Khảo sát mật độ vi khuẩn e. coli, coliforms và listeria trong thịt cá và trong môi trường nước ao nuôi ở an giang và hậu giang
- 32 trang
- file .pdf
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN
NGUYỄN ĐẠI QUỐC DƯƠNG
KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN E. coli,
Coliforms và Listeria TRONG THỊT CÁ
VÀ TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC AO
NUÔI Ở AN GIANG VÀ HẬU GIANG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
2013
i
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản,
Quý Thầy Cô Khoa Thủy Sản và Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và năng cao kiến thức trong thời gian
theo học tại khoa.
Đặc biệt tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết
Ngân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cung cấp nhiều kiến thức quý báu
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn đến chị Phan Thị Cẩm Tú, anh Trần Phước Vinh đã nhiệt
tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm.
Tập thể lớp Nuôi Trồng Thủy Sản khóa 36 đã hỗ trợ, giúp đỡ nhiều mặt trong
quá trình học tập và hoàn thiện luận văn.
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn
bè đã động viên, chia sẽ, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại trong
suốt quá trình học tập.
Ngày 01 tháng 12 năm 2013
Nguyễn Đại Quốc Dương
i
TÓM TẮT
Ngành thủy sản đang là một trong những ngành quan trọng trong phát triển
kinh tế của Việt Nam. Tuy nhiên, hàng năm có nhiều người mắc bệnh do trong
sản phẩm thủy nhiễm khuẩn làm người tiêu dùng đang dần mất lòng tin với
sản phẩm từ thủy sản. Mà chủ yếu là nhiễm vi khuẩn E. coli, Coliforms và
Listeria. Đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong
thịt cá và trong môi trường nước ao nuôi An Giang và Hậu Giang” nhằm khảo
sát mức độ nhiễm khuẩn của E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá
và môi trường nước nuôi ở ĐBSCL để kịp thời đưa ra các biện pháp phòng
tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm do thức ăn từ thủy
sản để lấy lại lòng tin của người tiêu dùng. Đề tài được tiến hành thu mẫu cá
tại các điểm: siêu thị Big C, các chợ ở Cần Thơ, ao nuôi ở An Giang và Hậu
Giang ở các loài cá rô, cá tra, cá lóc, cá điêu hồng, cá chép, cá rô phi, cá
hường mỗi loài được lặp lại 3 lần; thu mẫu nước 1 lần trong ao nuôi ở An
giang và Hậu Giang. Các mẫu được cấy vào đĩa petrifilm ở các mức nồng độ
pha loãng10-1, 10-2. Kết quả phân tích mẫu cho thấy sự biến động của mật độ
vi khuẩn E. coli, Coliforms và listeria nhiễm trong cá theo địa điểm thu, thành
phần loài khác nhau và môi trường nước nuôi. Mật độ 3 loại vi khuẩn ở loài cá
da trơn thấp hơn ở các loài cá có vẩy và mật độ của 3 loại vi khuẩn ở siêu thị
Big C thấp hơn mật độ vi khuẩn trong cá ở các chợ ở thành phố Cần Thơ.
ii
CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành trên các kết quả nghiên cứu của
tôi và các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng
cấp nào khác.
Ngày 01 tháng 12 năm 2013
Nguyễn Đại Quốc Dương
iii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1. Mật độ vi khuẩn E. coli (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu mẫu
khác nhau ...................................................................................................... 16
Bảng 4.2. Mật độ vi khuẩn Coliforms (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu
mẫu khác nhau .............................................................................................. 16
Bảng 4.3. Mật độ vi khuẩn Listeria (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu
mẫu khác nhau .............................................................................................. 17
Bảng 4.4. Mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria (CFU/ml) giữa môi
trường nước nuôi và trong cơ cá trong ao nuôi .............................................. 18
iv
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ i
TÓM TẮT..................................................................................................... ii
CAM KẾT KẾT QUẢ.................................................................................. iii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................. iv
MỤC LỤC .....................................................................................................v
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................... i
1.1 Giới thiệu:............................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài: .................................................................................... 1
1.3 Nội dung đề tài:.................................................................................... 1
1.4 Thời gian thực hiện đề tài:.................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Đặc điểm và khả năng gây bệnh của nhóm Coliforms và E. coli........... 3
2.2.1 Khái quát về đặc điểm của Coliforms ........................................ 3
2.1.2 Khả năng gây bệnh của nhóm vi sinh vật Coliforms .................. 4
2.1.3 Một số nghiên cứu, phân tích về Coliforms ............................... 7
2.2 Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes (Phạm Ngọc Hà, 2012) .... 8
2.2.1 Khái quát về vi khuẩn Listerria ................................................. 8
2.2.2 Phân bố và cách lây lan ............................................................. 8
2.2.3 Hình thái ................................................................................... 9
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy ...................................................................... 9
2.2.5 Đặc tính sinh hóa....................................................................... 9
2.2.6 Đặc tính gây bệnh ....................................................................10
2.2.7 Khả năng lây bệnh....................................................................10
2.2.8 Miễn dịch.................................................................................10
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................12
3.1 Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................12
3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................12
v
3.2.1 Dụng cụ thu, trữ và phân tích mẫu............................................12
3.2.2 Hóa chất...................................................................................13
3.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu ......................................................13
3.4 Phương pháp phân tích mẫu ................................................................13
3.5 Cách xác định và tính các thông số theo dõi ........................................14
3.6 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................14
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................15
4.1 Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria trong các loài cá ở
các điểm thu khác nhau: ............................................................................15
4.2 Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria giữa môi trường
nước ao nuôi và trong cơ cá nuôi trong ao:................................................17
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT .....................................................19
5.1 Kết luận...............................................................................................19
5.2 Đề suất ................................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................20
PHỤ LỤC A: BẢNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN................................................22
vi
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu:
Việt Nam nhận biết được xu hướng chung của người tiêu dùng trên thế giới là
ngày càng tiêu thụ nhiều các sản phẩm có nguồn gốc thủy sản. Vì vậy trong
những năm gần đây, Việt Nam đã và đang đẩy mạnh phong trào nuôi trồng
thủy sản nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng và thủy
sản đã trở thành một ngành quan trọng trong phát triển kinh tế đất nước.
Nhưng hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, trong đó
đặc biệt là thức ăn từ thủy sản, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khoẻ của
cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước
khác trên thế giới cũng vậy. Việc này làm cho người tiêu dùng đang dần mất
lòng tin với các sản phẩm từ thủy sản. Một trong những nguyên nhân gây ra
tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép của các vi sinh vật gây hại
trong thực phẩm như: Bacillus cereus, Coliforms, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Shigella spp, Staphylococcusaureus,… Phổ biến là các dòng
vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria (http://topmanjsc.com/tu-van/iso-
22000/mot-so-vi-khuan-chu-yeu-trong-thuc-pham/).
Để ngành thủy sản không mất đi vai trò quan trọng đối với kinh tế đất nước và
giúp người tiêu dùng có thể an tâm sử dụng các sản phẩm từ thủy sản ta phải
có các biện pháp phòng tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực
phẩm do thức ăn từ thủy sản, nên cần khảo sát mức độ nhiễm khuẩn của E.
coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá và môi trường nước nuôi ở
ĐBSCL. Vì vậy, đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và
Listeria trong thịt cá và trong môi trường nước ao nuôi ở An Giang và
Hậu Giang” đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài:
Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài
cá thường được sử dụng và mức độ nhiễm khuẩn nguồn nước nuôi trong hệ
thống các ao nuôi cá.
1.3 Nội dung đề tài:
Xác định mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá
người dân thường sử dụng tại các nơi khác nhau.
1
Xác định mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong môi trường ao
nuôi ở các tỉnh An Giang và Hậu Giang.
1.4 Thời gian thực hiện đề tài:
Từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013.
2
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm và khả năng gây bệnh của nhóm Coliforms và E. coli
2.2.1 Khái quát về đặc điểm của Coliforms
Coliforms là nhóm vi khuẩn có trong môi trường xung quanh chúng ta, chúng
hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và các động vật máu nóng
khác. Coliforms gồm có 4 giống vi sinh vật là Escherichia (với một loài duy
nhất là E. coli), Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Nếu hiểu theo nghĩa
hẹp thì nó chỉ gồm có các giống vi sinh vật sau: Enterobacter, Klebsiella và
Citrobacter (Pieron và Corlett, 1992. Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, Phạm
Minh Tâm, 1999).
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ khả
năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Đây là nhóm những trực
khuẩn đường ruột Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,
có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37±1oC trong vòng 24-48
giờ. Trong thực tế phân tích Coliforms còn cho thấy các vi khuẩn thuộc nhóm
này có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường Lauryl Sulphate và
Brilliant Green Lactose Bile Salt (Reilly, 1992).
Coliforms gồm có Coliforms chịu nhiệt và Coliforms phân (Fecal Coliforms
hay E. coli giả định). Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên
men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường
EC (Escherichia coli Broth), chúng có nguồn gốc từ các nguồn nước giàu chất
hữu cơ như nước thải công nghiệp, đất hoặc xác thực vật phân hủy. Coliforms
phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indole khi được ủ khoảng 24
giờ ở 44,5oC trong môi trường lỏng Trypton (Nguyễn Phước Linh, 2006. Trích
dẫn bởi Nguyễn Mạnh Hùng, 2008).
Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm. Có
nhiều nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và
cao đến 50oC, trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5oC hoặc từ
3-6oC. Trên môi trường thạch sau 12-16 giờ chúng có khả năng phát triển
mạnh và tạo ra khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Ngưỡng pH để Coliforms có
thể phát triển là 4,4-9 (Nguyễn Đức Hùng, 2004).
3
Một số tính chất sinh hóa đặc trưng cho các loài thuộc nhóm này là các thử
nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC)
thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. Nhìn chung chúng thường cho kết
quả ngược nhau đối với 2 thử nghiệm MR và VP (MR dương tính thì VP âm
tính và ngược lại). Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992 thì sản phẩm
thủy sản đạt tiêu chuẩn phải có số Coliforms ≤ 200 CFU/g.
2.1.2 Khả năng gây bệnh của nhóm vi sinh vật Coliforms
Nhóm Coliforms có 4 giống: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter. Từ năm 1700, người ta đã phát hiện ra E. coli là một loài vi sinh
vật gây bệnh, tới năm 1885 nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã
tách được loài vi sinh vật này từ phân trẻ em bị bệnh và được đặt tên là
Bacterium commune. Sau này vi khuẩn này được mang tên ông. Năm 1971
người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là
một vi sinh vật chỉ thị nhiễm trùng thực phẩm.
Các nhà khoa học đã tìm ra 5 nhóm E. coli khác nhau:
- Enterohemorrhagic E. coli (EHEC): nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh ra
độc tố Shigatoxin gồm có 2 chất: Verotoxin viết tắt là Stx1 và Verocytoxin
viết tắt là Stx2. Đây là 2 loại độc tố rất nguy hiểm, chúng gây kích thích thành
ruột, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu đường và acid amin ở ruột non. Nếu chúng
tác động lên hệ thần kinh sẽ có thể gây tử vong (Calderwood, 1996. Trích dẫn
bởi Nguyễn Đức Lượng, 1999).
- Enterotoxigenic E. coli (ETEC): có khả năng tạo ra enterotoxin và có khả
năng gây bệnh rất nặng ở người. Loại độc tố này có cấu trúc, chức năng và
miễn dịch giống độc tố vi khuẩn tả. Chúng tác động vào lớp biểu mô ruột kích
thích bài tiết nước và muối gây tiêu chảy và mất nước trầm trọng.
- Enteropathogenic E. coli (EPEC): không có khả năng enterotoxin, tuy nhiên
chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho người.
- Enteroinvasive E. coli (EIEC): có khả năng phát triển rất nhanh và có thể tạo
ra enteroin-vasine plasmid gây ra một hiện tượng rất nguy hiểm là đau đầu,
nôn mửa, ỉa chảy có đầm máu (Cheasty và Rowe, 1983. Trích dẫn bởi Nguyễn
Đức Lượng, 1999).
- Enteroadherent E. coli (EAEC): một số chủng trong nhóm này có khả năng
tạo ra độc tố bền nhiệt enterotixin, kích thích bài tiết nước và muối gây tiêu
chảy cập tính ở người (Savarino, 1993. Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng,
1999).
4
Những đặc tính chung của các nhóm E. coli:
- E. coli thuộc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trực
khuẩn ngắn, không tạo bào tử.
- E. coli có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7-50oC. Nhiệt độ phát triển tối
ưu của chúng 37oC. Riêng loài Enterotoxigenic E. coli (ETEC) có thể phát
triển ở 4oC. Phát triển rất mạnh trong môi trường Mac Conkey.
- E. coli bị tiêu diệt ở 60oC sau 0,1 phút, điểm pH phát triển tối ưu là 4,4.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi và khử nitrate thành
nitrit.
- E. coli bị ức chế bởi một số loại hóa chất như: Chlorine, muối mật, brilliant
green, selemite, desoxycholate natri, tetrathionate natri…
- Khả năng gây bệnh của chúng rất đa dạng. Ở phụ nữ, 90% trường hợp
nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu là do E. coli từ đó dẫn tới tiểu lắt nhắt, tiểu
đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Trong trường hợp cơ thể yếu, sức đề kháng giảm
E. coli sẽ vào máu gây nhiễm khuẩn máu. Chúng còn có thể gây viêm màng
não (khoảng 40% viêm màng não ở trẻ sơ sinh) và phần lớn các vụ tiêu chảy là
do E. coli (James, 1997).
- Escherichia coli O157: H7 có thể gây ra một loạt bệnh truyền nhiễm như
tiêu chảy từ nhẹ tới cấp tính hoặc hội chứng tăng urê huyết tiêu máu gây tử
vong (World health organization, 1999).
Trong thủy sản, E. coli thường được dùng như một vi khuẩn chỉ thị về sự
nhiễm phân; tuy nhiên vẫn còn nghi ngờ mối liên quan này do chúng xuất hiện
khắp nơi trong vùng nhiệt đới. E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế
nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật, gồm nhiều chủng
khác nhau trong đó một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh qua thực phẩm
ở mức độ từ viêm ruột nhẹ đến cấp tính và tử vong. Những nơi dùng phân
chuồng, đặc biệt là phân bò để bón cho ao nuôi, đều có nguy cơ là các chủng
E. coli gây bệnh có thể có trong nước của các ao nuôi đó. Đã có trường hợp
nhiễm có nguồn gốc từ nước do E. coli O157: H7 gây nên. Dựa vào những gì
chủng vi khuẩn này đã gây ra đối với gia súc, có thể kết luận chắc chắn rằng
liều gây nhiễm của chúng là thấp. Vì vậy, ở những ao nuôi thủy sản có bón
phân bò đều chứa nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe cộng đồng (World health
organization, 1999).
Đối với giống Enterobacter: thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, chúng
hiện diện khắp nơi trên thế giới với các nguồn chứa là đất, nước, trong đường
ruột của các loài động vật kể cả con người. Trong nghiên cứu, chúng được
5
phân lập từ đất, nước thải, các mẫu bệnh phẩm và trên cả thực vật. Hiện nay
đã phân lập và định danh được các loài là: E. aerogenes, E. cancerogenus, E.
cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. hormaechei, E.
intermedius, E. kobei, E. nimipressuralis, E. pyrinus, E. sakazakii (Ibarrow và
Feltham, 1987).
Ibarrow (1987) đã ghi nhận một số đặc điểm hình thái của Enterobacter spp
như: có hình que ngắn, Gram âm, di động, không sinh bào, ở một số chủng có
vỏ capsit, hiếu khí tùy nghi, xung quanh tế bào có màng lông rung làm cho
Enterobacter spp có tính di động. Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ từ 30-35oC
và phát triển chậm trong khoảng 18-20oC. Trên môi trường cấy, Enterobacter
spp cho khuẩn lạc to, tròn lồi, có khi có màng nhầy. Enterobacter spp có thể
phân biệt với E. Coli bằng kiểm tra sinh hóa IMViC. E. Coli cho kết quả kiểm
tra IMViC với 4 chỉ tiêu Indol (+), Methyl Red (+) Voges-Proskauer (+),
Citrate (+). Trong khi Enterobacte spp cho kết quả ngược lại.
E. aerogenes là loài có quan hệ gần giống với Klebsiella spp nhất so với các
loài khác thuộc giống Enterobacter spp, vì thế E. Aerogenes còn có tên là
Klebsiella mobitis. Tuy nhiên có thể phân biệt Enterobacter spp với
Klebsiella spp ở một số tính chất: di động mạnh và có ornithine decarboxylase
(Klebsiella spp không), không tạo ra Urease (Klebsiella spp có).
Enterobacter spp được xem như có nội độc tố nhưng độc tính yếu hơn
Klebsiella spp. Ngòai ra, Enterobacter spp lại có khả năng gây ngưng kết hồng
cầu, có khả năng kháng lại tính diệt khuẩn của kháng huyết thanh và một số
loại độc tố diệt bạch cầu.
Về tính kháng kháng sinh: Enterobacter spp có khả năng tiết ra β-Lactamase
để ức chế tác dụng diệt khuẩn của các kháng sinh thuộc nhóm này. Theo
Nguyễn Hoàng Nam Kha (2006), có 12 loài Enterobacter phân lập được trên
cá nuôi tại tỉnh An Giang có khả năng kháng lại ampicilin, oxytetracylin (lên
đến 90%) và tại tỉnh Đồng Tháp chúng kháng được 6 loại kháng sinh là
chloramphenicol, nitrofurances, ampicilin, tetracylcin, trimethoprime-
sulfamethoxazole, nalidixic acid (ở mức 30%). Nhiều báo cáo trên thế giới cho
thấy mức độ kháng thuốc cao của Enterobacter spp như: tại Mỹ qua kiểm tra
198 vi khuẩn Enterobacter spp cho thấy mức độ kháng cephalosporin thế hệ 3
là 50%; tại Costa Rica, kháng với Amoxycillin-clavulanic là 25.3% và ở Nga
mức độ kháng Amoxycillin-clavulanic acid là 88%, với Cephalosporin thế hệ
II, III là 50% (Kozlov, 1999).
Đặc tính gây bệnh: Enterobacter spp thấy ở khắp nơi, trên da và trên đường
tiêu hóa của nhiều loài động vật kể cả con người. Tuy nhiên, chúng chỉ gây
6
bệnh trong một số điều kiện như sức đề kháng của cơ thể giảm, không gây
bệnh trên con vật khỏe mạnh. Các bệnh nhiễm trùng do Enterobacter spp gây
ra là: nhiễm trùng máu, viêm đường hô hấp, viêm đường tiết niệu, viêm giác
mạc, viêm dây thần kinh, viêm khớp (Hensen và ctv, 1990 trích dẫn bởi
Nguyễn Hoàng Nam Kha, 2006)
2.1.3 Một số nghiên cứu, phân tích về Coliforms
Phuket (1992) đã sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để so sánh Coliforms
tổng số của một số loài thủy sản tại Thái Lan khi mới được đánh bắt và sau khi
được vận chuyển. Kết quả phân tích cho thấy đối với cá tương ứng là 3,9x105
và 1,8x106 CFU/g, tôm là 3,2 x 105 và 4,8x106 CFU/g.
Boyd và ctv, (1998) phân tích mẫu nước của 48 ao nuôi cá da trơn tại bang
Alabama (Mỹ) theo phương pháp MPN. Kết quả cho thấy mức độ nhiễm
Coliforms tổng cộng nhỏ hơn 1000/100ml và Coliforms phân nhỏ hơn
200/100ml.
Theo Al-Harbi (2003), kết quả khảo sát mật độ Coliforms tổng số trong nước
và lớp chất thải lắng đọng của ao nuôi cá rô phi từ tháng 7/1999 đến tháng
6/2000 cho thấy mật độ Coliforms tổng số trong nước nằm trong khoảng
1,8±0,9x102 đến 6,0±1,2x104 CFU/ml, trong lớp chất thải từ 3,2±1,2x105 đến
2,8±1,5x107 CFU/g. Khi phân tích bằng phương pháp MPN cho kết quả trong
nước từ 287±12 đến >1600/100ml, trong lớp chất thải là 257±29 đến
>1100/100ml.
Suhalim và Huang (2002) khi phân tích Coliforms và E. coli trong thịt cá da
trơn phile tại 2 nông trại ở Atlanta (Mỹ) đã phát hiện được trong cơ cá có
nhiễm chủng E. coli ở mức 103 CFU/g. Ngoài ra, họ còn sử dụng kỹ thuật
màng lọc để phân tích mẫu nước trong ao nuôi và cho kết quả Coliforms tổng
số nằm trong khoảng 2,9-5,5 x 103 CFU/ml.
Nguyễn Đình Xuân Quý (2003) đã khảo sát mật độ Coliforms trong tôm sú
nguyên liệu và thành phẩm ở hai tỉnh Trà Vinh và Kiên Giang. Kết quả cho
thấy sự biến động Coliforms trong tôm sú nguyên liệu tại Trà Vinh là 468±229
CFU/g và tại Kiên Giang là 467±99,6 CFU/g. Đối với tôm thành phẩm, tổng
số Coliform biến động trong khoảng 42±18,5 CFU/g ở Trà Vinh và 11±9,6
CFU/g tại Kiên Giang. Như vậy tôm thành phẩm hoàn toàn đạt tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 5289-1992 (số Coliforms ≤ 200 CFU/g).
Phạm Đình Đôn (2006) cho thấy số liệu quan trắc môi trường nước trên sông
rạch khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng đã cảnh báo nguy cơ ô nhiễm
môi trường nước sông rạch là rất lớn. Trong đó, chỉ số vi sinh Coliforms trên
7
sông Tiền tại An Giang là 1000MNP/100ml, tại Vĩnh Long là
816MNP/100ml, trên sông Hậu (Vĩnh Long) là 55483MNP/100ml, trên kinh
xáng chợ Phụng Hiệp (Hậu Giang) là 2,4x105 MNP/100ml.
Phạm Văn Tuấn (2008) đã khảo sát chất lượng nước nuôi cá tra tại khu vực Ô
Môn -Cần Thơ dựa trên nồng độ Coliforms trong nước. Kết quả phân tích52
mẫu nước kiểm tra thì có tới 38 mẫu có chỉ tiêu Coliforms > 5000 MPN/100ml
chiếm tỷ lệ 73,08%. Ngoài ra có 45,45% số ao ương và 80,65% số ao nuôi cá
tra thịt trong khu vực này có nguồn nước bị nhiễm Coliforms vượt mức chỉ
tiêu cho phép về vi sinh vật trong nước nuôi trồng thủy sản theo thông tư
01/2000/TT-BTS của Bộ Thủy Sản, 2000 (> 5000 MPN/100ml). Điều này cho
thấy hiện nay nguồn nước nuôi cá tra đã bị nhiễm Coliforms trầm trọng.
2.2 Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes (Phạm Ngọc Hà, 2012)
2.2.1 Khái quát về vi khuẩn Listerria
Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ,
không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản
ứng catalase dương tính, oxydase âm tính. Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có
khả năng lên men đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và
người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai
truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều
loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người.
Listeria monocytogenes đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật năm
1926 bởi Prior, nhưng lúc đó chưa có đủ đặc tính chính xác để xác định nó.
Năm 1927, vi sinh vật này cũng được Pirie phân lập từ gan bi bệnh của chuột
nhảy (tatera tobengulae) tại nam Châu Phi, và được đặt tên là Listeria
hepalolytica. Khi sự tồn tại của vi sinh vật này được xác minh,
L. monocytogenes chính thức được Bergay đặt tên vào năm 1957.
2.2.2 Phân bố và cách lây lan
L. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân,
dịch tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe…Rau củ có thể
nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón. Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn
mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và
các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn. Theo Sở giám sát và an toàn thực
phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp bệnh Listeriosis ở Mĩ đều liên
quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc
xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả
tươi và sữa chưa tiệt trùng. Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò
8
hến, tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách
cải bắp và patê thịt. Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn
L. monocytogenes cực kỳ cao với các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước
khi ăn và các loại thức ăn làm sẵn. Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây
truyền của vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua
đường ăn uống. Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt
và mũi.
2.2.3 Hình thái
L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương.
Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L. monocytogenes được tìm
thấy ở dạng trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5µm×1-2 µm) lại
chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn (dễ nhầm với
Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử,
không tạo giáp mô, có khả năng di động. Ở 20-25oC vi khuẩn di động
mạnh nhất. Ở 37oC vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu. Khi nhuộm từ
mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ
nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase
để phân biệt. Trong 3-6 giờ ở 37oC vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày
vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn (đặc biệt chủng R). Sự di động của
Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix.
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí. Nhiệt độ thích hợp 30-
37oC, pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng môi trường
thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng,
đường kính 0,5-1 mm và gây dung huyết.
Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam
(màu blue-green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng.
Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự
phân giải Esculin sau 24-48 giờ.
Môi trường Gelatin không gây tan chảy.
2.2.5 Đặc tính sinh hóa
Listeria lên men chậm các loại đường như glucose, salicin, levulose. Không
lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose. Phản ứng Catalaza dương tính.
9
2.2.6 Đặc tính gây bệnh
Khi tiến hành phân tích chẩn đoán Listeriosis và khảo sát nguồn nhiễm khuẩn
thì thấy rằng vi khuẩn này có thể tồn tại trong thời gian dài lâu có thể là 90
ngày từ khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn và xuất hiện triệu chứng. Thời
gian trung bình từ khi nhiễm khuẩn vào cơ thể đến khi phát bệnh khoảng 30
ngày. Vi khuẩn này rất bền. Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao,
dưới 60oC), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí
có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh (ở khoảng 4oC). Vi khuẩn bị
diệt ở 60oC trong 30 phút và 72oC trong 15 giây. Vi khuẩn đề kháng với
sự khô hạn. Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những
chất sát trùng thông thường. Nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng
tetracycline cho kết quả tốt nhất. Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim
với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones.
Erythromycine, ampicillin được dung trong điều trị bệnh cho người.
2.2.7 Khả năng lây bệnh
Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis và ở dạng thần kinh đôi khi được
gọi là bệnh quay mòng, phổ biến nhất đối với động vật nhai lại như bò,
cừu....đặc biệt vào mùa đông và đầu mùa xuân với mọi lứa tuổi. Đối với dạng
phủ tạng thường gặp ở động vật dạ dày đơn. Bệnh có thể gây sảy thai ở ngựa.
Ngoài ra vi khuẩn còn gây bệnh cho gia cầm và cá. Ở người thường gặp sảy
thai, thai chết và viêm não. Ở vài động vật thể hiện sự gia tăng bạch cầu đơn
nhân. Trong phòng thí nghiệm: Dùng thỏ và chuột lang. Chuột nhạy cảm, chết
sau khi tiêm nhiễm 48 giờ với bệnh tích hoại tử gan. Dùng test ANTON gây
viêm kết mạc mắt.
Một bệnh do L. monocytogenes là viêm màng não mủ, hay viêm màng não
nhiễm khuẩn, là hiện tượng viêm của các màng bao bọc quanh hệ thần kinh
trung ương (não và tủy sống) do sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong
khoang dịch não tủy. Sự viêm nhiễm này sẽ gây nên tình trạng sinh mủ
bên trong hệ thống thần kinh trung ương. Những bệnh nhân suy giảm miễn
dịch như người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc ức chế miễn dịch,
AIDS thường có nguy cơ bị bệnh. Viêm màng não mủ sơ sinh do tác nhân này
thường nằm trong bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng. Các dấu hiệu nghi ngờ
trên lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non không rõ nguyên nhân, nhau thai
có tổn thương hạt...
2.2.8 Miễn dịch
Cơ thể thú có thể hình thành miễn dịch sau khi nhiễm. Miễn dịch trung gian tế
bào là chủ yếu. Hiện nay có hai loại vaccine chết và nhược độc có thể đem lại
10
kết quả. Vaccine thường sử dụng: 1a và 4b đạt kết quả phòng bệnh trên cừu.
11
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm nghiên cứu
Thu mẫu:
- Mẫu cá: các loài cá mua từ siêu thị Big C, chợ Cái khế, chợ Tân An, chợ
Cần Thơ và trong các ao nuôi ở các tỉnh An Giang, Hậu Giang.
- Mẫu nước: thu trong ao nuôi ở các tỉnh An Giang và Hậu Giang.
- Nghiên cứu sẽ được tiến hành trên các loài cá chính như: cá rô đồng, cá tra,
cá lóc, cá diêu hồng, cá rô phi, cá hường, cá chép và các mẫu nước trong các
ao nuôi.
Phân tích mẫu: tại phòng thí nghiệm vi sinh – khoa Thủy sản – Trường Đại
Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ thu, trữ và phân tích mẫu
Thùng giữ lạnh có nắp đậy
Khay và thớt nhựa
Túi PE tuyệt trùng
Túi gói vô trùng Whirl
Bộ đồ tiểu phẩu
Kính hiển vi nổi
Tủ sấy, tủ ấm, tủ mát
Tủ cấy vô trùng
Máy trộn mẫu (vortex)
Nồi tiệt trùng áp suất
Đĩa Petrifilm E. Coli/Coliforms Count (EC) và Đĩa Petrifilm Environment
Listeria (EL) của hãng 3M, được sản xuất tại Nhật Bản.
Pipet chia khoảng bằng nhựa 25ml (có bông hút ẩm ở đầu)
Micropipette 1ml, 5ml
Đầu ống pipet 1ml, 5ml
12
3.2.2 Hóa chất
Peptone
Cồn tuyệt đối, cồn 96o, cồn 70o
3.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
• Mẫu nước:
Mẫu nước được thu trong ống nghiệm nghiệm vô trùng 10 ml, được thu tương
tự như các mẫu nước để phân tích hóa học (thu dưới mặt nước). Ghi nhận vị trí
thu mẫu trên cả hai ống mẫu.
Các mẫu sẽ được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thùng giữ lạnh (giữ
dưới 10oC), xử lí trong vòng 6-8 tiếng.
• Mẫu cá:
75 mẫu, 7 loài cá được thu gom và chứa trong túi nhựa PE. Thu ít nhất 3 mẫu
cho từng loài cá tại mỗi nơi thu mẫu. Cá được đựng chung trong 1 túi PE duy
nhất cho mỗi loài/địa điểm. Khi xử lí cá, nên đeo găng tay, phun cồn 70o, lau
bằng khăn giấy khô để giảm ô nhiễm chéo vi khuẩn giữa các mẫu cá. Ghi nhận
vị trí thu mẫu trên cả hai túi mẫu.
Các mẫu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thùng giữ lạnh (giữ
dưới 10oC), xử lí trong vòng 6-8 tiếng.
3.4 Phương pháp phân tích mẫu
Mẫu cá: cắt 2,5-3g thịt cá cho vào túi vô trùng Whirl, cho tiếp vào đó 5ml
dung dịch peptone đã được chuẩn bị trước với nồng độ 1% và được tuyệt trùng
ở 121oC trong 20 phút. Túi mẫu được để vào máy lắc khoảng 5 phút.
Cấy vi khuẩn được tiến hành các bước sau cho cả mẫu cá và mẫu nước:
- Lắc trộn đều mẫu bằng máy trộn mẫu khoảng 7 giây.
- Dùng micropipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml peptone thứ
nhất (nồng độ 10-1). Lắc đều ống nghiệm.
- Thay đầu col trên pipet, chuyển 1ml dung dịch từ ống nghiệm thứ nhất sang
ống nghiệm thứ hai (nồng độ 10-2). Lắc đều ống nghiệm.
- Cấy vi khuẩn E. coli và Coliforms dùng micropipet vô trùng lấy 0.1 ml mẫu
ở mỗi nồng độ pha loãng, kể cả nồng độ 100, cho vào đĩa petrifilm EC. Đối với
vi khuẩn Listeria lấy 0.2ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng, kể cả nồng độ 100,
cho vào đĩa petrifilm EL (đậy đĩa từ từ tránh bọt khí).
13
KHOA THỦY SẢN
NGUYỄN ĐẠI QUỐC DƯƠNG
KHẢO SÁT MẬT ĐỘ VI KHUẨN E. coli,
Coliforms và Listeria TRONG THỊT CÁ
VÀ TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC AO
NUÔI Ở AN GIANG VÀ HẬU GIANG
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
2013
i
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản,
Quý Thầy Cô Khoa Thủy Sản và Bộ môn Thủy Sinh Học Ứng Dụng đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và năng cao kiến thức trong thời gian
theo học tại khoa.
Đặc biệt tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Phạm Thị Tuyết
Ngân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và cung cấp nhiều kiến thức quý báu
giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời cảm ơn đến chị Phan Thị Cẩm Tú, anh Trần Phước Vinh đã nhiệt
tình giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện thí nghiệm.
Tập thể lớp Nuôi Trồng Thủy Sản khóa 36 đã hỗ trợ, giúp đỡ nhiều mặt trong
quá trình học tập và hoàn thiện luận văn.
Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn
bè đã động viên, chia sẽ, giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn, trở ngại trong
suốt quá trình học tập.
Ngày 01 tháng 12 năm 2013
Nguyễn Đại Quốc Dương
i
TÓM TẮT
Ngành thủy sản đang là một trong những ngành quan trọng trong phát triển
kinh tế của Việt Nam. Tuy nhiên, hàng năm có nhiều người mắc bệnh do trong
sản phẩm thủy nhiễm khuẩn làm người tiêu dùng đang dần mất lòng tin với
sản phẩm từ thủy sản. Mà chủ yếu là nhiễm vi khuẩn E. coli, Coliforms và
Listeria. Đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong
thịt cá và trong môi trường nước ao nuôi An Giang và Hậu Giang” nhằm khảo
sát mức độ nhiễm khuẩn của E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá
và môi trường nước nuôi ở ĐBSCL để kịp thời đưa ra các biện pháp phòng
tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực phẩm do thức ăn từ thủy
sản để lấy lại lòng tin của người tiêu dùng. Đề tài được tiến hành thu mẫu cá
tại các điểm: siêu thị Big C, các chợ ở Cần Thơ, ao nuôi ở An Giang và Hậu
Giang ở các loài cá rô, cá tra, cá lóc, cá điêu hồng, cá chép, cá rô phi, cá
hường mỗi loài được lặp lại 3 lần; thu mẫu nước 1 lần trong ao nuôi ở An
giang và Hậu Giang. Các mẫu được cấy vào đĩa petrifilm ở các mức nồng độ
pha loãng10-1, 10-2. Kết quả phân tích mẫu cho thấy sự biến động của mật độ
vi khuẩn E. coli, Coliforms và listeria nhiễm trong cá theo địa điểm thu, thành
phần loài khác nhau và môi trường nước nuôi. Mật độ 3 loại vi khuẩn ở loài cá
da trơn thấp hơn ở các loài cá có vẩy và mật độ của 3 loại vi khuẩn ở siêu thị
Big C thấp hơn mật độ vi khuẩn trong cá ở các chợ ở thành phố Cần Thơ.
ii
CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành trên các kết quả nghiên cứu của
tôi và các kết quả nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng
cấp nào khác.
Ngày 01 tháng 12 năm 2013
Nguyễn Đại Quốc Dương
iii
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 4.1. Mật độ vi khuẩn E. coli (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu mẫu
khác nhau ...................................................................................................... 16
Bảng 4.2. Mật độ vi khuẩn Coliforms (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu
mẫu khác nhau .............................................................................................. 16
Bảng 4.3. Mật độ vi khuẩn Listeria (CFU/ml) trong các loài ở các điểm thu
mẫu khác nhau .............................................................................................. 17
Bảng 4.4. Mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria (CFU/ml) giữa môi
trường nước nuôi và trong cơ cá trong ao nuôi .............................................. 18
iv
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................ i
TÓM TẮT..................................................................................................... ii
CAM KẾT KẾT QUẢ.................................................................................. iii
DANH SÁCH BẢNG .................................................................................. iv
MỤC LỤC .....................................................................................................v
CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ........................................................................... i
1.1 Giới thiệu:............................................................................................ 1
1.2 Mục tiêu đề tài: .................................................................................... 1
1.3 Nội dung đề tài:.................................................................................... 1
1.4 Thời gian thực hiện đề tài:.................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 3
2.1 Đặc điểm và khả năng gây bệnh của nhóm Coliforms và E. coli........... 3
2.2.1 Khái quát về đặc điểm của Coliforms ........................................ 3
2.1.2 Khả năng gây bệnh của nhóm vi sinh vật Coliforms .................. 4
2.1.3 Một số nghiên cứu, phân tích về Coliforms ............................... 7
2.2 Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes (Phạm Ngọc Hà, 2012) .... 8
2.2.1 Khái quát về vi khuẩn Listerria ................................................. 8
2.2.2 Phân bố và cách lây lan ............................................................. 8
2.2.3 Hình thái ................................................................................... 9
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy ...................................................................... 9
2.2.5 Đặc tính sinh hóa....................................................................... 9
2.2.6 Đặc tính gây bệnh ....................................................................10
2.2.7 Khả năng lây bệnh....................................................................10
2.2.8 Miễn dịch.................................................................................10
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................12
3.1 Địa điểm nghiên cứu ...........................................................................12
3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................12
v
3.2.1 Dụng cụ thu, trữ và phân tích mẫu............................................12
3.2.2 Hóa chất...................................................................................13
3.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu ......................................................13
3.4 Phương pháp phân tích mẫu ................................................................13
3.5 Cách xác định và tính các thông số theo dõi ........................................14
3.6 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................14
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................15
4.1 Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria trong các loài cá ở
các điểm thu khác nhau: ............................................................................15
4.2 Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms, Listeria giữa môi trường
nước ao nuôi và trong cơ cá nuôi trong ao:................................................17
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT .....................................................19
5.1 Kết luận...............................................................................................19
5.2 Đề suất ................................................................................................19
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................20
PHỤ LỤC A: BẢNG MẬT ĐỘ VI KHUẨN................................................22
vi
CHƯƠNG 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu:
Việt Nam nhận biết được xu hướng chung của người tiêu dùng trên thế giới là
ngày càng tiêu thụ nhiều các sản phẩm có nguồn gốc thủy sản. Vì vậy trong
những năm gần đây, Việt Nam đã và đang đẩy mạnh phong trào nuôi trồng
thủy sản nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của người tiêu dùng và thủy
sản đã trở thành một ngành quan trọng trong phát triển kinh tế đất nước.
Nhưng hàng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, trong đó
đặc biệt là thức ăn từ thủy sản, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khoẻ của
cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước
khác trên thế giới cũng vậy. Việc này làm cho người tiêu dùng đang dần mất
lòng tin với các sản phẩm từ thủy sản. Một trong những nguyên nhân gây ra
tình trạng này là sự hiện diện quá mức cho phép của các vi sinh vật gây hại
trong thực phẩm như: Bacillus cereus, Coliforms, Escherichia coli, Listeria
monocytogenes, Shigella spp, Staphylococcusaureus,… Phổ biến là các dòng
vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria (http://topmanjsc.com/tu-van/iso-
22000/mot-so-vi-khuan-chu-yeu-trong-thuc-pham/).
Để ngành thủy sản không mất đi vai trò quan trọng đối với kinh tế đất nước và
giúp người tiêu dùng có thể an tâm sử dụng các sản phẩm từ thủy sản ta phải
có các biện pháp phòng tránh, ngăn chặn và làm giảm bớt số ca ngộ độc thực
phẩm do thức ăn từ thủy sản, nên cần khảo sát mức độ nhiễm khuẩn của E.
coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá và môi trường nước nuôi ở
ĐBSCL. Vì vậy, đề tài “Khảo sát mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và
Listeria trong thịt cá và trong môi trường nước ao nuôi ở An Giang và
Hậu Giang” đã được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài:
Đánh giá mức độ nhiễm khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài
cá thường được sử dụng và mức độ nhiễm khuẩn nguồn nước nuôi trong hệ
thống các ao nuôi cá.
1.3 Nội dung đề tài:
Xác định mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong cơ các loài cá
người dân thường sử dụng tại các nơi khác nhau.
1
Xác định mật độ vi khuẩn E. coli, Coliforms và Listeria trong môi trường ao
nuôi ở các tỉnh An Giang và Hậu Giang.
1.4 Thời gian thực hiện đề tài:
Từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013.
2
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm và khả năng gây bệnh của nhóm Coliforms và E. coli
2.2.1 Khái quát về đặc điểm của Coliforms
Coliforms là nhóm vi khuẩn có trong môi trường xung quanh chúng ta, chúng
hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và các động vật máu nóng
khác. Coliforms gồm có 4 giống vi sinh vật là Escherichia (với một loài duy
nhất là E. coli), Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Nếu hiểu theo nghĩa
hẹp thì nó chỉ gồm có các giống vi sinh vật sau: Enterobacter, Klebsiella và
Citrobacter (Pieron và Corlett, 1992. Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, Phạm
Minh Tâm, 1999).
Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, số lượng hiện diện của chúng
trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ khả
năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Đây là nhóm những trực
khuẩn đường ruột Gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi,
có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37±1oC trong vòng 24-48
giờ. Trong thực tế phân tích Coliforms còn cho thấy các vi khuẩn thuộc nhóm
này có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường Lauryl Sulphate và
Brilliant Green Lactose Bile Salt (Reilly, 1992).
Coliforms gồm có Coliforms chịu nhiệt và Coliforms phân (Fecal Coliforms
hay E. coli giả định). Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên
men lactose sinh hơi trong khoảng 24 giờ khi được ủ ở 44oC trong môi trường
EC (Escherichia coli Broth), chúng có nguồn gốc từ các nguồn nước giàu chất
hữu cơ như nước thải công nghiệp, đất hoặc xác thực vật phân hủy. Coliforms
phân là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh Indole khi được ủ khoảng 24
giờ ở 44,5oC trong môi trường lỏng Trypton (Nguyễn Phước Linh, 2006. Trích
dẫn bởi Nguyễn Mạnh Hùng, 2008).
Coliforms phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm. Có
nhiều nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến -2oC và
cao đến 50oC, trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở 5oC hoặc từ
3-6oC. Trên môi trường thạch sau 12-16 giờ chúng có khả năng phát triển
mạnh và tạo ra khuẩn lạc có thể nhìn thấy được. Ngưỡng pH để Coliforms có
thể phát triển là 4,4-9 (Nguyễn Đức Hùng, 2004).
3
Một số tính chất sinh hóa đặc trưng cho các loài thuộc nhóm này là các thử
nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC)
thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. Nhìn chung chúng thường cho kết
quả ngược nhau đối với 2 thử nghiệm MR và VP (MR dương tính thì VP âm
tính và ngược lại). Theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5289-1992 thì sản phẩm
thủy sản đạt tiêu chuẩn phải có số Coliforms ≤ 200 CFU/g.
2.1.2 Khả năng gây bệnh của nhóm vi sinh vật Coliforms
Nhóm Coliforms có 4 giống: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter. Từ năm 1700, người ta đã phát hiện ra E. coli là một loài vi sinh
vật gây bệnh, tới năm 1885 nhà khoa học người Đức là Theodor Escherich đã
tách được loài vi sinh vật này từ phân trẻ em bị bệnh và được đặt tên là
Bacterium commune. Sau này vi khuẩn này được mang tên ông. Năm 1971
người ta xếp chúng vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và là
một vi sinh vật chỉ thị nhiễm trùng thực phẩm.
Các nhà khoa học đã tìm ra 5 nhóm E. coli khác nhau:
- Enterohemorrhagic E. coli (EHEC): nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh ra
độc tố Shigatoxin gồm có 2 chất: Verotoxin viết tắt là Stx1 và Verocytoxin
viết tắt là Stx2. Đây là 2 loại độc tố rất nguy hiểm, chúng gây kích thích thành
ruột, gây tiêu chảy, ức chế hấp thu đường và acid amin ở ruột non. Nếu chúng
tác động lên hệ thần kinh sẽ có thể gây tử vong (Calderwood, 1996. Trích dẫn
bởi Nguyễn Đức Lượng, 1999).
- Enterotoxigenic E. coli (ETEC): có khả năng tạo ra enterotoxin và có khả
năng gây bệnh rất nặng ở người. Loại độc tố này có cấu trúc, chức năng và
miễn dịch giống độc tố vi khuẩn tả. Chúng tác động vào lớp biểu mô ruột kích
thích bài tiết nước và muối gây tiêu chảy và mất nước trầm trọng.
- Enteropathogenic E. coli (EPEC): không có khả năng enterotoxin, tuy nhiên
chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho người.
- Enteroinvasive E. coli (EIEC): có khả năng phát triển rất nhanh và có thể tạo
ra enteroin-vasine plasmid gây ra một hiện tượng rất nguy hiểm là đau đầu,
nôn mửa, ỉa chảy có đầm máu (Cheasty và Rowe, 1983. Trích dẫn bởi Nguyễn
Đức Lượng, 1999).
- Enteroadherent E. coli (EAEC): một số chủng trong nhóm này có khả năng
tạo ra độc tố bền nhiệt enterotixin, kích thích bài tiết nước và muối gây tiêu
chảy cập tính ở người (Savarino, 1993. Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng,
1999).
4
Những đặc tính chung của các nhóm E. coli:
- E. coli thuộc họ Enterbacteriaceae, catalose (+), oxidase (-), gram (-), trực
khuẩn ngắn, không tạo bào tử.
- E. coli có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 7-50oC. Nhiệt độ phát triển tối
ưu của chúng 37oC. Riêng loài Enterotoxigenic E. coli (ETEC) có thể phát
triển ở 4oC. Phát triển rất mạnh trong môi trường Mac Conkey.
- E. coli bị tiêu diệt ở 60oC sau 0,1 phút, điểm pH phát triển tối ưu là 4,4.
Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường, sinh hơi và khử nitrate thành
nitrit.
- E. coli bị ức chế bởi một số loại hóa chất như: Chlorine, muối mật, brilliant
green, selemite, desoxycholate natri, tetrathionate natri…
- Khả năng gây bệnh của chúng rất đa dạng. Ở phụ nữ, 90% trường hợp
nhiễm khuẩn đường tiểu lần đầu là do E. coli từ đó dẫn tới tiểu lắt nhắt, tiểu
đau, tiểu ra máu, tiểu ra mủ. Trong trường hợp cơ thể yếu, sức đề kháng giảm
E. coli sẽ vào máu gây nhiễm khuẩn máu. Chúng còn có thể gây viêm màng
não (khoảng 40% viêm màng não ở trẻ sơ sinh) và phần lớn các vụ tiêu chảy là
do E. coli (James, 1997).
- Escherichia coli O157: H7 có thể gây ra một loạt bệnh truyền nhiễm như
tiêu chảy từ nhẹ tới cấp tính hoặc hội chứng tăng urê huyết tiêu máu gây tử
vong (World health organization, 1999).
Trong thủy sản, E. coli thường được dùng như một vi khuẩn chỉ thị về sự
nhiễm phân; tuy nhiên vẫn còn nghi ngờ mối liên quan này do chúng xuất hiện
khắp nơi trong vùng nhiệt đới. E. coli là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế
nhất trong hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật, gồm nhiều chủng
khác nhau trong đó một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh qua thực phẩm
ở mức độ từ viêm ruột nhẹ đến cấp tính và tử vong. Những nơi dùng phân
chuồng, đặc biệt là phân bò để bón cho ao nuôi, đều có nguy cơ là các chủng
E. coli gây bệnh có thể có trong nước của các ao nuôi đó. Đã có trường hợp
nhiễm có nguồn gốc từ nước do E. coli O157: H7 gây nên. Dựa vào những gì
chủng vi khuẩn này đã gây ra đối với gia súc, có thể kết luận chắc chắn rằng
liều gây nhiễm của chúng là thấp. Vì vậy, ở những ao nuôi thủy sản có bón
phân bò đều chứa nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe cộng đồng (World health
organization, 1999).
Đối với giống Enterobacter: thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae, chúng
hiện diện khắp nơi trên thế giới với các nguồn chứa là đất, nước, trong đường
ruột của các loài động vật kể cả con người. Trong nghiên cứu, chúng được
5
phân lập từ đất, nước thải, các mẫu bệnh phẩm và trên cả thực vật. Hiện nay
đã phân lập và định danh được các loài là: E. aerogenes, E. cancerogenus, E.
cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. hormaechei, E.
intermedius, E. kobei, E. nimipressuralis, E. pyrinus, E. sakazakii (Ibarrow và
Feltham, 1987).
Ibarrow (1987) đã ghi nhận một số đặc điểm hình thái của Enterobacter spp
như: có hình que ngắn, Gram âm, di động, không sinh bào, ở một số chủng có
vỏ capsit, hiếu khí tùy nghi, xung quanh tế bào có màng lông rung làm cho
Enterobacter spp có tính di động. Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ từ 30-35oC
và phát triển chậm trong khoảng 18-20oC. Trên môi trường cấy, Enterobacter
spp cho khuẩn lạc to, tròn lồi, có khi có màng nhầy. Enterobacter spp có thể
phân biệt với E. Coli bằng kiểm tra sinh hóa IMViC. E. Coli cho kết quả kiểm
tra IMViC với 4 chỉ tiêu Indol (+), Methyl Red (+) Voges-Proskauer (+),
Citrate (+). Trong khi Enterobacte spp cho kết quả ngược lại.
E. aerogenes là loài có quan hệ gần giống với Klebsiella spp nhất so với các
loài khác thuộc giống Enterobacter spp, vì thế E. Aerogenes còn có tên là
Klebsiella mobitis. Tuy nhiên có thể phân biệt Enterobacter spp với
Klebsiella spp ở một số tính chất: di động mạnh và có ornithine decarboxylase
(Klebsiella spp không), không tạo ra Urease (Klebsiella spp có).
Enterobacter spp được xem như có nội độc tố nhưng độc tính yếu hơn
Klebsiella spp. Ngòai ra, Enterobacter spp lại có khả năng gây ngưng kết hồng
cầu, có khả năng kháng lại tính diệt khuẩn của kháng huyết thanh và một số
loại độc tố diệt bạch cầu.
Về tính kháng kháng sinh: Enterobacter spp có khả năng tiết ra β-Lactamase
để ức chế tác dụng diệt khuẩn của các kháng sinh thuộc nhóm này. Theo
Nguyễn Hoàng Nam Kha (2006), có 12 loài Enterobacter phân lập được trên
cá nuôi tại tỉnh An Giang có khả năng kháng lại ampicilin, oxytetracylin (lên
đến 90%) và tại tỉnh Đồng Tháp chúng kháng được 6 loại kháng sinh là
chloramphenicol, nitrofurances, ampicilin, tetracylcin, trimethoprime-
sulfamethoxazole, nalidixic acid (ở mức 30%). Nhiều báo cáo trên thế giới cho
thấy mức độ kháng thuốc cao của Enterobacter spp như: tại Mỹ qua kiểm tra
198 vi khuẩn Enterobacter spp cho thấy mức độ kháng cephalosporin thế hệ 3
là 50%; tại Costa Rica, kháng với Amoxycillin-clavulanic là 25.3% và ở Nga
mức độ kháng Amoxycillin-clavulanic acid là 88%, với Cephalosporin thế hệ
II, III là 50% (Kozlov, 1999).
Đặc tính gây bệnh: Enterobacter spp thấy ở khắp nơi, trên da và trên đường
tiêu hóa của nhiều loài động vật kể cả con người. Tuy nhiên, chúng chỉ gây
6
bệnh trong một số điều kiện như sức đề kháng của cơ thể giảm, không gây
bệnh trên con vật khỏe mạnh. Các bệnh nhiễm trùng do Enterobacter spp gây
ra là: nhiễm trùng máu, viêm đường hô hấp, viêm đường tiết niệu, viêm giác
mạc, viêm dây thần kinh, viêm khớp (Hensen và ctv, 1990 trích dẫn bởi
Nguyễn Hoàng Nam Kha, 2006)
2.1.3 Một số nghiên cứu, phân tích về Coliforms
Phuket (1992) đã sử dụng phương pháp đếm khuẩn lạc để so sánh Coliforms
tổng số của một số loài thủy sản tại Thái Lan khi mới được đánh bắt và sau khi
được vận chuyển. Kết quả phân tích cho thấy đối với cá tương ứng là 3,9x105
và 1,8x106 CFU/g, tôm là 3,2 x 105 và 4,8x106 CFU/g.
Boyd và ctv, (1998) phân tích mẫu nước của 48 ao nuôi cá da trơn tại bang
Alabama (Mỹ) theo phương pháp MPN. Kết quả cho thấy mức độ nhiễm
Coliforms tổng cộng nhỏ hơn 1000/100ml và Coliforms phân nhỏ hơn
200/100ml.
Theo Al-Harbi (2003), kết quả khảo sát mật độ Coliforms tổng số trong nước
và lớp chất thải lắng đọng của ao nuôi cá rô phi từ tháng 7/1999 đến tháng
6/2000 cho thấy mật độ Coliforms tổng số trong nước nằm trong khoảng
1,8±0,9x102 đến 6,0±1,2x104 CFU/ml, trong lớp chất thải từ 3,2±1,2x105 đến
2,8±1,5x107 CFU/g. Khi phân tích bằng phương pháp MPN cho kết quả trong
nước từ 287±12 đến >1600/100ml, trong lớp chất thải là 257±29 đến
>1100/100ml.
Suhalim và Huang (2002) khi phân tích Coliforms và E. coli trong thịt cá da
trơn phile tại 2 nông trại ở Atlanta (Mỹ) đã phát hiện được trong cơ cá có
nhiễm chủng E. coli ở mức 103 CFU/g. Ngoài ra, họ còn sử dụng kỹ thuật
màng lọc để phân tích mẫu nước trong ao nuôi và cho kết quả Coliforms tổng
số nằm trong khoảng 2,9-5,5 x 103 CFU/ml.
Nguyễn Đình Xuân Quý (2003) đã khảo sát mật độ Coliforms trong tôm sú
nguyên liệu và thành phẩm ở hai tỉnh Trà Vinh và Kiên Giang. Kết quả cho
thấy sự biến động Coliforms trong tôm sú nguyên liệu tại Trà Vinh là 468±229
CFU/g và tại Kiên Giang là 467±99,6 CFU/g. Đối với tôm thành phẩm, tổng
số Coliform biến động trong khoảng 42±18,5 CFU/g ở Trà Vinh và 11±9,6
CFU/g tại Kiên Giang. Như vậy tôm thành phẩm hoàn toàn đạt tiêu chuẩn Việt
Nam TCVN 5289-1992 (số Coliforms ≤ 200 CFU/g).
Phạm Đình Đôn (2006) cho thấy số liệu quan trắc môi trường nước trên sông
rạch khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng đã cảnh báo nguy cơ ô nhiễm
môi trường nước sông rạch là rất lớn. Trong đó, chỉ số vi sinh Coliforms trên
7
sông Tiền tại An Giang là 1000MNP/100ml, tại Vĩnh Long là
816MNP/100ml, trên sông Hậu (Vĩnh Long) là 55483MNP/100ml, trên kinh
xáng chợ Phụng Hiệp (Hậu Giang) là 2,4x105 MNP/100ml.
Phạm Văn Tuấn (2008) đã khảo sát chất lượng nước nuôi cá tra tại khu vực Ô
Môn -Cần Thơ dựa trên nồng độ Coliforms trong nước. Kết quả phân tích52
mẫu nước kiểm tra thì có tới 38 mẫu có chỉ tiêu Coliforms > 5000 MPN/100ml
chiếm tỷ lệ 73,08%. Ngoài ra có 45,45% số ao ương và 80,65% số ao nuôi cá
tra thịt trong khu vực này có nguồn nước bị nhiễm Coliforms vượt mức chỉ
tiêu cho phép về vi sinh vật trong nước nuôi trồng thủy sản theo thông tư
01/2000/TT-BTS của Bộ Thủy Sản, 2000 (> 5000 MPN/100ml). Điều này cho
thấy hiện nay nguồn nước nuôi cá tra đã bị nhiễm Coliforms trầm trọng.
2.2 Giới thiệu chung về Listeria motocytogenes (Phạm Ngọc Hà, 2012)
2.2.1 Khái quát về vi khuẩn Listerria
Giống vi khuẩn Listeria thuộc tộc Lactobacilleae gồm những trực khuẩn nhỏ,
không sinh bào tử, có lông ở một đầu nên có thể di động, gam dương, có phản
ứng catalase dương tính, oxydase âm tính. Hiếu khí hoặc yếm khí tùy ý và có
khả năng lên men đường. Giống này gồm nhiều loài gây bệnh cho gia súc và
người, trong đó có loài Listeria monocytogenes là loài gây bệnh sảy thai
truyền nhiễm ở cừu và làm tăng số bạch cầu đơn nhân trong máu của nhiều
loài động vật như bò, ngựa, dê, cừu, heo, chuột, kể cả người.
Listeria monocytogenes đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật năm
1926 bởi Prior, nhưng lúc đó chưa có đủ đặc tính chính xác để xác định nó.
Năm 1927, vi sinh vật này cũng được Pirie phân lập từ gan bi bệnh của chuột
nhảy (tatera tobengulae) tại nam Châu Phi, và được đặt tên là Listeria
hepalolytica. Khi sự tồn tại của vi sinh vật này được xác minh,
L. monocytogenes chính thức được Bergay đặt tên vào năm 1957.
2.2.2 Phân bố và cách lây lan
L. monocytogenes được phân bố rất rộng rãi, nó có trong đất, nước, phân,
dịch tiết đường sinh dục và niêm mạc mũi của động vật khỏe…Rau củ có thể
nhiễm khuẩn từ đất hoặc từ phân bón. Súc vật ở nông trại có thể nhiễm khuẩn
mà không có triệu chứng gì và thực phẩm từ động vật như thịt, thịt gia cầm và
các sản phẩm sữa có thể bị nhiễm khuẩn. Theo Sở giám sát và an toàn thực
phẩm thuộc Bộ nông nghiệp, những trường hợp bệnh Listeriosis ở Mĩ đều liên
quan đến thực phẩm xúc xích nhỏ xông khói, thịt hộp tươi ngon, patê lạnh, xúc
xích Ý, pho phát mềm của Pháp, pho mát mềm kiểu Mêhicô, tôm, bơ, rau quả
tươi và sữa chưa tiệt trùng. Trận dịch bệnh bùng phát có thể liên quan đến sò
8
hến, tôm cua, cá tươi, thủy sản xông khói, lưỡi heo, kem, xà lách gạo, xà lách
cải bắp và patê thịt. Do đó, con người có nguy cơ nhiễm khuẩn
L. monocytogenes cực kỳ cao với các loại thực phẩm chưa nấu chín kỹ trước
khi ăn và các loại thức ăn làm sẵn. Bệnh thể hiện ở nhiều dạng và sự lây
truyền của vi khuẩn có khác nhau. Nếu như ở dạng phủ tạng, sự lây nhiễm qua
đường ăn uống. Nếu như ở dạng thần kinh chủ yếu lây nhiễm qua đường mắt
và mũi.
2.2.3 Hình thái
L. monocytogenes gồm những trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, Gram dương.
Trong môi trường nuôi cấy, khi tế bào còn non L. monocytogenes được tìm
thấy ở dạng trực khuẩn. Nhưng trễ hơn dạng hình cầu (0,5µm×1-2 µm) lại
chiếm ưu thế, đôi khi vi khuẩn xếp thành chuỗi ngắn (dễ nhầm với
Streptococcus), lúc này chiêm mao dài 6-20 µm. Vi khuẩn không sinh bào tử,
không tạo giáp mô, có khả năng di động. Ở 20-25oC vi khuẩn di động
mạnh nhất. Ở 37oC vi khuẩn di động nhờ một chiêm mao ở đầu. Khi nhuộm từ
mô bệnh hoặc dịch nuôi cấy, đôi khi vi khuẩn có dạng hình cầu xếp chuỗi dễ
nhầm với Streptococci. Trong trường hợp này có thể dùng phản ứng Catalase
để phân biệt. Trong 3-6 giờ ở 37oC vi khuẩn có dạng trực, nuôi cấy 3-5 ngày
vi khuẩn có dạng dài 6-20 µm hay hơn (đặc biệt chủng R). Sự di động của
Listeria dùng để phân biệt với Erysipelothrix.
2.2.4 Đặc tính nuôi cấy
Vi khuẩn có thể phát triển trong điều kiệm yếm khí. Nhiệt độ thích hợp 30-
37oC, pH 7,2-7,4 phát triển trên môi trường nhưng thường sử dụng môi trường
thạch máu trong điều kiện 5-10% CO2 cho khuẩn lạc tròn bóng, màu trắng,
đường kính 0,5-1 mm và gây dung huyết.
Trên môi trường Trytose agar tạo khóm sáng, trắng mờ và có màu xanh lam
(màu blue-green) khi quan sát dưới ánh sáng nghiêng.
Trên môi trường LSA (Listeria selective agar) tạo vòng đen quanh khóm do sự
phân giải Esculin sau 24-48 giờ.
Môi trường Gelatin không gây tan chảy.
2.2.5 Đặc tính sinh hóa
Listeria lên men chậm các loại đường như glucose, salicin, levulose. Không
lên men mannitol, xylose, lactose, saccarose. Phản ứng Catalaza dương tính.
9
2.2.6 Đặc tính gây bệnh
Khi tiến hành phân tích chẩn đoán Listeriosis và khảo sát nguồn nhiễm khuẩn
thì thấy rằng vi khuẩn này có thể tồn tại trong thời gian dài lâu có thể là 90
ngày từ khi ăn phải thực phẩm nhiễm khuẩn và xuất hiện triệu chứng. Thời
gian trung bình từ khi nhiễm khuẩn vào cơ thể đến khi phát bệnh khoảng 30
ngày. Vi khuẩn này rất bền. Nó kháng nhiệt (mặc dầu nhiệt độ không cao,
dưới 60oC), muối, nitrite và acid, sống sót ở điều kiện lạnh đông và thậm chí
có thể sinh sôi phát triển chậm chạp trong tủ lạnh (ở khoảng 4oC). Vi khuẩn bị
diệt ở 60oC trong 30 phút và 72oC trong 15 giây. Vi khuẩn đề kháng với
sự khô hạn. Có thể sống sót trong thực phẩm và đất nhưng bị diệt bởi những
chất sát trùng thông thường. Nhạy cảm với nhiều loại kháng sinh nhưng
tetracycline cho kết quả tốt nhất. Người ta có thể kết hợp giữa Trimethoprim
với Sulphamethazol trong điều trị, vi khuẩn kháng lại với Quinolones.
Erythromycine, ampicillin được dung trong điều trị bệnh cho người.
2.2.7 Khả năng lây bệnh
Trong tự nhiên vi khuẩn gây bệnh Listeriosis và ở dạng thần kinh đôi khi được
gọi là bệnh quay mòng, phổ biến nhất đối với động vật nhai lại như bò,
cừu....đặc biệt vào mùa đông và đầu mùa xuân với mọi lứa tuổi. Đối với dạng
phủ tạng thường gặp ở động vật dạ dày đơn. Bệnh có thể gây sảy thai ở ngựa.
Ngoài ra vi khuẩn còn gây bệnh cho gia cầm và cá. Ở người thường gặp sảy
thai, thai chết và viêm não. Ở vài động vật thể hiện sự gia tăng bạch cầu đơn
nhân. Trong phòng thí nghiệm: Dùng thỏ và chuột lang. Chuột nhạy cảm, chết
sau khi tiêm nhiễm 48 giờ với bệnh tích hoại tử gan. Dùng test ANTON gây
viêm kết mạc mắt.
Một bệnh do L. monocytogenes là viêm màng não mủ, hay viêm màng não
nhiễm khuẩn, là hiện tượng viêm của các màng bao bọc quanh hệ thần kinh
trung ương (não và tủy sống) do sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trong
khoang dịch não tủy. Sự viêm nhiễm này sẽ gây nên tình trạng sinh mủ
bên trong hệ thống thần kinh trung ương. Những bệnh nhân suy giảm miễn
dịch như người già, trẻ sơ sinh, bệnh nhân điều trị thuốc ức chế miễn dịch,
AIDS thường có nguy cơ bị bệnh. Viêm màng não mủ sơ sinh do tác nhân này
thường nằm trong bối cảnh nhiễm trùng huyết nặng. Các dấu hiệu nghi ngờ
trên lâm sàng là: mẹ thường có sốt, sinh non không rõ nguyên nhân, nhau thai
có tổn thương hạt...
2.2.8 Miễn dịch
Cơ thể thú có thể hình thành miễn dịch sau khi nhiễm. Miễn dịch trung gian tế
bào là chủ yếu. Hiện nay có hai loại vaccine chết và nhược độc có thể đem lại
10
kết quả. Vaccine thường sử dụng: 1a và 4b đạt kết quả phòng bệnh trên cừu.
11
CHƯƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm nghiên cứu
Thu mẫu:
- Mẫu cá: các loài cá mua từ siêu thị Big C, chợ Cái khế, chợ Tân An, chợ
Cần Thơ và trong các ao nuôi ở các tỉnh An Giang, Hậu Giang.
- Mẫu nước: thu trong ao nuôi ở các tỉnh An Giang và Hậu Giang.
- Nghiên cứu sẽ được tiến hành trên các loài cá chính như: cá rô đồng, cá tra,
cá lóc, cá diêu hồng, cá rô phi, cá hường, cá chép và các mẫu nước trong các
ao nuôi.
Phân tích mẫu: tại phòng thí nghiệm vi sinh – khoa Thủy sản – Trường Đại
Học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ thu, trữ và phân tích mẫu
Thùng giữ lạnh có nắp đậy
Khay và thớt nhựa
Túi PE tuyệt trùng
Túi gói vô trùng Whirl
Bộ đồ tiểu phẩu
Kính hiển vi nổi
Tủ sấy, tủ ấm, tủ mát
Tủ cấy vô trùng
Máy trộn mẫu (vortex)
Nồi tiệt trùng áp suất
Đĩa Petrifilm E. Coli/Coliforms Count (EC) và Đĩa Petrifilm Environment
Listeria (EL) của hãng 3M, được sản xuất tại Nhật Bản.
Pipet chia khoảng bằng nhựa 25ml (có bông hút ẩm ở đầu)
Micropipette 1ml, 5ml
Đầu ống pipet 1ml, 5ml
12
3.2.2 Hóa chất
Peptone
Cồn tuyệt đối, cồn 96o, cồn 70o
3.3 Phương pháp thu và bảo quản mẫu
• Mẫu nước:
Mẫu nước được thu trong ống nghiệm nghiệm vô trùng 10 ml, được thu tương
tự như các mẫu nước để phân tích hóa học (thu dưới mặt nước). Ghi nhận vị trí
thu mẫu trên cả hai ống mẫu.
Các mẫu sẽ được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thùng giữ lạnh (giữ
dưới 10oC), xử lí trong vòng 6-8 tiếng.
• Mẫu cá:
75 mẫu, 7 loài cá được thu gom và chứa trong túi nhựa PE. Thu ít nhất 3 mẫu
cho từng loài cá tại mỗi nơi thu mẫu. Cá được đựng chung trong 1 túi PE duy
nhất cho mỗi loài/địa điểm. Khi xử lí cá, nên đeo găng tay, phun cồn 70o, lau
bằng khăn giấy khô để giảm ô nhiễm chéo vi khuẩn giữa các mẫu cá. Ghi nhận
vị trí thu mẫu trên cả hai túi mẫu.
Các mẫu được vận chuyển đến phòng thí nghiệm trong thùng giữ lạnh (giữ
dưới 10oC), xử lí trong vòng 6-8 tiếng.
3.4 Phương pháp phân tích mẫu
Mẫu cá: cắt 2,5-3g thịt cá cho vào túi vô trùng Whirl, cho tiếp vào đó 5ml
dung dịch peptone đã được chuẩn bị trước với nồng độ 1% và được tuyệt trùng
ở 121oC trong 20 phút. Túi mẫu được để vào máy lắc khoảng 5 phút.
Cấy vi khuẩn được tiến hành các bước sau cho cả mẫu cá và mẫu nước:
- Lắc trộn đều mẫu bằng máy trộn mẫu khoảng 7 giây.
- Dùng micropipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml peptone thứ
nhất (nồng độ 10-1). Lắc đều ống nghiệm.
- Thay đầu col trên pipet, chuyển 1ml dung dịch từ ống nghiệm thứ nhất sang
ống nghiệm thứ hai (nồng độ 10-2). Lắc đều ống nghiệm.
- Cấy vi khuẩn E. coli và Coliforms dùng micropipet vô trùng lấy 0.1 ml mẫu
ở mỗi nồng độ pha loãng, kể cả nồng độ 100, cho vào đĩa petrifilm EC. Đối với
vi khuẩn Listeria lấy 0.2ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng, kể cả nồng độ 100,
cho vào đĩa petrifilm EL (đậy đĩa từ từ tránh bọt khí).
13