Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm khả năng sinh tổng hợp gsh của nấm men saccharomyces cerevisiae
- 148 trang
- file .pdf
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ
làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của
nấm men Saccharomyces cerevisiae
TRẦN THỊ HOA
[email protected]
Ngành Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Trần Liên Hà
Chữ ký của GVHD
TS. Trương Hương Lan Chữ ký của GVHD
Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
HÀ NỘI, 10/2022
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
Đề tài: Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp
GSH của nấm men Saccharomyces cerevisiae
Tác giả luận văn: Trần Thị Hoa Khoá: 2020B
Ngành: Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Liên Hà
TS. Trương Hương Lan
Ngày ....... tháng ....... năm 2022
Cán bộ hướng dẫn 1 Cán bộ hướng dẫn 2
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
LỜI CẢM ƠN
Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của
nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Với tình cảm sâu sắc và chân thành nhất, cho
phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân và cơ quan đã tạo
điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường Đại học
Bách khoa Hà Nội nói chung, các thầy cô trong viện Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm nói riêng đã dạy dỗ cho tôi kiến thức về các môn đại cương cũng
như các môn chuyên ngành, giúp tôi có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận
tình chu đáo của thầy cô, đến nay tôi đã có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ khoa
học, đề tài:
“Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp
GSH của nấm men Saccharomyces cerevisiae”
Đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trần Liên Hà
và TS. Trương Hương Lan – người đã dìu dắt, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong
suốt khoảng thời gian học tập và nghiên cứu đề tài.
Và không thể thiếu sự hướng dẫn tận tâm của các cô chú, anh chị tại bộ môn
Thực phẩm và Dinh dưỡng, Viện công nghiệp thực phẩm nơi tôi thực hiện luận
văn.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn yêu thương, hỗ trợ tôi về mọi mặt để
tôi có thể yên tâm rèn luyện, học tập tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Với kinh nghiệm còn hạn chế, luận văn này không thể tránh được những thiếu
sót. Tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo để
tôi có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn công tác
thực tế sau này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Học viên
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN
Mục đích của luận văn nghiên cứu này nhằm khảo sát, lựa chọn các nguyên
liệu cho môi trường cải tiến làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của chủng nấm
men S. cerevisiae YM22, tiếp đó tiến hành tối ưu hoá các thông số nhiệt độ, pH,
thời gian nuôi cấy, tỷ lệ cấp giống đã được khảo sát sơ bộ trước đó bằng việc thiết
kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp với mô hình Box-
Behnken (BBD). Tiến hành khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung của axit amin
tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng. Sau cùng là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình trích ly GSH từ sinh khối nấm men bằng cồn ethanol. Nghiên cứu đã
chọn được môi trường cải tiến làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của chủng S.
cerevisiae YM22 bao gồm các thành phần: Rỉ đường, glucose, sucrose; cao đậu
tương, cao nấm men, cao malt, ZnSO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4.
Đồng thời đã tìm ra điểm tối ưu của 4 thông số nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ
lệ cấp giống mà tại đó hàm lượng GSH cao gấp 3,6 lần so với ban đầu. Tiếp đó, đã
xác định được thời điểm và nồng độ bổ sung thích hợp của L-cysteine và natri
citrate. Nghiên cứu cũng đã khảo sát sơ bộ về 4 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
trích ly GSH từ sinh khối nấm men sử dụng cồn ethanol, bao gồm: ảnh hưởng của
nồng độ ethanol, nồng độ cơ chất/ethanol, nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly và
đưa ra nhận xét về sự ảnh hưởng của các yếu tố này tới quá trình thu nhận GSH từ
sinh khối nấm men. Luận văn có thể làm tài liệu tham khảo cho các sinh viên trong
các trường đại học, các độc giả muốn nghiên cứu về khảo sát và tối ưu hoá các
thông số của quá trình lên men. Trong khuân khổ của luận văn này chắc chắn chưa
thể giải quyết triệt để mục tiêu đề tài, rất mong nhận được sự giúp đỡ và đóng góp
ý kiến của quý thầy cô trong hội đồng để đề tài được hoàn chỉnh hơn.
Học viên
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU ..................................................................................... 9
DANH MỤC HÌNH VẼ ........................................................................................ 11
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. 12
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN.......................................................................................... 2
1.1. Glutathione .................................................................................................. 2
1.1.1. Cấu trúc của glutathione ....................................................................... 2
1.1.2. Chức năng của glutathione ................................................................... 3
1.2. Công nghệ sản xuất glutathione .................................................................. 4
1.2.1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione.............................................. 4
1.2.2. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học ............................... 4
1.2.3. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp enzyme ............................... 8
1.2.4. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp lên men vi sinh vật ........... 11
1.3 Giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp glutathione ở vi sinh
vật ..................................................................................................................... 14
1.3.1. Cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy ........................................... 14
1.3.2. Tối ưu các thông số của quá trình lên men......................................... 15
1.3.3. Bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng ............... 15
1.4. Hiện trạng sản xuất glutathione bằng phương pháp vi sinh ...................... 16
1.5. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và sự sinh tổng hợp GSH .............. 18
1.5.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................. 18
1.5.2. Ứng dụng công nghệ của nấm men Saccharomyces cerevisiae ......... 19
1.5.3. Sinh tổng hợp glutathione ở Saccharomyces cerevisiae .................... 20
1.5.4. Vai trò của glutathione đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae 23
1.6. Thu nhận glutathione từ sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae . 24
1.7. Ứng dụng của glutathione ......................................................................... 26
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 28
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ................................................... 28
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................... 28
2.1.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 29
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 29
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 29
2.2.1. Phương pháp phân tích ....................................................................... 29
2.2.2. Phương pháp thiết kế thí nghiệm ........................................................ 32
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37
3.1. Khảo sát và lựa chọn các nguyên liệu thay thế để tạo môi trường cải tiến
trong sinh tổng hợp GSH của nấm men ........................................................... 37
3.1.1. Nguồn dinh dưỡng cacbon ................................................................. 37
3.1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ ....................................................................... 39
3.1.3. Nguyên tố vi lượng ............................................................................. 42
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của axit amin tới quá trình sinh tổng hợp GSH bởi
nấm men S. cerevisiae YM22 ....................................................................... 43
3.2. Nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hoá điều kiện lên men sinh tổng hợp
glutathione. ....................................................................................................... 45
3.2.1. Tối ưu hoá điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ nhân giống
...................................................................................................................... 45
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ thông khí tới quá trình sinh tổng hợp
GSH của nấm men S. cerevisiae YM22 ....................................................... 50
3.2.3. Dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S. cerevisiae YM22..... 51
3.3. Khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ
trợ năng lượng .................................................................................................. 53
3.3.1. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung L-cysteine đến quá trình lên men
sinh tổng hợp GSH ....................................................................................... 53
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ L-cysteine đến quá trình lên men
sinh tổng hợp GSH ....................................................................................... 54
3.3.3. Nghiên cứu lựa chọn thời điểm và nồng độ bổ sung natri citrate....... 55
3.3.4. Động học sinh trưởng chủng nấm men S. cerevisiae YM22 .............. 57
3.4. Khảo sát điều kiện thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men bằng phương
pháp trích ly cồn ethanol .................................................................................. 58
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cồn ethanol đến hiệu suất trích ly GSH ...... 59
3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi ethanol đến hiệu suất trích
ly GSH .......................................................................................................... 60
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly GSH ............. 61
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly GSH ............ 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 64
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................ 65
PHỤ LỤC............................................................................................................. 73
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1. Xu hướng phát triển trong công nghệ sản xuất GSH............................ 8
Bảng 1.2. Tổng hợp các nghiên cứu sản xuất GSH bởi vi sinh vật bằng phương
pháp enzyme........................................................................................................... 9
Bảng 1.3. Các hướng nghiên cứu khác nhau về việc tăng cường sinh khối và nồng
độ glutathione trong sản xuất GSH của vi sinh vật. ............................................. 11
Bảng 1.4. Thống kê các nghiên cứu về sinh tổng hợp GSH bằng vi sinh vật tái tổ
hợp ........................................................................................................................ 13
Bảng 1. 5. Các chiến lược và xu hướng sản xuất GSH bằng lên men vi sinh vật
hiện nay ................................................................................................................ 17
Bảng 1. 6. So sánh quá trình thu hồi GSH từ sinh khối nấm men bằng phương pháp
trích ly cồn ethanol và sử dụng nước nóng .......................................................... 25
Bảng 1.7. Các ứng dụng và cơ chế tác dụng của glutathione và các sản phẩm liên
quan ...................................................................................................................... 27
Bảng 2. 1. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hoá các biến ......................................... 34
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon thay thế tới sự phát triển và khả năng lên
men GSH của S. cerevisiae YM22. ...................................................................... 38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường thay thế glucose tới khả năng phát triển và
sinh tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................. 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau tới sự phát triển và khả năng lên
men GSH của S. cerevisiae YM22 ....................................................................... 40
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ cao chiết đậu tương tới khả năng phát triển và sinh
tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 .................................................... 41
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của một số loại muối khoáng vi lượng (FeSO4, ZnSO4,
MnSO4) tới sự sinh tổng hợp GSH ...................................................................... 42
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối ZnSO4 đến khả năng sinh tổng hợp GSH
bởi S. cerevisiae YM22 ........................................................................................ 43
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung các loại axit amin khác nhau đến khả năng
sinh tổng hợp glutathione của chủng S. cerevisiae YM22. .................................. 44
Bảng 3. 8. Các mức thí nghiệm của biến số ......................................................... 45
Bảng 3. 9. Ma trận thực nghiệm và kết quả thực nghiệm theo ma trận ............... 45
Bảng 3. 10. Bảng kết quả phân tích hồi quy tuyến tính ....................................... 46
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình sinh tổng hợp GSH của nấm
men S. cerevisiae YM22 ...................................................................................... 50
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí tới quá trình sinh tổng hợp GSH của
nấm men S. cerevisiae YM22 .............................................................................. 51
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung cơ chất L-cysteine đến quá trình lên
men sinh tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22..................................... 53
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất L-cysteine đến quá trình lên men sinh tổng
hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................................ 54
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung natri citrate khác nhau tới sự sinh
tổng hợp GSH ở chủng S. cerevisiae YM22 ........................................................ 56
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng natri citrate đến quá trình lên men sinh tổng
hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................................ 56
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc của glutathione......................................................................... 2
Hình 1.2. Cấu trúc của glutathione disulfide ......................................................... 3
Hình 1.3. Tóm tắt về chức năng của glutathione ................................................... 3
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tổng hợp GSH từ N-benzyloxycarbonyl cysteine ........ 5
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-
cystine..................................................................................................................... 6
Hình 1. 6. Các con đường chuyển hoá liên quan đến GSH và vai trò sinh lý của
GSH ở vi sinh vật ................................................................................................... 7
Hình 1.7. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................... 19
Hình 1.8. Chu trình γ-glutamyl ............................................................................ 21
Hình 1.9. Quá trình chuyển hoá GSH ở nấm men S. cerevisiae .......................... 22
Hình 2. 1. Hình thái chủng S. cerevisiae YM22 .................................................. 28
Hình 2. 2. Bố trí thí nghiệm sinh tổng hợp glutathione từ nấm men S. cerevisiae
YM22 ................................................................................................................... 32
Hình 3.1. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố nhiệt độ (oC) và pH cố
định ....................................................................................................................... 48
Hình 3.2. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố nhiệt độ và thời gian
nuôi cấy (giờ) cố định .......................................................................................... 48
Hình 3. 3. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố tỷ lệ cấp giống và nhiệt
độ (pH) cố định .................................................................................................... 49
Hình 3.4. Động học sinh trưởng của chủng S. cerevisiae YM22......................... 52
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn động học của quá trình lên men theo mẻ của chủng S.
cerevisiae YM22 .................................................................................................. 58
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ cồn tới khả năng thu nhận
GSH từ sinh khối nấm men .................................................................................. 59
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối sinh khối khô/dung
môi cồn tới khả năng thu nhận GSH .................................................................... 60
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly tới khả năng thu nhận
GSH ...................................................................................................................... 62
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian trích ly tới khả năng thu
nhận GSH ............................................................................................................. 62
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADP : Adenosine diphosphat
ATP : Adenosine triphosphate
BBD : Box–Behnken design
CCD : Central composite design
FB : Feed back
FF : Feed forward
γ-GCS/GSH II : Gamma-glutamylcysteine synthetase
GSH : Glutathione
GSSG : Glutathione disulfide
RSM : Response surface methodology
SKK : Sinh khối khô
γ-GC/GSH I : γ-Glutamylcystein
γ-GT : γ-Glutamyltranspeptidase
γ-GTP : Glutamyltranspeptidase
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
LỜI MỞ ĐẦU
Glutathione (GSH) là thành phần thiol-nonprotein dồi dào nhất trong cơ thể
sinh vật sống, đặc biệt chiếm ưu thế trong tế bào nhân thực. Có tới 90% glutathione
hoạt động ở dạng khử trong tế bào (vi khuẩn), mô, plasma. GSH tham gia và đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, tuy nhiên có thể khái
quát vai trò của GSH trong 3 chức năng chính: chống oxy hoá, tăng cường miễn
dịch và khử độc tế bào trong các sinh vật nhân thực bậc cao. Do đó GSH được ứng
dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh và có tiềm năng to lớn sử dụng trong ngành
thực phẩm và mỹ phẩm.
Theo các nhà khoa học, việc thiếu hụt GSH có liên quan đến nhiều vấn đề
sức khoẻ nghiêm trọng. Chẳng hạn như hội chứng suy giảm miễn dịch HIV, xơ
gan, bệnh phổi, viêm dạ dày và tuyến tuỵ, bệnh tiểu đường, các bệnh lý về thần
kinh và lão hoá.
Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất GSH là lên men bởi
nấm men Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae. GSH được tổng hợp trong
tế bào nấm men (nội bào), và chỉ tiết một lượng nhỏ ra ngoài môi trường nuôi cấy.
GSH tinh khiết được thu nhận bằng cách chiết tách từ sinh khối nấm men, tinh
sạch và tạo chế phẩm dạng dung dịch hay bột sấy khô.
Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm chứa GSH, được sử
dụng rộng rãi như thực phẩm bổ sung, viên uống chứa GSH chống lão hoá trong
công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các sản phẩm trên cũng đã được tiêu thụ tại
Việt Nam, tuy nhiên chủ yếu là các mặt hàng nhập khẩu với giá thành cao.
Chính vì vậy, việc tìm ra giải pháp công nghệ giúp cải tiến, hoàn thiện quá
trình sản xuất GSH, nhằm hạ giá thành sản xuất là điều cần thiết, là mục tiêu mà
các nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp trên thế giới nói chung và Việt Nam
nói riêng đang hướng tới.
HVTH: Trần Thị Hoa
1
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Glutathione
1.1.1. Cấu trúc của glutathione
Glutathione là một chất chống oxy hoá trong cơ thể sống. Đây là một
tripeptide bao gồm các đơn phân L-glutamate, L-cysteine và glycine (hình 1.1).
GSH có thể được tìm thấy trong nhiều loại động thực vật, trong đó được tìm thấy
nhiều nhất trong nấm men, mầm lúa mạch, và gan động vật [44]. Cấu trúc của GSH
chứa một nhóm thiol có tính khử mạnh (R-SH) . Glutathione ổn định ở trạng thái
rắn nhưng dễ bị oxy hoá trong môi trường nước. Ở dạng oxy hoá, glutathione
disulfide (GSSG) được minh hoạ ở hình 1.2. Dạng oxy hoá của của GSH được liên
kết bằng liên kết disulfide, thu được bằng cách khử hydro ở hai nguyên tử GSH.
GSSG bị khử thành GSH bằng enzyme glutathione reductase [31]. Phương trình
(1.1) thể hiện phản ứng hoá học này [43],[51].
-2H
2GSH GSSG (1.1)
+2H
Glutathione có thể tồn tại cả ở trạng thái khử và trạng thái oxy hoá trong các
tế bào, mô và màng plasma [4]. Trong tế bào và mô khoẻ mạnh, có hơn 90% GSH
tồn tại dưới dạng khử và khoảng dưới 10% tồn tại dưới dạng oxy hoá. Tỷ lệ chuyển
đổi GSSG – GSH thường được coi là một dấu hiệu của sự mất cân bằng oxy hoá
[21],[32].
Hình 1.1. Cấu trúc của glutathione [4]
HVTH: Trần Thị Hoa
2
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
O NH2
H
HO N OH
N
H
O O O
S
S
O O O
H
N
HO N OH
H
NH2 O
Hình 1.2. Cấu trúc của glutathione disulfide [4]
1.1.2. Chức năng của glutathione
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý quan trọng, thể hiện trong hình 1.3.
GSH liên quan tới quá trình chống sự mất cân bằng oxy hoá; vận chuyển axit amin;
ổn định hoạt tính enzyme; giải độc các chất ngoại bào và xenobiotic; chuyển hoá
nitơ và lưu huỳnh [55],[57].
Hình 1.3. Tóm tắt về chức năng của glutathione [58]
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, có thể tóm tắt trong ba
khía cạnh chính: chống oxy hóa, chống lại các phân tử ngoại lai và tăng cường
miễn dịch [16],[56]. Các chức năng sinh lý này khiến GSH trở thành một loại sinh
phẩm quan trọng dùng trong điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ gan, nhiễm
HVTH: Trần Thị Hoa
3
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
HIV và viêm tuyến tụy [35],[83]. Ngày nay, GSH đã được sử dụng trong ngành
công nghiệp mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm.
1.2. Công nghệ sản xuất glutathione
1.2.1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione
Glutathione được phát hiện lần đầu tiên bởi J.de Rey-Paihade vào năm 1888
từ cao nấm men và nhiều loại mô động vật (mô cơ xương và gan bò, cơ xương của
cá, ruột non và não của cừu) và trong lòng trắng trứng. J.de Rey-Paihade còn đặt
tên cho hợp chất này là philothion với ý nghĩa là tình yêu và lưu huỳnh trong tiếng
Hy Lạp [62]. Năm 1921, Hopkins đã xác định được thành phần của philothion
phân lập từ gan, cơ xương và nấm men và cho rằng đây là một dipeptide có chứa
cysteine và glutamate. Tuy nhiên, Hopkins và cộng sự đã bỏ qua sự có mặt của
glycine trong cấu trúc của philothion. Và để tôn vinh lịch sử phát hiện ra
philothion, Hopkins đã đặt tên cho hợp chất này là ‘glutathione’. Dựa trên hàm
lượng nitơ và lưu huỳnh có trong GSH được phân lập từ nấm men, máu và gan,
năm 1927, Hunter và Eagles đã chỉ ra rằng GSH không phải là một dipeptide chỉ
có chứa glutamate-cysteine mà là một tripeptide chứa glutamate-cysteine và một
phân tử amino axit trọng lượng phân tử thấp (có thể là serine). Bằng cách sử dụng
phương pháp thuỷ phân axit, năm 1929 Hopkins đã xác định được cấu trúc
tripeptide bao gồm glutamate, cysteine và glycine của GSH. Và kết quả này được
củng cố bởi nghiên cứu độc lập của tác giả Kendall và cộng sự vào năm 1929 và
1930. Dựa trên thí nghiệm chuẩn độ GSH trong nước và formaldehyde cũng như
các giá trị pK quan sát được, năm 1929, Pirie và Pinhey đã báo cáo cấu trúc của
GSH là γ-glutamate – cysteine – glycine. Cấu trúc của GSH đã được xác nhận một
lần nữa vào năm 1935 bởi Mead và Harington thông qua tổng hợp hoá học từ N-
carbobenzoxycystine và glycine ethyl ester. Một năm sau đó, quá trình tổng hợp
hoá học khác của GSH được thực hiện bởi Vigneaud và Miller sử dụng S-
benzylcysteinylglycine metyl este và hợp chất acyl clorua của N-
carbobenzoxyglutamate- α-methyl ester. Trong suốt nửa thế kỷ trước, GSH được
tìm thấy ở hầu khắp các tế bào. Những hợp chất liên quan đã được báo cáo tới hiện
tại bao gồm γ-Glu-Cys-Gly-essenceidine ở E. coli và (γ-Glu-Cys) n-Gly trong thực
vật [1],[84].
1.2.2. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học
1.2.2.1. Phương pháp tổng hợp từ N-benzyloxycarbonyl cysteine
HVTH: Trần Thị Hoa
4
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Quá trình tổng hợp glutathione được mô tả lần đầu tiên bởi Harrington và
Mead (Hình 1.4) như sau: N-benzyloxycarbonyl cysteine 1 được chuyển đổi thành
acyl clorua 2 và sau đó liên kết với glycine ethyl ester 3, sản phẩm 4 được xử lý
với Phosphonium iodide trong axit acetic được chuyển thành cysteylglycyl ethyl
ester 5 được phân tách thuận tiện dưới dạng hydroiodide. Sau đó axit N-
benzyloxycarbonylglutamic 6 được chuyển thành anhydrit N-benzyloxycarbonyl
glutamic acid 7. Xử lý thành phần 7 bởi photpho pentaclorua để tạo acyl clorua 8.
Sau đó acyl clorua 8 sẽ kết hợp với cysteylglycyl ethyl ester 5 để tạo ra ester 9.
Nhóm chức ester sau đó sẽ được loại bỏ khỏi 9 bằng cách thuỷ phân cẩn thận trong
dung dịch kiềm và axit được loại ra sẽ được xử lý với phosphonium iodide dưới
điều kiện thông thường. Từ hỗn hợp phản ứng, thu được lượng nhỏ tripeptide
glutathione 10 được chứng minh là giống nhau về mọi mặt với một mẫu GSH thu
được từ các nguồn tự nhiên [1].
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ N-benzyloxycarbonyl
cysteine [1]
HVTH: Trần Thị Hoa
5
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
1.2.2.2. Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine
Berse và cộng sự (1959) đã mô tả phương pháp sản xuất glutathione (Hình
1.5). Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine 1 được ngưng tụ với glycine ethyl ester
2 trong sự có mặt của N,N’-dicyclohexylcarbodiimide; ester trung gian 3 bị khử
một phần để phá vỡ nhóm amino của L-cysteine mà không phân cắt liên kết
disulfate của nó. Kết quả dietyl L-cysteinyl diglycinat 4 được ngưng tụ với 2 đương
lượng mol của p-nitrocarbobenzoxy-L-glutamic 5 để tạo ra ester 6, sau đó cấu trúc
GSH được hình thành. Quá trình xà phòng hoá (a) và sự khử một phần (b) của 6
tạo ra GSH oxy hoá. Quá trình hydro hoá với xúc tac paladi tạo ra GSH 7 [7].
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp Glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy)
L-cystine [7]
Mặc dù, sản xuất GSH bằng phương pháp hoá học đã được thương mại hoá
vào những năm 1950 của thế kỷ trước, nhưng sản phẩm tạo ra bởi phương pháp
này thường là hỗn hợp racemic bao gồm cả hai dạng đồng phân D- và L-. Bởi vì,
chỉ có đồng phân dạng L mới có chức năng sinh lý, do đó đòi hỏi thêm giải pháp
tối ưu để tách đồng phân dạng L ra khỏi hỗn hợp với đồng phân dạng D.
HVTH: Trần Thị Hoa
6
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Dựa trên sự nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp GSH trong gan và các đặc
trưng của quá trình này, năm 1949 Bloch đã khám phá ra con đường sản xuất GSH
bằng phương pháp enzyme và lên men vi sinh vật. Theo đó, GSH được tổng hợp
bằng hai phản ứng enzyme phụ thuộc ATP kế tiếp nhau [44]. Đầu tiên dipeptide
γ-glutamylcysteine (γ-GC) được tổng hợp từ axit glutamic và L-cysteine bởi
enzyme dipeptide γ-glutamylcysteine synthetase (cũng được biết đến với tên gọi
glutamate-cysteine ligase, EC 6.3.2.2, GSH I). Trong bước thứ 2, glycine được gắn
vào vị trí C cuối của γ-glutamylcysteine (γ-GC) bởi glutathione synthetase (EC
6.3.2.2, GSH II) để tạo thành GSH. Thông thường, hoạt động của GSH I bị ức chế
phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH, bảo đảm hàm lượng GSH ở
mức độ sinh lý [35]. Trong khi đó, GSH nội bào có thể bị phân huỷ bởi
glutamyltranspeptidase (γ-GTP) để tạo thành gốc γ-glutamyl – có vai trò quan
trọng trong vận chuyển amino axit. Để sản xuất quá mức GSH sử dụng xúc tác
sinh học hoặc lên men vi sinh vật cần phải giải phóng GSH I khỏi sự ức chế phản
hồi bởi GSH cùng với đó là sự bất hoạt hoặc loại bỏ enzyme γ-GTP [46]. Hình 1.6
cung cấp một cái nhìn tổng quan về sinh hoá, cho thấy các con đường sinh tổng
hợp, chuyển hoá và minh hoạ các vai trò sinh lý của GSH.
Hình 1. 6. Các con đường chuyển hoá liên quan đến GSH và vai trò sinh lý
của GSH ở vi sinh vật [35]
(Cys: cysteine, Gly: glycine, Glu: glutamate, G6PDH: glucose-6-
phosphate dehydrogenase, GPx: glutathione peroxidase, GR: glutathione
reductase, GRX: glutaredoxin, GSH I: γ-glutamylcysteine synthetase, GSH II:
glutathione synthetase, GTP: γ-glutamyltransferase, R-OOH: các peroxide, R-
OH các peroxide bị khử, S–S: liên kết disulfide).
HVTH: Trần Thị Hoa
7
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Bảng 1.1 tóm tắt xu hướng phát triển trong công nghệ sản xuất GSH. Các
nghiên cứu về sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme hay lên men rất thịnh
hành ở giai đoạn 1976-1985; quá trình sản xuất GSH bằng phương pháp lên men
bởi nấm men được thương mại hoá vào đầu những năm 1980. Tới hiện tại, xu
hướng nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu quá trình lên men cũng như tạo biến
chủng siêu tổng hợp GSH ở vi khuẩn.
Bảng 1. 1. Xu hướng phát triển trong công nghệ sinh tổng hợp GSH [35]
Xu hướng phát triển của các nghiên cứu về sản xuất Thời kỳ
glutathione
Sử dụng nấm men (chủ yếu Saccharomyces cerevisiae và 1976 – 1985
Candida utilis) để sản xuất nấm men bằng phương pháp
lên men hoặc enzyme
Tinh sạch glutathione từ các hệ thống sinh học 1976 – 1987
Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sản sinh glutathione để 1978 – 1991
sử dụng trong phương pháp enzyme
Kỹ thuật gen ở E. coli và tạo chủng E. coli tái tổ hợp để sản 1982 – 1990
xuất GSH
Tạo chủng S. cerevisiae tái tổ hợp để sản xuất GSH 1986 – 1990
Tối ưu hoá và kiểm soát quá trình lên men sinh tổng hợp 1991 – hiện tại
glutathione
Kỹ thuật trao đổi chất để sinh tổng hợp glutathione ở vi 2001 – hiện tại
khuẩn
1.2.3. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp enzyme
Đây là một trong các phương pháp được tiếp cận để sản xuất GSH. Về nguyên
tắc, các yếu tố cần thiết để cấu thành một hệ thống tổng hợp GSH bởi enzyme bao
gồm: các enzyme GSH I, GSH II, các axit amin tiền chất (L-glutamate, L-cysteine,
glycine), ATP, các co-factor cần thiết (Mg2+) để duy trì hoạt tính của GSH I và
GSH II, cùng với đó là mức pH thích hợp (thường là pH 7,5). Bảng 1.2 trình bày
tổng quan về phương pháp enzyme sản xuất GSH bằng cách sử dụng tế bào nguyên
vẹn hoặc enzyme thô. Từ thông tin được thu thập cho thấy, khi sử dụng nấm men
S. cerevisiae thì không cần bổ sung thêm ATP, tuy nhiên điều này là ngược lại nếu
sử dụng vi khuẩn hoặc enzyme thô. Qua đó có thể khẳng định, ở S. cerevisiae có
một hệ thống tái tạo ATP mạnh mẽ của quá trình đường phân để bù đắp cho sự
tiêu thụ ATP. Đồng thời việc gia tăng tính thấm của thành tế bào (gây ra bởi quá
HVTH: Trần Thị Hoa
8
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ
làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của
nấm men Saccharomyces cerevisiae
TRẦN THỊ HOA
[email protected]
Ngành Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: PGS. TS. Trần Liên Hà
Chữ ký của GVHD
TS. Trương Hương Lan Chữ ký của GVHD
Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
HÀ NỘI, 10/2022
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
Đề tài: Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp
GSH của nấm men Saccharomyces cerevisiae
Tác giả luận văn: Trần Thị Hoa Khoá: 2020B
Ngành: Công nghệ Sinh học
Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Trần Liên Hà
TS. Trương Hương Lan
Ngày ....... tháng ....... năm 2022
Cán bộ hướng dẫn 1 Cán bộ hướng dẫn 2
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
LỜI CẢM ƠN
Để luận văn này đạt kết quả tốt đẹp, tôi đã nhận được sự hỗ trợ, giúp đỡ của
nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Với tình cảm sâu sắc và chân thành nhất, cho
phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả các cá nhân và cơ quan đã tạo
điều kiện giúp đỡ trong quá trình học tập và nghiên cứu.
Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường Đại học
Bách khoa Hà Nội nói chung, các thầy cô trong viện Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm nói riêng đã dạy dỗ cho tôi kiến thức về các môn đại cương cũng
như các môn chuyên ngành, giúp tôi có được cơ sở lý thuyết vững vàng và tạo điều
kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Với sự quan tâm, dạy dỗ, chỉ bảo tận
tình chu đáo của thầy cô, đến nay tôi đã có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ khoa
học, đề tài:
“Nghiên cứu một số giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp
GSH của nấm men Saccharomyces cerevisiae”
Đặc biệt tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Trần Liên Hà
và TS. Trương Hương Lan – người đã dìu dắt, giúp đỡ và đồng hành với tôi trong
suốt khoảng thời gian học tập và nghiên cứu đề tài.
Và không thể thiếu sự hướng dẫn tận tâm của các cô chú, anh chị tại bộ môn
Thực phẩm và Dinh dưỡng, Viện công nghiệp thực phẩm nơi tôi thực hiện luận
văn.
Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình đã luôn yêu thương, hỗ trợ tôi về mọi mặt để
tôi có thể yên tâm rèn luyện, học tập tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội.
Với kinh nghiệm còn hạn chế, luận văn này không thể tránh được những thiếu
sót. Tôi rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô giáo để
tôi có điều kiện bổ sung, nâng cao kiến thức của mình, phục vụ tốt hơn công tác
thực tế sau này.
Hà Nội, ngày tháng năm 2022
Học viên
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
TÓM TẮT NỘI DUNG LUẬN VĂN
Mục đích của luận văn nghiên cứu này nhằm khảo sát, lựa chọn các nguyên
liệu cho môi trường cải tiến làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của chủng nấm
men S. cerevisiae YM22, tiếp đó tiến hành tối ưu hoá các thông số nhiệt độ, pH,
thời gian nuôi cấy, tỷ lệ cấp giống đã được khảo sát sơ bộ trước đó bằng việc thiết
kế thí nghiệm theo phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) kết hợp với mô hình Box-
Behnken (BBD). Tiến hành khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung của axit amin
tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng. Sau cùng là khảo sát các yếu tố ảnh hưởng
đến quá trình trích ly GSH từ sinh khối nấm men bằng cồn ethanol. Nghiên cứu đã
chọn được môi trường cải tiến làm tăng khả năng sinh tổng hợp GSH của chủng S.
cerevisiae YM22 bao gồm các thành phần: Rỉ đường, glucose, sucrose; cao đậu
tương, cao nấm men, cao malt, ZnSO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, K2HPO4, KH2PO4.
Đồng thời đã tìm ra điểm tối ưu của 4 thông số nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy, tỷ
lệ cấp giống mà tại đó hàm lượng GSH cao gấp 3,6 lần so với ban đầu. Tiếp đó, đã
xác định được thời điểm và nồng độ bổ sung thích hợp của L-cysteine và natri
citrate. Nghiên cứu cũng đã khảo sát sơ bộ về 4 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
trích ly GSH từ sinh khối nấm men sử dụng cồn ethanol, bao gồm: ảnh hưởng của
nồng độ ethanol, nồng độ cơ chất/ethanol, nhiệt độ trích ly và thời gian trích ly và
đưa ra nhận xét về sự ảnh hưởng của các yếu tố này tới quá trình thu nhận GSH từ
sinh khối nấm men. Luận văn có thể làm tài liệu tham khảo cho các sinh viên trong
các trường đại học, các độc giả muốn nghiên cứu về khảo sát và tối ưu hoá các
thông số của quá trình lên men. Trong khuân khổ của luận văn này chắc chắn chưa
thể giải quyết triệt để mục tiêu đề tài, rất mong nhận được sự giúp đỡ và đóng góp
ý kiến của quý thầy cô trong hội đồng để đề tài được hoàn chỉnh hơn.
Học viên
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU ..................................................................................... 9
DANH MỤC HÌNH VẼ ........................................................................................ 11
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. 12
LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN.......................................................................................... 2
1.1. Glutathione .................................................................................................. 2
1.1.1. Cấu trúc của glutathione ....................................................................... 2
1.1.2. Chức năng của glutathione ................................................................... 3
1.2. Công nghệ sản xuất glutathione .................................................................. 4
1.2.1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione.............................................. 4
1.2.2. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học ............................... 4
1.2.3. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp enzyme ............................... 8
1.2.4. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp lên men vi sinh vật ........... 11
1.3 Giải pháp công nghệ làm tăng khả năng sinh tổng hợp glutathione ở vi sinh
vật ..................................................................................................................... 14
1.3.1. Cải tiến thành phần môi trường nuôi cấy ........................................... 14
1.3.2. Tối ưu các thông số của quá trình lên men......................................... 15
1.3.3. Bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ trợ năng lượng ............... 15
1.4. Hiện trạng sản xuất glutathione bằng phương pháp vi sinh ...................... 16
1.5. Nấm men Saccharomyces cerevisiae và sự sinh tổng hợp GSH .............. 18
1.5.1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................. 18
1.5.2. Ứng dụng công nghệ của nấm men Saccharomyces cerevisiae ......... 19
1.5.3. Sinh tổng hợp glutathione ở Saccharomyces cerevisiae .................... 20
1.5.4. Vai trò của glutathione đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae 23
1.6. Thu nhận glutathione từ sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae . 24
1.7. Ứng dụng của glutathione ......................................................................... 26
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................. 28
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ................................................... 28
2.1.1. Vật liệu ............................................................................................... 28
2.1.2. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 29
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 29
2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 29
2.2.1. Phương pháp phân tích ....................................................................... 29
2.2.2. Phương pháp thiết kế thí nghiệm ........................................................ 32
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 37
3.1. Khảo sát và lựa chọn các nguyên liệu thay thế để tạo môi trường cải tiến
trong sinh tổng hợp GSH của nấm men ........................................................... 37
3.1.1. Nguồn dinh dưỡng cacbon ................................................................. 37
3.1.2. Nguồn dinh dưỡng nitơ ....................................................................... 39
3.1.3. Nguyên tố vi lượng ............................................................................. 42
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của axit amin tới quá trình sinh tổng hợp GSH bởi
nấm men S. cerevisiae YM22 ....................................................................... 43
3.2. Nghiên cứu lựa chọn và tối ưu hoá điều kiện lên men sinh tổng hợp
glutathione. ....................................................................................................... 45
3.2.1. Tối ưu hoá điều kiện nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ nhân giống
...................................................................................................................... 45
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ thông khí tới quá trình sinh tổng hợp
GSH của nấm men S. cerevisiae YM22 ....................................................... 50
3.2.3. Dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S. cerevisiae YM22..... 51
3.3. Khảo sát thời gian và nồng độ bổ sung axit amin tiền chất và cơ chất phụ
trợ năng lượng .................................................................................................. 53
3.3.1. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung L-cysteine đến quá trình lên men
sinh tổng hợp GSH ....................................................................................... 53
3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ L-cysteine đến quá trình lên men
sinh tổng hợp GSH ....................................................................................... 54
3.3.3. Nghiên cứu lựa chọn thời điểm và nồng độ bổ sung natri citrate....... 55
3.3.4. Động học sinh trưởng chủng nấm men S. cerevisiae YM22 .............. 57
3.4. Khảo sát điều kiện thu hồi glutathione từ sinh khối nấm men bằng phương
pháp trích ly cồn ethanol .................................................................................. 58
3.3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cồn ethanol đến hiệu suất trích ly GSH ...... 59
3.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối khô/dung môi ethanol đến hiệu suất trích
ly GSH .......................................................................................................... 60
3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly GSH ............. 61
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly GSH ............ 62
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 64
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................ 65
PHỤ LỤC............................................................................................................. 73
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1. Xu hướng phát triển trong công nghệ sản xuất GSH............................ 8
Bảng 1.2. Tổng hợp các nghiên cứu sản xuất GSH bởi vi sinh vật bằng phương
pháp enzyme........................................................................................................... 9
Bảng 1.3. Các hướng nghiên cứu khác nhau về việc tăng cường sinh khối và nồng
độ glutathione trong sản xuất GSH của vi sinh vật. ............................................. 11
Bảng 1.4. Thống kê các nghiên cứu về sinh tổng hợp GSH bằng vi sinh vật tái tổ
hợp ........................................................................................................................ 13
Bảng 1. 5. Các chiến lược và xu hướng sản xuất GSH bằng lên men vi sinh vật
hiện nay ................................................................................................................ 17
Bảng 1. 6. So sánh quá trình thu hồi GSH từ sinh khối nấm men bằng phương pháp
trích ly cồn ethanol và sử dụng nước nóng .......................................................... 25
Bảng 1.7. Các ứng dụng và cơ chế tác dụng của glutathione và các sản phẩm liên
quan ...................................................................................................................... 27
Bảng 2. 1. Ma trận bố trí thí nghiệm mã hoá các biến ......................................... 34
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon thay thế tới sự phát triển và khả năng lên
men GSH của S. cerevisiae YM22. ...................................................................... 38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ rỉ đường thay thế glucose tới khả năng phát triển và
sinh tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................. 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau tới sự phát triển và khả năng lên
men GSH của S. cerevisiae YM22 ....................................................................... 40
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỉ lệ cao chiết đậu tương tới khả năng phát triển và sinh
tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 .................................................... 41
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của một số loại muối khoáng vi lượng (FeSO4, ZnSO4,
MnSO4) tới sự sinh tổng hợp GSH ...................................................................... 42
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ muối ZnSO4 đến khả năng sinh tổng hợp GSH
bởi S. cerevisiae YM22 ........................................................................................ 43
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của việc bổ sung các loại axit amin khác nhau đến khả năng
sinh tổng hợp glutathione của chủng S. cerevisiae YM22. .................................. 44
Bảng 3. 8. Các mức thí nghiệm của biến số ......................................................... 45
Bảng 3. 9. Ma trận thực nghiệm và kết quả thực nghiệm theo ma trận ............... 45
Bảng 3. 10. Bảng kết quả phân tích hồi quy tuyến tính ....................................... 46
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới quá trình sinh tổng hợp GSH của nấm
men S. cerevisiae YM22 ...................................................................................... 50
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí tới quá trình sinh tổng hợp GSH của
nấm men S. cerevisiae YM22 .............................................................................. 51
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung cơ chất L-cysteine đến quá trình lên
men sinh tổng hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22..................................... 53
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất L-cysteine đến quá trình lên men sinh tổng
hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................................ 54
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung natri citrate khác nhau tới sự sinh
tổng hợp GSH ở chủng S. cerevisiae YM22 ........................................................ 56
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của hàm lượng natri citrate đến quá trình lên men sinh tổng
hợp GSH của chủng S. cerevisiae YM22 ............................................................ 56
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc của glutathione......................................................................... 2
Hình 1.2. Cấu trúc của glutathione disulfide ......................................................... 3
Hình 1.3. Tóm tắt về chức năng của glutathione ................................................... 3
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tổng hợp GSH từ N-benzyloxycarbonyl cysteine ........ 5
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-
cystine..................................................................................................................... 6
Hình 1. 6. Các con đường chuyển hoá liên quan đến GSH và vai trò sinh lý của
GSH ở vi sinh vật ................................................................................................... 7
Hình 1.7. Nấm men Saccharomyces cerevisiae ................................................... 19
Hình 1.8. Chu trình γ-glutamyl ............................................................................ 21
Hình 1.9. Quá trình chuyển hoá GSH ở nấm men S. cerevisiae .......................... 22
Hình 2. 1. Hình thái chủng S. cerevisiae YM22 .................................................. 28
Hình 2. 2. Bố trí thí nghiệm sinh tổng hợp glutathione từ nấm men S. cerevisiae
YM22 ................................................................................................................... 32
Hình 3.1. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố nhiệt độ (oC) và pH cố
định ....................................................................................................................... 48
Hình 3.2. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố nhiệt độ và thời gian
nuôi cấy (giờ) cố định .......................................................................................... 48
Hình 3. 3. Kết quả phân tích đáp ứng bề mặt với hai yếu tố tỷ lệ cấp giống và nhiệt
độ (pH) cố định .................................................................................................... 49
Hình 3.4. Động học sinh trưởng của chủng S. cerevisiae YM22......................... 52
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn động học của quá trình lên men theo mẻ của chủng S.
cerevisiae YM22 .................................................................................................. 58
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ cồn tới khả năng thu nhận
GSH từ sinh khối nấm men .................................................................................. 59
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối sinh khối khô/dung
môi cồn tới khả năng thu nhận GSH .................................................................... 60
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly tới khả năng thu nhận
GSH ...................................................................................................................... 62
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian trích ly tới khả năng thu
nhận GSH ............................................................................................................. 62
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADP : Adenosine diphosphat
ATP : Adenosine triphosphate
BBD : Box–Behnken design
CCD : Central composite design
FB : Feed back
FF : Feed forward
γ-GCS/GSH II : Gamma-glutamylcysteine synthetase
GSH : Glutathione
GSSG : Glutathione disulfide
RSM : Response surface methodology
SKK : Sinh khối khô
γ-GC/GSH I : γ-Glutamylcystein
γ-GT : γ-Glutamyltranspeptidase
γ-GTP : Glutamyltranspeptidase
HVTH: Trần Thị Hoa
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
LỜI MỞ ĐẦU
Glutathione (GSH) là thành phần thiol-nonprotein dồi dào nhất trong cơ thể
sinh vật sống, đặc biệt chiếm ưu thế trong tế bào nhân thực. Có tới 90% glutathione
hoạt động ở dạng khử trong tế bào (vi khuẩn), mô, plasma. GSH tham gia và đóng
vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh lý khác nhau, tuy nhiên có thể khái
quát vai trò của GSH trong 3 chức năng chính: chống oxy hoá, tăng cường miễn
dịch và khử độc tế bào trong các sinh vật nhân thực bậc cao. Do đó GSH được ứng
dụng rộng rãi trong lĩnh vực y sinh và có tiềm năng to lớn sử dụng trong ngành
thực phẩm và mỹ phẩm.
Theo các nhà khoa học, việc thiếu hụt GSH có liên quan đến nhiều vấn đề
sức khoẻ nghiêm trọng. Chẳng hạn như hội chứng suy giảm miễn dịch HIV, xơ
gan, bệnh phổi, viêm dạ dày và tuyến tuỵ, bệnh tiểu đường, các bệnh lý về thần
kinh và lão hoá.
Phương pháp được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất GSH là lên men bởi
nấm men Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae. GSH được tổng hợp trong
tế bào nấm men (nội bào), và chỉ tiết một lượng nhỏ ra ngoài môi trường nuôi cấy.
GSH tinh khiết được thu nhận bằng cách chiết tách từ sinh khối nấm men, tinh
sạch và tạo chế phẩm dạng dung dịch hay bột sấy khô.
Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm chứa GSH, được sử
dụng rộng rãi như thực phẩm bổ sung, viên uống chứa GSH chống lão hoá trong
công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các sản phẩm trên cũng đã được tiêu thụ tại
Việt Nam, tuy nhiên chủ yếu là các mặt hàng nhập khẩu với giá thành cao.
Chính vì vậy, việc tìm ra giải pháp công nghệ giúp cải tiến, hoàn thiện quá
trình sản xuất GSH, nhằm hạ giá thành sản xuất là điều cần thiết, là mục tiêu mà
các nhà khoa học cũng như các doanh nghiệp trên thế giới nói chung và Việt Nam
nói riêng đang hướng tới.
HVTH: Trần Thị Hoa
1
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Glutathione
1.1.1. Cấu trúc của glutathione
Glutathione là một chất chống oxy hoá trong cơ thể sống. Đây là một
tripeptide bao gồm các đơn phân L-glutamate, L-cysteine và glycine (hình 1.1).
GSH có thể được tìm thấy trong nhiều loại động thực vật, trong đó được tìm thấy
nhiều nhất trong nấm men, mầm lúa mạch, và gan động vật [44]. Cấu trúc của GSH
chứa một nhóm thiol có tính khử mạnh (R-SH) . Glutathione ổn định ở trạng thái
rắn nhưng dễ bị oxy hoá trong môi trường nước. Ở dạng oxy hoá, glutathione
disulfide (GSSG) được minh hoạ ở hình 1.2. Dạng oxy hoá của của GSH được liên
kết bằng liên kết disulfide, thu được bằng cách khử hydro ở hai nguyên tử GSH.
GSSG bị khử thành GSH bằng enzyme glutathione reductase [31]. Phương trình
(1.1) thể hiện phản ứng hoá học này [43],[51].
-2H
2GSH GSSG (1.1)
+2H
Glutathione có thể tồn tại cả ở trạng thái khử và trạng thái oxy hoá trong các
tế bào, mô và màng plasma [4]. Trong tế bào và mô khoẻ mạnh, có hơn 90% GSH
tồn tại dưới dạng khử và khoảng dưới 10% tồn tại dưới dạng oxy hoá. Tỷ lệ chuyển
đổi GSSG – GSH thường được coi là một dấu hiệu của sự mất cân bằng oxy hoá
[21],[32].
Hình 1.1. Cấu trúc của glutathione [4]
HVTH: Trần Thị Hoa
2
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
O NH2
H
HO N OH
N
H
O O O
S
S
O O O
H
N
HO N OH
H
NH2 O
Hình 1.2. Cấu trúc của glutathione disulfide [4]
1.1.2. Chức năng của glutathione
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý quan trọng, thể hiện trong hình 1.3.
GSH liên quan tới quá trình chống sự mất cân bằng oxy hoá; vận chuyển axit amin;
ổn định hoạt tính enzyme; giải độc các chất ngoại bào và xenobiotic; chuyển hoá
nitơ và lưu huỳnh [55],[57].
Hình 1.3. Tóm tắt về chức năng của glutathione [58]
Glutathione có nhiều chức năng sinh lý khác nhau, có thể tóm tắt trong ba
khía cạnh chính: chống oxy hóa, chống lại các phân tử ngoại lai và tăng cường
miễn dịch [16],[56]. Các chức năng sinh lý này khiến GSH trở thành một loại sinh
phẩm quan trọng dùng trong điều trị nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ gan, nhiễm
HVTH: Trần Thị Hoa
3
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
HIV và viêm tuyến tụy [35],[83]. Ngày nay, GSH đã được sử dụng trong ngành
công nghiệp mỹ phẩm và phụ gia thực phẩm.
1.2. Công nghệ sản xuất glutathione
1.2.1. Lịch sử cấu trúc phân tử của glutathione
Glutathione được phát hiện lần đầu tiên bởi J.de Rey-Paihade vào năm 1888
từ cao nấm men và nhiều loại mô động vật (mô cơ xương và gan bò, cơ xương của
cá, ruột non và não của cừu) và trong lòng trắng trứng. J.de Rey-Paihade còn đặt
tên cho hợp chất này là philothion với ý nghĩa là tình yêu và lưu huỳnh trong tiếng
Hy Lạp [62]. Năm 1921, Hopkins đã xác định được thành phần của philothion
phân lập từ gan, cơ xương và nấm men và cho rằng đây là một dipeptide có chứa
cysteine và glutamate. Tuy nhiên, Hopkins và cộng sự đã bỏ qua sự có mặt của
glycine trong cấu trúc của philothion. Và để tôn vinh lịch sử phát hiện ra
philothion, Hopkins đã đặt tên cho hợp chất này là ‘glutathione’. Dựa trên hàm
lượng nitơ và lưu huỳnh có trong GSH được phân lập từ nấm men, máu và gan,
năm 1927, Hunter và Eagles đã chỉ ra rằng GSH không phải là một dipeptide chỉ
có chứa glutamate-cysteine mà là một tripeptide chứa glutamate-cysteine và một
phân tử amino axit trọng lượng phân tử thấp (có thể là serine). Bằng cách sử dụng
phương pháp thuỷ phân axit, năm 1929 Hopkins đã xác định được cấu trúc
tripeptide bao gồm glutamate, cysteine và glycine của GSH. Và kết quả này được
củng cố bởi nghiên cứu độc lập của tác giả Kendall và cộng sự vào năm 1929 và
1930. Dựa trên thí nghiệm chuẩn độ GSH trong nước và formaldehyde cũng như
các giá trị pK quan sát được, năm 1929, Pirie và Pinhey đã báo cáo cấu trúc của
GSH là γ-glutamate – cysteine – glycine. Cấu trúc của GSH đã được xác nhận một
lần nữa vào năm 1935 bởi Mead và Harington thông qua tổng hợp hoá học từ N-
carbobenzoxycystine và glycine ethyl ester. Một năm sau đó, quá trình tổng hợp
hoá học khác của GSH được thực hiện bởi Vigneaud và Miller sử dụng S-
benzylcysteinylglycine metyl este và hợp chất acyl clorua của N-
carbobenzoxyglutamate- α-methyl ester. Trong suốt nửa thế kỷ trước, GSH được
tìm thấy ở hầu khắp các tế bào. Những hợp chất liên quan đã được báo cáo tới hiện
tại bao gồm γ-Glu-Cys-Gly-essenceidine ở E. coli và (γ-Glu-Cys) n-Gly trong thực
vật [1],[84].
1.2.2. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp hoá học
1.2.2.1. Phương pháp tổng hợp từ N-benzyloxycarbonyl cysteine
HVTH: Trần Thị Hoa
4
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Quá trình tổng hợp glutathione được mô tả lần đầu tiên bởi Harrington và
Mead (Hình 1.4) như sau: N-benzyloxycarbonyl cysteine 1 được chuyển đổi thành
acyl clorua 2 và sau đó liên kết với glycine ethyl ester 3, sản phẩm 4 được xử lý
với Phosphonium iodide trong axit acetic được chuyển thành cysteylglycyl ethyl
ester 5 được phân tách thuận tiện dưới dạng hydroiodide. Sau đó axit N-
benzyloxycarbonylglutamic 6 được chuyển thành anhydrit N-benzyloxycarbonyl
glutamic acid 7. Xử lý thành phần 7 bởi photpho pentaclorua để tạo acyl clorua 8.
Sau đó acyl clorua 8 sẽ kết hợp với cysteylglycyl ethyl ester 5 để tạo ra ester 9.
Nhóm chức ester sau đó sẽ được loại bỏ khỏi 9 bằng cách thuỷ phân cẩn thận trong
dung dịch kiềm và axit được loại ra sẽ được xử lý với phosphonium iodide dưới
điều kiện thông thường. Từ hỗn hợp phản ứng, thu được lượng nhỏ tripeptide
glutathione 10 được chứng minh là giống nhau về mọi mặt với một mẫu GSH thu
được từ các nguồn tự nhiên [1].
Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tổng hợp glutathione từ N-benzyloxycarbonyl
cysteine [1]
HVTH: Trần Thị Hoa
5
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
1.2.2.2. Phương pháp tổng hợp từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine
Berse và cộng sự (1959) đã mô tả phương pháp sản xuất glutathione (Hình
1.5). Di(N-p-nitrocarbobenzoxy) L-cystine 1 được ngưng tụ với glycine ethyl ester
2 trong sự có mặt của N,N’-dicyclohexylcarbodiimide; ester trung gian 3 bị khử
một phần để phá vỡ nhóm amino của L-cysteine mà không phân cắt liên kết
disulfate của nó. Kết quả dietyl L-cysteinyl diglycinat 4 được ngưng tụ với 2 đương
lượng mol của p-nitrocarbobenzoxy-L-glutamic 5 để tạo ra ester 6, sau đó cấu trúc
GSH được hình thành. Quá trình xà phòng hoá (a) và sự khử một phần (b) của 6
tạo ra GSH oxy hoá. Quá trình hydro hoá với xúc tac paladi tạo ra GSH 7 [7].
Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tổng hợp Glutathione từ Di(N-p-nitrocarbobenzoxy)
L-cystine [7]
Mặc dù, sản xuất GSH bằng phương pháp hoá học đã được thương mại hoá
vào những năm 1950 của thế kỷ trước, nhưng sản phẩm tạo ra bởi phương pháp
này thường là hỗn hợp racemic bao gồm cả hai dạng đồng phân D- và L-. Bởi vì,
chỉ có đồng phân dạng L mới có chức năng sinh lý, do đó đòi hỏi thêm giải pháp
tối ưu để tách đồng phân dạng L ra khỏi hỗn hợp với đồng phân dạng D.
HVTH: Trần Thị Hoa
6
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Dựa trên sự nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp GSH trong gan và các đặc
trưng của quá trình này, năm 1949 Bloch đã khám phá ra con đường sản xuất GSH
bằng phương pháp enzyme và lên men vi sinh vật. Theo đó, GSH được tổng hợp
bằng hai phản ứng enzyme phụ thuộc ATP kế tiếp nhau [44]. Đầu tiên dipeptide
γ-glutamylcysteine (γ-GC) được tổng hợp từ axit glutamic và L-cysteine bởi
enzyme dipeptide γ-glutamylcysteine synthetase (cũng được biết đến với tên gọi
glutamate-cysteine ligase, EC 6.3.2.2, GSH I). Trong bước thứ 2, glycine được gắn
vào vị trí C cuối của γ-glutamylcysteine (γ-GC) bởi glutathione synthetase (EC
6.3.2.2, GSH II) để tạo thành GSH. Thông thường, hoạt động của GSH I bị ức chế
phản hồi bởi GSH để tránh sự tích tụ quá mức GSH, bảo đảm hàm lượng GSH ở
mức độ sinh lý [35]. Trong khi đó, GSH nội bào có thể bị phân huỷ bởi
glutamyltranspeptidase (γ-GTP) để tạo thành gốc γ-glutamyl – có vai trò quan
trọng trong vận chuyển amino axit. Để sản xuất quá mức GSH sử dụng xúc tác
sinh học hoặc lên men vi sinh vật cần phải giải phóng GSH I khỏi sự ức chế phản
hồi bởi GSH cùng với đó là sự bất hoạt hoặc loại bỏ enzyme γ-GTP [46]. Hình 1.6
cung cấp một cái nhìn tổng quan về sinh hoá, cho thấy các con đường sinh tổng
hợp, chuyển hoá và minh hoạ các vai trò sinh lý của GSH.
Hình 1. 6. Các con đường chuyển hoá liên quan đến GSH và vai trò sinh lý
của GSH ở vi sinh vật [35]
(Cys: cysteine, Gly: glycine, Glu: glutamate, G6PDH: glucose-6-
phosphate dehydrogenase, GPx: glutathione peroxidase, GR: glutathione
reductase, GRX: glutaredoxin, GSH I: γ-glutamylcysteine synthetase, GSH II:
glutathione synthetase, GTP: γ-glutamyltransferase, R-OOH: các peroxide, R-
OH các peroxide bị khử, S–S: liên kết disulfide).
HVTH: Trần Thị Hoa
7
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP GVHD: PGS.TS. Trần Liên Hà, TS. Trương Hương Lan
Bảng 1.1 tóm tắt xu hướng phát triển trong công nghệ sản xuất GSH. Các
nghiên cứu về sản xuất GSH bằng phương pháp enzyme hay lên men rất thịnh
hành ở giai đoạn 1976-1985; quá trình sản xuất GSH bằng phương pháp lên men
bởi nấm men được thương mại hoá vào đầu những năm 1980. Tới hiện tại, xu
hướng nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu quá trình lên men cũng như tạo biến
chủng siêu tổng hợp GSH ở vi khuẩn.
Bảng 1. 1. Xu hướng phát triển trong công nghệ sinh tổng hợp GSH [35]
Xu hướng phát triển của các nghiên cứu về sản xuất Thời kỳ
glutathione
Sử dụng nấm men (chủ yếu Saccharomyces cerevisiae và 1976 – 1985
Candida utilis) để sản xuất nấm men bằng phương pháp
lên men hoặc enzyme
Tinh sạch glutathione từ các hệ thống sinh học 1976 – 1987
Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng sản sinh glutathione để 1978 – 1991
sử dụng trong phương pháp enzyme
Kỹ thuật gen ở E. coli và tạo chủng E. coli tái tổ hợp để sản 1982 – 1990
xuất GSH
Tạo chủng S. cerevisiae tái tổ hợp để sản xuất GSH 1986 – 1990
Tối ưu hoá và kiểm soát quá trình lên men sinh tổng hợp 1991 – hiện tại
glutathione
Kỹ thuật trao đổi chất để sinh tổng hợp glutathione ở vi 2001 – hiện tại
khuẩn
1.2.3. Tổng hợp glutathione bằng phương pháp enzyme
Đây là một trong các phương pháp được tiếp cận để sản xuất GSH. Về nguyên
tắc, các yếu tố cần thiết để cấu thành một hệ thống tổng hợp GSH bởi enzyme bao
gồm: các enzyme GSH I, GSH II, các axit amin tiền chất (L-glutamate, L-cysteine,
glycine), ATP, các co-factor cần thiết (Mg2+) để duy trì hoạt tính của GSH I và
GSH II, cùng với đó là mức pH thích hợp (thường là pH 7,5). Bảng 1.2 trình bày
tổng quan về phương pháp enzyme sản xuất GSH bằng cách sử dụng tế bào nguyên
vẹn hoặc enzyme thô. Từ thông tin được thu thập cho thấy, khi sử dụng nấm men
S. cerevisiae thì không cần bổ sung thêm ATP, tuy nhiên điều này là ngược lại nếu
sử dụng vi khuẩn hoặc enzyme thô. Qua đó có thể khẳng định, ở S. cerevisiae có
một hệ thống tái tạo ATP mạnh mẽ của quá trình đường phân để bù đắp cho sự
tiêu thụ ATP. Đồng thời việc gia tăng tính thấm của thành tế bào (gây ra bởi quá
HVTH: Trần Thị Hoa
8