Luận văn phan lap tuyen chon va nhan dien vi khuan co kha nang phan huy phenol

  • 11 trang
  • file .pdf
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TRẦN THỊ THÚY HẰNG
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NHẬN DIỆN
VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
PHENOL
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGs. Ts. NGUYỄN HỮU HIỆP
NĂM 2013
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
TÓM TẮT
Trong số những hợp chất thơm, phenol được biết đến như một thành
phần phổ biến trong đất và chất thải bị ô nhiễm từ nhiều ngành công nghiệp:
nhà máy lọc dầu, dược phẩm, dầu khí, dệt may,…Độc tính của phenol gây
ảnh hưởng tiêu cực đến con người, môi trường, động thực vật và sinh vật
thủy sinh. Phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng phân hủy
phenol tạo cơ sở hình thành giải pháp làm sạch môi trường theo hướng sinh
học. Nghiên cứu được thực hiện từ 12/2013- 08/2013. Trong nghiên cứu này,
các dòng vi khuẩn được phân lập trên môi trường MSB (Minerral salts basal)
với phenol là nguồn carbon duy nhất. Kết quả 37 dòng vi khuẩn có khả năng
phân hủy đã phân lập từ các địa điểm Trà Vinh, Vĩnh Long, Cần Thơ và Sóc
Trăng. Trong số đó, 35 dòng có dạng hình que, 2 dòng có dạng hình cầu;
34/37 dòng có khả năng di động, 3/37 dòng không di động; 29/37 dòng Gram
âm, 8/37 dòng Gram dương. Ba dòng vi khuẩn P3, P10, P36 có khả năng
phân hủy phenol tốt nhất. Sau 7 ngày trong môi trường có 0,5 g/L phenol,
dòng vi khuẩn P3, P10 và P36 theo thứ tự có thể phân hủy 39,8%, 95,2% và
83,2% và phenol. Kết quả giải trình tự gene 16S rRNA xác định dòng P3 là
Paenibacillus sp., dòng P10 và P36 là Rhodococcus sp.
Từ khóa: Paenibacillus sp., phân hủy sinh học, Rhodococcus sp., 16S
rRNA, vi khuẩn phân hủy phenol.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
ABSTRACT
Among aromatic compounds, phenol is known as a common constituent
of soil and wastes contaminated from many industries including oil refineries,
pharmaceutical, petroleum, textiles and coal refining etc. The toxicity of
phenol causes negative effects to human, environment, fauna and aquatic
organisms. Isolation, selection and identification bacterial strains capable of
degrading phenol to form the basis of an environmental cleaning solution by
biological methods. The study was carried out from 12/2013 to 08/2013. In
this study, the bacterial strains were isolated in MSB medium (Minerral basal
salts) with phenol as sole source of carbon. Thirty-seven bacterial strains
capaple of degrading phenol were isolated from soil and waste water in Tra
Vinh, Vinh Long, Can Tho and Soc Trang provinces. Among them, 35 strains
were rod shape, 2 trains were globular shape; 34/37 strains were motile, 3/37
strains were not motile; 29/37 trains were gram negative, 8/37 trains were
gram positive. P3, P10 and P36 could degrade phenol the best. After seven
days in the medium containing 0,5 g/L of phenol, P3, P10 and P36 could
degrade phenol at 39,8%, 95,2% and 83,2%, respectively. The results of 16S
rRNA sequence analysis showed that P3 strain was Peanibacillus sp. and P10,
P36 were Rhodococcus sp.
Key words: Biodegradation, Paenibacillus sp., phenol-degrading
bacteria, Rhodococcus sp., 16s rRNA.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
Tóm tắt........................................................................................................... iii
Abstract .......................................................................................................... iv
Chương 1: Giới thiệu .....................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................1
1.2 Mục tiêu đề tài............................................................................................2
Chương 2: Lược khảo tài liệu ........................................................................3
2.1 Cấu tạo và tính chất của phenol ..................................................................3
2.2 Nguồn gốc phát sinh chất thải chứa phenol .................................................3
2.2.1 Nguồn tự nhiên ........................................................................................3
2.2.2 Nguồn nhân tạo .......................................................................................4
2.3 Tác động của phenol đến sức khỏe con người, động vật và hệ sinh thái ......5
2.3.1 Ảnh hưởng đến sức khỏe con người.........................................................5
2.3.2 Ảnh hưởng đến động vật..........................................................................5
2.3.3 Ảnh hưởng đến hệ sinh thái .....................................................................6
2.4 Sự phân hủy sinh học của phenol bởi vi khuẩn ...........................................7
2.4.1 Vi khuẩn phân hủy phenol .......................................................................7
2.4.2 Cơ chế phân hủy phenol bởi vi khuẩn ......................................................8
2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy phenol ............................ 11
Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu................................. 13
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................ 13
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ............................................... 1313
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................... 1313
3.1.3 Hóa chất ................................................................................................ 14
3.1.4 Vật liệu .................................................................................................. 16
3.2 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
3.2.1 Chuẩn bị thí nghiệm .............................................................................. 16
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
3.2.2 Phân lập vi khuẩn từ đất và nước thải nhiễm phenol .............................. 16
3.2.3 Khảo sát một số đặc tính của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................. 16
3.2.4 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn đã phân lập có khả năng phân hủy
phenol ..................................................................................................... 19
3.2.5 Kiểm tra khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn đã tuyển
chọn. ....................................................................................................... 20
3.2.6 Khảo sát sự sinh trưởng của vi khuẩn đã tuyển chọn ở các nồng độ
phenol khác nhau .................................................................................... 21
3.2.7 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy phenol ............................... 22
3.2.8 Nhận diện vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử ................................ 23
Chương 4: Kết quả thảo luận ...................................................................... 25
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ đất và nước thải nhiễm phenol .................... 25
4.2 Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập được .............................. 26
4.3 Kết quả tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy phenol ....... 30
4.4 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp enzyme của các dòng vi khuẩn tuyển
chọn .................................................................................................... 3030
4.4.1 Khảo sát khả năng tạo enzyme protease ................................................. 30
4.4.2 Khảo sát khả năng tạo enzyme lipase ..................................................... 31
4.4.3 Khảo sát khả năng tạo enzyme amylase ................................................. 33
4.4.4 Khảo sát khả năng tạo enzyme cellulase ................................................ 33
4.5 Kết quả khảo sát khả năng sinh trưởng của vi khuẩn tuyển chọn ở các
nồng độ phenol khác nhau ....................................................................... 34
4.6 Thí nghiệm chứng minh khả năng phân hủy phenol của vi khuẩn ............. 38
4.7 Nhận diện vi khuẩn bằng kĩ thuật sinh học phân tử ................................... 40
Chương 5: Kết luận và đề xuất .................................................................... 44
5.1 Kết luận .................................................................................................... 44
5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 44
Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 45
Phụ lục .......................................................................................................... 54
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật ở cạn ................................. 6
Bảng 2.2: Giá trị LD50 đối với một số loài động vật thủy sinh ...........................6
Bảng 2.3: Vi khuẩn phân hủy phenol ................................................................7
Bảng 3.1: Nồng độ phenol ở các nghiệm thức trong thí nghiệm...................... 21
Bảng 4.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn đã phân lập...................................... 25
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập sau 72
giờ........................................................................................................... 27
Bảng 4.3: Một số đặc tính của các dòng vi khuẩn phân lập ............................. 29
Bảng 4.4: Kích thước vùng sáng do vi khuẩn tạo ra khi tổng hợp protease ..... 31
Bảng 4.5: Mật số dòng vi khuẩn P3 ở các nồng độ phenol khác nhau ............. 35
Bảng 4.6: Mật số dòng vi khuẩn P10 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 36
Bảng 4.7: Mật số dòng vi khuẩn P36 ở các nồng độ phenol khác nhau ........... 37
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1: Công thức cấu tạo của phenol ...........................................................3
Hình 2.2: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo con đường hiếu khí ...........................9
Hình 2.3: Sơ đồ chuyển hóa phenol theo con đường kỵ khí ............................ 10
Hình 3.1: Các bước thực hiện quy trình nhuộm Gram .................................... 19
Hình 3.2: Đường chuẩn phenol ....................................................................... 23
Hình 3.3: Nhiệt độ và thời gian của phản ứng PCR ........................................ 24
Hình 4.1: Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phát triển sau 72 giờ trên môi
trường MSB agar .................................................................................... 26
Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram của một số dòng vi khuẩn phân lập được ...... 28
Hình 4.3: Sự sinh trưởng của các dòng vi khuẩn ở nồng độ 0,5 g/L phenol .... 30
Hình 4.4: Vòng sáng của vi khuẩn có khả năng tạo enzyme protease sau 3
ngày ........................................................................................................ 31
Hình 4.5: Khả năng tổng hợp lipase của các dòng vi khuẩn ............................ 32
Hình 4.6: Lipid bị thủy phân bởi các dòng vi khuẩn ....................................... 32
Hình 4.7: Hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn sau 3 ngày ủ ...... 33
Hình 4.8: Hoạt tính enzyme cellulase của các dòng vi khuẩn sau 3 ngày ủ ..... 33
Hình 4.9: Sự tăng trưởng của dòng P3 trên môi trường MSB ở các nồng độ
phenol khác nhau .................................................................................... 35
Hình 4.10: Sự tăng trưởng của dòng P10 trên môi trường MSB ở các nồng
độ phenol khác nhau ............................................................................... 36
Hình 4.11: Sự tăng trưởng của dòng P36 trên môi trường MSB ở các nồng
độ phenol khác nhau ............................................................................... 37
Hình 4.12: Đường chuẩn phenol ..................................................................... 38
Hình 4.13: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P3 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.14: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P10 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 39
Hình 4.15: Sự sinh trưởng và phân hủy phenol của dòng P36 ở nồng độ 0,5
g/ L ......................................................................................................... 40
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH
Luận văn Thạc sĩ khóa 18 - 2013 Trường ĐHCT
Hình 4.16: Kết quả điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn trên gel
agarose 1% .............................................................................................. 40
Hình 4.17: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P3................................. 41
Hình 4.18: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P10 ............................... 42
Hình 4.19: Kết quả trình tự gen 16S rRNA của dòng P36 ............................... 43
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện Nghiên Cứu và Phát triển CNSH