Nghiên cứu bào chế tiểu phân nano artesunat pha tiêm hƣớng điều trị ung thƣ
- 226 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HỒ HOÀNG NHÂN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HỒ HOÀNG NHÂN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 62720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
GS. TS. Chul Soon Yong
HÀ NỘI, NĂM 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tác giả
NCS. Hồ Hoàng Nhân
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận án, tôi đã nhận đƣợc nhiều
sự hƣớng dẫn, giúp đỡ quý báu từ các thầy, cô, các nhà khoa học, các anh chị em, các
bạn bè đồng nghiệp và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành
tới PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến, GS. TS. Chul Soon Yong, hai ngƣời thầy đã nhiệt
tình hƣớng dẫn, hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Trƣờng
Đại học Y Dƣợc – Đại học Huế đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu
trong thời gian vừa qua.
Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô, các cán
bộ nhân viên, các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Viện Công nghệ dƣợc phẩm
Quốc gia, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp dƣợc, Bộ môn Vật lý – Hóa lý,
Phòng Sau đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, cùng các thầy cô, các đồng nghiệp
của Khoa Dƣợc, Bộ môn Bào chế - Công nghiệp dƣợc thuộc Trƣờng Đại học Y Dƣợc
– Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi có thể hoàn thành luận án này.
Tôi cũng xin cám ơn các thầy cô, các bạn bè thuộc Khoa Dƣợc - Trƣờng Đại học
Yeungnam - Hàn Quốc, đặc biệt TS. Trần Tuấn Hiệp, TS. Nguyễn Hạnh Thủy, GS.
TS. Jong Oh Kim, cũng nhƣ các thầy cô, các bạn bè thuộc Viện Dƣợc – Trƣờng Đại
học Tartu - Estonia, đặc biệt GS. TS. Jyrki Heinamaki, PGS. TS. Karin Kogermann,
GS. TS. Ain Raal đã giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình làm thực
nghiệm tại hai cơ sở nói trên.
Góp phần không nhỏ để đạt đƣợc các kết quả của luận án, tôi xin cảm ơn sự giúp
đỡ quý báu của các cô chú, các anh chị thuộc công ty cổ phần Dƣợc phẩm TW 1, công
ty cổ phần Dƣợc phẩm Sao Kim, công ty cổ phẩn Dƣợc phẩm Pymepharco, công ty cổ
phần Dƣợc TW Medipharco, Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử và Vi phân tích thuộc
Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa
Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Kiểm
nghiệm thuốc, thực phẩm và mỹ phẩm Thừa Thiên Huế, Trung tâm các phƣơng pháp
phổ ứng dụng - Viện Hóa học, Phòng Hiển vi điện tử - Viện Khoa học vật liệu, Phòng
Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị, kỹ thuật giúp tôi có
thể hoàn thành luận án này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến nhà xuất bản Taylor & Francis, Hidawi, Bộ Y tế,
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã xét duyệt và đăng tải các kết quả nghiên cứu đƣợc sử
dụng trong luận án này trên các tạp chí Drug Development and Industrial Pharmacy,
Journal of Nanomaterials, Tạp chí Dƣợc học, Tạp chí Nghiên cứu Dƣợc và Thông tin
thuốc.
Lời cám ơn cuối cùng tôi muốn dành tặng cho những ngƣời thân trong gia đình và
bạn bè, đặc biệt gia đình bố mẹ nội ngoại, vợ và hai con đã luôn ở bên cạnh động viên,
giúp đỡ và hy sinh rất nhiều để tôi có thể học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án
này.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2019
NCS. Hồ Hoàng Nhân
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN................................................................................................2
1.1. Đại cƣơng về artesunat .............................................................................................2
1.1.1. Công thức .............................................................................................. 2
1.1.2. Tính chất vật lý...................................................................................... 2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của artesunat ............................ 2
1.1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng artesunat ................................................ 4
1.1.5. Tác dụng ức chế ung thƣ ....................................................................... 5
1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thƣ .......................................... 8
1.2. Tiểu phân nano polyme ............................................................................................9
1.2.1. Đặc điểm ............................................................................................... 9
1.2.2. Một số phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano polyme ........................ 10
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA
bằng chitosan hoặc PEG ...................................................................................... 12
1.2.4. Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ..... 15
1.2.5. Phƣơng pháp đƣa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm ...................... 19
1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt
bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa ..................................................... 20
1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ ..........................................26
1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang
thuốc nano ........................................................................................................... 26
1.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế ung thƣ của tiểu phân nano ....................... 27
1.3.3. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ .............. 28
1.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thƣ của tiểu phân
nano chứa dẫn chất của artemisinin .................................................................... 29
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................34
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................................34
2.1.1. Nguyên liệu ......................................................................................... 34
2.1.2. Tế bào và động vật thí nghiệm ............................................................ 35
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 35
2.2. Địa điểm nghiên cứu...............................................................................................36
2.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................37
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................37
2.4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat........................................................ 37
2.4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ....................... 42
2.4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat.......... 47
2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................... 48
2.4.5. Theo dõi độ ổn định ............................................................................ 53
2.4.6. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo ....................................................................................................... 54
2.4.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 57
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................58
3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat ..............................................................58
3.1.1. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phƣơng pháp nhũ hóa
bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý .................................................................... 58
3.1.2. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phƣơng pháp phun điện
trƣờng .................................................................................................................. 65
3.1.3. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ......................................... 70
3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat..............................81
3.2.1. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS ............................................. 81
3.2.2. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG .......................................... 85
3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ................89
3.3.1. Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat......................... 89
3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg
............................................................................................................................. 94
3.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat .........................................................................................................................96
3.4.1. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................... 96
3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .......... 97
3.4.3. Phổ nhiễu xạ tia X ............................................................................... 97
3.4.4. Phân tích phổ hồng ngoại .................................................................... 98
3.4.5. Phân tích nhiệt vi sai ........................................................................... 99
3.4.6. Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro ............................................... 99
3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat ..............................................................................................100
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân
nano artesunat .................................................................................................... 100
3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
........................................................................................................................... 101
3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân
tán lại ................................................................................................................. 106
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế khối u
in vivo của tiểu phân nano artesunat ............................................................................107
3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro của tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................. 107
3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat
........................................................................................................................... 111
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ..........................................................................................114
4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat .........................................................................114
4.1.1. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và chitosan ............................... 114
4.1.2. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và PEG ..................................... 120
4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ..................................125
4.2.1. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và chitosan ............................... 125
4.2.2. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và PEG ..................................... 128
4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ...........................130
4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô .......................................134
4.5. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm ................................................................138
4.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế khối u in vivo .........140
4.6.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro ........................................... 140
4.6.2. Tác dụng ức chế khối u in vivo ......................................................... 143
4.7. Đóng góp mới của luận án ....................................................................................148
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................149
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy)
ART Artesunat
ATN Artemisinin
ATNs Artemisinin và dẫn chất
C6 Coumarin 6
CD Cyclodextrin
CS Chitosan
DCM Dicloromethan
DHA Dihydroartemisinin
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Acid deoxyribonucleic
DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry)
EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và lƣu giữ (Enhanced Permeability and
Retention effect)
FDA Cục quản lý Dƣợc phẩm và Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug
Administration)
FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared
Spectroscopy)
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
i.p. Đƣờng tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection)
i.v. Đƣờng tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection)
KTTP Kích thƣớc tiểu phân trung bình theo cƣờng độ (Z-Average,
Intensity Distribution)
LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LLC Ung thƣ phổi Lewis ở chuột (Lewis Lung Cancer)
MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System)
NP/s Tiểu phân nano (Nanoparticle/s)
PBS Phosphat Buffer Salin
PDI Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index)
PEG Poly ethylen glycol
PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic)
PL Phụ lục
PM Hỗn hợp vật lý (Physical mixture)
RES Hệ lƣới nội mô (Reticulo-Endothelial System)
ROS Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species)
SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy)
SRB Sulforhodamine B
TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)
TP nano Tiểu phân nano
XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột
của artemisinin và dẫn chất .............................................................................................6
Bảng 1.2. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ ........................28
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng .....................................................34
Bảng 3.1. Ký hiệu và các mức của biến độc lập............................................................60
Bảng 3.2. Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ƣu hóa .....................61
Bảng 3.3. Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS
.......................................................................................................................................61
Bảng 3.4. Công thức tối ƣu của TP nano ART/PLGA-CS............................................64
Bảng 3.5. Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo
công thức tối ƣu (n=3) ...................................................................................................64
Bảng 3.6. Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trƣờng kép tạo TP
nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS ....................................................................................65
Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập .....................................................73
Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ƣu hóa .............................73
Bảng 3.9. Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG .................74
Bảng 3.10. Kết quả tối ƣu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0.......................................78
Bảng 3.11. Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ƣu (n=3) ...................79
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp tinh chế hỗn dịch nano ART .......................80
Bảng 3.13. So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA gắn CS
hay PEG .........................................................................................................................89
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của tá dƣợc tạo bánh đến chất lƣợng sản phẩm đông khô .......90
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô ........................93
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của thời gian đông khô đến chất lƣợng sản phẩm ...................94
Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART ................96
Bảng 3.18. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART
.....................................................................................................................................101
Bảng 3.19. Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian
bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ..........................102
Bảng 3.20. Hàm lƣợng nƣớc, kích thƣớc tiểu phân và phân bố kích thƣớc tiểu phân sau
khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và
ở điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3)..................................................................103
Bảng 3.21. Phần trăm hàm lƣợng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột
đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC ......................................................................104
Bảng 3.22. Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4
giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ...................................107
Bảng 3.23. Giá trị IC50 của các công thức gắn PEG đối với tế bào LLC...................111
Bảng 3.24. Sự thay đổi khối lƣợng chuột thí nghiệm khi dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................111
Bảng 3.25. Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi .....................................112
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART ............................................................................2
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS .............................38
Hình 2.2. Minh họa quá trình phun điện trƣờng kép trong bào chế TP nano dạng nhân
– vỏ ................................................................................................................................39
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến ...........................................41
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG ...41
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm
chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đƣờng
tiêm tĩnh mạch đuôi .......................................................................................................57
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART
(n=3) ..............................................................................................................................58
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................59
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................60
Hình 3.4. Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25oC
(A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6 (C); và của
thế zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0 (D). .................63
Hình 3.5. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM1-FM4 ......................................................................................................................66
Hình 3.6. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM5-FM8 ......................................................................................................................67
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM9-FM12 ....................................................................................................................68
Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức:
FM13-FM16 ..................................................................................................................69
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................70
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dƣợc chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................72
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha dầu/nƣớc đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................72
Hình 3.13. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................75
Hình 3.14. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................76
Hình 3.15. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của
TP nano ART/PLGA-PEG ............................................................................................78
Hình 3.16. Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS .............................................81
Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-CS .............................................................................................................81
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ TP nano ART/PLGA và
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................82
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột ART và TP nano
ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) ..............................................84
Hình 3.20. Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG ..................................85
Hình 3.21. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-PEG (NPs) ................................................................................................85
Hình 3.22. Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP
nano ART/PLGA-PEG (NPs)........................................................................................86
Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O ..............87
Hình 3.24. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và
TP nano ART/PLGA (n=3) ...........................................................................................88
Hình 3.25. Ảnh hƣởng của các tá dƣợc tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và
sau khi phân tán lại (B) ..................................................................................................90
Hình 3.26. Ảnh hƣởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trƣớc và
sau khi đông khô (n=3) ..................................................................................................91
Hình 3.27. Ảnh hƣởng kết hợp tá dƣợc tạo bánh khác nhau đến chất lƣợng sản phẩm
đông khô (n=3) ..............................................................................................................92
Hình 3.28. Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ƣớt đáy (B và C) .................93
Hình 3.29. Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) với thời gian sấy sơ
cấp 48 giờ ......................................................................................................................94
Hình 3.30. Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trƣớc (A) và sau khi phân tán lại (B) ......96
Hình 3.31. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-PEG sau đông khô ....................97
Hình 3.32. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG (NPs_S) ............................97
Hình 3.33. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tƣơng ứng (PM_S) .........................98
Hình 3.34. Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tƣơng ứng (PM_S) .........................99
Hình 3.35. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm chứa
TP nano ART sau khi phân tán lại trong môi trƣờng đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4
(n=3) ............................................................................................................................100
Hình 3.36. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG ở các thời điểm và điều kiện
bảo quản khác nhau .....................................................................................................104
Hình 3.37. Hình ảnh SEM của TP nano ART trong bột đông khô sau 12 tháng bảo
quản ở điều kiện 5 ± 3 oC ............................................................................................105
Hình 3.38. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12
tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC (n=3) ...................................................................106
Hình 3.39. Khả năng thấm vào tế bào của TP nano C6-PLGA và C6/PLGA-CS trên tế
bào MCF-7 (A, B) và tế bào A549 (C, D) ...................................................................108
Hình 3.40. Tỷ lệ tế bào sống sót ở các dòng tế bào, (A) MCF-7, (B) A549 ...............109
Hình 3.41. Hình dáng nhân tế bào dƣới kính hiển vi lase quét đồng tiêu cự sau khi xử
lý tế bào trong 24 giờ với ART nguyên liệu, TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS
trên tế bào MCF-7 (A) và tế bào A549 (B) .................................................................110
Hình 3.42. Sự thay đổi khối lƣợng chuột thí nghiệm khi dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................112
Hình 3.43. Sự phát triển của khối u ở chuột sử dụng đƣờng tiêm tĩnh mạch đuôi .....113
ĐẶT VẤN ĐỀ
Artemisinin (ATN) và các dẫn chất nhƣ artesunat (ART) là sản phẩm của quá
trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L..
Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác
dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thƣ [26]. Do đó, nhằm tăng khả năng ức chế ƣng
thƣ, công nghệ nano đã và đang đƣợc áp dụng.
Các dạng bào chế chứa tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) có thể đƣợc thiết kế
nhằm giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lƣợng và khoảng thời gian nhƣ dự
kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, giúp làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu
độc tính cho cơ thể ngƣời bệnh [58]. Bên cạnh liposome với chất mang lipid, TP
nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế chứa TP
nano thu hút đƣợc khá nhiều nghiên cứu.
Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học đƣợc sử
dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm
soát và duy trì giải phóng dƣợc chất, độc tính thấp, tƣơng thích sinh học với nhiều
mô và tế bào [119]. TP nano ART sử dụng polyme PLGA làm chất mang đã chứng
tỏ tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro đƣợc tăng cƣờng đáng kể so với nguyên
liệu. Ngoài ra, các polyme thân nƣớc nhƣ chitosan (CS) hay PEG có thể đƣợc sử
dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các TP nano PLGA nhƣ tăng cƣờng sự bám
dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tƣơng tác bắt giữ bởi
các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội
phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dƣợc chất [44].
Trên cơ sở đó, luận án đã đƣợc thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu
phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm:
1. Xây dựng đƣợc công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở
quy mô phòng thí nghiệm;
2. Xây dựng đƣợc công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;
3. Đề xuất đƣợc tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha
tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;
4. Đánh giá đƣợc tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat.
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về artesunat
1.1.1. Công thức
- Công thức cấu tạo
CH3
H
H3C
O
O
H
O
H
O
CH3
OCOCH2 CH2 COOH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART
- Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro -
3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 -
ol, hydrogen sucinat.
- Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl dihydro-
artemisinin; Quinghaosu reduced succinat este, acid artesunic.
- Công thức phân tử: C19H28O8
- Khối lƣợng phân tử: 384,4 g/mol [1].
1.1.2. Tính chất vật lý
Bột kết tinh trắng mịn. Tan đƣợc trong nƣớc (khoảng 56,2 mg/l ở 25oC), tan
tốt trong dicloromethan (DCM), ethanol và aceton. ART là một acid yếu có pKa
bằng 4,6, có hệ số phân bố dầu/nƣớc thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, ngoài
ra, ART có khả năng tan một phần trong nƣớc ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể
thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (nhƣ dạng muối kiềm
natri). Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic đƣợc dùng kết hợp với natri hydrocarbonat
để tạo dạng muối natri artesunat ngay trƣớc khi tiêm [1], [20].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm
Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của
ẩm.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ART kém ổn định khi tăng nhiệt độ; ví dụ trong
2
dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn
định của ART lần lƣợt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24]. Độ ổn định của ART đạt
đƣợc tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8oC [12].
Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hƣởng mạnh khi có độ ẩm cao. Hàm
lƣợng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ
30-35oC và độ ẩm tƣơng đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6]. Quá trình phân hủy của
thuốc đƣợc chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt
độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ
40oC và độ ẩm 75% [12].
Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trƣờng huyết tƣơng, nhiệt độ cao
cũng làm ART kém ổn định. Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn
định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự
phân hủy sau 8 tháng [24]. Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy
ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lƣợng dƣợc chất lần
lƣợt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và
dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [104].
Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản nhƣ đối với công thức bào
chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ đƣợc
phối trộn với nƣớc ngay trƣớc khi sử dụng. Ngoài ra công thức cần đƣợc bào chế
trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần đƣợc kiểm tra trong quá trình
sản xuất dƣới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung
Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base. Phụ
thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thƣờng tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu.
Do đó, trong dung dịch nƣớc, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn.
Mặc dù các hệ đệm thƣờng đƣợc dùng trong các dung dịch dƣợc phẩm để điều
chỉnh pH của dung dịch nhƣng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy.
Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử nhƣ ART có thể bị thủy
phân khi có mặt nƣớc. Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ đƣợc thúc đẩy bởi sự hiện
diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói
chung của hệ đệm.
3
Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid. ART thủy phân đáng kể khi pha loãng
với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24]. Đồng thời, mặc dù
tan đƣợc trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm
lƣợng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2].
Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên
nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 nhƣ ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lƣợng
ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần nhƣ ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm
phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25oC với hàm lƣợng còn lại sau 1
tuần lần lƣợt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12].
1.1.3.3. Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau
Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hƣởng của các dung môi khan nƣớc đến sự ổn
định của ART nhƣ ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,…
Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART nhƣ quá trình phân
hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác
nhau [71].
Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là
chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả. Do đó, PEG
400 là tá dƣợc có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71].
Nhằm nghiên cứu ảnh hƣởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy
của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART. Các dung môi đƣợc sử
dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nƣớc cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn
hợp các dung môi. Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nƣớc cất đƣợc lựa chọn để
tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm
bảo tránh sự phân hủy dƣợc chất [2].
1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat
- Phƣơng pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy
phân trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ 50 1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm
phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bƣớc sóng 289 1 nm [1].
- Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng
tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ
2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút. Bƣớc sóng kích thích là 303 nm và bƣớc
sóng phát xạ tƣơng ứng của ART trong methanol là 609 nm [141].
4
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HỒ HOÀNG NHÂN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
HÀ NỘI, NĂM 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
HỒ HOÀNG NHÂN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ TIỂU PHÂN
NANO ARTESUNAT PHA TIÊM
HƢỚNG ĐIỀU TRỊ UNG THƢ
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƢỢC PHẨM
VÀ BÀO CHẾ THUỐC
MÃ SỐ: 62720402
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến
GS. TS. Chul Soon Yong
HÀ NỘI, NĂM 2019
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tác giả
NCS. Hồ Hoàng Nhân
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và nghiên cứu thực hiện luận án, tôi đã nhận đƣợc nhiều
sự hƣớng dẫn, giúp đỡ quý báu từ các thầy, cô, các nhà khoa học, các anh chị em, các
bạn bè đồng nghiệp và gia đình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành
tới PGS. TS. Nguyễn Ngọc Chiến, GS. TS. Chul Soon Yong, hai ngƣời thầy đã nhiệt
tình hƣớng dẫn, hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn
thành luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Trƣờng
Đại học Y Dƣợc – Đại học Huế đã tạo điều kiện cho tôi đƣợc học tập và nghiên cứu
trong thời gian vừa qua.
Lời cảm ơn tiếp theo, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô, các cán
bộ nhân viên, các anh chị học viên, các bạn sinh viên của Viện Công nghệ dƣợc phẩm
Quốc gia, Bộ môn Bào chế, Bộ môn Công nghiệp dƣợc, Bộ môn Vật lý – Hóa lý,
Phòng Sau đại học – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, cùng các thầy cô, các đồng nghiệp
của Khoa Dƣợc, Bộ môn Bào chế - Công nghiệp dƣợc thuộc Trƣờng Đại học Y Dƣợc
– Đại học Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi có thể hoàn thành luận án này.
Tôi cũng xin cám ơn các thầy cô, các bạn bè thuộc Khoa Dƣợc - Trƣờng Đại học
Yeungnam - Hàn Quốc, đặc biệt TS. Trần Tuấn Hiệp, TS. Nguyễn Hạnh Thủy, GS.
TS. Jong Oh Kim, cũng nhƣ các thầy cô, các bạn bè thuộc Viện Dƣợc – Trƣờng Đại
học Tartu - Estonia, đặc biệt GS. TS. Jyrki Heinamaki, PGS. TS. Karin Kogermann,
GS. TS. Ain Raal đã giúp đỡ và hƣớng dẫn tôi rất tận tình trong quá trình làm thực
nghiệm tại hai cơ sở nói trên.
Góp phần không nhỏ để đạt đƣợc các kết quả của luận án, tôi xin cảm ơn sự giúp
đỡ quý báu của các cô chú, các anh chị thuộc công ty cổ phần Dƣợc phẩm TW 1, công
ty cổ phần Dƣợc phẩm Sao Kim, công ty cổ phẩn Dƣợc phẩm Pymepharco, công ty cổ
phần Dƣợc TW Medipharco, Phòng thí nghiệm Hiển vi điện tử và Vi phân tích thuộc
Viện Tiên tiến Khoa học và Công nghệ - Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội, Khoa
Hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Trung tâm Kiểm
nghiệm thuốc, thực phẩm và mỹ phẩm Thừa Thiên Huế, Trung tâm các phƣơng pháp
phổ ứng dụng - Viện Hóa học, Phòng Hiển vi điện tử - Viện Khoa học vật liệu, Phòng
Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam đã hỗ trợ về nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị, kỹ thuật giúp tôi có
thể hoàn thành luận án này.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến nhà xuất bản Taylor & Francis, Hidawi, Bộ Y tế,
Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã xét duyệt và đăng tải các kết quả nghiên cứu đƣợc sử
dụng trong luận án này trên các tạp chí Drug Development and Industrial Pharmacy,
Journal of Nanomaterials, Tạp chí Dƣợc học, Tạp chí Nghiên cứu Dƣợc và Thông tin
thuốc.
Lời cám ơn cuối cùng tôi muốn dành tặng cho những ngƣời thân trong gia đình và
bạn bè, đặc biệt gia đình bố mẹ nội ngoại, vợ và hai con đã luôn ở bên cạnh động viên,
giúp đỡ và hy sinh rất nhiều để tôi có thể học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án
này.
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2019
NCS. Hồ Hoàng Nhân
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN................................................................................................2
1.1. Đại cƣơng về artesunat .............................................................................................2
1.1.1. Công thức .............................................................................................. 2
1.1.2. Tính chất vật lý...................................................................................... 2
1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến độ ổn định của artesunat ............................ 2
1.1.4. Các phƣơng pháp định lƣợng artesunat ................................................ 4
1.1.5. Tác dụng ức chế ung thƣ ....................................................................... 5
1.1.6. Cơ chế gây tác dụng ức chế tế bào ung thƣ .......................................... 8
1.2. Tiểu phân nano polyme ............................................................................................9
1.2.1. Đặc điểm ............................................................................................... 9
1.2.2. Một số phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano polyme ........................ 10
1.2.3. Vài nét về việc cải thiện đặc tính bề mặt của tiểu phân nano PLGA
bằng chitosan hoặc PEG ...................................................................................... 12
1.2.4. Phƣơng pháp đánh giá một số đặc tính lý hóa của tiểu phân nano ..... 15
1.2.5. Phƣơng pháp đƣa tiểu phân nano vào dạng thuốc tiêm ...................... 19
1.2.6. Một số nghiên cứu về tiểu phân nano PLGA chức năng hóa bề mặt
bằng cách kết hợp với chitosan hay PEG hóa ..................................................... 20
1.3. Ứng dụng công nghệ nano trong điều trị bệnh ung thƣ ..........................................26
1.3.1. Đặc điểm sinh học của khối u liên quan đến việc thiết kế hệ mang
thuốc nano ........................................................................................................... 26
1.3.2. Đánh giá tác dụng ức chế ung thƣ của tiểu phân nano ....................... 27
1.3.3. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ .............. 28
1.3.4. Một số nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thƣ của tiểu phân
nano chứa dẫn chất của artemisinin .................................................................... 29
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................34
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................................................34
2.1.1. Nguyên liệu ......................................................................................... 34
2.1.2. Tế bào và động vật thí nghiệm ............................................................ 35
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ............................................................................. 35
2.2. Địa điểm nghiên cứu...............................................................................................36
2.3. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................37
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................37
2.4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat........................................................ 37
2.4.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ....................... 42
2.4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat.......... 47
2.4.4. Đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................... 48
2.4.5. Theo dõi độ ổn định ............................................................................ 53
2.4.6. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo ....................................................................................................... 54
2.4.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 57
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .....................................................................58
3.1. Kết quả bào chế tiểu phân nano artesunat ..............................................................58
3.1.1. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phƣơng pháp nhũ hóa
bốc hơi dung môi và hấp phụ vật lý .................................................................... 58
3.1.2. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS bằng phƣơng pháp phun điện
trƣờng .................................................................................................................. 65
3.1.3. Bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-PEG ......................................... 70
3.2. Kết quả đánh giá đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat..............................81
3.2.1. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-CS ............................................. 81
3.2.2. Đối với tiểu phân nano ART/PLGA-PEG .......................................... 85
3.3. Kết quả bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ................89
3.3.1. Bào chế bột đông khô chứa tiểu phân nano artesunat......................... 89
3.3.2. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat 20 mg
............................................................................................................................. 94
3.4. Kết quả đánh giá các đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat .........................................................................................................................96
3.4.1. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................... 96
3.4.2. Hình thái của tiểu phân nano ART/PLGA-PEG sau đông khô .......... 97
3.4.3. Phổ nhiễu xạ tia X ............................................................................... 97
3.4.4. Phân tích phổ hồng ngoại .................................................................... 98
3.4.5. Phân tích nhiệt vi sai ........................................................................... 99
3.4.6. Khả năng giải phóng hoạt chất in vitro ............................................... 99
3.5. Kết quả đề xuất tiêu chuẩn cơ sở và độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat ..............................................................................................100
3.5.1. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân
nano artesunat .................................................................................................... 100
3.5.2. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat
........................................................................................................................... 101
3.5.3. Độ ổn định của hỗn dịch chứa tiểu phân nano artesunat sau khi phân
tán lại ................................................................................................................. 106
3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế khối u
in vivo của tiểu phân nano artesunat ............................................................................107
3.6.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro của tiểu phân nano
artesunat............................................................................................................. 107
3.6.2. Đánh giá tác dụng ức chế khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat
........................................................................................................................... 111
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ..........................................................................................114
4.1. Bào chế tiểu phân nano artesunat .........................................................................114
4.1.1. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và chitosan ............................... 114
4.1.2. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và PEG ..................................... 120
4.2. Đánh giá các đặc tính lý hóa của tiểu phân nano artesunat ..................................125
4.2.1. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và chitosan ............................... 125
4.2.2. Đối với trƣờng hợp sử dụng PLGA và PEG ..................................... 128
4.3. Bào chế bột đông khô pha tiêm chứa tiểu phân nano artesunat ...........................130
4.4. Đánh giá các đặc tính lý hóa, vi sinh của bột đông khô .......................................134
4.5. Độ ổn định của bột đông khô pha tiêm ................................................................138
4.6. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế khối u in vivo .........140
4.6.1. Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro ........................................... 140
4.6.2. Tác dụng ức chế khối u in vivo ......................................................... 143
4.7. Đóng góp mới của luận án ....................................................................................148
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .....................................................................................149
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
AFM Kính hiển vi lực nguyên tử (Atomic Force Microscopy)
ART Artesunat
ATN Artemisinin
ATNs Artemisinin và dẫn chất
C6 Coumarin 6
CD Cyclodextrin
CS Chitosan
DCM Dicloromethan
DHA Dihydroartemisinin
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Acid deoxyribonucleic
DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential Scanning Calorimetry)
EPR Hiệu ứng tăng tính thấm và lƣu giữ (Enhanced Permeability and
Retention effect)
FDA Cục quản lý Dƣợc phẩm và Thực phẩm Mỹ (US Food and Drug
Administration)
FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (Fourier transform Infrared
Spectroscopy)
HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid
chromatography)
i.p. Đƣờng tiêm màng bụng (Intraperitoneal injection)
i.v. Đƣờng tiêm tĩnh mạch (Intravenous injection)
KTTP Kích thƣớc tiểu phân trung bình theo cƣờng độ (Z-Average,
Intensity Distribution)
LC-MS Sắc ký lỏng, khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)
LLC Ung thƣ phổi Lewis ở chuột (Lewis Lung Cancer)
MPS Hệ thực bào đơn nhân (Mononuclear Phagocytic System)
NP/s Tiểu phân nano (Nanoparticle/s)
PBS Phosphat Buffer Salin
PDI Hệ số đa phân tán (Polydispersity Index)
PEG Poly ethylen glycol
PLGA Acid poly(lactic-co-glycolic)
PL Phụ lục
PM Hỗn hợp vật lý (Physical mixture)
RES Hệ lƣới nội mô (Reticulo-Endothelial System)
ROS Các gốc oxy hoạt động (Reactive Oxygen Species)
SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy)
SRB Sulforhodamine B
TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron
Microscopy)
TP nano Tiểu phân nano
XRD Phổ nhiễu xạ tia X (X-Ray Diffraction)
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
Bảng 1.1. Các nghiên cứu về tác dụng ức chế sự phát triển khối u in vivo trên chuột
của artemisinin và dẫn chất .............................................................................................6
Bảng 1.2. Một số chế phẩm nano sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ ........................28
Bảng 2.1. Danh mục nguyên liệu, hóa chất sử dụng .....................................................34
Bảng 3.1. Ký hiệu và các mức của biến độc lập............................................................60
Bảng 3.2. Ký hiệu, các mức của biến phụ thuộc và điều kiện tối ƣu hóa .....................61
Bảng 3.3. Các công thức thực nghiệm và đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS
.......................................................................................................................................61
Bảng 3.4. Công thức tối ƣu của TP nano ART/PLGA-CS............................................64
Bảng 3.5. Kết quả một số đặc tính lý hóa của TP nano ART/PLGA-CS bào chế theo
công thức tối ƣu (n=3) ...................................................................................................64
Bảng 3.6. Các mức và thông số thiết yếu của quá trình phun điện trƣờng kép tạo TP
nano nhân - vỏ ART/PLGA-CS ....................................................................................65
Bảng 3.7. Ký hiệu và các mức của các biến độc lập .....................................................73
Bảng 3.8. Ký hiệu của các biến phụ thuộc và điều kiện tối ƣu hóa .............................73
Bảng 3.9. Các công thức thực nghiệm bào chế TP nano ART/PLGA-PEG .................74
Bảng 3.10. Kết quả tối ƣu hóa bằng phần mềm MODDE 8.0.......................................78
Bảng 3.11. Một số đặc tính TP nano bào chế theo công thức tối ƣu (n=3) ...................79
Bảng 3.12. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp tinh chế hỗn dịch nano ART .......................80
Bảng 3.13. So sánh một số đặc điểm của quá trình bào chế các TP nano PLGA gắn CS
hay PEG .........................................................................................................................89
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của tá dƣợc tạo bánh đến chất lƣợng sản phẩm đông khô .......90
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thể tích đến hình thức sản phẩm đông khô ........................93
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của thời gian đông khô đến chất lƣợng sản phẩm ...................94
Bảng 3.17. Một số đặc tính của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART ................96
Bảng 3.18. Đề xuất tiêu chuẩn cơ sở của bột đông khô pha tiêm chứa TP nano ART
.....................................................................................................................................101
Bảng 3.19. Chỉ tiêu hình thức, thời gian phân tán lại của bột đông khô sau thời gian
bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ..........................102
Bảng 3.20. Hàm lƣợng nƣớc, kích thƣớc tiểu phân và phân bố kích thƣớc tiểu phân sau
khi phân tán lại của bột đông khô chứa TP nano ART bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC và
ở điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) (n=3)..................................................................103
Bảng 3.21. Phần trăm hàm lƣợng ART, giới hạn tạp chất và độ vô khuẩn trong bột
đông khô bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC ......................................................................104
Bảng 3.22. Độ ổn định của hỗn dịch chứa TP nano ART sau khi phân tán lại trong 4
giờ ở điều kiện 5 ± 3oC và điều kiện thực (15-35oC, 50-90%) ...................................107
Bảng 3.23. Giá trị IC50 của các công thức gắn PEG đối với tế bào LLC...................111
Bảng 3.24. Sự thay đổi khối lƣợng chuột thí nghiệm khi dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................111
Bảng 3.25. Sự phát triển của khối u khi tiêm tĩnh mạch đuôi .....................................112
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART ............................................................................2
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình bào chế tiểu phân nano ART/PLGA-CS .............................38
Hình 2.2. Minh họa quá trình phun điện trƣờng kép trong bào chế TP nano dạng nhân
– vỏ ................................................................................................................................39
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tinh chế bằng cột lọc tiếp tuyến ...........................................41
Hình 2.4. Sơ đồ quy trình bào chế TP nano ART/PLGA-PEG sử dụng PLGA-PEG ...41
Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng ức chế khối u in vivo của bột pha tiêm
chứa TP nano ART trên mô hình chuột gây u bằng dòng tế bào LLC khi dùng đƣờng
tiêm tĩnh mạch đuôi .......................................................................................................57
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ CS và PLGA tới KTTP và thế zeta của TP nano ART
(n=3) ..............................................................................................................................58
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của pH dung dịch CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................59
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ hấp phụ CS đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................60
Hình 3.4. Hình ảnh mặt đáp của KTTP ở các điều kiện khác nhau: khi nhiệt độ = 25oC
(A), khi pH của dung dịch CS = 4,0 (B), và khi tỉ lệ CS/PLGA (kl/kl) = 0,6 (C); và của
thế zeta của TP nano ART/PLGA-CS khi pH của dung dịch CS = 4,0 (D). .................63
Hình 3.5. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM1-FM4 ......................................................................................................................66
Hình 3.6. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM5-FM8 ......................................................................................................................67
Hình 3.7. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức
FM9-FM12 ....................................................................................................................68
Hình 3.8. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-CS đại diện cho các công thức:
FM13-FM16 ..................................................................................................................69
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của tỷ lệ PLGA-PEG đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................70
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của tỷ lệ dƣợc chất/polyme đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................71
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ Tween 80 đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................72
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ pha dầu/nƣớc đến đặc tính lý hóa của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................72
Hình 3.13. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến KTTP của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................75
Hình 3.14. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến PDI của TP nano
ART/PLGA-PEG ...........................................................................................................76
Hình 3.15. Mặt đáp biểu thị ảnh hƣởng của các yếu tố đầu vào đến tỷ lệ nạp thuốc của
TP nano ART/PLGA-PEG ............................................................................................78
Hình 3.16. Hình ảnh TEM của TP nano ART/PLGA-CS .............................................81
Hình 3.17. Phổ hồng ngoại của ART, CS, PLGA, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-CS .............................................................................................................81
Hình 3.18. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ TP nano ART/PLGA và
ART/PLGA-CS (n=3) ...................................................................................................82
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột ART và TP nano
ART/PLGA-CS (công thức FM15, ký hiệu NPs) (n= 3) ..............................................84
Hình 3.20. Hình ảnh chụp SEM của TP nano ART/PLGA-PEG ..................................85
Hình 3.21. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP nano
ART/PLGA-PEG (NPs) ................................................................................................85
Hình 3.22. Phổ hồng ngoại của ART, PLGA, PLGA-PEG, hỗn hợp vật lý (PM) và TP
nano ART/PLGA-PEG (NPs)........................................................................................86
Hình 3.23. Phổ 1H-NMR của TP nano ART/PLGA-PEG trong CDCl3, D2O ..............87
Hình 3.24. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ TP nano ART/PLGA-PEG và
TP nano ART/PLGA (n=3) ...........................................................................................88
Hình 3.25. Ảnh hƣởng của các tá dƣợc tạo bánh đến sản phẩm sau đông khô (A) và
sau khi phân tán lại (B) ..................................................................................................90
Hình 3.26. Ảnh hƣởng của nồng độ saccarose và manitol đến KTTP và PDI trƣớc và
sau khi đông khô (n=3) ..................................................................................................91
Hình 3.27. Ảnh hƣởng kết hợp tá dƣợc tạo bánh khác nhau đến chất lƣợng sản phẩm
đông khô (n=3) ..............................................................................................................92
Hình 3.28. Hình ảnh bánh bị phồng rộp (A) và bánh còn ƣớt đáy (B và C) .................93
Hình 3.29. Sản phẩm sau đông khô (A) và sau khi phân tán lại (B) với thời gian sấy sơ
cấp 48 giờ ......................................................................................................................94
Hình 3.30. Hình ảnh bột đông khô pha tiêm trƣớc (A) và sau khi phân tán lại (B) ......96
Hình 3.31. Hình ảnh SEM của TP nano ART/PLGA-PEG sau đông khô ....................97
Hình 3.32. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG (NPs_S) ............................97
Hình 3.33. Phổ hồng ngoại của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tƣơng ứng (PM_S) .........................98
Hình 3.34. Giản đồ nhiệt vi sai của nguyên liệu (ART, PLGA, PLGA-PEG, saccarose
(SAC)), bột đông khô (NPs_S) và hỗn hợp vật lý tƣơng ứng (PM_S) .........................99
Hình 3.35. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm chứa
TP nano ART sau khi phân tán lại trong môi trƣờng đệm phosphat pH 6,8 và pH 7,4
(n=3) ............................................................................................................................100
Hình 3.36. Phổ XRD của ART, PLGA, PLGA-PEG, SAC (Saccarose), hỗn hợp vật lý
(PM_S) và bột đông khô chứa TP nano ART/PLGA-PEG ở các thời điểm và điều kiện
bảo quản khác nhau .....................................................................................................104
Hình 3.37. Hình ảnh SEM của TP nano ART trong bột đông khô sau 12 tháng bảo
quản ở điều kiện 5 ± 3 oC ............................................................................................105
Hình 3.38. Đồ thị thể hiện tỷ lệ giải phóng dƣợc chất từ bột đông khô pha tiêm sau 12
tháng bảo quản ở điều kiện 5 ± 3oC (n=3) ...................................................................106
Hình 3.39. Khả năng thấm vào tế bào của TP nano C6-PLGA và C6/PLGA-CS trên tế
bào MCF-7 (A, B) và tế bào A549 (C, D) ...................................................................108
Hình 3.40. Tỷ lệ tế bào sống sót ở các dòng tế bào, (A) MCF-7, (B) A549 ...............109
Hình 3.41. Hình dáng nhân tế bào dƣới kính hiển vi lase quét đồng tiêu cự sau khi xử
lý tế bào trong 24 giờ với ART nguyên liệu, TP nano ART/PLGA và ART/PLGA-CS
trên tế bào MCF-7 (A) và tế bào A549 (B) .................................................................110
Hình 3.42. Sự thay đổi khối lƣợng chuột thí nghiệm khi dùng đƣờng tiêm tĩnh mạch
đuôi (n=6) ....................................................................................................................112
Hình 3.43. Sự phát triển của khối u ở chuột sử dụng đƣờng tiêm tĩnh mạch đuôi .....113
ĐẶT VẤN ĐỀ
Artemisinin (ATN) và các dẫn chất nhƣ artesunat (ART) là sản phẩm của quá
trình chiết xuất và bán tổng hợp từ cây thanh hao hoa vàng Artemisia annua L..
Ngoài tác dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy ART có tác
dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thƣ [26]. Do đó, nhằm tăng khả năng ức chế ƣng
thƣ, công nghệ nano đã và đang đƣợc áp dụng.
Các dạng bào chế chứa tiểu phân nano (viết tắt là TP nano) có thể đƣợc thiết kế
nhằm giải phóng thuốc tại đích tác dụng với liều lƣợng và khoảng thời gian nhƣ dự
kiến, đặc biệt với các tế bào khối u, giúp làm tăng hiệu quả điều trị và giảm thiểu
độc tính cho cơ thể ngƣời bệnh [58]. Bên cạnh liposome với chất mang lipid, TP
nano sử dụng chất mang polyme cũng là một trong những dạng bào chế chứa TP
nano thu hút đƣợc khá nhiều nghiên cứu.
Một trong những polyme tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học đƣợc sử
dụng khá phổ biến là acid poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) do có khả năng kiểm
soát và duy trì giải phóng dƣợc chất, độc tính thấp, tƣơng thích sinh học với nhiều
mô và tế bào [119]. TP nano ART sử dụng polyme PLGA làm chất mang đã chứng
tỏ tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro đƣợc tăng cƣờng đáng kể so với nguyên
liệu. Ngoài ra, các polyme thân nƣớc nhƣ chitosan (CS) hay PEG có thể đƣợc sử
dụng nhằm thay đổi đặc tính bề mặt của các TP nano PLGA nhƣ tăng cƣờng sự bám
dính sinh học hoặc giúp làm giảm sự hoạt hóa bổ thể, giảm sự tƣơng tác bắt giữ bởi
các đại thực bào, do đó giúp kéo dài thời gian tuần hoàn của TP nano, tạo cơ hội
phân phối thuốc đến các khối u đích và điều chỉnh tỷ lệ giải phóng dƣợc chất [44].
Trên cơ sở đó, luận án đã đƣợc thực hiện với tiêu đề ―Nghiên cứu bào chế tiểu
phân nano artesunat pha tiêm hướng điều trị ung thư” với các mục tiêu bao gồm:
1. Xây dựng đƣợc công thức và quy trình bào chế tiểu phân nano artesunat ở
quy mô phòng thí nghiệm;
2. Xây dựng đƣợc công thức và quy trình bào chế bột đông khô pha tiêm chứa
tiểu phân nano artesunat ở quy mô phòng thí nghiệm;
3. Đề xuất đƣợc tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của bột đông khô pha
tiêm chứa tiểu phân nano artesunat;
4. Đánh giá đƣợc tác dụng ức chế tế bào ung thƣ in vitro và tác dụng ức chế
khối u in vivo của tiểu phân nano artesunat.
1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Đại cƣơng về artesunat
1.1.1. Công thức
- Công thức cấu tạo
CH3
H
H3C
O
O
H
O
H
O
CH3
OCOCH2 CH2 COOH
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của ART
- Tên khoa học: (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - Decahydro -
3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano (4,3 – j) - 1,2 - benzodioxepin - 10 -
ol, hydrogen sucinat.
- Tên khác: Dihydroartemisinin-12-alpha-succinat; Succinyl dihydro-
artemisinin; Quinghaosu reduced succinat este, acid artesunic.
- Công thức phân tử: C19H28O8
- Khối lƣợng phân tử: 384,4 g/mol [1].
1.1.2. Tính chất vật lý
Bột kết tinh trắng mịn. Tan đƣợc trong nƣớc (khoảng 56,2 mg/l ở 25oC), tan
tốt trong dicloromethan (DCM), ethanol và aceton. ART là một acid yếu có pKa
bằng 4,6, có hệ số phân bố dầu/nƣớc thay đổi theo các giá trị pH khác nhau, ngoài
ra, ART có khả năng tan một phần trong nƣớc ở pH=7,4 do logD7,4 nhỏ nên có thể
thích hợp với dạng thuốc tiêm khi chuyển qua dạng muối (nhƣ dạng muối kiềm
natri). Ở dạng thuốc tiêm, acid artesunic đƣợc dùng kết hợp với natri hydrocarbonat
để tạo dạng muối natri artesunat ngay trƣớc khi tiêm [1], [20].
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của artesunat
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ ẩm
Là dẫn chất este của ATN, ART kém ổn định ở nhiệt độ cao và sự có mặt của
ẩm.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, ART kém ổn định khi tăng nhiệt độ; ví dụ trong
2
dung dịch natri clorid 0,9% (kl/tt) khi bảo quản ở 9oC, 23oC, 36,5oC thì thời gian ổn
định của ART lần lƣợt là 130 giờ, 10,6 giờ và 1,6 giờ [24]. Độ ổn định của ART đạt
đƣợc tối đa khi bảo quản thuốc ở 2-8oC [12].
Đồng thời, độ ổn định của ART bị ảnh hƣởng mạnh khi có độ ẩm cao. Hàm
lƣợng ART giảm nhanh trên 2%/năm khi bảo bảo quản nguyên liệu ART ở nhiệt độ
30-35oC và độ ẩm tƣơng đối (gọi tắt là độ ẩm) 80-90% [6]. Quá trình phân hủy của
thuốc đƣợc chứng tỏ có liên quan nhiều đến độ ẩm hơn, ví dụ khi bảo quản ở nhiệt
độ 50oC và độ ẩm 60%, thuốc ít bị phân hủy hơn so với khi bảo quản ở nhiệt độ
40oC và độ ẩm 75% [12].
Khi nghiên cứu sự ổn định của ART trong môi trƣờng huyết tƣơng, nhiệt độ cao
cũng làm ART kém ổn định. Ví dụ, khi bảo quản ở nhiệt độ 4oC, ART có thể ổn
định đến 6 ngày so với 5 giờ ở nhiệt độ phòng (24oC), ở -25oC cho thấy không có sự
phân hủy sau 8 tháng [24]. Thời gian bảo quản càng lâu càng dẫn đến sự phân hủy
ART, ví dụ ở nhiệt độ 4oC, sau 2, 3, 6 tháng bảo quản thì hàm lƣợng dƣợc chất lần
lƣợt giảm đến 6-18%, 25-37% và 59-80%; ở nhiệt độ phòng, tỉ lệ giữa ART và
dihydroartemisinin (DHA) càng giảm khi thời gian bảo quản càng kéo dài [104].
Do đó, bột khô là dạng thích hợp nhất để bảo quản nhƣ đối với công thức bào
chế thuốc tiêm chứa ART để hạn chế sự không ổn định hoặc công thức chỉ đƣợc
phối trộn với nƣớc ngay trƣớc khi sử dụng. Ngoài ra công thức cần đƣợc bào chế
trong điều kiện kiểm soát độ ẩm và độ ổn định cần đƣợc kiểm tra trong quá trình
sản xuất dƣới điều kiện kiểm soát độ ẩm và bao gói trong các bao bì tránh ẩm [12].
1.1.3.2. Ảnh hưởng của pH và xúc tác acid-base nói chung
Một số thuốc chịu sự phân hủy trong dung dịch khi cho thêm acid hay base. Phụ
thuộc vào pKa, hầu hết các thuốc thƣờng tồn tại ở dạng muối của acid hay base yếu.
Do đó, trong dung dịch nƣớc, các phân tử thuốc sẽ phân ly một phần hay hoàn toàn.
Mặc dù các hệ đệm thƣờng đƣợc dùng trong các dung dịch dƣợc phẩm để điều
chỉnh pH của dung dịch nhƣng một vài hệ sẽ xúc tác quá trình phân hủy.
Các thuốc có nhóm este succinat trong cấu trúc phân tử nhƣ ART có thể bị thủy
phân khi có mặt nƣớc. Đặc biệt quá trình thủy phân sẽ đƣợc thúc đẩy bởi sự hiện
diện nhiều hơn của nồng độ ion hydro hoặc hydroxyl hoặc bởi xúc tác acid-base nói
chung của hệ đệm.
3
Nói chung, ART kém ổn định ở pH acid. ART thủy phân đáng kể khi pha loãng
với dung dịch glucose 5% kl/tt với pH thấp khoảng bằng 5 [24]. Đồng thời, mặc dù
tan đƣợc trong dung dịch kiềm tuy nhiên lại dễ thủy phân tạo DHA, ví dụ hàm
lƣợng ART giảm còn 92-93% khi đông khô dung dịch ART có pH 9,1-9,5 [2].
Do vậy, các nghiên cứu chỉ ra rằng, giá trị pH để duy trì ổn định của ART nên
nằm trong khoảng từ 7,5-8,5 nhƣ ở pH 8,2 khi đông khô dung dịch ART, hàm lƣợng
ART vẫn duy trì bằng 98,4% gần nhƣ ban đầu [2], thuốc ổn định nhất tại đệm
phosphat pH 8 trong điều kiện nhiệt độ 2-8oC và 25oC với hàm lƣợng còn lại sau 1
tuần lần lƣợt là 94,5 ± 0,2% và 94,6 ± 0,8% [12].
1.1.3.3. Ảnh hưởng của các dung môi khác nhau
Các nghiên cứu đã đánh giá ảnh hƣởng của các dung môi khan nƣớc đến sự ổn
định của ART nhƣ ethanol, dimethylsulfoxid (DMSO), PEG 400,…
Việc sử dụng ethanol có thể giảm tốc độ phân hủy của ART nhƣ quá trình phân
hủy chỉ xảy ra sau 3 tháng ở nhiệt độ phòng, tuy nhiên tạo nhiều sản phẩm khác
nhau [71].
Đối với PEG 400, quá trình phân hủy xảy ra chỉ sau 1 tháng tuy nhiên DHA là
chất phân hủy duy nhất, đồng thời là chất chống sốt rét khá hiệu quả. Do đó, PEG
400 là tá dƣợc có thể đáng quan tâm do chỉ tạo mỗi DHA [71].
Nhằm nghiên cứu ảnh hƣởng của các hệ dung môi khác nhau đến sự phân hủy
của ART trong quá trình bào chế thuốc tiêm đông khô ART. Các dung môi đƣợc sử
dụng trong khảo sát bao gồm dung môi số 1, nƣớc cất, ethanol, DMSO, hoặc hỗn
hợp các dung môi. Kết quả hỗn hợp dung môi số 1 và nƣớc cất đƣợc lựa chọn để
tiếp tục nghiên cứu vì có khả năng hòa tan các thành phần trong công thức và đảm
bảo tránh sự phân hủy dƣợc chất [2].
1.1.4. Các phương pháp định lượng artesunat
- Phƣơng pháp quang phổ UV-Vis: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng thủy
phân trong môi trƣờng kiềm ở nhiệt độ 50 1 oC trong 60 phút tạo ra sản phẩm
phân hủy có khả năng hấp thụ ánh sáng tại bƣớc sóng 289 1 nm [1].
- Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Với nguyên tắc dựa vào phản ứng
tạo chất huỳnh quang màu nâu xanh với hỗn hợp acid acetic và acid sulfuric (tỉ lệ
2:1) ở nhiệt độ cao 100oC trong 5 phút. Bƣớc sóng kích thích là 303 nm và bƣớc
sóng phát xạ tƣơng ứng của ART trong methanol là 609 nm [141].
4