi .......................................................................... 38
CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................. 40
3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát.................................................................................... 40
3.2 Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 41
3.2.1 Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ
.................................................................................................................................. 41
3.2.2 Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại
thành phố Cần Thơ ................................................................................................... 45
3.3 Vấn đề y đức .......................................................................................................... 58
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 60
4.1 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ .................. 60
4.1.1 Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu ............................................................. 60
4.1.2 Tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố Cần Thơ ........... 60
4.2 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao nghiên cứu ...... 66
4.2.1 Các kiểu đột biến gen gây kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao tại thành
phố Cần Thơ ............................................................................................................. 66
4.2.2 Sự giảm nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tƣơng của bệnh nhân
lao phổi tái trị so sánh với nhóm bệnh nhân lao phổi mới ....................................... 86
4.2.3 Sự giảm số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu của bệnh nhân lao phổi đa
kháng thuốc so với nhóm lao phổi mới và nhóm đối chứng ngƣời bình thƣờng ... 101
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................... 114
5.1 Kết luận ................................................................................................................ 114
5.1.1 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc tại thành phố Cần Thơ ......................... 114
5.1.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành phố
Cần Thơ .................................................................................................................. 114
5.2 Đề xuất ................................................................................................................. 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 116
PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 127
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Giá trị nội kiểm tham chiếu cho bộ thuốc thử BD Multitest 6-color TBNK sử
dụng với các ống BD Trucount ........................................................................................ 57
Bảng 4.1 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi của bệnh nhân nghiên cứu ............................... 60
Bảng 4.2 So sánh tỷ lệ mắc lao phổi kháng thuốc chung ở các nghiên cứu trong và ngoài
nƣớc .................................................................................................................................. 61
Bảng 4.3 So sánh kết quả tỷ lệ lao phổi đa kháng thuốc với các nghiên cứu khác .......... 63
Bảng 4.4 Các kiểu đột biến thay thế base có thay đổi acid amin ..................................... 69
Bảng 4.5 Các kiểu đột biến thay thế base không gây thay đổi acid amin ........................ 79
Bảng 4.6 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có đột biến tại 1 codon ........................... 80
Bảng 4.7 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 2 codon .................... 81
Bảng 4.8 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 3 codon .................... 82
Bảng 4.9 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 4 codon .................... 83
Bảng 4.10 Tỷ lệ bệnh nhân mang vi khuẩn lao có kiểu đột biến tại 7 codon .................. 84
Bảng 4.11 Sự khác nhau về kiểu đột biến của vi khuẩn lao kháng RMP ở các nghiên cứu....... 85
Bảng 4.12 Đặc điểm giới tính, nhóm tuổi và cân nặng của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu
.......................................................................................................................................... 87
Bảng 4.13 Liều điều trị RMP trung bình theo cân nặng ở 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu
.......................................................................................................................................... 89
Bảng 4.14 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tƣơng đo ở thời điểm 2 giờ của 2 nhóm bệnh
nhân nghiên cứu ............................................................................................................... 90
Bảng 4.15 Nồng độ thuốc RMP trong huyết tƣơng đo ở thời điểm 3 giờ của 2 nhóm bệnh
nhân nghiên cứu ............................................................................................................... 91
Bảng 4.16 Nồng độ RMP trung bình trong huyết tƣơng ở cả 2 thời điểm của 2 nhóm
bệnh nhân nghiên cứu ...................................................................................................... 92
Bảng 4.17 Nồng độ tối đa trong huyết tƣơng của 2 nhóm bệnh nhân nghiên cứu ........... 93
Bảng 4.18 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với giới tính ở nhóm
bệnh nhân lao phổi mới .................................................................................................... 99
Bảng 4.19 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với giới tính ở nhóm
bệnh nhân lao phổi tái điều trị .......................................................................................... 99
Bảng 4.20 Đặc điểm chung của các nhóm bệnh nhân nghiên cứu ................................. 101
Bảng 4.21 Số lƣợng bạch cầu chung và các loại bạch cầu ở các nhóm nghiên cứu ...... 102
Bảng 4.22 Số lƣợng tế bào bạch cầu momo ở các nhóm nghiên cứu ............................ 104
Bảng 4.23 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho T chung (CD3+) ............................. 106
Bảng 4.24 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho T giúp đỡ (Th - CD4+) ................... 107
Bảng 4.25 Số lƣợng trung bình của tế bào lympho Tc (CD8+) ...................................... 108
Bảng 4.26 Tỷ số tế bào lympho Th / Tc (T CD4+/ T CD8+) ........................................... 109
Bảng 4.27 Số lƣợng trung bình của tế bào diệt tự nhiên (NK) ...................................... 110
Bảng 4.28 Phân tích tƣơng quan đơn biến giữa số lƣợng một số bạch cầu trong máu
ngoại vi với tình trạng kháng thuốc của bệnh lao phổi .................................................. 111
Bảng 4.29 Phân tích tƣơng quan đa biến giữa số lƣợng một số bạch cầu trong máu vi với
tình trạng kháng thuốc của bệnh nhân lao phổi.............................................................. 112
x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn lao................................................................. 8
Hình 2.2 Vi khuẩn lao nhuộm bằng phƣơng pháp Ziehl-Neelsen ..................................... 9
Hình 2.3 Khuẩn lạc của vi khuẩn lao trên môi trƣờng nuôi cấy Lowenstein Jensen ......... 9
Hình 2.4 Vi khuẩn lao chụp phóng đại x7.500 qua KHV điện tử quét (SEM-JSM 5550)
.......................................................................................................................................... 10
Hình 2.5 Đƣờng lây truyền của vi khuẩn lao ................................................................... 10
Hình 2.6 Quá trình nhiễm lao........................................................................................... 11
Hình 2.7 Bản đồ nhiễm sắc thể của vi khuẩn lao ............................................................. 12
Hình 2.8 Các loại đột biến điểm....................................................................................... 14
Hình 2.9 Kiểu đột biến thay thế base ............................................................................... 14
Hình 2.10 Các dạng ảnh hƣởng của đột biến điểm .......................................................... 15
Hình 2.11 Các cơ chế kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn........................................... 16
Hình 2.12 Sự hình thành u hạt (granuloma) và hoại tử bã đậu (caseum) trong nhiễm lao
.......................................................................................................................................... 17
Hình 2.13 Vi trí gắn kết của vi khuẩn lao và các tế bào thực bào.................................... 18
Hình 2.14 Vai trò của IFN-γ và TNF-α ............................................................................ 20
Hình 2.15 Sự chết lập trình và hoại tử của các đại thực bào nhiễm vi khuẩn lao ............ 21
Hình 2.16 Cơ chế miễn dịch tự nhiên trong nhiễm lao .................................................... 22
Hình 2.17 Vai trò của CD4 và CD8 của miễn dịch thích nghi trong nhiễm vi khuẩn lao26
Hình 2.18 Quá trình nhiễm lao và các đáp ứng miễn dịch trong nhiễm lao .................... 27
Hình 2.19 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hạng 1 trên vi khuẩn lao................ 30
Hình 2.20 Cơ chế tác dụng của các thuốc chống lao hàng 2 trên vi khuẩn lao................ 31
Hình 2.21 Công thức hóa học của RMP .......................................................................... 32
Hình 2.22 Sự gắn kết của RMP vào vị trí hoạt động tổng hợp RNA polymerase ........... 32
Hình 2.23 Các nƣớc có lao phổi kháng thuốc cao ở những bệnh nhân tái điều trị .......... 37
Hình 3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát............................................................................... 40
Hình 4.1 Tỷ lệ kháng thuốc chung của vi khuẩn lao ........................................................ 61
Hình 4.2 Tỷ lệ mắc lao phổi đa kháng thuốc ở bệnh nhân nghiên cứu ............................ 62
Hình 4.3 Tỷ lệ mắc lao phổi đơn kháng thuốc ................................................................. 64
Hình 4.4 Tỷ lệ các loại lao phổi kháng thuốc kết hợp ..................................................... 66
Hình 4.5 Sản phẩm PCR có chiều dài 411bp trên bảng gel ............................................. 67
Hình 4.6 Các đỉnh của các nucleotid trên biểu đồ giải trình tự ........................................ 67
Hình 4.7 Tỷ lệ đột biến kháng RMP của các chủng vi khuẩn lao đa kháng .................... 68
Hình 4.8 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi mới .......................................................................................... 95
Hình 4.9 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi mới .......................................................................................... 96
Hình 4.10 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 2 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị ....................................................................................... 96
Hình 4.11 Liên quan giữa nồng độ thuốc RMP ở thời điểm 3 giờ với liều điều trị của
nhóm bệnh nhân lao phổi tái trị ....................................................................................... 97
Hình 4.12 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với độ tuổi của nhóm
bệnh nhân lao phổi mới .................................................................................................... 98
Hình 4.13 Liên quan giữa nồng độ RMP tối đa trong huyết tƣơng với độ tuổi của nhóm
bệnh nhân lao phổi tái trị .................................................................................................. 98
xi
DANH MỤC VIẾT TẮT
AFB Acid Fast Bacilli: trực khuẩn kháng acid
ATSH An toàn sinh học
APC antigen presentation cell: tế bào trình diện kháng nguyên
BAL broncoalveolar lavage liquid: dịch rửa phế quản
BC bạch cầu
BYT Bộ Y tế
BK Bacilli de Koch: trực khuẩn Kock
BSC Bio – Safety – Cabinet: tủ an toàn sinh học
Cmax maximium concentration: nồng độ tối đa
CD cluster differentiation: cụm biệt hóa
CMI cell mediated immunity: miễn dịch qua trung gian tế bào
CTLs cytotoxic T lymphocytes: lympho T gây độc tế bào
CR complement receptor: thụ thể của bổ thể
CTCLQG chƣơng trình chống lao quốc gia
DC dendritic cell: tế bào tua
DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-
Grabbing Non-integrin
DOTS Directly Observed Treatment, Short-course: phác đồ điều trị
ngắn ngày có kiểm soát
EMB ethambutol
FDC fixed dose combination: sự kết hợp liều thuốc cố định
FMH functional mutant homozygotes: đồng hợp tử đột biến chức
năng
GM-CSF granulocyte-macrophage-colony stimulating factor: yếu tố
kích thích đại thực bào - bạch cầu hạt
GKO gene knoch out
HLA human leukocyte antigen system: hệ thống kháng nguyên
bạch cầu ở ngƣời- hệ HLA
HNP1-3 human neutrophile peptides 1-3
HLPC high-performance liquid chromatography: sắc ký lỏng hiệu
năng cao
ICAM Intercellular Adhesion Molecule: phân tử dính nội bào
IFN interferon
IL interleukin
iNOS2 inducible nitric oxide synthase 2
xii
IUATLD International Union Against Tuberculosis and Lung Disease:
Hiệp hội chống lao và bệnh phổi quốc tế
INH (H) isoniazid
LAM lipoarabino mannan
LJ Lowenstein-Jensen: môi trƣờng đặc nuôi cấy vi khuẩn lao
MAC Mycobacterium avium complexes
MBL Mannose binding lectin: chất lectin gắn đƣờng mannose
MCP monocyte chemoattractant protein: protein hấp dẫn bạch cầu
đơn nhân
MDR-TB multidrug resistant tuberculosis: lao đa kháng thuốc
MHC major histocompatibility complexes: phức hợp hòa hợp mô
chủ yếu
MIP macrophage inflammatory protein: protein viêm đại thực bào
MTB Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn lao
MR mannose receptor: thụ thể đƣờng mannose
NFkB nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B
cells
NALC N – acetyl L-cysteine): hóa chất làm tan đàm
NO nitric oxide
NK natural killer: diệt tự nhiên
NTM Non tuberculosis mycobacteria: không phải lao
NTP National Tuberculosis Program: chƣơng trình chống lao
quốc gia
PAS para-aminosalicylic acid
PIM phosphatidylinositol mannoside
PZA pyrazinamid
PBMCs peripheral blood mononuclear cells: các tế bào đơn nhân ở
máu ngoại vi
PMN polymorphonuclear: bạch cầu đa nhân
KN kháng nguyên
KSĐ kháng sinh đồ
KTC khoảng tin cậy
RANTES regulated on activation normal T cell expressed and secreted
RNI reactive nitrogen intermediate: chất trung gian nitơ hoạt hóa
ROI reactive oxygen intermediate: chất trung gian oxy hoạt hóa
RMP rifampicin
xiii
RHZ thuốc kháng lao hỗn hợp 3 thành phần RMP-INH-PZA
SD Standard Deviation: độ lệch chuẩn
SM streptomycin
SP-TB sensitive positive tuberculosis: bệnh lao còn nhạy thuốc
TB tế bào
TCYTTG tổ chức y tế thế giới
TCR T cell receptor: thụ thể tế bào lympho T
TLR toll like receptor
TNF tumor necrosis factor: yếu tố gây hoại tử khối u
VDR vitamine D receptor: thụ thể vitamin D
VK vi khuẩn
WHO world heath organization: tổ chức y tế thế giới
XDR-TB extensively drug-tuberculosis: bệnh lao cực kháng
ZN Ziehl - Neelson
(-) âm tính
(+) dƣơng tính
xiv
Chƣơng 1: GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh lao đã đƣợc biết rõ từ hơn một thế kỷ nay và đƣợc xem là bệnh nan y
của thời đại, cho đến những năm 1950, các loại thuốc kháng sinh dùng chữa trị
bệnh lao tỏ ra rất có hiệu quả (Iseman, 2002), thì bệnh lao đã đƣợc các thầy thuốc
khống chế và kiểm soát bệnh một cách dễ dàng. Tuy nhiên, từ thập niên 1990 trở
lại đây, trên thế giới đã xuất hiện nhiều chủng trực khuẩn lao kháng thuốc, rất khó
chữa trị và đang có nguy cơ lây lan rất nhanh trong cộng đồng và hiện nay, lao
kháng thuốc đang trở thành một thách thức lớn đối với chƣơng trình phòng chống
lao toàn cầu và trong y học (Raja et al, 2011) vì nó làm gia tăng tỉ lệ tử vong ở
ngƣời bệnh.
Năm 2012, Tổ chức y tế thế giới (WHO) ƣớc tính có một phần ba dân số
tƣơng đƣơng với 2 tỷ ngƣời trên thế giới nhiễm vi khuẩn lao, trong đó có 8,6 triệu
ngƣời mắc bệnh lao với 1,3 triệu ngƣời chết. Hàng năm, trong số những ngƣời
nhiễm vi khuẩn lao, có khoảng 450.000 bệnh nhân mắc lao đa kháng thuốc (cụ
thể là thể lao phổi có vi khuẩn kháng với 2 loại thuốc chống lao hàng đầu
rifampicin và isoniazid), gây ra cái chết cho 170.000 ngƣời (WHO, 2013). Điều
này đã khiến bệnh lao trở thành một bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất so
với các loại bệnh nhiễm trùng khác trên thế giới (Truscott, 1993), (Daniel, 2006).
Hiện nay, tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn lao đã và đang là mối quan
tâm hàng đầu trong việc điều trị cho bệnh nhân lao, do mối tƣơng quan phức tạp
giữa yếu tố gây bệnh, ngƣời bệnh và nồng độ thuốc trong huyết tƣơng ảnh hƣởng
rất lớn đến kết quả điều trị. Có nhiều yếu tố góp phần tác động gây kháng thuốc
đã đƣợc đề cập đến, từ việc sử dụng thuốc không đúng cách của các bác sĩ điều trị
không chuyên nghiệp hoặc do nhận thức sai lầm của chính bản thân ngƣời bệnh,
bệnh nhân không tuân thủ chặt chẽ qui trình điều trị, nhƣ uống thuốc không đủ
liều, không đúng cách, không đủ thời gian hay tự ý ngƣng thuốc (Sharma and
Mohan, 2004) làm cho nồng độ thuốc chống lao trong huyết tƣơng bệnh nhân
không đủ cao để có thể tiêu diệt vi khuẩn lao và các quần thể vi khuẩn lao không
đƣợc tiêu diệt hết, thƣờng sẽ biến đổi, nhằm kháng với các thuốc chống lao bằng
nhiều cách, trong đó có việc thay đổi cấu trúc một số gen dẫn đến thất bại trong
điều trị (Faustini et al, 2006). Hiện nay, phác đồ điều trị bệnh lao đƣợc WHO đƣa
ra bao gồm 5 loại thuốc kết hợp với nhau đó là isoniazid (INH), rifampicin
(RMP), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM) và ethambutol (EMB). Với các
thuốc chống lao này, việc chữa khỏi bệnh lao có thể đạt đƣợc trên 95%; thêm vào
đó, việc kết hợp các thuốc trong phác đồ điều trị đã đem lại kết quả rất lớn trong
1
việc giải quyết vấn đề khẩn cấp về tình hình lao kháng thuốc hiện nay (Iseman,
2002). Tuy nhiên, trên thực tế, theo WHO cảnh báo, vẫn còn những bệnh nhân
điều trị bằng thuốc chống lao nhƣng không đem lại hiệu quả, điều này sẽ dẫn đến
là làm tăng tỷ lệ tử vong cho bệnh nhân lao, tăng gánh nặng bệnh tật cho cộng
đồng và xã hội. Tại sao lại xảy ra điều đó? Để trả lời câu hỏi này là vấn đề lớn
cho xã hội, đặc biệt cho ngành y tế và trên cơ sở đó, việc nghiên cứu tìm hiểu các
yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn lao là rất cần
thiết, nhằm có thể đề xuất biện pháp can thiệp đạt kết quả cao, giúp cho việc điều
trị bệnh nhân lao ngày càng có hiệu quả.
1.2 Giả thuyết khoa học, cách tiếp cận và mục tiêu của luận án
Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 quốc gia có tỷ lệ bệnh lao xuất hiện cao,
cũng là một trong 14/27 nƣớc có bệnh lao phổi đa kháng thuốc cao trên thế giới.
Theo nhận định của Raja (2011), thuốc chống lao giống nhƣ con dao hai lƣỡi,
thuốc có tác dụng diệt vi khuẩn, mặt khác thuốc cũng là nguyên nhân gây kháng
thuốc (Raja et al, 2011). Có nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn lao có khả năng
chống lại với các thuốc dùng để điều trị bệnh lao bằng cách thay đổi kiểu gen hoặc
làm bất hoạt hệ thống bảo vệ cơ thể của túc chủ thông qua cơ chế trốn thoát hiện tƣợng
thực bào hoặc làm giảm số lƣợng và chức năng các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch
chống vi khuẩn lao, khi nồng độ thuốc chống lao không đạt nồng độ chuẩn trong huyết
tƣơng theo khuyến cáo của chƣơng trình chống lao Quốc gia, có thể xảy ra đột biến
kháng thuốc dẫn đến hậu quả là thất bại trong điều trị chống lao (Williamson et al,
2011).
Mối lo ngại trong kiểm soát bệnh lao chính là làm thế nào để phát hiện sớm
bệnh lao kháng thuốc (Gillespie, 2002) và quản lý tốt việc điều trị bệnh nhân;
Việc này hiện nay đang gặp rất nhiều khó khăn. Năm 2012, có khoảng 75% số
bệnh nhân tại 27 quốc gia có bệnh lao kháng thuốc cao trên thế giới chƣa đƣợc
phát hiện và quản lý điều trị (WHO, 2013). Hiện nay, các quốc gia phát triển có
nền công nghệ sinh học hiện đại, đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong
chẩn đoán bệnh lao kháng thuốc nhằm khắc phục việc phát triển rất chậm của vi
khuẩn lao trong nuôi cấy, rút ngắn thời gian chẩn đoán xác định lao kháng thuốc
từ 4-10 tuần (qua cách nuôi cấy tự nhiên) xuống còn 1 ngày. Việc phát hiện sớm
các chủng lao kháng thuốc có ý nghĩa rất lớn trong điều trị bệnh, vì có thể áp
dụng phác đồ điều trị đúng, nhằm đạt tỷ lệ thành công cao trong điều trị bệnh
nhân lao kháng thuốc. Bên cạnh đó, mặc dù các vùng, miền khắp nơi trên thế giới
đều áp dụng phác đồ điều trị do WHO đƣa ra, nhƣng kết quả điều trị ở các nơi lại
rất khác nhau, do hiện tƣợng đột biến của vi khuẩn ở các nơi cũng khác nhau. Sự
2
khác nhau này có thể xảy ra ngay cả trong cùng một quốc gia (Sandgren et al,
2009), (Lishi Qian et al, 2002). Theo Sandgren et al (2009) cần có thêm nhiều
nghiên cứu về kiểu gen gây kháng thuốc của vi khuẩn lao, để có nhận định chính
xác hơn, đƣa ra khuyến cáo phù hợp hơn trong công tác phòng, chống bệnh lao
nói chung và lao đa kháng thuốc nói riêng; trong đó, xét nghiệm phát hiện kháng
thuốc rifampicin (RMP) đối với vi khuẩn lao là bắt buộc, bởi vì trong các loại
thuốc kết hợp điều trị bệnh lao, RMP là thuốc quan trọng ƣu tiên hàng đầu trong
chỉ định thuốc chống lao của các bác sĩ. Do đó, nếu vi khuẩn lao kháng với thuốc
RMP thì sẽ có đến trên 95% số bệnh nhân thuộc nhóm lao đa kháng thuốc
(Ormerod, 2005)
Việt Nam đã thực hiện các kỹ thuật nêu trên trong việc phát hiện nhanh
bệnh lao kháng thuốc (Đinh Ngọc Sỹ, 2011), trong đó, có phát hiện lao phổi đề
kháng thuốc RMP. Bệnh viện Lao và Bệnh phổi thành phố Cần Thơ là đơn vị đã
và đang sử dụng một máy Gene-Xpert có khả năng phát hiện lao phổi đề kháng
với thuốc RMP chỉ trong vòng 3 giờ bằng kỹ thuật nhận dạng các đột biến gây
kháng RMP. Tuy nhiên, hiện nay chƣa có công trình nghiên cứu nào để đánh giá
về việc phát hiện kiểu gen kháng thuốc RMP của vi khuẩn lao tại thành phố Cần
Thơ.
Mặt khác, nồng độ thuốc chống lao RMP không đạt chuẩn trong huyết
tƣơng có thể là điều kiện thuận lợi gây ra những kiểu gen đột biến kháng thuốc
khác nhau của vi khuẩn lao, điều này lại ít đƣợc các bác sĩ điều trị quan tâm.
Ngoài ra, theo WHO cảnh báo, lao kháng thuốc cũng đã xuất hiện với mức độ khá
cao trên những bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải
(HIV/AIDS); ở những bệnh nhân này, có sự giảm thiểu về số lƣợng và chất lƣợng
tế bào lympho T giúp đỡ, là tế bào miễn dịch đóng vai trò chính trong điều hòa
đáp ứng miễn dịch của cơ thể, dẫn đến tình trạng cơ thể trở nên đáp ứng kém với
thuốc chống lao và tạo điều kiện thuận lợi cho tính kháng thuốc của vi khuẩn lao
phát triển. Đây là cơ sở cho việc đặt vấn đề nghiên cứu về số lƣợng các tế bào
miễn dịch nhƣ là một yếu tố ảnh hƣởng đến sự kháng thuốc của vi khuẩn lao ở
bệnh nhân lao kháng thuốc. Từ các giả thuyết nghiên cứu trên, đề tài đƣợc thực
hiện nhằm các mục tiêu sau:
a. Xác định tỷ lệ kháng thuốc ở bệnh nhân lao phổi tái trị tại thành phố
Cần Thơ.
b. Tìm hiểu một số yếu tố ảnh hƣởng đến tính kháng thuốc của vi khuẩn
lao qua việc xác định (i) Các kiểu gen đột biến kháng thuốc rifampicin của
vi khuẩn lao. (ii) Nồng độ thuốc chống lao rifampicin trong huyết tƣơng
3
của bệnh nhân lao phổi tái điều trị (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới).
(iii) Số lƣợng các tế bào miễn dịch trong máu bệnh nhân lao phổi đa kháng
thuốc (so sánh với bệnh nhân lao phổi mới và ngƣời bình thƣờng làm đối
chứng).
1.3 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận án
Luận án đã cung cấp những số liệu cụ thể góp phần làm rõ tình hình dịch tễ
bệnh lao kháng thuốc, đặc biệt là dịch tễ học phân tử của lao phổi đa kháng thuốc
tại thành phố Cần Thơ. Ngoài ra, đề tài cũng cung cấp thêm những cơ sở khoa
học cho những giả thuyết về sinh bệnh học kháng thuốc của vi khuẩn lao tại thành
phố Cần Thơ, cụ thể:
Kết quả đề tài cho thấy tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn lao ở bệnh nhân tái
trị tại thành phố Cần Thơ cao hơn so với kết quả đã đƣợc chƣơng trình chống lao
Quốc gia công bố.
Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp số liệu về tần suất và các kiểu gen đột
biến kháng thuốc rifampicin của vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại Cần Thơ; tần
suất đột biến và các kiểu gen đột biến rất khác nhau khi so sánh với các công
trình nghiên cứu khác. Kết quả còn cho thấy, ngoài những kiểu gen đột biến đã
đƣợc công bố, chúng tôi còn phát hiện thêm 2 đột biến mới tại codon 510 và
codon 532 trên đoạn gen rpoB ở chủng vi khuẩn lao đa kháng thuốc tại thành phố
Cần Thơ. Đặc biệt, chúng tôi cũng đã phát hiện có 1 chủng vi khuẩn lao có sự
xuất hiện đột biến trên cả 7 codon, đây là kiểu đột biến mà chúng tôi chƣa thấy
công bố trên các tài liệu tham khảo nào cả trong cũng nhƣ ngoài nƣớc.
Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu cho thấy có sự giảm thiểu rất đáng lo ngại
về nồng độ thuốc rifampicin trong huyết tƣơng ở các bệnh nhân đang điều trị
thuốc chống lao và sự giảm đáng kể số lƣợng các tế bào lympho T chung, tế bào
T gây độc, tế bào T giúp đỡ và cả tế bào diệt tự nhiên ở các bệnh nhân lao đặc
biệt là lao phổi đa kháng thuốc. Từ đó, gợi ý rằng có thể đây là những yếu tố
thuận lợi làm phát triển đột biến kháng thuốc trên các bệnh nhân; và tình trạng
đột biến gây kháng thuốc này sẽ đƣợc duy trì và nhân lên theo sự phát triển của vi
khuẩn lao kháng thuốc.
Những kết quả này có thể làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp sau để khẳng
định sự ảnh hƣởng của các yếu tố nêu trên, góp phần cung cấp thêm thông tin
trong việc đánh giá, tiên lƣợng bệnh nhân lao phổi đa kháng thuốc trong tƣơng
lai.
4
1.4 Kết cấu của luận án
Luận án dài 115 trang, nội dung chính của luận án gồm 5 chƣơng: (i)
chƣơng 1: Giới thiệu (5 trang với 4 tiểu mục); (ii) chƣơng 2: Lƣợc khảo tài liệu
(34 trang với 6 tiểu mục); (iii) chƣơng 3: Phƣơng pháp nghiên cứu (20 trang có 2
tiểu mục); (iv) chƣơng 4: Kết quả và thảo luận (54 trang với 2 tiểu mục); (v)
chƣơng 5: Kết luận và đề nghị (2 trang với 2 tiểu mục).
Số bảng và hình trong nội dung chính gồm: 30 bảng và 37 hình, bài viết sử
dụng 113 tài liệu tham khảo, bao gồm 18 tài liệu tham khảo tiếng Việt và 95 tài
liệu tham khảo tiếng Anh.
5
Chƣơng 2: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Sơ lƣợc về lịch sử phát hiện bệnh lao
Bệnh lao đã có từ rất lâu cùng với lịch sử phát triển của xã hội loài ngƣời,
bệnh do một loại vi khuẩn có tên là Mycobacterium tuberculosis gây ra, đây là
loại vi khuẩn đã giết chết nhiều ngƣời hơn bất cứ loại vi khuẩn gây bệnh nào khác
trên khắp thế giới (Daniel, 2006). Chi Mycobacterium đã có từ hơn 150 triệu năm
trƣớc, nó đƣợc chứng minh đã hiện diện rất sớm từ 5000 năm trƣớc đây ở Ai Cập,
3300 năm ở Ấn Độ và 2300 năm ở Trung Hoa (Daniel, 2006). Lần đầu tiên trên
các tài liệu của Hy Lạp, bệnh lao xuất hiện dƣới tên gọi là “Phthisis hay
Consumption” Vào khoảng năm 460 trƣớc công nguyên, Hyppocrates đã khẳng
định bệnh lao là bệnh gây lây lan cho nhiều ngƣời nhất trong thời gian đó, những
bệnh nhân mắc phải căn bệnh này đều ở lứa tuổi từ 18 đến 35 và hầu hết đều tử
vong. Lúc bấy giờ, Hyppocrates cũng đã cảnh báo các bác sĩ không nên thăm
khám cho những bệnh nhân lao trong giai đoạn bệnh đang tiến triển, để bảo vệ
cho chính bản thân của các bác sĩ. Mặc dù Aristotle (384-322 BC) đã lƣu ý đây là
bệnh truyền nhiễm, nhƣng những ngƣời Hy Lạp lúc đó vẫn cho rằng bệnh lao là
do di truyền. Về sau, Clarissimus Galen (131-201 AD), một bác sĩ nổi tiếng sau
Hypopcrates, đã xác định bệnh lao là do ổ loét trong phổi, ngực hoặc họng đi kèm
ho, sốt nhẹ và khạc ra mủ, ông cũng mô tả đây là một bệnh của tình trạng suy
dinh dƣỡng (Pease, 1940 trích dẫn của Juan Carlos Palomino, 2007).
Tại Châu Âu, do việc bùng nổ dân số và sự phát triển quá nhanh của các
thành phố lớn, đã khiến châu lục này trở thành trung tâm của dịch bệnh lao có lẽ
từ đầu thế kỷ thứ 17 và tiếp tục cho đến 200 năm sau đó, bệnh lao đƣợc biết đến
nhƣ “Great White Plague” là nguyên nhân chủ yếu dẫn đến tử vong và cái chết do
bệnh lao là điều không thể tránh khỏi. Ở Châu Âu và Bắc Mỹ, những đặc điểm
phổ biến của các thành phố lớn lúc bấy giờ nhƣ mật độ dân cƣ đông đúc, điều
kiện vệ sinh thiếu thốn, chính là những nguyên nhân tạo ra dịch bệnh lao tại hai
châu lục trên, dịch bệnh này tiếp tục âm ỉ lan rộng ra những châu lục khác do xu
hƣớng thực dân hóa và phong trào thám hiểm để khám phá các vùng đất mới của
ngƣời Châu Âu. Những ngƣời Châu Âu di cƣ đã mang bệnh lao cùng với họ tới
những vùng đất mà họ mới đến (Juan Carlos Palomino, 2007). Có khoảng một
phần tƣ dân số Châu Âu đã chết vì bệnh lao, nghiên cứu ở một bệnh viện tại Paris
đã ghi nhận, trong số 696 thi hài đƣợc khám nghiệm đã có đến 250 thi hài chết do
mắc phải bệnh lao (Dubos, R and J. Dubos, 1952 trích dẫn của Smith Issar, 2003).
Trƣớc khi Columbus phát hiện ra Châu Mỹ, có rất ít ngƣời dân địa phƣơng
mắc bệnh lao. Mãi cho đến năm 1880, bệnh lao bùng phát chủ yếu trong số những
6