Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng sinh học của cây cam thảo đá bia jasminanthes tuyetanhiae t.b.tran & rodda, apocynaceae

  • 181 trang
  • file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
THÁI HỒNG ĐĂNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY
CAM THẢO ĐÁ BIA
JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA,
APOCYNACEAE
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2020
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA DƯỢC
THÁI HỒNG ĐĂNG
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY
CAM THẢO ĐÁ BIA
JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA,
APOCYNACEAE
Chuyên ngành: Dược học cổ truyền
Mã số: 60720406
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Thị Vân Anh
Thành phố Hồ Chí Minh – 2020
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Thái Hồng Đăng
.
.
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ dược học – Năm học 2018-2020
KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ TÁC
DỤNG SINH HỌC VÀ CỦA CÂY CAM THẢO ĐÁ BIA
(Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae)
Thái Hồng Đăng
Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Thị Vân Anh
Đặt vấn đề: Cam thảo đá bia (CTĐB) Jasminanthes tuyetanhiae Apocynaceae là loài
dược liệu đặc hữu của vùng núi Đá Bia - Phú Yên, phần thân rễ có vị ngọt được dân
gian sử dụng để chữa ho và thay thế Cam thảo bắc trong các bài thuốc. Do tác dụng
độc đáo, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến chỉ còn vài cá thể ít ỏi và được xếp vào
sách đỏ Việt Nam năm 2007. Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển một dược liệu quý,
chúng tôi thực hiện đề tài khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng
sinh học của cây CTĐB, mở đầu cho nghiên cứu phát triển ứng dụng chữa bệnh trong
tương lai.
Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm vi học các bộ phận rễ, thân, lá CTĐB,
phân tích mã vạch ADN vùng gen ITS và rbcL, so sánh với dữ liệu các loài trên
Genbank. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học 3 bộ phận theo phương pháp Ciuley
cải tiến, so sánh thành phần hóa học bằng sắc kí lớp mỏng. Đánh giá tiềm năng hoạt
tính sinh học các bộ phận bằng thử nghiệm chống oxy hóa làm giảm màu DPPH, độc
tính trên tế bào ung thư MDA-MB-231 và RD, ức chế sản sinh NO từ tế bào bạch cầu
RAW 264.7, kháng khuẩn và kháng nấm với một số chủng vi sinh vật gây bệnh. Từ
kết quả thử nghiệm in vitro lựa chọn bộ phận có hoạt tính tiến hành nghiên cứu thành
phần hóa học, sử dụng phương pháp chiết ngấm kiệt, chiết phân bố lỏng - lỏng,
phương pháp sắc kí cột để phân lập chất tinh khiết. Cấu trúc chất phân lập được xác
định bằng phổ MS và NMR.
Kết quả: Thân cây CTĐB có cấu tạo vi phẫu đặc trưng của các cây họ Apocynaceae
như ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy và cụm tế bào sợi vách cellulose; trong khi ở
lá và cuống lá có ống nhựa mủ, libe quanh tủy. Kết quả phân tích ADN bằng công cụ
BLAST và xây dựng cây phát sinh loài đã khẳng định sự khác biệt về gen ITS và
.
.
rbcL của CTĐB so với các loài khác trong phân họ. Thành phần hóa học toàn cây
CTĐB cùng chứa các nhóm hợp chất giống nhau gồm: Triterpenoid tự do, alkaloid,
coumarin, đường 2-desoxy, saponin và hợp chất polyuronic. Ngoài các nhóm hợp
chất chung, trong mẫu lá còn có thêm tinh dầu. Bằng sắc kí lớp mỏng cho thấy lá
CTĐB có thành phần khác biệt so với thân và rễ, trong khi ở thân và rễ các vết chính
hoàn toàn tương đồng nhau ngoại trừ ở cao nước.
Kết quả thử nghiệm in vitro: rễ và lá cho kết quả chống oxy hóa tốt hơn so với thân,
thấp nhất ở lá là cao MeOH với IC50 3,74 ± 0,085 µg/ml, ở rễ là cao DCM với IC50
4,61 ± 0,13 µg/ml. Cao chiết DCM lá CTĐB là cao chiết tiềm năng có tác dụng trên
các dòng tế bào ung thư MDA-MB-231 và RD với IC50 lần lượt là 95,31 ± 0.58 µg/ml
và 38,40 ± 0.92 µg/ml. Lá và rễ CTĐB có hoạt tính kháng viêm tốt hơn bộ phận thân,
tập trung ở các phân đoạn kém phân cực đến phân cực trung bình, cao chiết DCM từ
lá có giá trị IC50 tốt nhất 8,71 ± 0,37 μg/ml. Cả 3 bộ phận không thể hiện hoạt tính
kháng khuẩn và kháng nấm.
Từ 1,8 kg nguyên liệu rễ chiết ngấm kiệt với cồn 70%, chiết phân bố lỏng - lỏng và
chọn phân đoạn ether phân tách chất bằng phương pháp sắc kí cột thu được 4 chất
glycosid tinh khiết gồm Telosmoside A11, Telosmoside A22, Telosmoside A23 và
Tuyetanhoside 1.
Kết luận: Đề tài đã xây dựng đặc điểm vi học và mã vạch ADN phục vụ định danh
cây Cam thảo Đá Bia. Hoạt tính kháng viêm vẫn là hoạt tính chủ đạo của CTĐB đặc
biệt đối với bộ phận dùng là rễ. Thành phần chính trong rễ là các steroid glycosid với
phần đường 2,6-deoxy. Đề tài đã phân lập và xác định 3 chất mới từ CTĐB
(Telosmoside A22, Telosmoside A23 và Tuyetanhoside 1)
.
.
Final essay for the degree of MS Pharm. Academic year 2018-2020
INVESTIGATION OF THE CHEMICAL CONSTITUENTS AND
BIOLOGICAL ACTIVITIES OF CAM THAO DA BIA
(Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda, Apocynaceae)
Thai Hong Dang
Supervisor: Dr. Tran Thi Van Anh
Introduction: Cam Thao Da Bia (CTDB) Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran &
Rodda, Apocynaceae is an endemic plant of the Da Bia mountainous region in Phu
Yen province. The stems and roots of this plant with sweet taste are used as a
substitution for licorice in traditional medicine. With the aim of reserving and
developing this precious plant, the plant anatomy characteristics and evaluation of
some biological effects have been conducted to establish a foundation for further
studies of therapeutic applications in the future.
Research Methodology: For identification, the microbiological characteristics of the
roots, stems, leaves were described; DNA of ITS and rbcL genome regions were
analyzed and compared with species data on Genbank. Chemical constituents of three
parts of CTDB were preliminarily analyzed by Ciuley method and thin layer
chromatography. The biological activities were evaluated by DPPH antioxidant test,
cytotoxicity test on MDA-MB-231 and RD cancer cell, anti-inflammatory test on
inhibiting production of NO from white blood cells RAW 264.7, antibacterial and
antifungal test with some pathogenic microorganisms. The part of CTDB which
showed good activities was chosen for investigation of the chemical constituents,
using percolation method, liquid-liquid distribution extraction, column
chromatography. Structure of isolated compounds were elucidated by analyzing MS
and NMR spectroscopy.
Results: The stems of CTDB have the plant anatomy characteristics of Apocynaceae
family such as non-articulated laticifer, internal phloem and bunch of cellulose wall
sclerenchyma fibres; while in the leaves and petiole there is a non-articulated laticifer,
the phloem around the pith. Results of DNA analysis using BLAST tool and
phylogenetic tree construction have confirmed the distinction of ITS gene and rbcL
.
.
of CTDB compared with other species in subfamily. Chemical constituents in
different parts of CTDB were similar in general (free triterpenoids, alkaloids,
coumarins, 2-desoxy sugars, saponins and polyuronic compounds); except the leaf
had essential oils. The thin layer chromatography analyses showed that the leaves of
CTDB have different constituents compared with stems and roots. The result of in
vitro test indicated that roots and leaves showed better antioxidant activity than stems,
with IC50 3.74 ± 0.085 µg/ml of MeOH extract from leaf and IC50 4.61. ± 0.13 µg/ml
of DCM extract from the root. The CTDB leaf extract showed the potential effects
on MDA-MB-231 and RD cancer cell with IC50 at 95.31 ± 0.58 µg/ml and 38.40 ±
0.92 µg/ml, respectively. The leaves and roots had better anti-inflammatory activity
than the stem. The best IC50 value, 8.71 ± 0.37 μg/ml was found for the DCM extract
from leaves. The extract from three plant parts did not show antibacterial and
antifungal function.
1.8 kg of root was percolated with 70% ethanol and the separated by liquid - liquid
distribution. Ether fraction was chosen for investigation chemical constituents. By
different means of column chromatography, 4 glycosides including Telosmoside
A11, Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside 1 were obtained.
Conclusions: The thesis has established micro-characteristics and DNA barcodes for
the identification of CTDB. Anti-inflammatory activity is still the main bio-activity
for the roots, the used part in folk medicine. The main components in the roots were
steroidal glycosides with a 2,6-deoxy sugar moieties. 3 new compounds from CTDB
were identified (Telosmoside A22, Telosmoside A23 and Tuyetanhoside 1).
.
.
MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... 1
DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................................ 3
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... 1
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... 1
DANH MỤC SƠ ĐỒ .................................................................................................. 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 2
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC................................................................ 2
1.1.1. Giới thiệu chi Jasminanthes ............................................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái Jasminanthes tuyetanhiae ................................................. 3
1.2. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC LOÀI
THUỘC CHI JASMINANTHES .................................................................................. 6
1.2.1. Thành phần hóa học của Jasminanthes (Stephanotis) mucronata ................... 6
1.2.2. Thành phần hóa học của Jasminanthes tuyetanhiae ...................................... 14
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES ........... 17
1.3.1. Tác dụng dược lý của Jasminanthes mucronata ............................................ 17
1.3.2. Tác dụng dược lý của Jasminanthes tuyetanhiae........................................... 22
1.4. CÔNG DỤNG DÂN GIAN CÁC LOÀI THUỘC CHI JASMINANTHES .... 22
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO ................. 22
1.5.1. Tác dụng chống oxy hóa ................................................................................ 22
1.5.2. Tác dụng độc tính tế bào ung thư ................................................................... 25
1.5.3. Tác dụng kháng khuẩn ................................................................................... 25
1.5.4. Tác dụng kháng viêm ..................................................................................... 28
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 30
2.1. ĐỐI TƯỢNG .................................................................................................... 30
1.1.1 Nguyên liệu .................................................................................................... 30
2.1.1. Dung môi và thuốc thử ................................................................................... 30
2.1.2. Dụng cụ và trang thiết bị ................................................................................ 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................... 32
2.2.1. Khảo sát thực vật ............................................................................................ 32
.
.
2.2.2. Phân tích mã vạch ADN ................................................................................. 32
2.2.3. Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học ........................................................... 33
2.2.4. Đánh giá tác dụng sinh học in vitro ............................................................... 34
2.2.5. Nghiên cứu hóa học........................................................................................ 38
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 40
3.1. KIỂM TRA NGUYÊN LIỆU ........................................................................... 40
3.1.1. Khảo sát thực vật cây CTĐB.......................................................................... 40
3.1.2. Phân tích mã vạch ADN định danh ................................................................ 45
3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết .................................................................................... 48
3.1.4. Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật trong Cam thảo Đá Bia .................. 48
3.1.5. So sánh thành phần hóa học các bộ phận bằng sắc kí lớp mỏng ................... 49
3.2. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC IN VITRO ........................... 52
3.2.1. Chiết xuất cao thử nghiệm hoạt tính sinh học ................................................ 52
3.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa ................................................................................ 52
3.2.3. Độc tính tế bào ............................................................................................... 54
3.2.4. Hoạt tính kháng viêm ..................................................................................... 55
3.2.5. Hoạt tính kháng khuẩn ................................................................................... 57
3.2.6. Tổng kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro ................................................. 58
3.3. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAM THẢO ĐÁ BIA ..... 59
3.3.1. Chiết xuất ....................................................................................................... 59
3.3.2. Phân tách cao chiết toàn phần ........................................................................ 60
Phân tách cao ether (JasA) ....................................................................................... 62
3.3.3. Xác định cấu trúc hóa học các chất phân lập ................................................. 73
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................... 88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 92
KẾT LUẬN.............................................................................................................. 92
Kiểm tra nguyên liệu ............................................................................................... 92
Khảo sát một số tác dụng sinh học in vitro .............................................................. 92
Nghiên cứu thành phần hóa học của CTĐB ............................................................ 93
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 95
.
.
DANH MỤC VIẾT TẮT
Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải
Con A Concanavalin A
CsA Cyclosporin A
CTĐB Cam thảo Đá Bia
DMSO Dimethyl sulfoxide
DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
DTH Delayed-type hypersensitivity
EtOAc Ethyl acetat
GSH Glutathion
GSH Px Glutathion peroxydase
IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối
tượng thử nghiệm
ICR Institute of Cancer Research
IFN-γ Interferon-γ
IL-10 Interleukin-10
IL-2 Interleukin-2
IL-4 Interleukin-4
LPS Lipopolysaccharide
M Mucronatoside Mucronatosid
MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu
MTT 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-
diphenyltetrazol bromide
NBT Nitroblue tetrazolim
NFAT Nuclear factor of activated T-cells
NFκB Nuclear factor-kappa B
NO Nitric oxide
.
.
Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải
NSAIDs Non-steroid anti-inflammatory drugs Kháng viêm không steroid
OD Optical density Mật độ quang học
OVA Ovalbumin
PBS Phosphate-buffered saline
PE Petroleum ether Ether dầu hỏa
PKCθ Protein kinase C-theta
PNP p-nitrophenol
S Sitakisoside Sitakisosid
SKLM Sắc kí lớp mỏng
SM Stemucronatoside Stemucronatosid
SN Sinomarinoside Sinomarinosid
SOD Superoxyd dismutase
SRB Sulforhodamine B
ST Stephanoside Stephanosid
TCA Trichloroacetic acid
Th1 T helper lymphocyte type 1
Th2 T helper lymphocyte type 2
TNF-α Tumor necrosis factor-α
TT Thuốc thử
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1-1: Vùng sinh thái núi Đá Bia và hình thái của Jasminanthes tuyetanhiae
[37] ..............................................................................................................................4
Hình 1-2: Các bộ phận của hoa Jasminanthes tuyetanhiae [37] ................................5
Hình 1-3: Jasminanthes tuyetanhiae (hình vẽ bởi Lê Kim Chi) [37] ........................5
Hình 1-4: Cấu trúc các hợp chất Mucronatosid .........................................................7
Hình 1-5: Cấu trúc các hợp chất Stemucronatosid và Sinomarinosid .......................9
Hình 1-6: Cấu trúc các hợp chất Stephanosid ..........................................................10
Hình 1-7: Cấu trúc các hợp chất C21 steroid aglycon .............................................11
Hình 1-8: Cấu trúc các hợp chất pregnan glycosid ..................................................12
Hình 1-9: Cấu trúc các hợp chất oleanan saponin ....................................................14
Hình 1-10: Cấu trúc các hợp chất Telosmosid .........................................................16
Hình 3-1: Đặc điểm hình thái mẫu dược liệu CTĐB ...............................................40
Hình 3-2 :Vi phẫu và sơ đồ thân (T) và rễ (R) CTĐB .............................................42
Hình 3-3 :Vi phẫu và sơ đồ lá (L), cuống lá (CL) và phiến lá (PL) .........................44
Hình 3-4: Cấu tử bột rễ (F1-6), thân (G1-6) và lá (H1-5) ........................................45
Hình 3-5: ADN tổng số trên agarose 0,8% ..............................................................46
Hình 3-6: Kết quả PCR mồi ITS1-ITS4 (trái) và mồi rbcL_F-rbcL_R (phải) .........46
Hình 3-7: Cây phát sinh loài của gen ITS (trái) và rbcL (phải) ...............................47
Hình 3-8: Sắc kí đồ phân tích cao DCM rễ, thân, lá ................................................50
Hình 3-9: Sắc kí đồ phân tích cao MeOH rễ, thân, lá so sánh với mẫu đối chiếu
(ĐC) ...........................................................................................................................51
Hình 3-10: Sắc kí đồ phân tích cao nước rễ, thân, lá ...............................................51
Hình 3-11: Biểu đồ kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa (IC50 µg/mL) .....53
Hình 3-12: Giá trị IC50 hoạt tính ức chế sản sinh NO của các mẫu có hoạt tính .....57
Hình 3-13: So sánh các phân đoạn từ cao cồn 70% toàn phần ................................62
Hình 3-14 Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột nhanh JasA ......................................63
Hình 3-15: Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột silicagel JA.6 ..................................64
Hình 3-16 Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí rây phân tử JA.6.3 .................................65
Hình 3-17 Sắc kí pha đảo kiểm tra tinh khiết JA.6.3.2 ............................................66
Hình 3-18: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS1.....................................67
Hình 3-19 Sắc kí đồ các phân đoạn JA.7 .................................................................68
Hình 3-20: Sắc kí đồ các phân đoạn sắc kí cột silicagel JA.7.1 ...............................69
Hình 3-21: Sắc kí pha đảo kiểm tra tinh khiết JA.7.1.3 và 7.1.5 .............................69
Hình 3-22: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS2 và JAS3 ......................70
Hình 3-23: Sắc kí đồ kiểm tra độ tinh khiết của chất JAS4 .....................................71
Hình 3-24: Sắc kí đồ các chất phân lập từ cao ether ................................................72
Hình 3-25: Phổ MS của chất JAS1 ..........................................................................73
Hình 3-26: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS1 .....................77
.
.
Hình 3-27: Phổ MS của chất JAS2 ..........................................................................77
Hình 3-28: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS2 .....................81
Hình 3-29: Phổ MS của chất JAS3 ..........................................................................81
Hình 3-30: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất của JAS3 ..............84
Hình 3-31: Phổ MS chất JAS4 .................................................................................84
Hình 3-32: Cấu trúc và các tương tác HMBC, COSY của chất JAS4 .....................87
.
.
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1-1: Danh sách các loài thuộc chi Jasminanthes [27], [30], [51] .....................3
Bảng 1-2: Các hợp chất Mucronatosid .......................................................................6
Bảng 1-3: Các hợp chất Stemucronatosid ..................................................................8
Bảng 1-4: Các hợp chất Stephanosid ........................................................................10
Bảng 1-5: Các hợp chất C21 steroid aglycon ...........................................................11
Bảng 1-6: Các hợp chất Sinomarinosid ....................................................................12
Bảng 1-7: Các hợp chất pregnan glycosid ................................................................12
Bảng 1-8: Các hợp chất oleanan saponin .................................................................13
Bảng 1-9: Tổng hợp hoạt tính sinh học các hợp chất trong Jasminanthes mucronata
...................................................................................................................................21
Bảng 2-1: Kí hiệu mẫu cao thử nghiệm sinh học .....................................................34
Bảng 2-2: Hỗn hợp phản ứng ...................................................................................35
Bảng 2-3: Các nhóm vi sinh vật trong đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ..................37
Bảng 3-1: Thành phần bốn loại nucleotide của mẫu CTĐB ....................................46
Bảng 3-2: Kết quả BLAST đoạn gen ITS và rbcL của CTĐB .................................47
Bảng 3-3: Kết quả thử tinh khiết mẫu Cam thảo Đá Bia ..........................................48
Bảng 3-4: Kết quả định tính trên các dịch chiết Cam thảo Đá Bia ..........................49
Bảng 3-5: Khối lượng và hiệu suất chiết các cao thử nghiệm sinh học ...................52
Bảng 3-6: Kết quả sàng lọc sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào ung thư ........................54
Bảng 3-7: Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao LD ..............55
Bảng 3-8: Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW 264.7 .56
Bảng 3-9 :Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .................................................58
Bảng 3-10: Tổng kết đánh giá tác dụng sinh học in vitro.........................................59
Bảng 3-11 Các phân đoạn thu được từ JasA ............................................................63
Bảng 3-12: Các phân đoạn thu được từ JA.6 ............................................................64
Bảng 3-13: Các phân đoạn thu được từ JA.6.3 ........................................................65
Bảng 3-14 Các phân đoạn thu được từ JA.7 .............................................................68
Bảng 3-15: Các phân đoạn thu được từ JA.7.1 ........................................................68
Bảng 3-16 : Các giá trị phổ NMR của JAS1 ............................................................75
Bảng 3-17: Dữ liệu phổ NMR của chất JAS2 ..........................................................79
Bảng 3-18: Dữ liệu phổ NMR chất JAS3 ................................................................82
Bảng 3-19: Dữ liệu phổ NMR chất JAS4 ................................................................86
.
.
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3-1: Quy trình chiết xuất, phân tách các cao từ cao cồn 70% của rễ CTĐB ..61
Sơ đồ 3-2: Tóm tắt quy trình phân lập các chất từ cao JasA ....................................72
.
.
MỞ ĐẦU
Hơn 30 năm trước đây, đoàn điều tra dược liệu của Tỉnh Phú Khánh (Ds Phan Phúc
Thích, KS Nguyễn Văn Tập và một số lương y của Phú Yên) khi điều tra vùng núi
Đá Bia, Đông Hòa, Phú Yên đã phát hiện một loài cây có vị ngọt như dược liệu cam
thảo bắc nên đặt tên là Cam thảo Đá Bia (CTĐB). Do tác dụng độc đáo nên khi được
công bố, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến chỉ còn vài cá thể ít ỏi và được xếp vào
sách đỏ Việt Nam năm 2007 với tên Cam thảo Đá Bia Telosma procumbens (Blanco)
Merr. Asclepiadaceae (EN B1+2B) [2].
Tháng 8 năm 2017, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm bảo tồn cây thuốc miền Trung
cùng với các chuyên gia và TS Trần Thế Bách thu được mẫu ra hoa của cây CTĐB,
CTĐB được định danh lại và mang danh pháp khoa học mới là Jasminanthes
tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda Apocynaceae, Asclepiadoideae [37].
Công dụng của CTĐB xuất phát từ kinh nghiệm của các lương y địa phương sử dụng
phần thân rễ để chữa ho và thay thế cam thảo bắc trong các bài thuốc. Hiện nay, có
rất ít các nghiên cứu khoa học trên thế giới và tại Việt Nam thực hiện trên mẫu CTĐB
(Jasminanthes tuyetanhiae). Nhằm mục đích bảo tồn, phát triển một dược liệu quý,
chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học và đánh giá một số tác dụng
sinh học của cây Cam thảo Đá Bia (Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda
Apocynaceae)”.
Mục tiêu đề tài
- Xây dựng đặc điểm định danh CTĐB bằng phương pháp vi học và phân tích ADN
(vùng ITS và rbcL). Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các bộ phận của cây CTĐB.
- Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro các cao chiết: tác dụng chống oxy hóa, độc tính
tế bào, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính kháng viêm.
- Nghiên cứu thành phần hóa học cao chiết tiềm năng có tác dụng tốt trên các mô hình
in vitro, phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất chính.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ THỰC VẬT HỌC
1.1.1. Giới thiệu chi Jasminanthes
Theo hệ thống phân loại của A.Takhtajan (2009) [61], vị trí của chi Jasminanthes
trong hệ thống phân loại của thực vật có hoa như sau:
Giới Thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)
Bộ Trúc đào (Apocynales)
Họ Trúc đào (Apocynaceae)
Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae)
Tông Marsdenieae
Chi Jasminanthes
Jasminanthes (Apocynaceae, Asclepiadoideae, Marsdenieae) [26] là một chi gồm
tám loài được tìm thấy ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Đông Nam Á và
Sundaland. Jasminanthes chunii và J. saxatilis là loài đặc hữu của Trung Quốc, J.
pilosa được tìm thấy ở Trung Quốc và Thái Lan, J. mucronata có khu vực phân bố
rộng từ miền nam Trung Quốc đến Nhật Bản [30], [42]. Loài J. suaveolens được tìm
thấy tại Java và Borneo [62]. J. xuanlienensis được công bố gần đây là loài đặc hữu
của Việt Nam [62]. Năm 2019, thêm một loài mới được tìm thấy ở Lào là J. laotica
[23].
Năm 1995, các loài thuộc chi Jasminanthes được tách riêng từ chi Stephanotis, vốn
đặc hữu cho nhiều loài ở vùng Madagascar [30], [27]. Thông tin các loài trong chi
Jasminanthes được nêu trong Bảng 1.1 [51].
Ở Việt Nam không có loài Jasminanthes nào được ghi nhận cho đến năm 2016 khi J.
xuanlienensis được công bố. Nghiên cứu thực địa sâu hơn ở Việt Nam đã phát hiện
thêm nhiều loài thuộc họ Apocynaceae chưa định danh. Một mẫu thu thập từ khu bảo
.
.
tồn thiên nhiên Kon Chu Rang (Việt Nam, tỉnh Gia Lai) đã được xác định là J. pilosa.
Một mẫu khác từ núi Đá Bia (Việt Nam, tỉnh Phú Yên) được nhóm nghiên cứu xác
định là một loài mới và công bố với tên Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda
Apocynaceae, Asclepiadoideae [37].
Bảng 1-1: Danh sách các loài thuộc chi Jasminanthes [27], [30], [51]
STT Tên mới Đồng danh
1 Jasminanthes chunii (Tsiang) Marsdenia chunii (Tsiang) P.I.Forst.
W.D.Stevens & P.T.Li Stephanotis chunii Tsiang
2 Jasminanthes mucronata Apocynum mucronatum Blanco
(Blanco) W.D.Stevens & P.T.Li Marsdenia chinensis (Champ. ex Benth.)
P.I.Forst.
Stephanotis chinensis Champ. ex Benth.
Stephanotis lutchuensis Koidz.
Stephanotis mucronata (Blanco) Merr.
Toxocarpus mucronatus (Blanco) Woodson
3 Jasminanthes pilosa (Kerr) Huthamnus sinicus Tsiang
W.D.Stevens & P.T.Li Marsdenia pilosa (Kerr) P.I.Forst.
Stephanotis pilosa Kerr
4 Jasminanthes saxatilis Stephanotis saxatilis Y.Tsiang & P.T.Li
(Y.Tsiang & P.T.Li)
W.D.Stevens & P.T.Li
5 Jasminanthes suaveolens Blume Marsdenia jasminoides P.I.Forst.
Stephanotis suaveolens (Blume) K.Schum.
6 Jasminanthes tuyetanhiae Telosma procumbens (Blanco) Merr.
T.B.Tran & Rodda
7 Jasminanthes xuanlienensis
T.B.Tran & Rodda
8 Jasminanthes laotica Y.H. Tan
& H.B. Ding
1.1.2. Đặc điểm hình thái Jasminanthes tuyetanhiae
Dây leo, dài đến 10 m. Thân gồm nhiều lóng, mỗi lóng dài 3-6 cm, nhẵn, đường kính
3,1-5 mm. Lá đơn, cuống dài 8,3-11,2 mm, đường kính 2,1-3,2 mm, nhẵn hoặc rãi
rác lông mịn, có nhiều nốt sần xám nhạt; phiến lá hình trứng, dài 6,9-9 cm, rộng 3-
4,5 cm, mỏng, lồi, nhẵn; đầu thuôn nhọn 0,6-1 cm; gốc hình tim; gân bên 5-7 cặp;
gốc lá có 9 – 11 tuyến. Cụm hoa xim co, dạng tán, lên đến 10 hoa; cuống cụm hoa
0-2 cm, đường kính 2,4 mm, nhẵn. Lá bắc hẹp hoặc thon hẹp, kích thước 3-4,5 x
khoảng 1 mm, nhẵn. Cuống hoa 5,6-7 mm, đường kính 1,6-2,3 mm, nhẵn. Nụ hoa
.
.
ngay trước khi nở dài 9,7-12,6 mm, đường kính 3-4 mm. Lá đài 5, xếp chồng lên
nhau ở gốc, màu xanh lục hơi vàng, hình trứng hay tam giác 5,1-7,7 x 3,6-4,4 mm,
nhẵn, đầu nhọn; giữa các lá đài có các tuyến xen giữa, hình nón 0,15-0,19 x 0,12-0,15
mm. Cánh hoa 5, tràng hình đinh, đường kính 16-18 mm; các cánh hoa dính nhau
phía dưới tạo thành ống hình trụ, dài 5,6-7,4 mm, rộng 4-5 mm; bên ngoài và bên
trong màu trắng hơi xanh ở gốc, nhẵn, có 5 cặp đường dọc màu nâu dài 3,3-3,8 mm;
thùy hình trứng đầu hơi nhọn 8-10 x 4,7-5 mm, gốc bất đối xứng, bên trái thẳng, bên
phải có tai nhỏ, đỉnh bất đối xứng , màu trắng, nhẵn. Cuống nhị nhụy cao 4 mm, rộng
2,8 mm. Tràng phụ rất nhỏ, gắn với cuống nhị nhụy theo chiều dọc, cao 4,8 mm,
rộng 3 mm, màu xanh hơi vàng, nhẵn. Nhị gồm 5 thùy mập xen kẻ với cánh hoa và
đính vào gốc ống tràng, dài 3,5-4,5 mm, rộng 1,5 mm, rãnh dài 2,4-2,7 mm. Phấn
khối hình elip 0,08-0,1 x 0,19-0,25 mm, màu vàng; vĩ phấn hình tam giác 0,08-0,1 x
0,1-0,15 mm, trong suốt; chung đới hình bầu dục 0,37-0,41 x 0,19-0,21 mm, màu nâu
sẫm. Đầu nhị có phụ bộ hình elip 2 x 1 mm, màu trắng, dính nhau thành ống hình trụ
đầu tròn, cao 1,78-1,86, rộng 1,12-1,25 mm. Bộ nhụy bầu 2 ô, đính noãn trung trụ;
lá noãn hình trụ, dài 1,43-1,99 mm, rộng 1,44-1,63 mm, nhẵn. Quả và hạt không được
quan sát [37].
A-C: Môi trường sống
D: Cành mang hoa
E: Hoa đang nở
D và E: chụp từ mẫu gốc
trước khi ép tiêu bản
Hình 1-1: Vùng sinh thái núi Đá Bia và hình thái của Jasminanthes tuyetanhiae [37]
.
.
A: Nụ hoa. - B: Hoa bắt đầu nở.
C: Hoa. - D: Đài và bầu nhụy.
E: Tràng hoa mặt ngoài.
F: Tràng hoa mặt trong với 5 cặp
đường dọc màu nâu.
G: Đường dọc màu nâu bên trong
ống tràng.
H: Cuống nhị nhụy.
I: Bầu nhụy cắt dọc.
J: Bầu. - K: Phấn khối.
Hình 1-2: Các bộ phận của hoa Jasminanthes tuyetanhiae [37]
A: Cành hoa - B: Hoa. - C: Đài.
D: Tràng hoa mặt ngoài.
E. Tràng hoa mặt trong với 5 cặp
đường dọc màu nâu.
F: Cuống nhị nhụy.
G: Phấn khối.
H: Bầu và kiểu nhụy. - I: Bầu.
Hình 1-3: Jasminanthes tuyetanhiae (hình vẽ bởi Lê Kim Chi) [37]
.