Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu chiết xuất và tinh chế conessin, kaempferol, nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc - hoàng thị tuyết nhung

  • 238 trang
  • file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ
CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN TỪ
DƯỢC LIỆU LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ TUYẾT NHUNG
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ
CONESSIN, KAEMPFEROL, NUCIFERIN TỪ
DƯỢC LIỆU LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU
TRONG KIỂM NGHIỆM THUỐC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC
MÃ SỐ: 62. 73. 15. 01
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu
HÀ NỘI 2012
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên
cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được
công bố trong bất kì công trình nào khác.
Hoàng Thị Tuyết Nhung
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới:
PSG.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
PGS.TS. Trịnh Văn Lẩu
những người thầy đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực
hiện luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quí báu của PGS.TS. Nguyễn Viết
Thân, PGS.TS Nguyễn Thái An, Bộ môn Dược liệu, Trường Đại học Dược Hà Nội,
đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu tìm hiểu và khảo sát các phương pháp chiết
xuất, phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên từ dược liệu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quí báu của TS. Trần Việt Hùng, ThS.
Nguyễn Thị Kim Thanh,TS. Trần Thị Hồng Anh, ThS. Vũ Thị Nguyệt Minh và
các bạn đồng nghiệp tại Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình xây dựng bộ dữ liệu chuẩn, xây dựng phương
pháp phân tích và đánh giá liên phòng thí nghiệm.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Tử An, đã giới thiệu đề tài nghiên
cứu và dành cho tôi nhiều ý kiến trao đổi khoa học thú vị trong suốt quá trình thực
hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Đức Hậu, PGS.TSKH Lê Thành
Phước, đã đóng góp cho tôi nhiều nhận xét bổ ích trong quá trình hoàn thành bản luận
án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn DS. Dương Văn Tú, Bộ môn Bào chế, Trường Đại
học Dược Hà Nội đã giúp tôi tìm được nhiều tài liệu tham khảo có giá trị.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội,
Phòng Sau đại học, Bộ môn Hóa phân tích đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Hóa đại cương – vô cơ đã
giúp đỡ tôi trong quá trình vừa công tác vừa thực hiện luận án.
Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tất cả sự giúp đỡ
quí báu trên.
Hà Nội, 12/2011
Hoàng Thị Tuyết Nhung
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Xu thế phát triển thuốc có nguồn gốc thiên nhiên 3
1.2. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 7
1.2.1. Về hợp chất Conessin và cây Mức hoa trắng 7
1.2.2. Về hợp chất Kaempferol và cây Đơn lá đỏ 12
1.2.3. Về hợp chất Nuciferin và cây Sen 16
1.3. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu 22
1.3.1. Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 22
1.3.2. Hoạt động thiết lập chất chuẩn đối chiếu của các Hội đồng Dược điển, của khu
vực ASEAN và Việt Nam 29
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu 33
2.1.1. Nguyên liệu 33
2.1.2. Hóa chất, thuốc thử 34
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ 34
2.2. Phương pháp nghiên cứu 35
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 36
2.2.2. Thiết kế thí nghiệm 37
2.2.3. Chiết xuất, phân lập, tinh chế 37
2.2.4. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất 40
2.2.5. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 40
2.2.6. Thiết lập chất chuẩn và xây dựng tiêu chuẩn đánh giá chất chuẩn 41
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 49
3.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế các hợp chất tự nhiên từ dược liệu 49
3.1.1. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Conessin từ Mức hoa trắng 49
3.1.2. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Kaempferol từ Đơn lá đỏ 56
3.1.3. Chiết xuất, phân lập và tinh chế Nuciferin từ lá Sen 65
3.2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng và xác định độ tinh khiết của các chất 69
3.2.1. Đặc điểm cảm quan 69
3.2.2. Điểm chảy 70
3.2.3. Kết quả đo phổ 70
3.2.4. Xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76
3.3. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 78
3.3.1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích 78
3.3.2. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng đánh giá chất chuẩn 87
3.3.3. Áp dụng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp phân tích đã được thẩm định để
xác định chất lượng nguyên liệu thiết lập chuẩn 88
3.3.4. Đóng gói và đánh giá đồng nhất lô 96
3.3.5. Đánh giá liên phòng thí nghiệm và xác định giá trị ấn định 97
3.4. Kết quả nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 100
3.4.1. Đề cương nghiên cứu độ ổn định 100
3.4.2. Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 9 tháng 102
3.4.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của các chất chuẩn đối chiếu sau 15 tháng 106
3.5. Kết quả ứng dụng chất chuẩn đối chiếu 107
3.5.1. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 108
3.5.2. Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 115
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. Về việc lựa chọn đối tượng nghiên cứu 124
4.2. Về các phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 124
4.2.1. Nhóm các phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế 124
4.2.2. Nhóm các phương pháp nhận dạng, xác định độ tinh khiết 126
4.2.3. Phương pháp định lượng và xác định tạp chất liên quan 127
4.3. Về qui trình chiết xuất, phân lập và tinh chế 128
4.3.1. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin 128
4.3.2. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Kaempferol 130
4.3.3. Chiết xuất, phân lập, tinh chế Nuciferin 131
4.4. Về bộ dữ liệu nhận dạng và độ tinh khiết của các hợp chất 133
4.4.1. Về bộ dữ liệu đo phổ 133
4.4.2. Về độ tinh khiết xác định bằng kĩ thuật quét nhiệt vi sai 133
4.5. Về kết quả nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu 133
4.5.1. Về tiêu chuẩn chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 133
4.5.2. Về qui trình đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu 135
4.5.3. Về qui trình đóng gói và đánh giá độ đồng nhất lô 136
4.6. Về độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu 136
4.6.1. Về độ ổn định ở thời điểm 9 tháng 137
4.6.2. Về độ ổn định ở thời điểm 15 tháng 138
4.7. Về việc ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu 139
4.7.1. Định lượng Kaempferol trong dược liệu 139
4.7.2. Định lượng Conessin trong chế phẩm đông dược 140
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 141
Kết luận 141
Đề xuất 142
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN Acetonitril
ACRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học của ASEAN
(Asean Chemical Reference Substance)
ASEAN Hiệp Hội Các Nước Đông Nam Á
(Association of Southeast Asian Nations)
CCĐC Chất chuẩn đối chiếu
CE Điện di mao quản
(Capillary Electrophoresis)
CTCL Chỉ tiêu chất lượng
DSC Đo nhiệt vi sai
(Differential Scanning Calorimetry)
EDQM Ủy ban Châu Âu về chất lượng thuốc và chăm sóc y tế
(European Directorate for the Quality of Medicine & HealthCare)
EP Dược điển Châu Âu
(European Pharmacopoeia)
EPCRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Châu Âu
(European Pharmacopoeial Chemical Reference Substance)
ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun mù electron
(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)
EtOAc Ethyl acetat
EtOH Ethanol
GC Sắc kí khí
(Gas Chromatography)
GLP Thực hành phòng thí nghiệm tốt
(Good Laboratory Practice)
HCTP Hợp chất toàn phần
HĐDĐ Hội đồng Dược điển
HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)
HPLC-MS Sắc kí lỏng - khối phổ
(High Performance Liquid Chromatography– Mass Spectrometry)
HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao
(High Performance Thin Layer Chromatography)
ICRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Quốc tế
(International Pharmacopoeial Chemical Reference Substance)
IP Dược điển Quốc tế
(International Pharmacopoeia)
IR Hồng ngoại
(Infrared)
ISO Tổ chức Quốc tế về Tiêu chuẩn hóa
(International Organization for Standardization)
JPMA Hiệp hội các nhà sản xuất dược Nhật Bản
(Japan Pharmaceutical Manufacturers Association)
LOD Giới hạn phát hiện
(Limit of Detection)
LOQ Giới hạn định lượng
(Limit of Quantitation)
MeOH Methanol
NLĐC Nguyên liệu đối chiếu
NMR Cộng hưởng từ hạt nhân
(Nuclear Magnetic Resonance)
NSX Nhà sản xuất
PCRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học sơ cấp
(Primary Chemical Reference Substance)
PPPT Phương pháp phân tích
PTN Phòng thí nghiệm
RSD Độ lệch chuẩn tương đối
(Relative Standard Deviation)
SCRS Chất chuẩn đối chiếu hóa học thứ cấp
(Secondary Chemical Reference Substance)
SKĐ Sắc kí đồ
TCCL Tiêu chuẩn chất lượng
TLC Sắc kí lớp mỏng
(Thin Layer Chromatography)
UNDP Chương Trình Phát Triển Liên Hợp Quốc
(United Nations Development Programme)
USPRS Chất chuẩn đối chiếu Dược điển Mĩ
(United State Pharmacopoeial Reference Standard)
UV Tử ngoại
(Ultraviolet)
UV-VIS Tử ngoại – khả kiến
(Ultraviolet – Visible)
VKNTTƯ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
kl/tt Khối lượng/thể tích
tt/tt Thể tích/thể tích
tt/tt/tt Thể tích/thể tích/thể tích
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết alcaloid toàn phần từ vỏ thân Mức hoa trắng. 50
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát hàm lượng cắn flavonoid toàn phần từ đơn lá đỏ 57
Bảng 3.3. Hàm lượng Kaempferol trung bình trong cắn EtOAc 59
Bảng 3.4. Hàm lượng Kaempferol có thể chiết xuất được từ Đơn lá đỏ 60
Bảng 3.5. Thành phần và thể tích các hệ dung môi giải hấp phụ cột silicagel 62
Bảng 3.6. Giá trị Rf và màu sắc các vết sắc kí của Kaempferol tinh chế được với
các hệ dung môi I, II, III 65
Bảng 3.7. Hàm lượng alcaloid toàn phần trong lá Sen thu được bằng
hai phương pháp chiết 66
Bảng 3.8. Đặc điểm cảm quan của các chất 69
Bảng 3.9. Kết quả đo điểm chảy 70
Bảng 3.10. Kết quả đo phổ tử ngoại khả kiến 71
Bảng 3.11. Kết quả đo phổ hồng ngoại 71
Bảng 3.12. Kết quả đo phổ khối lượng (ESI-MS) 72
Bảng 3.13. Kết quả phân tích phổ NMR của Conessin 73
Bảng 3.14. Kết quả phân tích phổ NMR của Kaempferol 74
Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ NMR của Nuciferin 75
Bảng 3.16. Kết quả xác định độ tinh khiết bằng quét nhiệt vi sai 76
Bảng 3.17. Loại cột HPLC đã khảo sát xây dựng phương pháp phân tích 78
Bảng 3.18. Khảo sát pha động và thành phần pha động 78
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát bước sóng phát hiện 80
Bảng 3.20. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn 80
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ chính xác của 3 chất 83
Bảng 3.22. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Conessin 84
Bảng 3.23. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Kaempferol 84
Bảng 3.24. Kết quả khảo sát tính tuyến tính với Nuciferin 84
Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ đúng của 3 chất 85
Bảng 3.26. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) 86
Bảng 3.27. Chương trình sắc kí để định lượng và xác định tạp chất trong nguyên
liệu thiết lập chuẩn 87
Bảng 3.28. Tóm tắt các chỉ tiêu và phương pháp thử của các chất đối chiếu 88
Bảng 3.29. Điểm chảy của các hợp chất dùng làm nguyên liệu thiết lập chất
chuẩn 89
Bảng 3.30. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Conessin 90
Bảng 3.31. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Kaempferol 90
Bảng 3.32. Kết quả phân tích tạp chất trong nguyên liệu Nuciferin 91
Bảng 3.33. Kết quả định lượng Conessin nguyên liệu thiết lập chuẩn 95
Bảng 3.34. Kết quả định lượng Kaempferol nguyên liệu thiết lập chuẩn 95
Bảng 3.35. Kết quả định lượng Nuciferin nguyên liệu thiết lập chuẩn 96
Bảng 3.36. Kết quả đánh giá độ đồng nhất lô 97
Bảng 3.37. Kết quả hàm lượng công bố và số lượng của các chất chuẩn đã thiết
lập được 98
Bảng 3.38. Các chỉ tiêu chất lượng đánh giá và giới hạn chấp nhận 100
Bảng 3.39. Các giá trị tại thời điểm ban đầu 102
Bảng 3.40. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Conessin sau 9 tháng 102
Bảng 3.41. Kết quả bán định lượng Conessin sau 9 tháng 103
Bảng 3.42. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Kaempferol sau 9 tháng 104
Bảng 3.43. Kết quả định lượng Kaempferol sau 9 tháng 104
Bảng 3.44. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Nuciferin sau 9 tháng 105
Bảng 3.45. Kết quả định lượng Nuciferin sau 9 tháng 105
Bảng 3.46. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Conessin sau 15 tháng 106
Bảng 3.47. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Kaempferol sau 15 tháng 106
Bảng 3.48. Kết quả phân tích tạp chất liên quan của Nuciferin sau 15 tháng 107
Bảng 3.49. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí định lượng
Kaempferol trong lá Đơn lá đỏ 109
Bảng 3.50. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng
Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ
111
Bảng 3.51. Kết quả xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ
111
Bảng 3.52. Kết quả thẩm định độ đúng của phương pháp định lượng Kaempferol
trong dược liệu Đơn lá đỏ 112
Bảng 3.53. Kết quả định lượng Kaempferol trong dược liệu Chè vằng 114
Bảng 3.54. Chương trình gradient dung môi định lượng Conessin trong viên nén
Mộc hoa trắng HT 116
Bảng 3.55. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí định lượng Conessin
trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 117
Bảng 3.56. Khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng Conessin trong
viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 120
Bảng 3.57. Khảo sát độ chính xác trung gian (khác ngày) của phương pháp định
lượng Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121
Bảng 3.58. Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng Conessin
trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121
Bảng 3.59. Khảo sát độ đúng của phương pháp định lượng Conessin trong viên
nén bao phim Mộc hoa trắng HT 122
Bảng 3.60. Kết quả khảo sát LOD của phương pháp định lượng Conessin trong
viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 123
Bảng 4.1. Kết quả đạt được của nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tinh chế 132
Bảng 4.2. Số liệu thẩm định phương pháp HPLC 135
Bảng 4.3. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độ ổn định sau 9 tháng 138
Bảng 4.4. Tóm tắt kết quả nghiên cứu độ ổn định sau 9 tháng và 15 tháng 138
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Số nước thành viên của WHO đã có qui chế quản lí thuốc từ dược liệu 5
Hình 1.2. Công thức cấu tạo của Conessin 7
Hình 1.3. Ảnh cây Mức hoa trắng 11
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của Kaempferol 13
Hình 1.5. Ảnh cây Đơn lá đỏ 15
Hình 1.6. Công thức cấu tạo của Nuciferin 17
Hình 1.7. Ảnh cây Sen 19
Hình 1.8. Sự phát triển số lượng EPCRS 30
Hình 1.9. Phân bố nhu cầu sử dụng EPCRS theo khu vực địa lí 30
Hình 1.10. Hình ảnh USPRS 30
Hình 1.11. Hình ảnh ACRS 31
Hình 1.12. Chất chuẩn đối chiếu hóa học Cefuroxim acetil 31
Hình 1.13. Chất chuẩn đối chiếu hóa học Acid Chlorogenic 31
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu 36
Hình 3.1. Kiểm tra khối lượng phân tử của Conessin bằng phổ khối (ESI-MS) 56
Hình 3.2. SKĐ các dịch chiết Kaempferol từ Đơn lá đỏ 58
Hình 3.3. SKĐ các phân đoạn phân lập Kaempferol 62
Hình 3.4. SKĐ của Keampferol tinh chế được với các hệ dung môi 64
Hình 3.5. Kiểm tra khối lượng phân tử của Nuciferin bằng phổ khối (ESI-MS) 69
Hình 3.6. Nhiệt đồ của mẫu Conessin 77
Hình 3.7. Nhiệt đồ của mẫu Kaempferol 77
Hình 3.8. Nhiệt đồ của mẫu Nuciferin 77
Hình 3.9. SKĐ và phổ UV của dung dịch đối chiếu Conessin 79
Hình 3.10. SKĐ và phổ UV của dung dịch đối chiếu Kaempferol 79
Hình 3.11. SKĐ và phổ UV cùa dung dịch đối chiếu Nuciferin 80
Hình 3.12. Dữ liệu độ tinh khiết pic Conessin 81
Hình 3.13. Dữ liệu độ tinh khiết pic Kaempferol 82
Hình 3.14. Dữ liệu độ tinh khiết pic Nuciferin 82
Hình 3.15. SKĐ xác định tạp chất của mẫu Conessin 92
Hình 3.16. SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Conessin 92
Hình 3.17. SKĐ xác định tạp chất của mẫu Kaempferol 93
Hình 3.18. SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Kaempferol 93
Hình 3.19. SKĐ xác định tạp chất của mẫu Nuciferin 94
Hình 3.20. SKĐ mẫu trắng trong xác định tạp chất của mẫu Nuciferin 94
Hình 3.21. Ảnh chất chuẩn đối chiếu Conessin 99
Hình 3.22. Ảnh chất chuẩn đối chiếu Kaempferol 99
Hình 3.23. Ảnh chất chuẩn đối chiếu Nuciferin 99
Hình 3.24. SKĐ dung dịch chuẩn Kaempferol 0,025 mg/ml 110
Hình 3.25. SKĐ dịch chiết đơn lá đỏ 110
Hình 3.26. Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng
Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ 112
Hình 3.27. SKĐ tại giới hạn định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ 113
Hình 3.28. SKĐ định lượng Kaempferol trong dược liệu Đơn lá đỏ. 113
Hình 3.29. SKĐ định lượng Kaempferol trong dược liệu Chè vằng 115
Hình 3.30. SKĐ khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp định lượng Conessin
trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 118
Hình 3.31. Phổ UV và độ tinh khiết pic hoạt chất trong dung dịch mẫu thử viên
nén bao phim Mộc hoa trắng HT 119
Hình 3.32. SKĐ định lượng Conessin trong viên nén bao phim
Mộc hoa trắng HT 120
Hình 3.33. Khảo sát tính tuyến tính của phương pháp định lượng Conessin trong
viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT 121
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong vòng hai thập kỉ gần đây, xu hướng quay lại sử dụng các sản phẩm
thuốc có nguồn gốc thảo dược để phòng và trị bệnh trở nên phổ biến. Dược điển
các nước khu vực châu Á như Việt Nam, Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản đều có
các chuyên luận về dược liệu. Một số chuyên luận dược liệu cũng đã được đưa vào
Dược điển Mĩ, châu Âu... Theo ước tính, 70% dân số toàn cầu vẫn sử dụng thuốc từ
dược liệu trong chăm sóc sức khỏe ban đầu tại cộng đồng. Vì vậy, tổ chức y tế thế
giới đã nhấn mạnh việc đảm bảo chất lượng của các thuốc này phải dựa trên các kĩ
thuật phân tích hiện đại, với việc sử dụng các chất chuẩn đối chiếu phù hợp.
Dược điển Việt Nam lần 3 (năm 2002) có 312 chuyên luận dược liệu và
thuốc từ dược liệu. Trong số 275 chuyên luận dược liệu có 48 chuyên luận sử dụng
chất chuẩn đối chiếu chiết ra từ dược liệu. Dược điển Việt Nam lần 4 (năm 2009)
có 314 chuyên luận dược liệu và thuốc từ dược liệu. Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở của
nhiều thành phẩm được xây dựng dựa trên việc định lượng hỗn hợp toàn phần bằng
các phương pháp không đặc hiệu mà không định lượng được các hợp chất chính,
đặc trưng, được coi là các hợp chất có hoạt tính sinh học do thiếu chất chuẩn đối
chiếu. Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu ngày càng trở nên cần
thiết đối với công tác đảm bảo chất lượng thuốc, từ giai đoạn lựa chọn nguyên liệu
đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở, cũng như giám sát chất lượng thuốc
lưu hành của cơ quan quản lí. Xuất phát từ thực tế này, luận án “Nghiên cứu chiết
xuất và tinh chế Conessin, Kaempferol, Nuciferin từ dược liệu làm chất chuẩn
đối chiếu trong kiểm nghiệm thuốc” được thực hiện với ba mục tiêu sau:
1. Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế 03 hợp chất tự nhiên
đặc trưng từ dược liệu là Conessin, Kaempferol và Nuciferin đạt độ tinh khiết trên
95% để sử dụng làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu.
2. Thiết lập 03 chất chuẩn đối chiếu có nguồn gốc dược liệu trên.
3. Ứng dụng các chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để đánh giá chất lượng
một số dược liệu và chế phẩm đông dược.
1
Để đạt được 3 mục tiêu trên, luận án đã tiến hành 5 nội dung chính sau đây:
1. Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế Conessin từ vỏ thân cây
Mức hoa trắng, Nuciferin từ lá cây Sen, Kaempferol từ lá cây Đơn lá đỏ đạt độ tinh
khiết trên 95%, với khối lượng mỗi hợp chất tinh khiết là 02 gam.
2. Xây dựng bộ dữ liệu nhận dạng chất.
3. Xây dựng các chỉ tiêu chất lượng của chất chuẩn đối chiếu và phương
pháp phân tích để đánh giá chất lượng của chất chuẩn đối chiếu.
4. Nghiên cứu độ ổn định của 03 chất chuẩn đối chiếu trong điều kiện bảo
quản 2 – 80C.
5. Ứng dụng chất chuẩn đối chiếu thiết lập được để xây dựng và thẩm định
phương pháp định lượng Kaempferol trong dược liệu lá cây Đơn lá đỏ, lá cây Chè
vằng, Conessin trong viên nén bao phim Mộc hoa trắng HT.
2
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. XU THẾ PHÁT TRIỂN THUỐC CÓ NGUỒN GỐC THIÊN NHIÊN
Trên thế giới, đã phát hiện được 265.000 loài thực vật. Trong đó có
150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước
ASEAN. Trong số này có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc. Các loài thực vật
có chứa khoảng 5 triệu hợp chất hóa học. Cho tới nay, đã có 0,5%, nghĩa là 1.300
cây được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và giá trị chữa
bệnh [45]. Thuốc từ dược liệu được sử dụng không chỉ các nước Á Đông mà còn
được tiêu thụ một lượng khá lớn ở các nước Phương Tây. Ở các nước có nền công
nghiệp phát triển thì một phần tư số thuốc kê trong các đơn có chứa hoạt chất từ
dược liệu. Tại Mĩ năm 1980 giá trị số thuốc đó lên tới 8 tỉ đô la, tại thị trường Châu
Âu lượng thuốc đông dược tiêu thụ cũng lên tới 2,3 tỉ đô la. Nhiều biệt dược đông
dược của Trung Quốc được tiêu thụ mạnh ở các nước phát triển. Việt Nam cũng có
một số mặt hàng đông dược xuất khẩu có uy tín ở thị trường nước ngoài như hoa
hòe, quế, sa nhân, dừa cạn, các loại tinh dầu hồi, quế, tràm… [46].
Về sử dụng thuốc, ở khu vực Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với Ấn
Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất. Tại Trung Quốc, đông dược chiếm
khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung
Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm 2003 ước đạt 20 tỉ đô la. Tại Nhật Bản,
đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và sử dụng rộng rãi,
với doanh số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm. Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là
nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc, có tới
90% số lượng cây thuốc trên thế giới được tìm thấy ở đây. Theo số liệu năm 1995,
có 40% dân số Indonesia sử dụng đông dược, trong đó có 70% sinh sống ở vùng
nông thôn. Các nước Đông Nam Á khác đều có tỉ lệ sử dụng đông dược đáng kể
trong cộng đồng và hệ thống y tế [132]. Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng đông dược
cũng rất lớn. Theo đánh giá của Viện Dược liệu năm 1995, nhu cầu dược liệu toàn
3
quốc khoảng 30 000 tấn, cung cấp cho 145 bệnh viện y học cổ truyền, 242 khoa y
học cổ truyền trong bệnh viên đa khoa và khoảng 30 000 lương y đang hành nghề,
ngoài ra còn cần khoảng 20 000 tấn cho nhu cầu xuất khẩu [16], [17], [20], [28].
Nhiều chế phẩm đông dược đã được nghiên cứu tại các viện nghiên cứu và chuyển
giao kĩ thuật cho các xí nghiệp sản xuất trong nước, như thuốc viêm gan Haina,
thuốc hạ cholesterol máu và hạ huyết áp Ruventat, thuốc chống đái tháo đường
Morantin, thuốc nhỏ mũi Ngũ sắc, thuốc hòa tan sỏi thận Somatan, Sotinin, thuốc
tăng tuần hoàn máu Angelin, thuốc viêm gan Phyllantin [19], [27].
Về nghiên cứu phát triển, hiện nay các công ty đa quốc gia đang có xu
hướng phát triển các dược phẩm có chứa một hoạt chất từ cây thuốc (tinh chất dược
liệu) do các chế phẩm này có giá trị kinh tế lớn hơn nhiều so với các sản phẩm chứa
cao thuốc (extracts) hoặc hợp chất toàn phần chưa xác định được trong các công
thức cổ truyền, kinh điển [45]. Ở Trung Quốc giai đoạn 1979 - 1990 có 42 chế
phẩm thuốc mới từ cây thuốc được đưa ra thị trường, trong đó có 11 chế phẩm chữa
bệnh tim mạch, 5 chế phẩm chữa ung thư, 6 chế phẩm chữa tiêu hóa [122]. Cho đến
nay đã có trên 4.000 bằng sáng chế về thuốc đông dược của Trung Quốc được đăng
kí, với 40 dạng bào chế khác nhau, được sản xuất ở 684 nhà máy chuyên về đông
dược [132]. Từ năm 1990 đến nay là giai đoạn phát triển rất mạnh đối với lĩnh vực
sản xuất thuốc từ dược liệu với hàng trăm chế phẩm mới ra đời. Nhật Bản là nước
dẫn đầu thế giới về nghiên cứu các hợp chất có tác dụng sinh học từ cây thuốc,
chiếm 60% bằng phát minh trên thế giới về lĩnh vực này trong 5 năm (1990 -
1995). Trong giai đoạn 2000 – 2005 các công ty dược phẩm đa quốc gia đã có 23
thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên được phép đưa ra thị trường để điều trị bệnh ung
thư, bệnh thần kinh, bệnh nhiễm trùng, bệnh tim mạch, các bệnh liên quan đến hệ
miễn dịch, chống viêm… Điển hình là các thuốc Bivalirudin (MDCO, 2000),
Ozogamicin (Wyeth – Ayerst, 2000), Pimecrolimus (Novatis, 2001), Nitisinone
(Swedish Orphan, 2002), Ziconotide (Elan, 2004), Exenatide (Eli Lilly, 2005),
Micafungin (Fujisawa, 2005)… [18], [45]. Ở Việt Nam, một số thuốc đang được
nghiên cứu lâm sàng giai đoạn I, II, III như thuốc viêm lợi Dentonin, thuốc trị lỵ và
4
thương hàn Geranin, thuốc hỗ trợ và điều trị ung thư Panacrin, thuốc điều hòa
miễn dịch Angala…[19].
Về pháp chế dược và đăng kí thuốc, theo báo cáo của WHO năm 2011 [25],
[26], [149], tốc độ xây dựng và ban hành qui chế quản lí thuốc từ dược liệu phát
triển khá nhanh trong khoảng thời gian từ năm 1986 đến 2007 ( Hình 1.1).
Hình 1.1. Số nước thành viên của WHO đã có qui chế quản lí thuốc từ dược liệu*
*
(Nguồn: The World Medicines Situation 2011: Traditional Medicines: Global Situation, Issues and Chalenges [149] )
Ở Việt Nam, riêng trong năm 2010, Cục quản lí Dược, Bộ Y tế đã cấp phép
nhập khẩu cho 106 chế phẩm từ dược liệu thuộc 15 quốc gia và vùng lãnh thổ trên
thế giới [11], [12], [13], [14], số lượng cụ thể như sau: Hàn Quốc: 44, Ấn Độ: 20,
Trung Quốc: 15, Hồng Kông: 1, Đài Loan: 1, Nhật Bản: 1, Thái Lan: 3, Malaysia:
2, Pakistan: 1, Argentina: 2, Thụy Sĩ: 1, Australia: 1, Đức: 2, Pháp: 1, Mĩ: 7.
Sự phát triển nhanh chóng các thuốc từ cây cỏ là do xu hướng của các nước
phương Tây nhằm tăng cường tự điều trị, và do lo lắng về tác dụng bất lợi của chế
phẩm hóa dược và sự nâng cao nhận thức của cộng đồng về vai trò của thuốc từ
dược liệu trong điều trị các bệnh mạn tính, bệnh thông thường [45].
Với sự phát triển của các kĩ thuật phân tích hiện đại, nhiều hoạt chất được
tách chiết từ dược liệu, nghiên cứu xác định cấu trúc và tác dụng dược lí. Kết hợp
với công nghệ bào chế, các nhà sản xuất đã cho ra đời những dạng thuốc thuận tiện
cho người sử dụng như viên nén, viên nang, cốm thuốc, trong đó nguyên liệu đầu
vào là tinh chất hoặc cao dược liệu chuẩn hóa có hàm lượng hoạt chất chính xác.
5