Luận văn phan lap va tuyen chon nam men tu nhien len men ruou vang chom chom java

  • 13 trang
  • file .pdf
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ THANH HỒNG
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM
MEN TỰ NHIÊN LÊN MEN RƯỢU VANG
CHÔM CHÔM JAVA
(Nephelium lappaceum)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG
NĂM 2013
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Với mục đích tạo ra sản phẩm rượu vang chôm chôm Java chất lượng
cao từ dòng nấm men thuần chủng và góp phần đa dạng sản phẩm của trái
chôm chôm Java, đa dạng sản phẩm rượu vang và tăng thu nhập cho người
dân. Đề tài: “ Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang
chôm chôm Java” được tiến hành. Kết quả nghiên cứu đã phân lập được 39
dòng nấm men từ dịch chôm chôm Java và bước đầu định danh sơ bộ 39 dòng
nấm men phân lập thuộc 03 giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora
và Pichia. Dòng nấm men phân lập từ dịch quả chôm chôm Java lên men tự
nhiên cùng với vỏ và bổ sung đường ở Vĩnh Long (VVĐ3) được tuyển chọn từ
39 dòng nấm men phân lập, thể hiện hoạt lực lên men rượu mạnh nhất biểu
hiện qua: thời gian kết thúc cột khí CO2 trong ống Durham sớm nhất (12 giờ),
hàm lượng ethanol cao nhất (14,2 % v/v). Rượu vang chôm chôm Java lên
men từ nấm men tuyển chọn và dịch phối chế ban đầu: 26oBrix, pH 3,9 và mật
số tế bào nấm men 105 tế bào/mL, lên men ở nhiệt độ 25oC trong 12 ngày cho
độ cồn cao nhất (16,8% v/v). Sản phẩm rượu vang chôm chôm Java có màu
sắc đẹp, mùi vị hài hòa đặc trưng cho sản phẩm. Kết quả định danh dòng nấm
men VVĐ3 bằng phương pháp giải trình tự, cho thấy dòng nấm men ưu việt
tạo ra rượu vang chôm chôm Java tốt nhất tương đồng với loài Saccharomyces
cerevisiae.
Từ khóa: chôm chôm Java, lên men, nấm men, phân lập, rượu vang,
Saccharomyces cerevisiae.
Đề tài: Phân lập và tuyển chọn nấm men tự nhiên lên men rượu vang
chôm chôm Java.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
ABSTRACT
In order to obtain the high quality Java rambutan wine product from
pure yeast and create variety of Java rambutan and wine products, increase
income for farmers producing rambutan. Researching on “Isolation and
selection of natural yeasts to apply in Java rambutan wine production” was
conducted. Results are: 39 yeast strains were obtained from rambutan juices at
different treatment conditions (natural, sugar, and rambutan shell added
fermentation). Based on the preliminary identification of yeasts, 39 isolated
yeast strains are belong to 3 genus of yeast: Saccharomyces, Hanseniaspora
and Pichia. As a result, the yeast strain isolated from natural fermented, added
sugar and rambutan’s shell at Vinh Long province (VVD3) having the best
fermented activity with good characteristics such as the fastest fermention by
Durham test (12 hours) and the highest ethanol content (14.2% v/v).
Moreover, results showed that with the optimal fermentation parameters:
26oBrix, pH 3.9 and 105 CFU/mL of yeast cell density inoculated and
incubaled at 25oC, 12 days of fermentation, as a result, the ethanol content
reached to 16.8% v/v. The Java rambutan wine product had good smell and
color. Result of the identification of yeast by DNA sequencing, the superior
yeast train VVD3 which produced the best Java rambutan wine belong to
Saccharomyces cerevisiae.
Keywords: fermentation, isolation, Java rambutan, Saccharomyces
cerevisiae, wine, yeast.
Title: Isolation and selection of natural yeasts to apply for Java
rambutan wine production.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Chấp nhận của Hội đồng ............................................................................... i
Lời cảm tạ ..................................................................................................... ii
Tóm lược...................................................................................................... iii
Abstract........................................................................................................ iv
Cam kết kết quả............................................................................................ v
Mục lục ........................................................................................................ vi
Danh sách bảng ........................................................................................... ix
Danh sách hình ............................................................................................. x
Danh mục từ viết tắt .................................................................................... xiii
Chương 1: Giới thiệu ................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 2
Chương 2: Lược khảo tài liệu .................................................................... 3
2.1 Nguồn nguyên liệu chôm chôm .............................................................. 3
2.1.1. Sơ lược nguồn gốc .............................................................................. 3
2.1.2 Phân loại.............................................................................................. 3
2.1.3 Đặc điểm chung ................................................................................... 4
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng cây chôm chôm .......................... 7
2.1.5 Thành phần dinh dưỡng và giá trị sử dụng ........................................... 8
2.2 Nấm men ................................................................................................ 10
2.2.1 Hình dạng và kích thước ...................................................................... 10
2.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men....................................................................... 11
2.2.3 Sự sinh sản của tế bào nấm men .......................................................... 12
2.2.4 Phân loại nấm men .............................................................................. 13
2.2.5 Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men ............................................. 13
2.2.6 Các hình thức hô hấp của nấm men ..................................................... 16
2.2.7 Các chủng nấm men thường thấy trong lên men rượu vang tự nhiên .... 17
2.2.8 Vùng gen ITS của nấm men................................................................. 18
2.3 Phân lập nấm men .................................................................................. 19
2.4 Rượu vang quả ....................................................................................... 21
2.4.1 Tìm hiểu rượu vang quả....................................................................... 21
2.4.2 Thành phần hóa học rượu vang quả ..................................................... 22
2.4.3 Phân loại rượu vang ............................................................................. 23
2.4.4 Quá trình sản xuất rượu vang quả ....................................................... 24
2.4.5 Cơ chế quá trình lên men .................................................................... 26
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
2.4.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong lên men rượu vang .............. 28
2.4.7 Những khó khăn và thuận lợi trong sản xuất rượu vang ở Việt Nam .... 30
2.5 Phản ứng PCR ........................................................................................ 30
2.5.1 Kỹ thuật PCR ...................................................................................... 30
2.5.2 Nguyên lý của kỹ thuật PCR ................................................................ 31
2.5.3 Chuẩn bị mẫu DNA ............................................................................. 31
2.5.4 Thiết kế mồi ........................................................................................ 31
2.5.5 Điều kiện phản ứng PCR ..................................................................... 32
2.5.6 Chu kỳ nhiệt ........................................................................................ 33
2.6 Một số đề tài nghiên cứu về rượu vang ở Việt Nam ................................ 34
Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu............................... 37
3.1 Phương tiện nghiên cứu .......................................................................... 37
3.1.1 Địa điểm và thời gian .......................................................................... 37
3.1.2 Nguyên liệu ......................................................................................... 37
3.1.3 Hóa chất và môi trường sử dụng .......................................................... 37
3.1.4 Thiết bị và dụng cụ .............................................................................. 38
3.2 Phương pháp .......................................................................................... 38
3.2.1 Thí nghiệm 1: Phân lập nấm men tự nhiên từ dịch quả chôm chôm 40
3.2.2 Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các dòng nấm men có hoạt lực lên men rượu
cao ..................................................................................................... 42
3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng các nhân tố mật số nấm men, độ
Brix, pH ban đầu đến quá trình lên men rượu vang chôm chôm và đánh
giá chất lượng sản phẩm rượu vang chôm chôm Java ........................ 44
Chương 4: Kết quả thảo luận .................................................................... 47
4.1 Kết quả phân lập nấm men ..................................................................... 50
4.1.1 Địa điểm thu mẫu tại Vĩnh Long.......................................................... 50
4.1.2 Địa điểm thu mẫu tại Bến Tre .............................................................. 53
4.1.3 Địa điểm thu mẫu tại Cần Thơ ............................................................. 57
4.1.4 Định danh sơ bộ các dòng nấm men đã phân lập.................................. 62
4.2 Khả năng lên men dịch chôm chôm Java của các chủng nấm men vừa phân
lập và so sánh với dòng nấm men đối chứng ...................................... 75
4.2.1 Kết quả chiều cao cột khí CO2 trong ống nghiệm chứa ống Durham .... 76
4.2.2 Khả năng lên men của các dòng nấm men phân lập với dòng nấm men
đối chứng........................................................................................... 77
4.3 Kết quả khảo sát các nhân tố mật số nấm men, độ Brix, pH ban đầu lên
quá trình lên men rượu vang chôm chôm ........................................... 79
4.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm rượu vang chôm chôm Java .................... 82
4.4.1 Phân tích các chỉ tiêu hóa học trong sản phẩm rượu vang chôm chôm
Java ................................................................................................... 82
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
4.4.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm rượu vamg chôm chôm Java.................. 85
4.5 Định danh dòng nấm men VVĐ3 bằng phương pháp giải trình tự .......... 86
Chương 5: Kết luận và kiến nghị............................................................... 88
5.1 Kết luận ................................................................................................. 88
5.2 Đề nghị................................................................................................... 88
Tài liệu tham khảo ..................................................................................... 90
Phụ lục ........................................................................................................ 93
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Bảng phân biệt đặc điểm cơ bản của ba loài phụ của Nephelium
lappaceum ......................................................................................... 4
Bảng 2.2: Đặc tính một số giống chôm chôm đang được quan tâm ............... 7
Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thịt của quả chôm chôm chín. 8
Bảng 2.4: Thành phần hóa học của nấm men ................................................ 14
Bảng 2.5: Các chất khoáng cần thiết cho nấm men ....................................... 15
Bảng 2.6: Thành phần rượu vang quả Ba Lan ............................................... 22
Bảng 3.1: Thành phần dung dịch lysis buffer................................................ 47
Bảng 3.2: Công thức chạy phản ứng PCR..................................................... 48
Bảng 4.1: Hình dạng nấm men ở Vĩnh Long, Bến Tre và Cần Thơ ............... 61
Bảng 4.2: Khả năng lên men đường glucose và đường saccharose của 39 dòng
nấm men đã phân lập ........................................................................ 72
Bảng 4.3: Tổng hợp đặc điểm hình thái và sinh lý của 39 dòng nấm men 74
Bảng 4.4: Chiều cao cột khí CO2 (cm) của 15 dòng nấm men theo thời gian lên
men ................................................................................................... 77
Bảng 4.5: Độ cồn và độ Brix sau khi lên men của 15 dòng nấm men ........... 78
Bảng 4.6: Độ cồn, độ Brix và pH của rượu chôm chôm Java sau khi lên men80
Bảng 4.7: Kết quả các chỉ tiêu phân tích sản phẩm theo TCVN 7045:2009 .. 82
Bảng 4.8: So sánh các chỉ tiêu phân tích của sản phẩm rượu vang chôm chôm
Java và rượu vang nhãn ..................................................................... 84
Bảng 4.9: Kết quả đánh giá cảm quan rượu vang chôm chôm Java ............... 85
Bảng 4.10: Kết quả giải trình tự ITS - rDNA (ITS1 - 5.8S rDNA - ITS2) của
dòng VVĐ3 ....................................................................................... 86
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Hoa chôm chôm ........................................................................... 4
Hình 2.2: Sự phát triển trọng lượng trái chôm chôm Java 24 năm tuổi tại huyện
Phong Điền TP. Cần Thơ .................................................................. 5
Hình 2.3: Chôm chôm Java ......................................................................... 6
Hình 2.4: Chôm chôm nhãn ......................................................................... 6
Hình 2.5: Chôm chôm Rongrien .................................................................. 6
Hình 2.6: Nấm men Saccharomyces cereviceae .......................................... 11
Hình 2.7: Biểu đồ biểu diễn đường tăng trưởng nấm men ............................ 16
Hình 2.8: Vị trí vùng ITS trên rDNA ........................................................... 19
Hình 2.9: Sơ đồ quá trình phân lập nấm men ............................................... 20
Hình 2.10: Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men .......................... 27
Hình 2.11: Các bước của phản ứng PCR ..................................................... 34
Hình 3.1: Quy trình tổng quát quá trình phân lập nấm men và sản xuất rượu
vang chôm chôm Java....................................................................... 39
Hình 3.2: Sơ đồ phân lập nấm men tự nhiên từ dịch chôm chôm Java ......... 41
Hình 3.3: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát và tuyển chọn hoạt tính nấm men ....... 43
Hình 3.4: Sơ đồ thí nghiệm ảnh hưởng của các nhân tố lên quá trình lên men
rượu vang chôm chôm Java .............................................................. 45
Hình 3.5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ........................................................ 48
Hình 4.1: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long
lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở
vật kính 100) .................................................................................... 50
Hình 4.2: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long
lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 51
Hình 4.3: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long
lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 52
Hình 4.4: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Vĩnh Long
lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100)
......................................................................................................... 52
Hình 4.5: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre
lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở
vật kính 100) .................................................................................... 53
Hình 4.6: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre
lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 54
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
Hình 4.7: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre
lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 55
Hình 4.8: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Bến Tre
lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100)
......................................................................................................... 56
Hình 4.9: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ
lên men trong điều kiện không có vỏ và không bổ sung đường (hình ở
vật kính 100) .................................................................................... 57
Hình 4.10: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ
lên men trong điều kiện có vỏ và không bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 58
Hình 4.11: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ
lên men trong điều kiện không có vỏ và bổ sung đường (vật kính 100)
......................................................................................................... 59
Hình 4.12: Hình dạng nấm men phân lập từ nước chôm chôm Java ở Cần Thơ
lên men trong điều kiện có vỏ và bổ sung đường (hình ở vật kính 100)
......................................................................................................... 60
Hình 4.13: Nấm men nhóm 1 (nấm men hình cầu lớn) ................................ 63
Hình 4.14: Nấm men nhóm 2 (nấm men hình cầu nhỏ) ................................ 63
Hình 4.15: Nấm men nhóm 3 (nấm men hình ovan lớn) .............................. 64
Hình 4.16: Nấm men nhóm 4 (nấm men hình ovan nhỏ) ............................. 64
Hình 4.17: Nấm men nhóm 5 (nấm men hình elip) ...................................... 67
Hình 4.18: Nấm men nhóm 6 (nấm men hình elip dài) ................................ 68
Hình 4.19: Nấm men nhóm 7 (nấm men hình elip nhọn) ............................. 68
Hình 4.20: Sự hình thành tế bào nảy chồi của 39 dòng nấm men phân lập (hình
vật kính 100) .................................................................................... 69
Hình 4.21: Hình dạng bào tử của các nhóm nấm men (vật kính 100) ........... 71
Hình 4.22: Môi trường Christensen khi vừa mới cấy các dòng nấm men 73
Hình 4.23: Sau khi nuôi cấy các dòng nấm men một tuần ............................ 73
Hình 4.24: Các dòng nấm men có khả năng sinh urease làm môi trường đổi
màu (đỏ) so với dòng không sinh urease (vàng) ................................ 73
Hình 4.25: Khuẩn lạc và tế bào nấm men VVĐ3 ......................................... 79
Hình 4.26: Biểu đồ mặt đáp ứng thể hiện sự tương quan giữa pH ban đầu và
mật số tế bào nấm men đến quá trình tạo ethanol .............................. 81
Hình 4.27: Biểu đồ đường mức thể hiện sự tương quan giữa độ pH ban đầu và
mật số nấm men đến quá trình tạo ethanol ........................................ 81
Hình 4.28: Kết quả chạy PCR của nấm men VVĐ3 trên gel agarose ........... 86
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Cao học Khóa XVIII – 2013 Trường ĐHCT
Hình 4.29: So sánh trình tự vùng ITS – rDNA của nấm men VVĐ3 và chủng
Saccharomyces cerevisiae với số đăng ký KC183726.1 .................... 87
Hình 5.1: Quy trình lên men rượu vang chôm chôm Java (đề nghị).........89
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xii Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công nghệ Sinh học