Luận văn y khoa dược phân tích mối tương quan giữa đột biến gen atp7b và kiểu hình trên bệnh nhân wilson ở việt nam
- 164 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƢƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA
BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƢƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA
BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành : Thần kinh
M s : 62720147
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Vân Khánh
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu
HÀ NỘI - 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đỗ Thanh Hương, nghiên cứu sinh khóa 31 trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Thần kinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện với sự hướng dẫn
của PGS. TS. Trần Vân Khánh và PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đ
được công b tại Việt Nam.
3. Các s liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đ được xác nhận và chấp thuận của cơ
sở nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 3 năm 2016
Ngƣời viết cam đoan
Đỗ Thanh Hƣơng
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án tôi đ nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên của các Thầy, Cô, gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp cùng các cơ quan hữu quan.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Nguyễn Văn Liệu và PGS.TS. Trần Vân Khánh - những người Thầy trực tiếp
hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và
kiến thức cho tôi trong su t quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành
Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà
và TS. Trần Huy Thịnh - Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học
Y Hà Nội, những người Thầy đ động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuân lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến:
- Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học,
- Ban Chủ nhiệm, các Thầy, Cô Bộ môn Thần kinh; các Thầy, Cô Bộ
môn Nhi đ tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong su t quá trình
học tập và hoàn thành luận án.
- Các Thầy, Cô trong Hội đồng thông qua đề cương, các Thầy Cô trong
Hội đồng chấm Học phần Tiến sỹ, Chuyên đề Tiến sỹ, Tiểu luận tổng quan và
Hội đồng đánh giá Luận án đ cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu để
hoàn thành chương trình học và hoàn thiện luận án.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
- Cán bộ và nhân viên Khoa Thần kinh, Khoa Gan mật, Khoa Tiêu hóa -
Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Nhi Trung ương.
- Ban Giám đ c, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh
viện Bạch Mai.
- Ban Giám đ c, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh
viện Nhi Trung ương.
Tôi xin ghi nhớ sự động viên, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô, các
cán bộ tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đ
taọ điều kiện giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến bệnh nhân và gia đình các bệnh
nhân đ đồng ý tham gia vào nghiên cứu để giúp tôi có được những s liệu
trong luận án này.
Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đ động viên giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình công tác và học tập.
Cu i cùng, tôi xin biết ơn gia đình, những người thân đ dành cho tôi sự
giúp đỡ vật chất, tình thương yêu, sự chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi
yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2016
Đỗ Thanh Hƣơng
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP7B : P-type ATPase
CT : Computer Tomography Scanner (Cắt lớp vi tính)
ddATP : Dideoxyadenin triphosphat
ddCTP : Dideoxycitosin triphosphat
ddGTP : Dideoxyguanin triphosphat
ddNTP : Dideoxynucleoside triphosphat
ddTTP : Dideoxytimin triphosphat
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxynucleoside triphosphat
Kb : Kilobase
kD : Kilo dantol
MRI : Magnetic Resonance Image (Cộng hưởng từ)
MRS : Magnetic Resonance Spectroscopy (Cộng hưởng từ quang phổ)
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
pDHPLC : Partially Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng cao áp biến tính một phần)
PET : Positron Emission Tomography (Cắt lớp phát điện tử dương)
PRNP : Protein prion
SNP : Single Nucleotid Polymorphisms (Đa hình đơn nucleotid)
ALT : Alanine aminotransferase
AST : Aspartate aminotransferase
MBDs : Metal Binding Domains (vùng gắn kim loại)
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson ............................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson............................................................. 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson ................................................... 3
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson....................................................................... 5
1.1.4. Sinh lý bệnh học bệnh Wilson ....................................................... 5
1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson .................. 7
1.1.6. Chẩn đoán .................................................................................... 19
1.1.7. Điều trị ......................................................................................... 22
1.1.8. Tiên lượng và phòng bệnh ........................................................... 27
1.2. Bệnh học phân tử bệnh Wilson ................................................................ 28
1.2.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B .............................. 28
1.2.2. Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson ........................................ 30
1.2.3. Đặc điểm di truyền của bệnh Wilson ........................................... 35
1.2.4. Cơ chế bệnh học phân tử của bệnh Wilson ................................. 36
1.3. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ATP7B ........................................... 38
1.3.1. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính .......................................... 38
1.3.2. Sử dụng enzym cắt giới hạn......................................................... 39
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen ............................................................ 40
1.4. M i tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình ở bệnh nhân
Wilson ........................................................................................................ 42
1.4.1. M i tương quan giữa các dạng đột biến và kiểu hình ................. 42
1.4.2. Tương quan giữa một s đột biến điểm trên gen ATP7B và
kiểu hình...................................................................................... 44
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 47
2.1. Đ i tượng nghiên cứu .............................................................................. 47
2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................. 48
2.3. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 48
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 48
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu ............................................................. 48
2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ...................................................................... 49
2.4.3. Các nội dung nghiên cứu ............................................................. 49
2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu................................................................ 50
2.5.1. Hỏi bệnh và khám lâm sàng ......................................................... 50
2.5.2. Xét nghiệm sinh hóa và chẩn đoán hình ảnh ............................... 52
2.5.3. Chẩn đoán .................................................................................... 52
2.5.4. Quy trình phân tích đột biến gen ATP7B ..................................... 53
2.6. Xử lý kết quả ............................................................................................. 56
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ............................................................ 57
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 58
3.1. Một s đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ............................................ 58
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng ....................................................................... 58
3.1.2. Triệu chứng cận lâm sàng ............................................................ 61
3.1.3. Thể lâm sàng của bệnh Wilson .................................................... 65
3.2. Kết quả phân tích gen ATP7B .................................................................. 65
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ............................................................... 65
3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B ......................................... 66
3.2.3 Các dạng đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson ..................... 72
3.3. M i tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình của
bệnh Wilson .............................................................................................. 73
3.3.1. M i tương quan giữa s alen đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân
Wilson ......................................................................................... 73
3.3.2. M i tương quan giữa dạng đột biến và kiểu hình bệnh Wilson .. 78
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 83
4.1. Một s đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson ............... 83
4.1.1. Một s đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson ............................... 83
4.1.2. Một s đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Wilson ......................... 90
4.1.3. Các biến đổi về hình ảnh học ....................................................... 92
4.1.4. Các thể lâm sàng của bệnh ........................................................... 94
4.2. Kết quả phân tích gen ATP7B .................................................................. 95
4.3. Phân tích m i tương quan giữa s alen đột biến trên gen ATP7B và
kiểu hình của bệnh nhân Wilson ........................................................... 100
4.3.1. M i tương quan giữa tuổi khởi phát và s alen đột biến ........... 100
4.3.2. M i tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và
s alen đột biến ......................................................................... 101
4.3.3. M i tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và s alen đột biến ...... 102
4.3.4. M i tương quan giữa thể lâm sàng và s alen đột biến ............. 103
4.4. Phân tích m i tương quan giữa dạng đột biến trên gen ATP7B và
kiểu hình của bệnh nhân Wilson ........................................................... 104
4.4.1. M i tương quan giữa tuổi khởi phát và dạng đột biến .............. 104
4.4.2. M i tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng
đột biến ...................................................................................... 106
4.4.3. M i tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến .......... 107
4.4.4. M i tương quan giữa thể lâm sàng và dạng đột biến................. 108
KẾT LUẬN .................................................................................................. 119
KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 120
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Chỉ s tiên lượng suy gan t i cấp .............................................. 26
Bảng 1.2. Kế hoạch ứng dụng lâm sàng của liệu pháp gen ........................ 27
Bảng 1.3. Một s dạng đột biến phổ biến trên thế giới ............................... 30
Bảng 1.4. Kiểu gen trên bệnh nhân Wilson Trung Qu c ........................... 34
Bảng 2.1. Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci .................... 47
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ......................................................... 54
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR.................................................... 55
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng sequencing ........................................ 55
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng sequencing................................... 56
Bảng 3.1. Tuổi khởi phát bệnh .................................................................... 58
Bảng 3.2. Triệu chứng ở giai đoạn khởi phát .............................................. 59
Bảng 3.3. Triệu chứng ở giai đoạn toàn phát .............................................. 60
Bảng 3.4. Tiền sử gia đình của bệnh nhân Wilson...................................... 61
Bảng 3.5. Định lượng ceruloplasmin huyết thanh ...................................... 61
Bảng 3.6. Định lượng transaminase huyết thanh ........................................ 62
Bảng 3.7. Xét nghiệm đồng niệu 24 giờ ..................................................... 62
Bảng 3.8. Kết quả siêu âm ổ bụng............................................................... 63
Bảng 3.9. Kết quả chụp MRI sọ não ........................................................... 64
Bảng 3.10. Phân b đột biến trên gen ATP7B của bệnh nhân Wilson .......... 67
Bảng 3.11: Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của các bệnh nhân Wilson
mang đột biến mới và đột biến đ được công b gây bệnh trên
gen ATP7B .................................................................................. 68
Bảng 3.12. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và s alen đột biến ............... 74
Bảng 3.13. Chỉ s tương quan giữa các thể lâm sàng và s alen đột biến .... 77
Bảng 3.14. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và dạng đột biến ................... 78
Bảng 3.15. Chỉ s tương quan giữa các thể lâm sàng và dạng đột biến ....... 82
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể ............................... 6
Hình 1.2. Hình ảnh vòng Kayser-Fleischer ở rìa giác mạc .......................... 9
Hình 1.3. Hình ảnh đục nhân mắt hình hoa hướng dương ......................... 10
Hình 1.4: Hình ảnh giảm tỷ trọng trên CT sọ n o bệnh nhân nữ 14 tuổi bị
bệnh Wilson ................................................................................ 15
Hình 1.5. Hình ảnh MRI sọ n o của bệnh nhân Wilson ............................. 16
Hình 1.6. Hình ảnh chụp PET n o của bệnh nhân Wilson ......................... 19
Hình 1.7. Cấu trúc protein ATP7B .............................................................. 29
Hình 1.8. Phân b một s đột biến trên gen ATP7B. .................................. 32
Hình 1.9. Phân b đột biến trên gen ATP7B ............................................... 33
Hình 1.10. Phả hệ một gia đình bị bệnh di truyền lặn trên NST thường ...... 35
Hình 1.11. Vị trí đột biến trên gen ATP7B .................................................. 37
Hình 1.12. Nguyên tắc kỹ thuật pDHPLC ................................................... 39
Hình 1.13. Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W trên gen ATP7B
bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn ............................................... 40
Hình 1.14. Trình tự nucleotid được xác định trên máy giải trình tự gen .......... 41
Hình 1.15. Các dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson ................ 43
Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh theo giới ............................................................ 58
Hình 3.2. Hình ảnh tăng tín hiệu nhân xám đ i xứng 2 bên trên phim MRI
của bênh nhân m s W56.00 (mũi tên màu đỏ) ........................ 64
Hình 3.3. Các thể lâm sàng của bệnh Wilson ............................................. 65
Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen ở exon 8 của gen ATP7B. ... 66
Hình 3.5. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W8.00 ........................ 72
Hình 3.6. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W37.00 ...................... 72
Hình 3.7. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W38.00 ...................... 73
Hình 3.8. Phân b tuổi khởi phát và s alen đột biến ................................. 75
Hình 3.9. Phân b nồng độ cerulopllasmin huyết thanh và s alen đột biến ... 75
Hình 3.10. Phân b nồng độ đồng niệu 24 giờ và s alen đột biến .............. 76
Hình 3.11. Phân b thể lâm sàng và s alen đột biến ................................... 77
Hình 3.12. Phân b tuổi khởi phát và dạng đột biến .................................... 79
Hình 3.13. Phân b nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến .. 80
Hình 3.14. Phân b đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến................................ 81
Hình 3.15. Phân b dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson .......... 81
Hình 4.1. Hình ảnh bệnh nhân m s W55.00 .......................................... 111
Hình 4.2. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W55.00 .................... 112
Hình 4.3. Hình ảnh bệnh nhân W31.00 (A) và hình ảnh MRI sọ n o (B) 113
Hình 4.4. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W31.00 .................... 114
Hình 4.5. Hình ảnh bệnh nhân W58.00 (A) và hình ảnh MRI sọ n o (B) ... 115
Hình 4.6. Hình giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân m s W58.00 . 116
Hình 4.7. Hình ảnh gia đình bệnh nhân m s W58.00 ............................ 118
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Y học hiện đại đ có những bước tiến nhanh trong khoảng vài thập kỷ trở
lại đây, sau sự kiện các nhà khoa học hoàn tất việc giải m bộ gen người. Cơ chế
bệnh sinh dần dần được sáng tỏ ở mức độ phân tử, làm tiền đề cho việc chẩn
đoán và điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận g c căn nguyên của
bệnh. Năm 1993 Kary Mullis, người phát minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase
Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) được trao giải Nobel về hóa học.
Từ đó kỹ thuật PCR được nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng r i
trong các nghiên cứu về lĩnh vực sinh học phân tử.
Những tiến bộ của ngành hoá sinh, sinh học phân tử đ giúp sàng lọc,
chẩn đoán sớm, phòng bệnh, điều trị t t hơn các bệnh r i loạn chuyển hóa và
di truyền... Mặc dù không phổ biến như một s nhóm bệnh khác nhưng đây là
nhóm gây nhiều khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức
khỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộc s ng cho bệnh nhi, đồng thời trở thành,
gánh nặng cho gia đình và toàn thể x hội.
Bệnh Wilson thuộc nhóm bệnh lý r i loạn chuyển hóa và di truyền lặn
trên nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc bệnh là 1/30.000 trẻ [1]. Bệnh gây nên
do đột biến gen ATP7B, là gen có vai trò điều hòa quá trình chuyển hóa đồng
trong cơ thể. Khi đột biến gen xảy ra sẽ gây r i loạn quá trình chuyển hóa
đồng, làm cho lượng đồng tăng cao trong cơ thể và tích lũy dần ở các cơ quan
(gan, n o, mắt…) gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng, các triệu
chứng này tiến triển nặng dần cùng với quá trình lắng đọng đồng theo thời
gian. Ngoài ra, đồng có thể lắng đọng ở hầu hết các cơ quan khác trong cơ thể
nhưng thường biểu hiện nhẹ và muộn hơn. Bệnh nhân Wilson thường biểu
hiện triệu chứng vềề gan nhiều hơn triệu chứng về thần kinh ở nhóm dưới 10
tuổi, các triệu chứng thần kinh hay gặp hơn ở bệnh nhân sau 30 tuổi [1].
2
Hiện nay, để chẩn đoán xác định bệnh cần có sự kết hợp giữa các triệu
chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: nồng độ ceruloplasmin huyết
thanh, nồng độ đồng trong nước tiểu 24 giờ, định lượng đồng trong gan hoặc
chẩn đoán hình ảnh n o và gan.
Trong thực hành lâm sàng, chẩn đoán và điều trị sớm bệnh Wilson
đóng vai trò quan trọng vì có thể tránh được các tiến triển nặng của bệnh
dẫn đến tử vong. Ngày nay, phát hiện đột biến trên gen ATP7B sẽ giúp
chẩn đoán xác định bệnh sớm hơn, phát hiện người lành mang gen bệnh và
chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Bên
cạnh đó, xác định m i tương quan giữa kiểu gen ATP7B với thể lâm sàng
của bệnh Wilson sẽ giúp cho tiên lượng bệnh và có phác đồ điều trị chính
xác, hiệu quả hơn.
Trên thế giới, đ có nhiều nghiên cứu về xác định đột biến gen ATP7B,
xác định m i tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson. Ở Việt
Nam, các nghiên cứu về bệnh Wilson trước đây chủ yếu là mô tả về đặc điểm
lâm sàng, cận lâm sàng [2],[3],[4]. Trong vài năm gần đây, một s nghiên cứu
về phát hiện đột biến trên gen ATP7B đ bắt đầu được triển khai
[5],[6],[7],[8]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về phân tích m i tương
quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh Wilson tạo cơ sở cho việc
tiên lượng bệnh và đưa ra phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả. Do đó đề tài:
“Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên
bệnh nhân Wilson ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân Wilson.
2. Phân tích m i tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh
nhân Wilson.
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson
Từ năm 1912, tác giả Wilson đưa ra những khái niệm đầu tiên về bệnh:
bệnh thoái hóa gan - nhân đậu có tính chất gia đình [9].
Sau đó bệnh Wilson được mô tả là bệnh di truyền, r i loạn chuyển hóa
đồng với các tổn thương đặc trưng ở n o, gan và mắt.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson
Trên thế giới
Bệnh Wilson được mô tả từ cu i thế kỷ XIX với các triệu chứng mang
tính chất đơn lẻ: triệu chứng run với tên gọi là bệnh "xơ cứng giả hiệu"; vòng
Kayser và Fleischer màu xanh ở rìa giác mạc [10].
Năm 1912, bệnh mang tên Wilson, với những mô tả đầy đủ các triệu
chứng tổn thương thoái hóa gan và n o, có tính chất gia đình [9].
Những năm sau đó, các tác giả tìm thấy r i loạn chuyển hóa đồng ở các
bệnh nhân Wilson, ứng dụng trong điều trị thải đồng và ghép gan [10],[11],
[12],[13],[14],[15].
Từ sau năm 1993, các nhà khoa học đ phát hiện gen gây bệnh Wilson là
gen lặn ATP7B trên nhiễm sắc thể s 13, ở vị trí 13q14.3 [16],[17].
Năm 1995, với những nghiên cứu phát hiện đột biến đầu tiên: đột biến
p.H1069Q ở châu Âu và p.R778L ở châu Á đ mở ra một kỷ nguyên mới cho
các nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B ở các bệnh nhân Wilson
[18],[19].
4
Từ đó đến nay, có rất nhiều các công trình nghiên cứu về phát hiện đột
biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson và đ phát hiện ra hơn 500 dạng đột
biến gen khác nhau được công b trên ngân hàng dữ liệu gen
(http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/).
Ở Việt Nam
Năm 1969, Bùi Qu c Hương và cộng sự đ báo cáo 8 trường hợp bệnh
nhân Wilson Việt Nam đầu tiên tại Hội nghị Thần kinh học Qu c tế lần thứ
IX ở Mỹ [20].
Năm 1975, Chu Văn Tường và cộng sự nhận xét hai trường hợp bệnh
Wilson đầu tiên tại Bệnh viện Nhi Trung Ương [21].
Từ năm 1977 đến năm 2003, Lê Đức Hinh và cộng sự đ nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 81 bệnh nhân Wilson ở Việt Nam [2],[3].
Năm 2010, Đỗ Thanh Hương và cộng sự là nhóm nghiên cứu đầu tiên
phân tích đột biến trên gen ATP7B. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu mới chỉ tập
trung phân tích một dạng đột biến phổ biến ở vùng châu Á là đột biến
Arg778Leu bằng phương pháp cắt enzym giới hạn. Nghiên cứu đ phát hiện
được 2/29 bệnh nhân mang đột biến Arg778Leu dạng dị hợp tử [5].
Năm 2012, Lê Hoàng Phúc phát hiện 8/16 bệnh nhân mang đột biến trên
các exon 8, 10, 12, 13, 15, 16 và 20 ở bệnh nhân Wilson tại Bệnh viện Nhi
Đồng 1, Thành ph Hồ Chí Minh [6].
Năm 2015, nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương phát hiện 10/16 bệnh
nhi mang đột biến khi giải trình tự gen trên các exon 2b, 8, 11, 12 và 13 [7].
Năm 2015, nghiên cứu của Phan Tôn Hoàng tại Trường Đại học Y Hà
Nội tiến hành phát hiện đột biến trên 21 exon của gen ATP7B, nghiên cứu đ
phát hiện 48/61 (78,6%) bệnh nhân Wilson có đột biến gen ATP7B [8].
5
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson
Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ người mang gen bệnh là 1/90. Tỷ lệ mắc bệnh Wilson
là 1/30.000 người.
Trên thế giới, tỷ lệ hiện mắc bệnh Wilson là 10 - 30 triệu người, trong đó
tỉ lệ người mang dị hợp tử là 1/ 100.000 người, với tần s đột biến gen khác
nhau 0,3-0,7%. Tại Nhật Bản, tỷ lệ này là 1/30.000 dân, so với 1/100.000 dân
ở Úc. Sự gia tăng tần s bệnh ở một s nước là do tỷ lệ cao của hôn nhân cùng
huyết th ng. Các biểu hiện t i cấp của bệnh Wilson gặp ở nữ nhiều hơn nam [1].
Một nghiên cứu ở Đức cho thấy bệnh nhân bị bệnh Wilson biểu hiện
triệu chứng sớm chủ yếu ở gan (tuổi khởi phát trung bình là 15,5 tuổi), các
triệu chứng thần kinh xuất hiện muộn hơn (trung bình là 20,2 tuổi) [22].
Manolaki và các cộng sự đ phân tích các đột biến được tìm thấy trên
gen ATP7B và phát hiện độ tuổi khởi phát của bệnh Wilson có khoảng dao
động lớn hơn so với trước đây. Các đột biến hoàn toàn phá vỡ cấu trúc gen có
thể gây tổn thương gan sớm trong thời thơ ấu, những bệnh nhân này không
được chẩn đoán bệnh Wilson ở giai đoạn khởi phát bệnh [23].
Nói chung, các nghiên cứu chỉ ra rằng bệnh Wilson có thể khởi phát ở
nhóm tuổi 5 - 40 tuổi. Tuy nhiên cũng có thể gặp một s rất ít các trường hợp
dưới 3 tuổi và trên 70 tuổi [24].
1.1.4. Sinh lý bệnh học bệnh Wilson
Tổng hàm lượng đồng bình thường trong cơ thể ước tính là 50-100mg và
trung bình tiêu thụ hàng ngày là 2-5mg, tùy thuộc vào lượng thức ăn chứa
đồng, bao gồm các loại đậu, các loại thịt, loài giáp xác và socola. Đồng là một
thành phần quan trọng của một s enzym chuyển hóa như lysyl oxidase,
cytochrome oxidase, superoxide dismutase và dopamine hydroxylase β.
Khoảng 50-75% đồng được hấp thụ từ ruột non và sau đó vận chuyển đến
các tế bào gan. Con đường này không bị ảnh hưởng trong bệnh Wilson. Sau khi
đồng đến tế bào gan, nó được tích hợp vào các enzym có chứa đồng và protein
gắn đồng (CBPs: Copper Binding Proteins), bao gồm ceruloplasmin và
ferroxidase huyết thanh.
6
Đồng dư thừa có thể ở dạng không độc bằng cách hình thành phức hợp
với apo-metallothionein, hoặc có thể được bài tiết ra ngoài cơ thể. Có khoảng
95% lượng đồng dư thừa bài tiết ra ngoài qua đường mật, s còn lại bài tiết
qua phân, nước tiểu và mồ hôi.
Cân bằng lượng đồng bình thường trong cơ thể phụ thuộc vào sự bài tiết,
không phụ thuộc vào sự hấp thu và đồng tồn tại trong cơ thể dưới 3 dạng:
- Một phần đồng gắn với protein, được bài tiết vào dịch mật và đào thải
ra ngoài qua phân.
- Một phần nhỏ đồng vào huyết tương dưới dạng cation, rồi thải ra
ngoài qua nước tiểu
- Phần lớn đồng gắn với protein của gan, tổng hợp thành ceruloplasmin,
bản chất là globulin, trọng lượng phân tử là 12.000 Da, gắn với 8
nguyên tử đồng.
Trong bệnh Wilson, quy trình chuyển hóa của đồng thành ceruloplasmin
và bài tiết của lượng đồng thừa qua đường mật bị suy giảm [25].
Đồng từ thức ăn, nước u ng
1. Đồng hấp thu tại ruột
Trong máu
3. Giai đoạn sau gan
2. Giai đoạn tại gan
4.Đồng bài tiết vào mật
Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể [25].
7
Lượng đồng dư thừa hình thành các g c tự do trong quá trình oxy hóa
của chất béo và protein. Bất thường siêu cấu trúc trong các giai đoạn sớm nhất
của tổn thương tế bào gan, liên quan đến các lưới nội chất, ty thể, peroxisome
và hạt nhân đ được xác định. Ban đầu, đồng dư thừa tích tụ trong gan, dẫn
đến tổn thương các tế bào gan. Cu i cùng, khi lượng đồng trong gan tăng, làm
tăng lưu thông và lắng đọng ở các cơ quan khác gây ra các triệu chứng đa
dạng trên lâm sàng. Ở giai đoạn toàn phát, bệnh có thể biểu hiện ở hầu hết các
cơ quan trong cơ thể: gan, n o, mắt, thận, da, xương...
Ngoài ra, có một s trường hợp tiến triển rất cấp tính ở thể suy gan bùng
phát t i cấp và tử vong sớm. Các thể tiến triển mạn tính dẫn đến xơ gan mất
bù hoặc s ít trường hợp bị ung thư tế bào gan nếu không được điều trị
kịp thời.
1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson
1.1.5.1. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson
Triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson biểu hiện khác nhau giữa các
bệnh nhân tùy thuộc vào giai đoạn bệnh và cơ quan bị tổn thương do lắng
đọng đồng.
Bệnh nhân đến khám và điều trị ở nhiều chuyên khoa (thần kinh, tiêu
hóa, mắt, da liễu, thận, xương khớp...) nên việc chẩn đoán, theo dõi và điều trị
gặp nhiều khó khăn.
Các triệu chứng tiêu hóa thường xuất hiện sớm nhất vì gan dự trữ khoảng
80% lượng đồng trong cơ thể và khi đồng tích tụ trong gan quá nhiều sẽ theo
hệ tuần hoàn đi đến các cơ quan đích khác (n o, mắt, thận, da, xương...).
Triệu chứng tại gan
Tổn thương gan là biểu hiện gặp nhiều nhất ở những bệnh nhân bị bệnh
Wilson (hơn 50% các trường hợp). Có 3 dạng tổn thương chính ở gan: viêm
gan mạn tính hoạt động, xơ gan và suy gan t i cấp.
8
Các bệnh nhân có biểu hiện viêm gan mạn tính hoặc xơ gan hay bị bỏ sót
chẩn đoán nguyên nhân.
Dấu hiệu của suy gan t i cấp bao gồm:
- Cổ trướng, tuần hoàn bàng hệ, sao mạch
- Bàn tay son, ngón tay dùi tr ng
- Nôn ra máu, hội chứng hoàng đảm
Chẩn đoán bệnh Wilson thể suy gan t i cấp khi có các biểu hiện lâm
sàng ở trên, các enzym gan tăng, phosphatase kiềm giảm, có biểu hiện tan
máu và hội chứng tổn thương thận Fanconi.
Bệnh nhân ở nhóm suy gan t i cấp thường rất nặng với tỷ lệ tử vong cao
và có chỉ định ghép gan cấp cứu [26].
Triệu chứng thần kinh
Hầu hết các bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng thần kinh đ bị xơ gan.
Các triệu chứng của hệ thần kinh trung ương do lắng đọng đồng ở các nhân
xám của n o.
Triệu chứng thường gặp nhất là run không đ i xứng (khoảng 50%), chủ
yếu là khi nghỉ ngơi, run tư thế, hoặc run động.
Triệu chứng ban đầu thường bao gồm:
- Nói khó, nu t khó, chảy nước d i.
- Vẻ mặt kém linh hoạt.
- Run tay, bàn tay vụng về, viết chữ xấu.
- Tăng nhẹ trương lực cơ kiểu ngoại tháp 2 chi trên, sau đó tăng
dần trương lực cơ tứ chi làm cho người bệnh khó ph i hợp động
tác và r i loạn dáng đi.
Biểu hiện muộn bao gồm:
- Loạn trương lực cơ, vẻ mặt bất động.
- Liệt cứng tứ chi, chân tay co quắp, có các cơn xoắn vặn làm bệnh
nhân đau cơ và các khớp.
- Có thể có cơn động kinh toàn thể.
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƢƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA
BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI - 2016
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
ĐỖ THANH HƢƠNG
PHÂN TÍCH MỐI TƢƠNG QUAN GIỮA
ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VÀ KIỂU HÌNH CỦA
BỆNH NHÂN WILSON Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành : Thần kinh
M s : 62720147
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Trần Vân Khánh
2. PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu
HÀ NỘI - 2016
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Đỗ Thanh Hương, nghiên cứu sinh khóa 31 trường Đại học Y Hà
Nội, chuyên ngành Thần kinh, xin cam đoan:
1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện với sự hướng dẫn
của PGS. TS. Trần Vân Khánh và PGS.TS. Nguyễn Văn Liệu.
2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đ
được công b tại Việt Nam.
3. Các s liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan, đ được xác nhận và chấp thuận của cơ
sở nghiên cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam đoan này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 3 năm 2016
Ngƣời viết cam đoan
Đỗ Thanh Hƣơng
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án tôi đ nhận
được rất nhiều sự giúp đỡ, động viên của các Thầy, Cô, gia đình, bạn bè và
đồng nghiệp cùng các cơ quan hữu quan.
Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Nguyễn Văn Liệu và PGS.TS. Trần Vân Khánh - những người Thầy trực tiếp
hướng dẫn khoa học, tận tình giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và
kiến thức cho tôi trong su t quá trình học tập và hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành
Văn, Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Y Hà Nội, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà
và TS. Trần Huy Thịnh - Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học
Y Hà Nội, những người Thầy đ động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện
thuân lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn trân trọng đến:
- Ban Giám Hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học,
- Ban Chủ nhiệm, các Thầy, Cô Bộ môn Thần kinh; các Thầy, Cô Bộ
môn Nhi đ tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi trong su t quá trình
học tập và hoàn thành luận án.
- Các Thầy, Cô trong Hội đồng thông qua đề cương, các Thầy Cô trong
Hội đồng chấm Học phần Tiến sỹ, Chuyên đề Tiến sỹ, Tiểu luận tổng quan và
Hội đồng đánh giá Luận án đ cho tôi những ý kiến đóng góp quý báu để
hoàn thành chương trình học và hoàn thiện luận án.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
- Cán bộ và nhân viên Khoa Thần kinh, Khoa Gan mật, Khoa Tiêu hóa -
Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Nhi Trung ương.
- Ban Giám đ c, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh
viện Bạch Mai.
- Ban Giám đ c, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Khoa Lưu trữ hồ sơ - Bệnh
viện Nhi Trung ương.
Tôi xin ghi nhớ sự động viên, giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy, Cô, các
cán bộ tại Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, đ
taọ điều kiện giúp tôi hoàn thành luận án.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến bệnh nhân và gia đình các bệnh
nhân đ đồng ý tham gia vào nghiên cứu để giúp tôi có được những s liệu
trong luận án này.
Xin cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đ động viên giúp đỡ tôi rất nhiều trong
quá trình công tác và học tập.
Cu i cùng, tôi xin biết ơn gia đình, những người thân đ dành cho tôi sự
giúp đỡ vật chất, tình thương yêu, sự chia sẻ và là chỗ dựa vững chắc để tôi
yên tâm học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Hà Nội, ngày 18 tháng 03 năm 2016
Đỗ Thanh Hƣơng
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP7B : P-type ATPase
CT : Computer Tomography Scanner (Cắt lớp vi tính)
ddATP : Dideoxyadenin triphosphat
ddCTP : Dideoxycitosin triphosphat
ddGTP : Dideoxyguanin triphosphat
ddNTP : Dideoxynucleoside triphosphat
ddTTP : Dideoxytimin triphosphat
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxynucleoside triphosphat
Kb : Kilobase
kD : Kilo dantol
MRI : Magnetic Resonance Image (Cộng hưởng từ)
MRS : Magnetic Resonance Spectroscopy (Cộng hưởng từ quang phổ)
PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi)
pDHPLC : Partially Denaturing High-Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng cao áp biến tính một phần)
PET : Positron Emission Tomography (Cắt lớp phát điện tử dương)
PRNP : Protein prion
SNP : Single Nucleotid Polymorphisms (Đa hình đơn nucleotid)
ALT : Alanine aminotransferase
AST : Aspartate aminotransferase
MBDs : Metal Binding Domains (vùng gắn kim loại)
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................ 3
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson ............................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson............................................................. 3
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson ................................................... 3
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson....................................................................... 5
1.1.4. Sinh lý bệnh học bệnh Wilson ....................................................... 5
1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson .................. 7
1.1.6. Chẩn đoán .................................................................................... 19
1.1.7. Điều trị ......................................................................................... 22
1.1.8. Tiên lượng và phòng bệnh ........................................................... 27
1.2. Bệnh học phân tử bệnh Wilson ................................................................ 28
1.2.1. Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen ATP7B .............................. 28
1.2.2. Đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson ........................................ 30
1.2.3. Đặc điểm di truyền của bệnh Wilson ........................................... 35
1.2.4. Cơ chế bệnh học phân tử của bệnh Wilson ................................. 36
1.3. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen ATP7B ........................................... 38
1.3.1. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp biến tính .......................................... 38
1.3.2. Sử dụng enzym cắt giới hạn......................................................... 39
1.3.3. Kỹ thuật giải trình tự gen ............................................................ 40
1.4. M i tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình ở bệnh nhân
Wilson ........................................................................................................ 42
1.4.1. M i tương quan giữa các dạng đột biến và kiểu hình ................. 42
1.4.2. Tương quan giữa một s đột biến điểm trên gen ATP7B và
kiểu hình...................................................................................... 44
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 47
2.1. Đ i tượng nghiên cứu .............................................................................. 47
2.2. Địa điểm nghiên cứu................................................................................. 48
2.3. Thời gian nghiên cứu ................................................................................ 48
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 48
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu ............................................................. 48
2.4.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ...................................................................... 49
2.4.3. Các nội dung nghiên cứu ............................................................. 49
2.5. Các bước tiến hành nghiên cứu................................................................ 50
2.5.1. Hỏi bệnh và khám lâm sàng ......................................................... 50
2.5.2. Xét nghiệm sinh hóa và chẩn đoán hình ảnh ............................... 52
2.5.3. Chẩn đoán .................................................................................... 52
2.5.4. Quy trình phân tích đột biến gen ATP7B ..................................... 53
2.6. Xử lý kết quả ............................................................................................. 56
2.7. Vấn đề đạo đức trong nghiên cứu ............................................................ 57
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................... 58
3.1. Một s đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng ............................................ 58
3.1.1. Đặc điểm lâm sàng ....................................................................... 58
3.1.2. Triệu chứng cận lâm sàng ............................................................ 61
3.1.3. Thể lâm sàng của bệnh Wilson .................................................... 65
3.2. Kết quả phân tích gen ATP7B .................................................................. 65
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA ............................................................... 65
3.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B ......................................... 66
3.2.3 Các dạng đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson ..................... 72
3.3. M i tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình của
bệnh Wilson .............................................................................................. 73
3.3.1. M i tương quan giữa s alen đột biến và kiểu hình ở bệnh nhân
Wilson ......................................................................................... 73
3.3.2. M i tương quan giữa dạng đột biến và kiểu hình bệnh Wilson .. 78
CHƢƠNG 4: BÀN LUẬN ............................................................................ 83
4.1. Một s đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson ............... 83
4.1.1. Một s đặc điểm lâm sàng của bệnh Wilson ............................... 83
4.1.2. Một s đặc điểm cận lâm sàng của bệnh Wilson ......................... 90
4.1.3. Các biến đổi về hình ảnh học ....................................................... 92
4.1.4. Các thể lâm sàng của bệnh ........................................................... 94
4.2. Kết quả phân tích gen ATP7B .................................................................. 95
4.3. Phân tích m i tương quan giữa s alen đột biến trên gen ATP7B và
kiểu hình của bệnh nhân Wilson ........................................................... 100
4.3.1. M i tương quan giữa tuổi khởi phát và s alen đột biến ........... 100
4.3.2. M i tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và
s alen đột biến ......................................................................... 101
4.3.3. M i tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và s alen đột biến ...... 102
4.3.4. M i tương quan giữa thể lâm sàng và s alen đột biến ............. 103
4.4. Phân tích m i tương quan giữa dạng đột biến trên gen ATP7B và
kiểu hình của bệnh nhân Wilson ........................................................... 104
4.4.1. M i tương quan giữa tuổi khởi phát và dạng đột biến .............. 104
4.4.2. M i tương quan giữa nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng
đột biến ...................................................................................... 106
4.4.3. M i tương quan giữa đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến .......... 107
4.4.4. M i tương quan giữa thể lâm sàng và dạng đột biến................. 108
KẾT LUẬN .................................................................................................. 119
KHUYẾN NGHỊ.......................................................................................... 120
DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Chỉ s tiên lượng suy gan t i cấp .............................................. 26
Bảng 1.2. Kế hoạch ứng dụng lâm sàng của liệu pháp gen ........................ 27
Bảng 1.3. Một s dạng đột biến phổ biến trên thế giới ............................... 30
Bảng 1.4. Kiểu gen trên bệnh nhân Wilson Trung Qu c ........................... 34
Bảng 2.1. Thang điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci .................... 47
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ......................................................... 54
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR.................................................... 55
Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng sequencing ........................................ 55
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng sequencing................................... 56
Bảng 3.1. Tuổi khởi phát bệnh .................................................................... 58
Bảng 3.2. Triệu chứng ở giai đoạn khởi phát .............................................. 59
Bảng 3.3. Triệu chứng ở giai đoạn toàn phát .............................................. 60
Bảng 3.4. Tiền sử gia đình của bệnh nhân Wilson...................................... 61
Bảng 3.5. Định lượng ceruloplasmin huyết thanh ...................................... 61
Bảng 3.6. Định lượng transaminase huyết thanh ........................................ 62
Bảng 3.7. Xét nghiệm đồng niệu 24 giờ ..................................................... 62
Bảng 3.8. Kết quả siêu âm ổ bụng............................................................... 63
Bảng 3.9. Kết quả chụp MRI sọ não ........................................................... 64
Bảng 3.10. Phân b đột biến trên gen ATP7B của bệnh nhân Wilson .......... 67
Bảng 3.11: Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của các bệnh nhân Wilson
mang đột biến mới và đột biến đ được công b gây bệnh trên
gen ATP7B .................................................................................. 68
Bảng 3.12. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và s alen đột biến ............... 74
Bảng 3.13. Chỉ s tương quan giữa các thể lâm sàng và s alen đột biến .... 77
Bảng 3.14. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và dạng đột biến ................... 78
Bảng 3.15. Chỉ s tương quan giữa các thể lâm sàng và dạng đột biến ....... 82
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể ............................... 6
Hình 1.2. Hình ảnh vòng Kayser-Fleischer ở rìa giác mạc .......................... 9
Hình 1.3. Hình ảnh đục nhân mắt hình hoa hướng dương ......................... 10
Hình 1.4: Hình ảnh giảm tỷ trọng trên CT sọ n o bệnh nhân nữ 14 tuổi bị
bệnh Wilson ................................................................................ 15
Hình 1.5. Hình ảnh MRI sọ n o của bệnh nhân Wilson ............................. 16
Hình 1.6. Hình ảnh chụp PET n o của bệnh nhân Wilson ......................... 19
Hình 1.7. Cấu trúc protein ATP7B .............................................................. 29
Hình 1.8. Phân b một s đột biến trên gen ATP7B. .................................. 32
Hình 1.9. Phân b đột biến trên gen ATP7B ............................................... 33
Hình 1.10. Phả hệ một gia đình bị bệnh di truyền lặn trên NST thường ...... 35
Hình 1.11. Vị trí đột biến trên gen ATP7B .................................................. 37
Hình 1.12. Nguyên tắc kỹ thuật pDHPLC ................................................... 39
Hình 1.13. Hình ảnh minh họa xác định đột biến R778W trên gen ATP7B
bằng kỹ thuật cắt enzym giới hạn ............................................... 40
Hình 1.14. Trình tự nucleotid được xác định trên máy giải trình tự gen .......... 41
Hình 1.15. Các dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson ................ 43
Hình 3.1. Tỷ lệ mắc bệnh theo giới ............................................................ 58
Hình 3.2. Hình ảnh tăng tín hiệu nhân xám đ i xứng 2 bên trên phim MRI
của bênh nhân m s W56.00 (mũi tên màu đỏ) ........................ 64
Hình 3.3. Các thể lâm sàng của bệnh Wilson ............................................. 65
Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm PCR đoạn gen ở exon 8 của gen ATP7B. ... 66
Hình 3.5. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W8.00 ........................ 72
Hình 3.6. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W37.00 ...................... 72
Hình 3.7. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W38.00 ...................... 73
Hình 3.8. Phân b tuổi khởi phát và s alen đột biến ................................. 75
Hình 3.9. Phân b nồng độ cerulopllasmin huyết thanh và s alen đột biến ... 75
Hình 3.10. Phân b nồng độ đồng niệu 24 giờ và s alen đột biến .............. 76
Hình 3.11. Phân b thể lâm sàng và s alen đột biến ................................... 77
Hình 3.12. Phân b tuổi khởi phát và dạng đột biến .................................... 79
Hình 3.13. Phân b nồng độ ceruloplasmin huyết thanh và dạng đột biến .. 80
Hình 3.14. Phân b đồng niệu 24 giờ và dạng đột biến................................ 81
Hình 3.15. Phân b dạng đột biến và thể lâm sàng của bệnh Wilson .......... 81
Hình 4.1. Hình ảnh bệnh nhân m s W55.00 .......................................... 111
Hình 4.2. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W55.00 .................... 112
Hình 4.3. Hình ảnh bệnh nhân W31.00 (A) và hình ảnh MRI sọ n o (B) 113
Hình 4.4. Hình giải trình tự gen của bệnh nhân m W31.00 .................... 114
Hình 4.5. Hình ảnh bệnh nhân W58.00 (A) và hình ảnh MRI sọ n o (B) ... 115
Hình 4.6. Hình giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân m s W58.00 . 116
Hình 4.7. Hình ảnh gia đình bệnh nhân m s W58.00 ............................ 118
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Y học hiện đại đ có những bước tiến nhanh trong khoảng vài thập kỷ trở
lại đây, sau sự kiện các nhà khoa học hoàn tất việc giải m bộ gen người. Cơ chế
bệnh sinh dần dần được sáng tỏ ở mức độ phân tử, làm tiền đề cho việc chẩn
đoán và điều trị can thiệp trúng đích nhằm giải quyết tận g c căn nguyên của
bệnh. Năm 1993 Kary Mullis, người phát minh ra kỹ thuật PCR (Polymerase
Chain Reaction: phản ứng khuếch đại chuỗi) được trao giải Nobel về hóa học.
Từ đó kỹ thuật PCR được nhanh chóng được phát triển và ứng dụng rộng r i
trong các nghiên cứu về lĩnh vực sinh học phân tử.
Những tiến bộ của ngành hoá sinh, sinh học phân tử đ giúp sàng lọc,
chẩn đoán sớm, phòng bệnh, điều trị t t hơn các bệnh r i loạn chuyển hóa và
di truyền... Mặc dù không phổ biến như một s nhóm bệnh khác nhưng đây là
nhóm gây nhiều khó khăn trong điều trị và để lại hậu quả rất nặng nề về sức
khỏe, tinh thần cũng như chất lượng cuộc s ng cho bệnh nhi, đồng thời trở thành,
gánh nặng cho gia đình và toàn thể x hội.
Bệnh Wilson thuộc nhóm bệnh lý r i loạn chuyển hóa và di truyền lặn
trên nhiễm sắc thể thường với tỷ lệ mắc bệnh là 1/30.000 trẻ [1]. Bệnh gây nên
do đột biến gen ATP7B, là gen có vai trò điều hòa quá trình chuyển hóa đồng
trong cơ thể. Khi đột biến gen xảy ra sẽ gây r i loạn quá trình chuyển hóa
đồng, làm cho lượng đồng tăng cao trong cơ thể và tích lũy dần ở các cơ quan
(gan, n o, mắt…) gây ra các triệu chứng đa dạng trên lâm sàng, các triệu
chứng này tiến triển nặng dần cùng với quá trình lắng đọng đồng theo thời
gian. Ngoài ra, đồng có thể lắng đọng ở hầu hết các cơ quan khác trong cơ thể
nhưng thường biểu hiện nhẹ và muộn hơn. Bệnh nhân Wilson thường biểu
hiện triệu chứng vềề gan nhiều hơn triệu chứng về thần kinh ở nhóm dưới 10
tuổi, các triệu chứng thần kinh hay gặp hơn ở bệnh nhân sau 30 tuổi [1].
2
Hiện nay, để chẩn đoán xác định bệnh cần có sự kết hợp giữa các triệu
chứng lâm sàng và cận lâm sàng điển hình như: nồng độ ceruloplasmin huyết
thanh, nồng độ đồng trong nước tiểu 24 giờ, định lượng đồng trong gan hoặc
chẩn đoán hình ảnh n o và gan.
Trong thực hành lâm sàng, chẩn đoán và điều trị sớm bệnh Wilson
đóng vai trò quan trọng vì có thể tránh được các tiến triển nặng của bệnh
dẫn đến tử vong. Ngày nay, phát hiện đột biến trên gen ATP7B sẽ giúp
chẩn đoán xác định bệnh sớm hơn, phát hiện người lành mang gen bệnh và
chẩn đoán trước sinh nhằm ngăn ngừa và làm giảm tỷ lệ mắc bệnh. Bên
cạnh đó, xác định m i tương quan giữa kiểu gen ATP7B với thể lâm sàng
của bệnh Wilson sẽ giúp cho tiên lượng bệnh và có phác đồ điều trị chính
xác, hiệu quả hơn.
Trên thế giới, đ có nhiều nghiên cứu về xác định đột biến gen ATP7B,
xác định m i tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson. Ở Việt
Nam, các nghiên cứu về bệnh Wilson trước đây chủ yếu là mô tả về đặc điểm
lâm sàng, cận lâm sàng [2],[3],[4]. Trong vài năm gần đây, một s nghiên cứu
về phát hiện đột biến trên gen ATP7B đ bắt đầu được triển khai
[5],[6],[7],[8]. Tuy nhiên, vẫn chưa có nghiên cứu nào về phân tích m i tương
quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh Wilson tạo cơ sở cho việc
tiên lượng bệnh và đưa ra phác đồ điều trị chính xác, hiệu quả. Do đó đề tài:
“Phân tích mối tương quan giữa đột biến gen ATP7B và kiểu hình trên
bệnh nhân Wilson ở Việt Nam” được thực hiện với 2 mục tiêu:
1. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân Wilson.
2. Phân tích m i tương quan giữa kiểu gen ATP7B và kiểu hình của bệnh
nhân Wilson.
3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm bệnh Wilson
1.1.1. Khái niệm về bệnh Wilson
Từ năm 1912, tác giả Wilson đưa ra những khái niệm đầu tiên về bệnh:
bệnh thoái hóa gan - nhân đậu có tính chất gia đình [9].
Sau đó bệnh Wilson được mô tả là bệnh di truyền, r i loạn chuyển hóa
đồng với các tổn thương đặc trưng ở n o, gan và mắt.
1.1.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh Wilson
Trên thế giới
Bệnh Wilson được mô tả từ cu i thế kỷ XIX với các triệu chứng mang
tính chất đơn lẻ: triệu chứng run với tên gọi là bệnh "xơ cứng giả hiệu"; vòng
Kayser và Fleischer màu xanh ở rìa giác mạc [10].
Năm 1912, bệnh mang tên Wilson, với những mô tả đầy đủ các triệu
chứng tổn thương thoái hóa gan và n o, có tính chất gia đình [9].
Những năm sau đó, các tác giả tìm thấy r i loạn chuyển hóa đồng ở các
bệnh nhân Wilson, ứng dụng trong điều trị thải đồng và ghép gan [10],[11],
[12],[13],[14],[15].
Từ sau năm 1993, các nhà khoa học đ phát hiện gen gây bệnh Wilson là
gen lặn ATP7B trên nhiễm sắc thể s 13, ở vị trí 13q14.3 [16],[17].
Năm 1995, với những nghiên cứu phát hiện đột biến đầu tiên: đột biến
p.H1069Q ở châu Âu và p.R778L ở châu Á đ mở ra một kỷ nguyên mới cho
các nghiên cứu phát hiện đột biến gen ATP7B ở các bệnh nhân Wilson
[18],[19].
4
Từ đó đến nay, có rất nhiều các công trình nghiên cứu về phát hiện đột
biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson và đ phát hiện ra hơn 500 dạng đột
biến gen khác nhau được công b trên ngân hàng dữ liệu gen
(http://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/).
Ở Việt Nam
Năm 1969, Bùi Qu c Hương và cộng sự đ báo cáo 8 trường hợp bệnh
nhân Wilson Việt Nam đầu tiên tại Hội nghị Thần kinh học Qu c tế lần thứ
IX ở Mỹ [20].
Năm 1975, Chu Văn Tường và cộng sự nhận xét hai trường hợp bệnh
Wilson đầu tiên tại Bệnh viện Nhi Trung Ương [21].
Từ năm 1977 đến năm 2003, Lê Đức Hinh và cộng sự đ nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 81 bệnh nhân Wilson ở Việt Nam [2],[3].
Năm 2010, Đỗ Thanh Hương và cộng sự là nhóm nghiên cứu đầu tiên
phân tích đột biến trên gen ATP7B. Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu mới chỉ tập
trung phân tích một dạng đột biến phổ biến ở vùng châu Á là đột biến
Arg778Leu bằng phương pháp cắt enzym giới hạn. Nghiên cứu đ phát hiện
được 2/29 bệnh nhân mang đột biến Arg778Leu dạng dị hợp tử [5].
Năm 2012, Lê Hoàng Phúc phát hiện 8/16 bệnh nhân mang đột biến trên
các exon 8, 10, 12, 13, 15, 16 và 20 ở bệnh nhân Wilson tại Bệnh viện Nhi
Đồng 1, Thành ph Hồ Chí Minh [6].
Năm 2015, nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương phát hiện 10/16 bệnh
nhi mang đột biến khi giải trình tự gen trên các exon 2b, 8, 11, 12 và 13 [7].
Năm 2015, nghiên cứu của Phan Tôn Hoàng tại Trường Đại học Y Hà
Nội tiến hành phát hiện đột biến trên 21 exon của gen ATP7B, nghiên cứu đ
phát hiện 48/61 (78,6%) bệnh nhân Wilson có đột biến gen ATP7B [8].
5
1.1.3. Dịch tễ bệnh Wilson
Tại Hoa Kỳ, tỷ lệ người mang gen bệnh là 1/90. Tỷ lệ mắc bệnh Wilson
là 1/30.000 người.
Trên thế giới, tỷ lệ hiện mắc bệnh Wilson là 10 - 30 triệu người, trong đó
tỉ lệ người mang dị hợp tử là 1/ 100.000 người, với tần s đột biến gen khác
nhau 0,3-0,7%. Tại Nhật Bản, tỷ lệ này là 1/30.000 dân, so với 1/100.000 dân
ở Úc. Sự gia tăng tần s bệnh ở một s nước là do tỷ lệ cao của hôn nhân cùng
huyết th ng. Các biểu hiện t i cấp của bệnh Wilson gặp ở nữ nhiều hơn nam [1].
Một nghiên cứu ở Đức cho thấy bệnh nhân bị bệnh Wilson biểu hiện
triệu chứng sớm chủ yếu ở gan (tuổi khởi phát trung bình là 15,5 tuổi), các
triệu chứng thần kinh xuất hiện muộn hơn (trung bình là 20,2 tuổi) [22].
Manolaki và các cộng sự đ phân tích các đột biến được tìm thấy trên
gen ATP7B và phát hiện độ tuổi khởi phát của bệnh Wilson có khoảng dao
động lớn hơn so với trước đây. Các đột biến hoàn toàn phá vỡ cấu trúc gen có
thể gây tổn thương gan sớm trong thời thơ ấu, những bệnh nhân này không
được chẩn đoán bệnh Wilson ở giai đoạn khởi phát bệnh [23].
Nói chung, các nghiên cứu chỉ ra rằng bệnh Wilson có thể khởi phát ở
nhóm tuổi 5 - 40 tuổi. Tuy nhiên cũng có thể gặp một s rất ít các trường hợp
dưới 3 tuổi và trên 70 tuổi [24].
1.1.4. Sinh lý bệnh học bệnh Wilson
Tổng hàm lượng đồng bình thường trong cơ thể ước tính là 50-100mg và
trung bình tiêu thụ hàng ngày là 2-5mg, tùy thuộc vào lượng thức ăn chứa
đồng, bao gồm các loại đậu, các loại thịt, loài giáp xác và socola. Đồng là một
thành phần quan trọng của một s enzym chuyển hóa như lysyl oxidase,
cytochrome oxidase, superoxide dismutase và dopamine hydroxylase β.
Khoảng 50-75% đồng được hấp thụ từ ruột non và sau đó vận chuyển đến
các tế bào gan. Con đường này không bị ảnh hưởng trong bệnh Wilson. Sau khi
đồng đến tế bào gan, nó được tích hợp vào các enzym có chứa đồng và protein
gắn đồng (CBPs: Copper Binding Proteins), bao gồm ceruloplasmin và
ferroxidase huyết thanh.
6
Đồng dư thừa có thể ở dạng không độc bằng cách hình thành phức hợp
với apo-metallothionein, hoặc có thể được bài tiết ra ngoài cơ thể. Có khoảng
95% lượng đồng dư thừa bài tiết ra ngoài qua đường mật, s còn lại bài tiết
qua phân, nước tiểu và mồ hôi.
Cân bằng lượng đồng bình thường trong cơ thể phụ thuộc vào sự bài tiết,
không phụ thuộc vào sự hấp thu và đồng tồn tại trong cơ thể dưới 3 dạng:
- Một phần đồng gắn với protein, được bài tiết vào dịch mật và đào thải
ra ngoài qua phân.
- Một phần nhỏ đồng vào huyết tương dưới dạng cation, rồi thải ra
ngoài qua nước tiểu
- Phần lớn đồng gắn với protein của gan, tổng hợp thành ceruloplasmin,
bản chất là globulin, trọng lượng phân tử là 12.000 Da, gắn với 8
nguyên tử đồng.
Trong bệnh Wilson, quy trình chuyển hóa của đồng thành ceruloplasmin
và bài tiết của lượng đồng thừa qua đường mật bị suy giảm [25].
Đồng từ thức ăn, nước u ng
1. Đồng hấp thu tại ruột
Trong máu
3. Giai đoạn sau gan
2. Giai đoạn tại gan
4.Đồng bài tiết vào mật
Hình 1.1. Chu trình chuyển hóa của đồng trong cơ thể [25].
7
Lượng đồng dư thừa hình thành các g c tự do trong quá trình oxy hóa
của chất béo và protein. Bất thường siêu cấu trúc trong các giai đoạn sớm nhất
của tổn thương tế bào gan, liên quan đến các lưới nội chất, ty thể, peroxisome
và hạt nhân đ được xác định. Ban đầu, đồng dư thừa tích tụ trong gan, dẫn
đến tổn thương các tế bào gan. Cu i cùng, khi lượng đồng trong gan tăng, làm
tăng lưu thông và lắng đọng ở các cơ quan khác gây ra các triệu chứng đa
dạng trên lâm sàng. Ở giai đoạn toàn phát, bệnh có thể biểu hiện ở hầu hết các
cơ quan trong cơ thể: gan, n o, mắt, thận, da, xương...
Ngoài ra, có một s trường hợp tiến triển rất cấp tính ở thể suy gan bùng
phát t i cấp và tử vong sớm. Các thể tiến triển mạn tính dẫn đến xơ gan mất
bù hoặc s ít trường hợp bị ung thư tế bào gan nếu không được điều trị
kịp thời.
1.1.5. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh Wilson
1.1.5.1. Các triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson
Triệu chứng lâm sàng của bệnh Wilson biểu hiện khác nhau giữa các
bệnh nhân tùy thuộc vào giai đoạn bệnh và cơ quan bị tổn thương do lắng
đọng đồng.
Bệnh nhân đến khám và điều trị ở nhiều chuyên khoa (thần kinh, tiêu
hóa, mắt, da liễu, thận, xương khớp...) nên việc chẩn đoán, theo dõi và điều trị
gặp nhiều khó khăn.
Các triệu chứng tiêu hóa thường xuất hiện sớm nhất vì gan dự trữ khoảng
80% lượng đồng trong cơ thể và khi đồng tích tụ trong gan quá nhiều sẽ theo
hệ tuần hoàn đi đến các cơ quan đích khác (n o, mắt, thận, da, xương...).
Triệu chứng tại gan
Tổn thương gan là biểu hiện gặp nhiều nhất ở những bệnh nhân bị bệnh
Wilson (hơn 50% các trường hợp). Có 3 dạng tổn thương chính ở gan: viêm
gan mạn tính hoạt động, xơ gan và suy gan t i cấp.
8
Các bệnh nhân có biểu hiện viêm gan mạn tính hoặc xơ gan hay bị bỏ sót
chẩn đoán nguyên nhân.
Dấu hiệu của suy gan t i cấp bao gồm:
- Cổ trướng, tuần hoàn bàng hệ, sao mạch
- Bàn tay son, ngón tay dùi tr ng
- Nôn ra máu, hội chứng hoàng đảm
Chẩn đoán bệnh Wilson thể suy gan t i cấp khi có các biểu hiện lâm
sàng ở trên, các enzym gan tăng, phosphatase kiềm giảm, có biểu hiện tan
máu và hội chứng tổn thương thận Fanconi.
Bệnh nhân ở nhóm suy gan t i cấp thường rất nặng với tỷ lệ tử vong cao
và có chỉ định ghép gan cấp cứu [26].
Triệu chứng thần kinh
Hầu hết các bệnh nhân có biểu hiện triệu chứng thần kinh đ bị xơ gan.
Các triệu chứng của hệ thần kinh trung ương do lắng đọng đồng ở các nhân
xám của n o.
Triệu chứng thường gặp nhất là run không đ i xứng (khoảng 50%), chủ
yếu là khi nghỉ ngơi, run tư thế, hoặc run động.
Triệu chứng ban đầu thường bao gồm:
- Nói khó, nu t khó, chảy nước d i.
- Vẻ mặt kém linh hoạt.
- Run tay, bàn tay vụng về, viết chữ xấu.
- Tăng nhẹ trương lực cơ kiểu ngoại tháp 2 chi trên, sau đó tăng
dần trương lực cơ tứ chi làm cho người bệnh khó ph i hợp động
tác và r i loạn dáng đi.
Biểu hiện muộn bao gồm:
- Loạn trương lực cơ, vẻ mặt bất động.
- Liệt cứng tứ chi, chân tay co quắp, có các cơn xoắn vặn làm bệnh
nhân đau cơ và các khớp.
- Có thể có cơn động kinh toàn thể.