Đánh giá hiệu quả một số phương pháp thu nhận xương khử khoáng từ mô xương người
- 83 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
LÊ CHÍ LINH
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
THU NHẬN XƯƠNG KHỬ KHOÁNG
TỪ MÔ XƯƠNG NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
LÊ CHÍ LINH
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
THU NHẬN XƯƠNG KHỬ KHOÁNG
TỪ MÔ XƯƠNG NGƯỜI
NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI)
MÃ SỐ: 8720101
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HUỲNH DUY THẢO
TS. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự
hướng dẫn khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc
Vương. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét,
đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong
phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận
xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều
có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung luận văn của mình.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20/10/2021
Tác giả luận văn
LÊ CHÍ LINH
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AATB American Association of Tissue Banks
AFFs Atypical Femur Fractures
BMP Bone Morphogenetic Protein
CS Cộng sự
EDTA Ethylene – Diamine Tetraacetic Acid
FDA Food and Drug Administration
FGF Fibroblast Growth Factor
GAG Glycosaminoglycan
H&E Hematoxylin & Eosin
IGF Insulin – like Growth Factor
MHC Major Histocompatibility Complex
OP Osteogenic Protein
PDGF Platelet Derived Growth Factor
PMMA Poly Methyl Methacrylate
SEM Scanning Electron Microscope
TGF Transforming Growth Factor
XKK Xương khử khoáng
.
.I
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Phân loại độc tính của dịch chiết vật liệu lên tế bào .............................. 31
Bảng 2.2 Phân loại mức phản ứng của tế bào khi tiếp xúc trực tiếp với vật liệu .. 32
Bảng 3.1 Thời gian pha khử khoáng trung bình của ba phương pháp ................... 35
Bảng 3.2 Khối lượng và tỉ lệ chất chiết rút trong quá trình khử khoáng ............... 36
Bảng 3.3 Hàm lượng calci và phospho được chiết rút ........................................... 37
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo xương sọ ................................................................................... 3
Hình 1.2. Các loại tế bào xương............................................................................. 6
Hình 1.3. Quá trình liền xương .............................................................................. 7
Hình 2.1. Mảnh xương sọ trước và sau khi cắt nhỏ ............................................... 27
Hình 2.2. Mẫu xương sọ ngâm trong dung dịch khử khoáng ................................ 28
Hình 2.3. Thử nghiệm đánh giá tiến trình khử khoáng .......................................... 28
Hình 2.4. Thử nghiệm độc tính lâu dài của vật liệu với tế bào .............................. 33
Hình 3.1. Các mẫu xương trước, trong và sau khi hoàn tất khử khoáng ............... 38
Hình 3.2. Kết quả thực hiện nhuộm mô học .......................................................... 39
Hình 3.3. Tế bào trong chai nuôi trước và sau khi tiếp xúc với dịch chiết vật liệu 41
Hình 3.4. Tế bào trong chai nuôi trước và sau khi tiếp xúc với vật liệu ................ 42
Hình 3.5. Nuôi tế bào trên giá thể xương khử khoáng ........................................... 43
.
.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................ Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Mô xương sọ và sự lành xương ...................................................................................... 3
1.2. Ghép xương và vật liệu ghép xương .............................................................................. 9
1.3. Tổng quan về xương khử khoáng .............................. Error! Bookmark not defined.5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 25
2.3. Phân tích số liệu ........................................................................................................... 33
2.4. Vấn đề y đức trong nghiên cứu .................................................................................... 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 35
3.1. Đánh giá thời gian khử khoáng của từng phương pháp. .............................................. 35
3.2. Đánh giá hiệu quả khử khoáng xương ......................................................................... 36
3.3. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng của xương khử khoáng thu được ................... 40
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................................. 45
4.1. Đánh giá phương pháp thu nhận xương khử khoáng từ mô xương sọ người .............. 45
4.1.1. Thời gian khử khoáng xương (tốc độ khử khoáng) .................................................. 46
4.1.2. Hiệu quả khử khoáng xương ..................................................................................... 46
4.1.3.Mức độ toàn vẹn cấu trúc xương ............................................................................... 47
4.2. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng của xương khử khoáng thu được ................... 50
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 53
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Mô xương là một trong những loại mô trong cơ thể có đ c tính tự chữa
lành, tuy nhiên trong những khuyết xương lớn thì quá trình lành xương rất khó xảy
ra nếu không có các biện pháp can thiệp để giúp quá trình liền xương xảy ra. Ghép
xương là một trong những phương pháp phổ biến để điều trị các tổn thương dẫn đến
khuyết xương.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng mô xương ghép để điều trị trong các trường hợp
khuyết hổng xương ho c các bệnh l dẫn đến tổn thương xương là rất lớn. Các loại
mô xương ghép tự thân, đồng loài, dị loài đ được sử dụng để đáp ứng nhu cầu ghép
xương ngày càng gia tăng của người bệnh. Tuy nhiên, các loại mô xương ghép hiện
tại vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của người bệnh. M t khác, việc
sử dụng các mô xương kể trên đều có những ưu nhược điểm nhất định.
Ghép xương tự thân là phương pháp phổ biến nhất và được xem là tiêu chu n
vàng trong ghép xương. Xương ghép tự thân là một nguồn xương ghép tự nhiên rất
hữu dụng, tuy nhiên trong nhiều trường hợp không đáp ứng đủ số lượng xương
ghép trên lâm sàng cũng như còn nhiều điểm hạn chế như không cung cấp đủ số
lượng xương khi cần thể tích xương ghép lớn, ghép xương nhiều lần, phải thực hiện
thêm các phẫu thuật thu nhận xương, do đó kéo dài thời gian phẫu thuật và có thể
dẫn đến các biến chứng đau, nhiễm tr ng, sẹo, mất máu.
Từ đó đ t ra nhu cầu cho các nhà nghiên cứu, các nhà lâm sàng phải chế tạo ra
nhiều loại vật liệu có khả năng d ng để ghép thay mô xương. Hiện có rất nhiều loại
vật liệu ghép thay xương đ được nghiên cứu và phát triển, từ các vật liệu ghép
xương có nguồn gốc tự nhiên đến các loại vật liệu tổng hợp nhân tạo. Các loại vật
liệu này trước hết phải có tính tương hợp sinh học, phải có khả năng cảm ứng và
kích ứng tạo xương, có độ bền cơ học để có thể đảm nhận được vai trò vật l của
mô xương và cuối c ng là có đ c tính thoái biến sinh học để chuyển hóa thành mô
xương chủ.
Một trong những vật liệu sinh học được sử dụng rất phổ biến trong ghép thay
xương là xương khử khoáng, được chế tạo từ xương người (là nguồn xương ghép
.
.
đồng loài rất quan trọng) ho c từ xương động vật (xương dị loài). Đây là loại vật
liệu sinh học có nguồn gốc tự nhiên, có hiệu quả rất cao trong việc cảm ứng và kích
ứng xương [111]. Đ c biệt hiệu quả trong những trường hợp làm đầy các khuyết
hổng xương [58 .
Xương khử khoáng được tạo ra từ các mẫu xương của người hiến, sau khi trải
qua quá trình khử khoáng thì còn lại chủ yếu là khung xương (bao gồm các thành
phần hữu cơ, các yếu tố cảm ứng và kích ứng tạo xương) [100,117 . Đây là những
thành phần chủ yếu tham gia tái tạo nên xương mới ở người nên xương khử khoáng
có một vai trò quan trọng và tiềm năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực chế tạo
xương ghép. Do đó, xương khử khoáng được xem là nguồn vật liệu ghép thay
xương hiệu quả và tiềm năng chỉ đứng sau xương ghép tự thân [36,39,47 .
M c d tiềm năng và ứng dụng của xương khử khoáng trên lâm sàng đ được
chứng minh rộng rãi, các nghiên cứu về xương khử khoáng đ được thực hiện
nghiên cứu khắp các phòng thí nghiệm trên thế giới và đ tạo ra được nhiều sản
ph m thương mại được phân phối trên thị trường xương ghép. Tuy nhiên, ở Việt
Nam tình hình nghiên cứu về xương khử khoáng còn rất hạn chế, chưa có nhiều sản
ph m được đưa ra thị trường ho c đưa vào sử dụng trên lâm sàng d nguồn nguyên
liệu khá phong phú ở các ngân hàng mô.
Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: Đánh giá hiệu
quả một số phương pháp thu nhận xương khử khoáng từ mô xương người với các
mục tiêu sau.
Mục tiêu nghiên cứu
1. Đánh giá hiệu quả một số phương pháp thu nhận nguồn xương khử
khoáng từ các mảnh xương sọ người.
2. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng đối với xương khử khoáng d ng
làm vật liệu ghép xương.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. M ng sọ v s l n ng
1.1.1. Cấu t o m ọc mô ng sọ
Xương sọ gồm: hai bản xương đ c thuộc loại xương cốt mạc được gọi là bản
ngoài và bản trong, nằm ở m t ngoài và m t trong tấm xương sọ, giữa hai bản
xương là lớp xương Havers xốp. Phía m t ngoài của bản ngoài xương vòm sọ là
màng liên kết, lót m t trong bản trong là màng cứng [5 .
Xương đ c
Màng xương
Xương Haver
xốp
Hình 1.1. Cấu t o ng sọ [26]
1.1.1.1. Thành phần vô cơ
Tích lũy chất vô cơ là đ c điểm nổi bật của mô xương so với phần lớn các mô
xương khác của cơ thể. Khoáng chất chủ yếu của chất nền xương gồm calci và
phospho, nhưng ngoài ra cũng có bicarbonat, citrat, magnesium, kali, natri và nhiều
chất khác. Phần lớn calci và phospho hợp thành các tinh thể hydroxyapatite
Ca10(PO4)6(OH)2 có dạng tấm 40x25x3nm phân bố dọc theo các vi sợi collagen.
Chất nền xương cũng chứa nước nhưng với tỉ lệ thấp hơn các mô liên kết khác,
phần lớn nước của chất nền xương ở hình dạng có cấu trúc, hình thành các lớp vỏ
bao quanh các tinh thể chất khoáng (lớp vỏ hydrat hoá). Lớp nước này giúp cho
việc trao đổi chất khoáng dự trữ trong chất nền xương với chất khoáng lưu hành
trong thể dịch được dễ dàng. Do chứa lượng lớn muối vô cơ trong chất nền, mô
xương có tỉ trọng cao hơn các mô mềm, rất rắn và cản quang tia X.
.
.
1.1.1.2. Thành phần hữu cơ
Chất nền xương chứa collagen, chất căn bản vô định hình với các phức hợp
proteoglycan và nhiều loại glycoprotein khác nhau. Collagen của xương thuộc loại I
nhưng không tạo thành các sợi, chỉ hình thành các vi sợi (fibril). Mạng vi sợi
collagen kết hợp với hydroxyapatite quyết định đ c tính vừa cứng chắc lại vừa đàn
hồi của mô xương. Một số ngân hàng mô áp dụng kỹ thuật chế tạo mô ghép xương
thông qua khử khoáng, xương khử khoáng hoàn toàn vẫn giữ được hình dạng ban
đầu của mô xương nhưng trở nên mềm và đàn hồi. M t khác, mô xương ghép do
ngân hàng mô chế tạo thường được khử khu n bằng tia gamma, tia này có tác dụng
cắt đứt các mạch collagen, vì vậy nếu mô ghép bị chiếu xạ quá liều, sẽ trở nên giòn,
dễ g y. Proteoglycan trong chất nền xương chiếm tỉ lệ ít hơn so với chất nền sụn.
Proteoglycan là các phức hợp phân tử lớn với các phân tử protein lõi kết hợp thành
một trục ở giữa, các phân tử glycosaminoglycan (GAG) mạch thẳng với protein lõi
ở một đầu, đầu kia hướng ra phía ngoài khiến cho cả phức hợp chiếm không gian
lớn. Trong số các GAG của xương, ngoài keratan sulfate là loại thường hay đi kèm
với collagen loại I, ta thấy trong xương có nhiều chondroitin 4-sulfat là loại GAG
thường do tế bào sụn sản xuất ra. Glycoprotein trong chất nền xương có nhiều loại.
Thành phần này tuy ít nhưng rất đáng quan tâm vì chúng có tác dụng không chỉ là
protein cấu trúc mà còn có nhiều hoạt tính chức năng khác nhau. Ví dụ như
osteocalcin có chứa nhiều gốc γ-carboxyglutamate có ái lực liên kết mạnh với Ca2+
và có chức năng hỗ trợ quá trình khoáng hoá chất nền. Gần đây, ngày càng có nhiều
bằng chứng phát hiện nhiều các cytokine khác nhau có trong chất nền xương.
Cytokine là các phân tử protein có hoạt tính thông tin liên tế bào, chúng tương tác
với tế bào đích qua thụ thể đ c hiệu trên màng tế bào và điều khiển các hoạt động
của nhân và bào tương, gây ra tác động hoạt hóa hay ức chế, chuyển dạng, thay đổi
định hướng biệt hóa của các tế bào; các yếu tố này thường tác dụng cận tiết
(paracrine, protein có tế bào đích nằm ngay trong mô, gần nơi tế bào sản xuất ra
nó), tự tiết (autocrine, protein có thụ thể ngay trên màng bào tương của chính tế bào
.
.
đ sản xuất ra nó), liên cận tiết (juxtacrine, protein vừa gắn trên m t tế bào đ sản
xuất ra nó, vừa tác dụng lên thụ thể trên tế bào nằm bên cạnh đó).
Tuy nhiên, cytokine cũng có thể lưu thông trong hệ tuần hoàn và tác dụng như
chất nội tiết (endocrine). Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy chất nền của xương là
kho dự trữ nhiều họ cytokine khác nhau như TGF-β (siêu họ bao gồm cả activin và
BMP), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor),
FGF (Fibroblast Growth Factor) ... Nhiều phân tử trong số này ở dạng liên kết và
không có hoạt tính nhưng khi chất nền phân hủy một phần, tác dụng của chúng mới
thể hiện. Trong các loại cytokine này thì cytokine đ được nghiên cứu nhiều nhất là
các phân tử BMP (Bone Morphogenic Protein) hay gần đây còn gọi là OP
(Osteogenic Protein). BMP có tác dụng thu hút các tế bào trung mô và biệt hoá các
tế bào này thành các tạo cốt bào. Mô ghép xương đồng loại được khử khoáng và
giảm chất nền đúng cách (thủy phân một phần ở nhiệt độ thấp, môi trường chống
oxy hoá, dùng acid rút calci phosphat) có thể vẫn giữ được hoạt tính BMP. Nhờ quá
trình khử khoáng và giảm chất nền, các phân tử này được bộc lộ ra và có thể hoạt
hoá quá trình tạo xương mới theo cơ chế kích tạo xương.
Đến 1996, đ tìm ra trên 12 loại BMP, trừ BMP-1, còn tất cả đều thuộc siêu họ
TGF-β (Transforming Growth Factor). Đây là loại glycoprotein có phân tử lượng
tương đối thấp (dimer 32-36 kD), khá kỵ nước, rất dễ bị oxy hoá, nhạy cảm với
nhiệt. Polypeptide khi mới tổng hợp khá lớn, sau đó bị cắt đứt đi khoảng 2/3 từ phía
đầu N. Miền C có cấu trúc bảo tồn, chứa 100 gốc acid amin, trong đó có 7 gốc
cystein. BMP được thấy nhiều trong các khối u xương sụn, chúng được cho là tham
gia kích thích tân sản mô xương – sụn, ngược lại đột biến mất gien BMP hay thụ thể
của chúng cũng đ được tìm ra là có mối liên quan đến một số dị tật b m sinh của
cơ quan vận động.
.
.
1.1.1.3. Các tế bào của mô xương:
Vi
nhung
mao
Tiền tạo cốt bào Tạo cốt bào Cốt bào Hủy cốt bào
Hình 1.2. Các lo i tế b o ng [5]
+ Tiền tạo cốt bào (osteoprogenitor cells): là những tế bào trung mô, thường
xuất hiện trên m t xương, lớp trong của màng xương. Bào tương tế bào nhạt màu,
nhân hình trứng. Trong quá trình tạo xương, tiền tạo cốt bào phân chia và biệt hóa
để trở thành tạo cốt bào [5,26 .
+ Tạo cốt bào (osteoblast): là những tế bào hình đa diện ho c hình lăng trụ, có
nhánh bào tương nối với nhau ho c nối với tế bào sợi nằm trong tủy xương. Tạo cốt
bào xuất hiện ở nơi cần tạo xương, thường chúng xếp thành một hàng trên m t các
bè xương đang hình thành tạo ra nền protein, tổng hợp collagen và gián tiếp tham
gia làm lắng đọng các muối khoáng trên nền đó. Ngoài ra, tạo cốt bào sản xuất các
yếu tố điều chỉnh tham gia quá trình tái tạo xương như là: các protein hình thái
xương (Bone Morphogenetic Protein - BMP), yếu tố tăng cường chuyển dạng β
(Transforming Growth factor – β, TGF – β), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
(bFGF), yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu (FDGF). Tạo cốt bào cũng có vai trò
trong sự huỷ xương [5,26 .
+ Cốt bào (osteocyte): thân tế bào nằm trong ổ xương, các nhánh bào tương
nằm trong vi quản xương nối với các nhánh bào tương của các tế bào bên cạnh. Tế
bào xương giữ vai trò quan trọng trong sự trao đổi calci giữa xương và dịch ngoại
bào do tiết ra osteocalcin. Các tế bào xương có nguồn gốc từ tạo cốt bào, không có
khả năng sinh sản, chúng hoạt động như những bộ phận nhận cảm của xương để
cảm nhận và khởi động quá trình tái tạo xương [5,26 .
+ Hủy cốt bào (osteoclast): là tế bào chính tham gia vào quá trình huỷ xương,
nguồn gốc từ tủy xương theo máu tới mô xương. Huỷ cốt bào có kích thước lớn (80
.
.
μm), nhiều nhân (50 – 60 nhân), nhân hình cầu, bào tương có nhiều lysosome chứa
enzyme để tiêu huỷ các sợi collagen của khuôn hữu cơ và tiết các acid làm hoà tan
muối calci. Hủy cốt bào có các vết lõm siêu vi, các vi nhung mao ăn sâu vào chất
căn bản để giúp tế bào gắn ch t vào bề m t xương đ được calci hoá và tạo ra các
khoảng Howship do hoạt động huỷ xương tạo thành [5,26,87,107].
1.1.1.4. Tủy xương
Tủy xương sọ là loại tủy đỏ nằm trong hốc tủy ở v ng xương xốp, nhiều mao
mạch kiểu xoang, được cung cấp và dẫn lưu bởi một số lượng lớn động mạch, tĩnh
mạch ở m t trong và m t ngoài của xương sọ [5 .
1.1.1.5. Màng xương sọ
Màng xương sọ là màng liên kết, có nhiều mao mạch máu. Màng xương cũng
có khả năng sinh xương do có nhiều tiền tạo cốt bào nhưng khả năng tạo xương yếu
hơn so với ở xương dài [5,26 .
1.1.2. S liền ng
1.1.2.1. i n xương sinh
Khi xương bị g y, diễn biến quá trình liền xương là một quá trình phức tạp,
liên quan nhiều yếu tố, từ mức phân tử, tế bào tới v ng tổn thương và toàn bộ cơ
thể. Về m t mô học, quá trình liền xương g y thường diễn ra theo bốn giai đoạn:
viêm, tạo can xương, sửa chữa can xương và hồi phục hình thái xương [5,87].
Hình 1.3. Quá trìn liền ng [87]. (I). Giai đoạn viêm, (II). Giai đoạn tạo can
xương, (III). Giai đoạn sửa chữa can xương, (IV). Giai đoạn hồi phục hình thái
xương.
.
.
- Giai đoạn viêm: xuất hiện ngay sau khi xương g y, kéo dài trong khoảng 3
tuần, đỉnh điểm là ngày thứ 3 tới ngày thứ 5 sau chấn thương. Lực tác động làm g y
xương sẽ đồng thời làm tổn thương cả mạch máu ở màng xương và tủy xương dẫn
tới hoại tử các tế bào tại ổ g y, các tế bào này sẽ giải phóng các yếu tố hoạt hóa
thành mạch gây tăng quá trình gi n mạch và th m thấu thành mạch, do đó tăng lưu
lượng máu tới ổ g y. Trên nền của cục máu đông hình thành từ các tế bào viêm, các
nguyên bào sợi xuất hiện tạo ra collagen dần thay thế cục máu đông bằng tổ chức
hạt [5,87].
- Giai đoạn tạo can xương:
+ Hình thành can xương mềm: diễn ra trong 1 - 3 tuần đầu, giai đoạn này
nhiều mạch máu tân tạo được tạo ra bởi các tế bào gốc tủy xương. Các tế bào trung
mô xâm nhập vào v ng tổn thương và biệt hóa t y thuộc vào điều kiện tại chỗ như:
nồng độ oxy tổ chức, sức căng gi n và các yếu tố kích thích phát triển tại chỗ. Sức
căng gi n tại chỗ sẽ hoạt hóa tế bào gốc biệt hóa thành các nguyên bào sợi. Ở những
nơi có nồng độ oxy thấp và căng gi n thường xuyên, các tế bào gốc sẽ biệt hóa
thành các nguyên bào sụn (chondrocyte), sau đó các can sụn sẽ tạo cầu nối giữa hai
đầu xương g y, cũng chính các can sụn này sẽ làm giảm độ căng gi n và dẫn tới sự
liền xương. Tiền tạo cốt bào sẽ tăng sinh nhanh chóng ở môi trường giàu oxy và ít
bị căng gi n cơ học, những v ng này tạo nên can xương cứng trực tiếp. Can xương
mềm được tạo ra nhờ sự biến đổi từ tổ chức hạt sang tổ chức calci hoá tạm thời, bao
gồm các tạo cốt bào và nguyên bào sụn c ng hệ thống các sợi collagen, các chất
gian bào dạng xương và sụn. Sự khoáng hóa can xương mềm xuất hiện đầu tiên ở
chỗ tiếp giáp giữa các đầu xương g y, tuần tự từ đầu này sang đầu kia của ổ g y cho
đến khi hai đầu xương g y được nối liền nhau. Can xương ở giai đoạn này rất mềm
và dễ g y [5,87].
+ Hình thành can xương cứng: can xương mềm tiếp tục phát triển, các tế bào
sụn c ng hệ thống sợi collagen có sự lắng đọng calci tạo môi trường cho các tế bào
gốc đi vào biệt hóa thành các nguyên bào xương, các tế bào này biến đổi sụn đ
.
.
khoáng hóa thành các bè xương cứng sắp xếp dọc theo các vi quản. Sự cốt hoá tạo
thành các bè xương cứng đảm bảo nối liền ổ g y vững chắc [5,87].
- Giai đoạn sửa chữa can xương: quá trình này hồi phục cấu trúc sinh học cho
xương. Dưới sự tác động của các lực cơ học, tổ chức can xương tại đây có sự thay
đổi về hình thái để thích hợp với chức năng của xương. Sự sửa chữa được thực hiện
bởi các đơn vị tái tạo xương (bone modelizing unit - BMU) gồm có các huỷ cốt bào,
tạo cốt bào và diễn ra theo một trình tự được l p đi l p lại [5,87].
- Giai đoạn hồi phục hình thái xương: Giai đoạn này có thể kéo dài từ một đến
nhiều năm, ở người lớn không thể hồi phục như hình thái ban đầu [5,87].
1.2. G p ng v vật li u g p ng
Mô ghép xương tự thân, đồng loại hay dị loại, xương vỏ hay xương xốp đều bị
chuyển hoá trong một chuỗi các quá trình sinh học có những đ c điểm chung và
những điểm khác biệt.
1.2.1. Các k ái ni m c ung
Sự xâm nhập (incorporation) là quá trình xương chủ liền vào xương ghép, tạo
thành các v ng lõm của xương chủ (mô sống) xâm lấn vào xương ghép (mô chết)
và dần dần thay thế nó. Quá trình thay thế bao gồm sự sinh xương mới và sự hủy
xương ghép.
Sự tiêu xương (bone resorption) được thực hiện bởi các huỷ cốt bào tiết ra các
enzyme (như acid phosphatase) phân huỷ chất căn bản xương. Sự sinh xương mới
(osteogenesis) do các tạo cốt bào thực hiện, các tế bào này tổng hợp ra các thành
phần của chất nền và gây lắng đọng muối calci lên đó, tạo thành chất căn bản
xương.
Quá trình sinh xương mới được thực hiện dọc theo các đường hầm do hủy cốt
bào tạo ra khi hủy xương ho c các khoảng trống của tủy xương và các kênh Havers
sẵn có trong xương. Do đ c điểm này, quá trình này được gọi là sự thay thế bò
trườn (creeping substitution). Quá trình xây dựng xương mới thay thế xương ghép
có hai quá trình chính là sự kích ứng xương và sự dẫn nhập xương.
.
0.
Kích ứng xương (osteoinduction) là quá trình biệt hoá các tế bào trung mô
dạng tương tự như nguyên bào sợi thành các hủy cốt bào, tạo cốt bào và các nguyên
bào sụn, dưới tác dụng của các cytokine như BMP trong chất nền của xương ghép.
Dẫn nhập xương (osteoconduction) là quá trình di cư của các tế bào đầu dòng
xương (osteoprogenitors) từ mô xương chủ vào các khoảng trống trong mảnh ghép.
Quá trình dẫn nhập xương xảy ra tương đối thụ động, phụ thuộc vào cấu trúc xốp
của mảnh ghép, sự cung cấp chất dinh dưỡng của xương chủ tại nền ghép và sự tiếp
xúc ch t chẽ của mảnh ghép với nền ghép. Ngoài ra, trong trường hợp ghép xương
có cuống (kèm theo mạch máu nuôi), nguyên bào xương còn sống sót trong mảnh
ghép có thể đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng xương mới, cơ chế này có
thể gọi là cơ chế tạo xương (osteoproduction).
Mô xương mới hình thành sẽ được tái cấu trúc và tự nắn chỉnh (remodelling)
thông qua các quá trình hủy xương và sinh xương thứ cấp. Quá trình tự nắn chỉnh
xương được thực hiện theo định luật Wolf, sau thời gian dài sẽ dẫn đến hình thái
của xương hài hoà với tổng hợp các lực cơ học tác dụng lên xương.
1.2.2. Vật li u g p ng t n iên
1.2.2.1. Ghép xương t thân
Một mẫu xương ghép được thu nhận từ một vị trí trên cơ thể và được cấy ghép
vào một vị trí khác trên cùng cơ thể người bệnh được gọi là ghép xương tự
thân [87 . Với việc sở hữu các đ c tính tương hợp sinh học, khả năng dẫn tạo
xương, cảm ứng và kích ứng tạo xương nên xương ghép tự thân có thể tích hợp vào
xương chủ nhanh và hoàn toàn. Do đó, mô xương ghép tự thân được coi là tiêu
chu n vàng trong điều trị khuyết tật xương và làm mẫu xương chu n trong việc
đánh giá các mảnh ghép xương khác và vật liệu thay thế. Tuy nhiên, những nhược
điểm của ghép xương tự thân đ được báo cáo rộng r i liên quan nhiều đến quá
trình lấy mảnh ghép, bao gồm biến chứng và đau tại chỗ lấy xương, gây mất máu,
tăng thời gian phẫu thuật, khả năng nhiễm khu n tại chỗ lấy xương và khối lượng
xương lấy được hạn chế [24,60,88].
.
1.
G p ng ốp t t n là hình thức ghép xương tự thân được sử dụng phổ
biến nhất. Xương xốp chứa ít tạo cốt bào và tế bào xương nhưng lại có rất nhiều tế
bào gốc trung mô giúp duy trì khả năng tạo xương mới mạnh mẽ từ mảnh
ghép [12,102 . Ngoài ra, diện tích bề m t lớn của mảnh ghép tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình tái tạo mạch máu và kết hợp mảnh ghép với xương chủ. Các protein
có nguồn gốc từ mảnh ghép cũng được bảo tồn và hiện diện khi các mảnh ghép
được xử l thích hợp [60 . Trong giai đoạn đầu ghép xương tự thân, khối máu tụ và
viêm được hình thành nhanh chóng, các tế bào gốc trung mô tạo thành mô
hạt. Trong khi đó, các mô ghép hoại tử đang dần bị loại bỏ bởi các đại thực bào và
quá trình tân tạo mạch máu cũng xảy ra. Tiếp theo, các đường nối của xương được
tạo ra bởi tạo cốt bào xung quanh mô hoại tử, điều này xảy ra đồng thời với sự hình
thành xương mới bởi các tế bào tích lũy trong xương được cấy ghép [60,88]. Quá
trình này, dẫn đến việc tái hấp thu và thay thế hoàn toàn mảnh ghép, thường mất
khoảng 6 - 12 tháng [15].
G p ng c t thân sở hữu tính toàn vẹn cấu trúc tuyệt vời và hỗ trợ cơ
học tốt nhưng số lượng tiền tạo cốt bào hạn chế [88]. Không giống như mô xương
xốp tự thân, sự thay thế mảnh ghép xương đ c chủ yếu được điều hòa bởi các hủy
cốt bào sau khi hình thành khối máu tụ và phản ứng viêm trong giai đoạn đầu tái tạo
xương, quá trình phân huỷ sinh học và tái cấu trúc bị cản trở bởi kết cấu dày
đ c. Do đó, sự phát triển xương trên lõi hoại tử là phương tiện chủ yếu kết hợp với
mảnh xương ghép [50]. Quá trình này có thể mất nhiều năm, t y thuộc vào kích
thước mảnh ghép và vị trí cấy ghép [60 .
1.2.2.2. Ghép xương ng oài
Ghép xương đồng loài là thu nhận mô xương ghép từ người hiến, mẫu xương
này sau đó được xử l để tạo ra mô ghép xương và ghép lại cho người bệnh
[88 . Xương đồng loài được coi là phương pháp thay thế tốt nhất cho xương ghép tự
thân và đ được sử dụng hiệu quả trên lâm sàng, đ c biệt là đối với những bệnh
nhân chậm lành xương, không lành xương sau khi g y xương [12 . Xương đồng loài
được xử l , tạo hình ph hợp do đó có sẵn ở nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm
.
2.
các dẫn xuất xương đ c, xương xốp và xương hạt (như xương khử khoáng) [88] do
đó rất đa dạng, phong phú và có tính sẵn có để tiến hành ghép xương. So với xương
tự thân, xương đồng loài được xem là vật lạ và tỷ lệ đào thải ghép cao hơn vì có thể
kích hoạt các phức hợp kháng nguyên tương hợp mô (MHC) [98 dẫn đến các phản
ứng thải loại mảnh ghép. Cơ chế chính xác của phản ứng miễn dịch trong việc ghép
xương đồng loài chưa được hiểu một cách rõ ràng. Các nghiên cứu đ phát hiện ra
rằng có thể hạn chế phản ứng thải ghép xương đồng loài, giảm khả năng tạo đáp
ứng miễn dịch bằng cách chọn lựa các mẫu xương ghép đồng loại có ít khác biệt về
kháng nguyên tương hợp mô. Một vấn đề khác là nguy cơ lây truyền virus từ mảnh
ghép, nguy cơ này đ được cải thiện đáng kể nhờ sự phát triển của các ngân hàng
mô hiện đại [60] và cải tiến công nghệ xử l [112 . Do những đ c điểm trên, việc áp
dụng xương tươi đồng loài bị hạn chế hơn so với xương khô đồng loài sau quá trình
xử l và bảo quản trước khi cung cấp để ứng dụng ghép trên lâm sàng.
X ng k ử k oáng là một loại xương đồng loài được sử dụng rất phổ biến
sau khi tr i qua quá trình xử l để loại bỏ đi ít nhất 40% hàm lượng chất khoáng của
xương bằng một số loại hóa chất như dung dịch acid (nồng độ thấp), trong khi các
thành phần khác như collagen, protein không collagen và các yếu tố tăng trưởng
vẫn còn lại trong sản ph m xương khử khoáng [13,74,106]. Tính toàn vẹn cấu trúc
và tính chất cơ học của xương khử khoáng kém do đó sản ph m xương khử khoáng
chủ yếu được áp dụng trên lâm sàng để lấp đầy các khuyết hổng xương [35 . Khả
năng tái tạo xương của xương khử khoáng là tạo ra khung xương để dẫn tạo xương
và kích thích tạo xương mới [60 . Đ c tính kích thích tạo xương của xương khử
khoáng chủ yếu là do các yếu tố tăng trưởng còn giữ lại sau quá trình khử
khoáng. Phần lớn xương khử khoáng trên thị trường thường sử dụng acid
chlohydric (nồng độ trong khoảng 0,5 - 0,6 M) làm dung dịch khử khoáng. Ghép
xương khử khoáng tương tự như ghép xương tự thân với các yếu tố tăng trưởng
kích hoạt sự tạo xương dẫn đến sự hình thành xương mới tại vị trí ghép xương [60].
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
LÊ CHÍ LINH
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
THU NHẬN XƯƠNG KHỬ KHOÁNG
TỪ MÔ XƯƠNG NGƯỜI
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
LÊ CHÍ LINH
ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP
THU NHẬN XƯƠNG KHỬ KHOÁNG
TỪ MÔ XƯƠNG NGƯỜI
NGÀNH: KHOA HỌC Y SINH (MÔ PHÔI)
MÃ SỐ: 8720101
LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. HUỲNH DUY THẢO
TS. TRẦN NGUYỄN QUỐC VƯƠNG
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021
.
.
.
.
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, được sự
hướng dẫn khoa học của TS. Huỳnh Duy Thảo và TS. Trần Nguyễn Quốc
Vương. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực.
Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét,
đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong
phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận
xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều
có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung luận văn của mình.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 20/10/2021
Tác giả luận văn
LÊ CHÍ LINH
.
.
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AATB American Association of Tissue Banks
AFFs Atypical Femur Fractures
BMP Bone Morphogenetic Protein
CS Cộng sự
EDTA Ethylene – Diamine Tetraacetic Acid
FDA Food and Drug Administration
FGF Fibroblast Growth Factor
GAG Glycosaminoglycan
H&E Hematoxylin & Eosin
IGF Insulin – like Growth Factor
MHC Major Histocompatibility Complex
OP Osteogenic Protein
PDGF Platelet Derived Growth Factor
PMMA Poly Methyl Methacrylate
SEM Scanning Electron Microscope
TGF Transforming Growth Factor
XKK Xương khử khoáng
.
.I
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Phân loại độc tính của dịch chiết vật liệu lên tế bào .............................. 31
Bảng 2.2 Phân loại mức phản ứng của tế bào khi tiếp xúc trực tiếp với vật liệu .. 32
Bảng 3.1 Thời gian pha khử khoáng trung bình của ba phương pháp ................... 35
Bảng 3.2 Khối lượng và tỉ lệ chất chiết rút trong quá trình khử khoáng ............... 36
Bảng 3.3 Hàm lượng calci và phospho được chiết rút ........................................... 37
.
.
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu tạo xương sọ ................................................................................... 3
Hình 1.2. Các loại tế bào xương............................................................................. 6
Hình 1.3. Quá trình liền xương .............................................................................. 7
Hình 2.1. Mảnh xương sọ trước và sau khi cắt nhỏ ............................................... 27
Hình 2.2. Mẫu xương sọ ngâm trong dung dịch khử khoáng ................................ 28
Hình 2.3. Thử nghiệm đánh giá tiến trình khử khoáng .......................................... 28
Hình 2.4. Thử nghiệm độc tính lâu dài của vật liệu với tế bào .............................. 33
Hình 3.1. Các mẫu xương trước, trong và sau khi hoàn tất khử khoáng ............... 38
Hình 3.2. Kết quả thực hiện nhuộm mô học .......................................................... 39
Hình 3.3. Tế bào trong chai nuôi trước và sau khi tiếp xúc với dịch chiết vật liệu 41
Hình 3.4. Tế bào trong chai nuôi trước và sau khi tiếp xúc với vật liệu ................ 42
Hình 3.5. Nuôi tế bào trên giá thể xương khử khoáng ........................................... 43
.
.
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................ Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................... Error! Bookmark not defined.
1.1. Mô xương sọ và sự lành xương ...................................................................................... 3
1.2. Ghép xương và vật liệu ghép xương .............................................................................. 9
1.3. Tổng quan về xương khử khoáng .............................. Error! Bookmark not defined.5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 25
2.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................................. 25
2.2. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 25
2.3. Phân tích số liệu ........................................................................................................... 33
2.4. Vấn đề y đức trong nghiên cứu .................................................................................... 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................................... 35
3.1. Đánh giá thời gian khử khoáng của từng phương pháp. .............................................. 35
3.2. Đánh giá hiệu quả khử khoáng xương ......................................................................... 36
3.3. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng của xương khử khoáng thu được ................... 40
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................................. 45
4.1. Đánh giá phương pháp thu nhận xương khử khoáng từ mô xương sọ người .............. 45
4.1.1. Thời gian khử khoáng xương (tốc độ khử khoáng) .................................................. 46
4.1.2. Hiệu quả khử khoáng xương ..................................................................................... 46
4.1.3.Mức độ toàn vẹn cấu trúc xương ............................................................................... 47
4.2. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng của xương khử khoáng thu được ................... 50
KẾT LUẬN ........................................................................................................................ 53
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Mô xương là một trong những loại mô trong cơ thể có đ c tính tự chữa
lành, tuy nhiên trong những khuyết xương lớn thì quá trình lành xương rất khó xảy
ra nếu không có các biện pháp can thiệp để giúp quá trình liền xương xảy ra. Ghép
xương là một trong những phương pháp phổ biến để điều trị các tổn thương dẫn đến
khuyết xương.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng mô xương ghép để điều trị trong các trường hợp
khuyết hổng xương ho c các bệnh l dẫn đến tổn thương xương là rất lớn. Các loại
mô xương ghép tự thân, đồng loài, dị loài đ được sử dụng để đáp ứng nhu cầu ghép
xương ngày càng gia tăng của người bệnh. Tuy nhiên, các loại mô xương ghép hiện
tại vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của người bệnh. M t khác, việc
sử dụng các mô xương kể trên đều có những ưu nhược điểm nhất định.
Ghép xương tự thân là phương pháp phổ biến nhất và được xem là tiêu chu n
vàng trong ghép xương. Xương ghép tự thân là một nguồn xương ghép tự nhiên rất
hữu dụng, tuy nhiên trong nhiều trường hợp không đáp ứng đủ số lượng xương
ghép trên lâm sàng cũng như còn nhiều điểm hạn chế như không cung cấp đủ số
lượng xương khi cần thể tích xương ghép lớn, ghép xương nhiều lần, phải thực hiện
thêm các phẫu thuật thu nhận xương, do đó kéo dài thời gian phẫu thuật và có thể
dẫn đến các biến chứng đau, nhiễm tr ng, sẹo, mất máu.
Từ đó đ t ra nhu cầu cho các nhà nghiên cứu, các nhà lâm sàng phải chế tạo ra
nhiều loại vật liệu có khả năng d ng để ghép thay mô xương. Hiện có rất nhiều loại
vật liệu ghép thay xương đ được nghiên cứu và phát triển, từ các vật liệu ghép
xương có nguồn gốc tự nhiên đến các loại vật liệu tổng hợp nhân tạo. Các loại vật
liệu này trước hết phải có tính tương hợp sinh học, phải có khả năng cảm ứng và
kích ứng tạo xương, có độ bền cơ học để có thể đảm nhận được vai trò vật l của
mô xương và cuối c ng là có đ c tính thoái biến sinh học để chuyển hóa thành mô
xương chủ.
Một trong những vật liệu sinh học được sử dụng rất phổ biến trong ghép thay
xương là xương khử khoáng, được chế tạo từ xương người (là nguồn xương ghép
.
.
đồng loài rất quan trọng) ho c từ xương động vật (xương dị loài). Đây là loại vật
liệu sinh học có nguồn gốc tự nhiên, có hiệu quả rất cao trong việc cảm ứng và kích
ứng xương [111]. Đ c biệt hiệu quả trong những trường hợp làm đầy các khuyết
hổng xương [58 .
Xương khử khoáng được tạo ra từ các mẫu xương của người hiến, sau khi trải
qua quá trình khử khoáng thì còn lại chủ yếu là khung xương (bao gồm các thành
phần hữu cơ, các yếu tố cảm ứng và kích ứng tạo xương) [100,117 . Đây là những
thành phần chủ yếu tham gia tái tạo nên xương mới ở người nên xương khử khoáng
có một vai trò quan trọng và tiềm năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực chế tạo
xương ghép. Do đó, xương khử khoáng được xem là nguồn vật liệu ghép thay
xương hiệu quả và tiềm năng chỉ đứng sau xương ghép tự thân [36,39,47 .
M c d tiềm năng và ứng dụng của xương khử khoáng trên lâm sàng đ được
chứng minh rộng rãi, các nghiên cứu về xương khử khoáng đ được thực hiện
nghiên cứu khắp các phòng thí nghiệm trên thế giới và đ tạo ra được nhiều sản
ph m thương mại được phân phối trên thị trường xương ghép. Tuy nhiên, ở Việt
Nam tình hình nghiên cứu về xương khử khoáng còn rất hạn chế, chưa có nhiều sản
ph m được đưa ra thị trường ho c đưa vào sử dụng trên lâm sàng d nguồn nguyên
liệu khá phong phú ở các ngân hàng mô.
Xuất phát từ những l do trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu: Đánh giá hiệu
quả một số phương pháp thu nhận xương khử khoáng từ mô xương người với các
mục tiêu sau.
Mục tiêu nghiên cứu
1. Đánh giá hiệu quả một số phương pháp thu nhận nguồn xương khử
khoáng từ các mảnh xương sọ người.
2. Đánh giá một số tiêu chu n chất lượng đối với xương khử khoáng d ng
làm vật liệu ghép xương.
.
.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. M ng sọ v s l n ng
1.1.1. Cấu t o m ọc mô ng sọ
Xương sọ gồm: hai bản xương đ c thuộc loại xương cốt mạc được gọi là bản
ngoài và bản trong, nằm ở m t ngoài và m t trong tấm xương sọ, giữa hai bản
xương là lớp xương Havers xốp. Phía m t ngoài của bản ngoài xương vòm sọ là
màng liên kết, lót m t trong bản trong là màng cứng [5 .
Xương đ c
Màng xương
Xương Haver
xốp
Hình 1.1. Cấu t o ng sọ [26]
1.1.1.1. Thành phần vô cơ
Tích lũy chất vô cơ là đ c điểm nổi bật của mô xương so với phần lớn các mô
xương khác của cơ thể. Khoáng chất chủ yếu của chất nền xương gồm calci và
phospho, nhưng ngoài ra cũng có bicarbonat, citrat, magnesium, kali, natri và nhiều
chất khác. Phần lớn calci và phospho hợp thành các tinh thể hydroxyapatite
Ca10(PO4)6(OH)2 có dạng tấm 40x25x3nm phân bố dọc theo các vi sợi collagen.
Chất nền xương cũng chứa nước nhưng với tỉ lệ thấp hơn các mô liên kết khác,
phần lớn nước của chất nền xương ở hình dạng có cấu trúc, hình thành các lớp vỏ
bao quanh các tinh thể chất khoáng (lớp vỏ hydrat hoá). Lớp nước này giúp cho
việc trao đổi chất khoáng dự trữ trong chất nền xương với chất khoáng lưu hành
trong thể dịch được dễ dàng. Do chứa lượng lớn muối vô cơ trong chất nền, mô
xương có tỉ trọng cao hơn các mô mềm, rất rắn và cản quang tia X.
.
.
1.1.1.2. Thành phần hữu cơ
Chất nền xương chứa collagen, chất căn bản vô định hình với các phức hợp
proteoglycan và nhiều loại glycoprotein khác nhau. Collagen của xương thuộc loại I
nhưng không tạo thành các sợi, chỉ hình thành các vi sợi (fibril). Mạng vi sợi
collagen kết hợp với hydroxyapatite quyết định đ c tính vừa cứng chắc lại vừa đàn
hồi của mô xương. Một số ngân hàng mô áp dụng kỹ thuật chế tạo mô ghép xương
thông qua khử khoáng, xương khử khoáng hoàn toàn vẫn giữ được hình dạng ban
đầu của mô xương nhưng trở nên mềm và đàn hồi. M t khác, mô xương ghép do
ngân hàng mô chế tạo thường được khử khu n bằng tia gamma, tia này có tác dụng
cắt đứt các mạch collagen, vì vậy nếu mô ghép bị chiếu xạ quá liều, sẽ trở nên giòn,
dễ g y. Proteoglycan trong chất nền xương chiếm tỉ lệ ít hơn so với chất nền sụn.
Proteoglycan là các phức hợp phân tử lớn với các phân tử protein lõi kết hợp thành
một trục ở giữa, các phân tử glycosaminoglycan (GAG) mạch thẳng với protein lõi
ở một đầu, đầu kia hướng ra phía ngoài khiến cho cả phức hợp chiếm không gian
lớn. Trong số các GAG của xương, ngoài keratan sulfate là loại thường hay đi kèm
với collagen loại I, ta thấy trong xương có nhiều chondroitin 4-sulfat là loại GAG
thường do tế bào sụn sản xuất ra. Glycoprotein trong chất nền xương có nhiều loại.
Thành phần này tuy ít nhưng rất đáng quan tâm vì chúng có tác dụng không chỉ là
protein cấu trúc mà còn có nhiều hoạt tính chức năng khác nhau. Ví dụ như
osteocalcin có chứa nhiều gốc γ-carboxyglutamate có ái lực liên kết mạnh với Ca2+
và có chức năng hỗ trợ quá trình khoáng hoá chất nền. Gần đây, ngày càng có nhiều
bằng chứng phát hiện nhiều các cytokine khác nhau có trong chất nền xương.
Cytokine là các phân tử protein có hoạt tính thông tin liên tế bào, chúng tương tác
với tế bào đích qua thụ thể đ c hiệu trên màng tế bào và điều khiển các hoạt động
của nhân và bào tương, gây ra tác động hoạt hóa hay ức chế, chuyển dạng, thay đổi
định hướng biệt hóa của các tế bào; các yếu tố này thường tác dụng cận tiết
(paracrine, protein có tế bào đích nằm ngay trong mô, gần nơi tế bào sản xuất ra
nó), tự tiết (autocrine, protein có thụ thể ngay trên màng bào tương của chính tế bào
.
.
đ sản xuất ra nó), liên cận tiết (juxtacrine, protein vừa gắn trên m t tế bào đ sản
xuất ra nó, vừa tác dụng lên thụ thể trên tế bào nằm bên cạnh đó).
Tuy nhiên, cytokine cũng có thể lưu thông trong hệ tuần hoàn và tác dụng như
chất nội tiết (endocrine). Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy chất nền của xương là
kho dự trữ nhiều họ cytokine khác nhau như TGF-β (siêu họ bao gồm cả activin và
BMP), PDGF (Platelet-Derived Growth Factor), IGF (Insulin-like Growth Factor),
FGF (Fibroblast Growth Factor) ... Nhiều phân tử trong số này ở dạng liên kết và
không có hoạt tính nhưng khi chất nền phân hủy một phần, tác dụng của chúng mới
thể hiện. Trong các loại cytokine này thì cytokine đ được nghiên cứu nhiều nhất là
các phân tử BMP (Bone Morphogenic Protein) hay gần đây còn gọi là OP
(Osteogenic Protein). BMP có tác dụng thu hút các tế bào trung mô và biệt hoá các
tế bào này thành các tạo cốt bào. Mô ghép xương đồng loại được khử khoáng và
giảm chất nền đúng cách (thủy phân một phần ở nhiệt độ thấp, môi trường chống
oxy hoá, dùng acid rút calci phosphat) có thể vẫn giữ được hoạt tính BMP. Nhờ quá
trình khử khoáng và giảm chất nền, các phân tử này được bộc lộ ra và có thể hoạt
hoá quá trình tạo xương mới theo cơ chế kích tạo xương.
Đến 1996, đ tìm ra trên 12 loại BMP, trừ BMP-1, còn tất cả đều thuộc siêu họ
TGF-β (Transforming Growth Factor). Đây là loại glycoprotein có phân tử lượng
tương đối thấp (dimer 32-36 kD), khá kỵ nước, rất dễ bị oxy hoá, nhạy cảm với
nhiệt. Polypeptide khi mới tổng hợp khá lớn, sau đó bị cắt đứt đi khoảng 2/3 từ phía
đầu N. Miền C có cấu trúc bảo tồn, chứa 100 gốc acid amin, trong đó có 7 gốc
cystein. BMP được thấy nhiều trong các khối u xương sụn, chúng được cho là tham
gia kích thích tân sản mô xương – sụn, ngược lại đột biến mất gien BMP hay thụ thể
của chúng cũng đ được tìm ra là có mối liên quan đến một số dị tật b m sinh của
cơ quan vận động.
.
.
1.1.1.3. Các tế bào của mô xương:
Vi
nhung
mao
Tiền tạo cốt bào Tạo cốt bào Cốt bào Hủy cốt bào
Hình 1.2. Các lo i tế b o ng [5]
+ Tiền tạo cốt bào (osteoprogenitor cells): là những tế bào trung mô, thường
xuất hiện trên m t xương, lớp trong của màng xương. Bào tương tế bào nhạt màu,
nhân hình trứng. Trong quá trình tạo xương, tiền tạo cốt bào phân chia và biệt hóa
để trở thành tạo cốt bào [5,26 .
+ Tạo cốt bào (osteoblast): là những tế bào hình đa diện ho c hình lăng trụ, có
nhánh bào tương nối với nhau ho c nối với tế bào sợi nằm trong tủy xương. Tạo cốt
bào xuất hiện ở nơi cần tạo xương, thường chúng xếp thành một hàng trên m t các
bè xương đang hình thành tạo ra nền protein, tổng hợp collagen và gián tiếp tham
gia làm lắng đọng các muối khoáng trên nền đó. Ngoài ra, tạo cốt bào sản xuất các
yếu tố điều chỉnh tham gia quá trình tái tạo xương như là: các protein hình thái
xương (Bone Morphogenetic Protein - BMP), yếu tố tăng cường chuyển dạng β
(Transforming Growth factor – β, TGF – β), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi
(bFGF), yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu (FDGF). Tạo cốt bào cũng có vai trò
trong sự huỷ xương [5,26 .
+ Cốt bào (osteocyte): thân tế bào nằm trong ổ xương, các nhánh bào tương
nằm trong vi quản xương nối với các nhánh bào tương của các tế bào bên cạnh. Tế
bào xương giữ vai trò quan trọng trong sự trao đổi calci giữa xương và dịch ngoại
bào do tiết ra osteocalcin. Các tế bào xương có nguồn gốc từ tạo cốt bào, không có
khả năng sinh sản, chúng hoạt động như những bộ phận nhận cảm của xương để
cảm nhận và khởi động quá trình tái tạo xương [5,26 .
+ Hủy cốt bào (osteoclast): là tế bào chính tham gia vào quá trình huỷ xương,
nguồn gốc từ tủy xương theo máu tới mô xương. Huỷ cốt bào có kích thước lớn (80
.
.
μm), nhiều nhân (50 – 60 nhân), nhân hình cầu, bào tương có nhiều lysosome chứa
enzyme để tiêu huỷ các sợi collagen của khuôn hữu cơ và tiết các acid làm hoà tan
muối calci. Hủy cốt bào có các vết lõm siêu vi, các vi nhung mao ăn sâu vào chất
căn bản để giúp tế bào gắn ch t vào bề m t xương đ được calci hoá và tạo ra các
khoảng Howship do hoạt động huỷ xương tạo thành [5,26,87,107].
1.1.1.4. Tủy xương
Tủy xương sọ là loại tủy đỏ nằm trong hốc tủy ở v ng xương xốp, nhiều mao
mạch kiểu xoang, được cung cấp và dẫn lưu bởi một số lượng lớn động mạch, tĩnh
mạch ở m t trong và m t ngoài của xương sọ [5 .
1.1.1.5. Màng xương sọ
Màng xương sọ là màng liên kết, có nhiều mao mạch máu. Màng xương cũng
có khả năng sinh xương do có nhiều tiền tạo cốt bào nhưng khả năng tạo xương yếu
hơn so với ở xương dài [5,26 .
1.1.2. S liền ng
1.1.2.1. i n xương sinh
Khi xương bị g y, diễn biến quá trình liền xương là một quá trình phức tạp,
liên quan nhiều yếu tố, từ mức phân tử, tế bào tới v ng tổn thương và toàn bộ cơ
thể. Về m t mô học, quá trình liền xương g y thường diễn ra theo bốn giai đoạn:
viêm, tạo can xương, sửa chữa can xương và hồi phục hình thái xương [5,87].
Hình 1.3. Quá trìn liền ng [87]. (I). Giai đoạn viêm, (II). Giai đoạn tạo can
xương, (III). Giai đoạn sửa chữa can xương, (IV). Giai đoạn hồi phục hình thái
xương.
.
.
- Giai đoạn viêm: xuất hiện ngay sau khi xương g y, kéo dài trong khoảng 3
tuần, đỉnh điểm là ngày thứ 3 tới ngày thứ 5 sau chấn thương. Lực tác động làm g y
xương sẽ đồng thời làm tổn thương cả mạch máu ở màng xương và tủy xương dẫn
tới hoại tử các tế bào tại ổ g y, các tế bào này sẽ giải phóng các yếu tố hoạt hóa
thành mạch gây tăng quá trình gi n mạch và th m thấu thành mạch, do đó tăng lưu
lượng máu tới ổ g y. Trên nền của cục máu đông hình thành từ các tế bào viêm, các
nguyên bào sợi xuất hiện tạo ra collagen dần thay thế cục máu đông bằng tổ chức
hạt [5,87].
- Giai đoạn tạo can xương:
+ Hình thành can xương mềm: diễn ra trong 1 - 3 tuần đầu, giai đoạn này
nhiều mạch máu tân tạo được tạo ra bởi các tế bào gốc tủy xương. Các tế bào trung
mô xâm nhập vào v ng tổn thương và biệt hóa t y thuộc vào điều kiện tại chỗ như:
nồng độ oxy tổ chức, sức căng gi n và các yếu tố kích thích phát triển tại chỗ. Sức
căng gi n tại chỗ sẽ hoạt hóa tế bào gốc biệt hóa thành các nguyên bào sợi. Ở những
nơi có nồng độ oxy thấp và căng gi n thường xuyên, các tế bào gốc sẽ biệt hóa
thành các nguyên bào sụn (chondrocyte), sau đó các can sụn sẽ tạo cầu nối giữa hai
đầu xương g y, cũng chính các can sụn này sẽ làm giảm độ căng gi n và dẫn tới sự
liền xương. Tiền tạo cốt bào sẽ tăng sinh nhanh chóng ở môi trường giàu oxy và ít
bị căng gi n cơ học, những v ng này tạo nên can xương cứng trực tiếp. Can xương
mềm được tạo ra nhờ sự biến đổi từ tổ chức hạt sang tổ chức calci hoá tạm thời, bao
gồm các tạo cốt bào và nguyên bào sụn c ng hệ thống các sợi collagen, các chất
gian bào dạng xương và sụn. Sự khoáng hóa can xương mềm xuất hiện đầu tiên ở
chỗ tiếp giáp giữa các đầu xương g y, tuần tự từ đầu này sang đầu kia của ổ g y cho
đến khi hai đầu xương g y được nối liền nhau. Can xương ở giai đoạn này rất mềm
và dễ g y [5,87].
+ Hình thành can xương cứng: can xương mềm tiếp tục phát triển, các tế bào
sụn c ng hệ thống sợi collagen có sự lắng đọng calci tạo môi trường cho các tế bào
gốc đi vào biệt hóa thành các nguyên bào xương, các tế bào này biến đổi sụn đ
.
.
khoáng hóa thành các bè xương cứng sắp xếp dọc theo các vi quản. Sự cốt hoá tạo
thành các bè xương cứng đảm bảo nối liền ổ g y vững chắc [5,87].
- Giai đoạn sửa chữa can xương: quá trình này hồi phục cấu trúc sinh học cho
xương. Dưới sự tác động của các lực cơ học, tổ chức can xương tại đây có sự thay
đổi về hình thái để thích hợp với chức năng của xương. Sự sửa chữa được thực hiện
bởi các đơn vị tái tạo xương (bone modelizing unit - BMU) gồm có các huỷ cốt bào,
tạo cốt bào và diễn ra theo một trình tự được l p đi l p lại [5,87].
- Giai đoạn hồi phục hình thái xương: Giai đoạn này có thể kéo dài từ một đến
nhiều năm, ở người lớn không thể hồi phục như hình thái ban đầu [5,87].
1.2. G p ng v vật li u g p ng
Mô ghép xương tự thân, đồng loại hay dị loại, xương vỏ hay xương xốp đều bị
chuyển hoá trong một chuỗi các quá trình sinh học có những đ c điểm chung và
những điểm khác biệt.
1.2.1. Các k ái ni m c ung
Sự xâm nhập (incorporation) là quá trình xương chủ liền vào xương ghép, tạo
thành các v ng lõm của xương chủ (mô sống) xâm lấn vào xương ghép (mô chết)
và dần dần thay thế nó. Quá trình thay thế bao gồm sự sinh xương mới và sự hủy
xương ghép.
Sự tiêu xương (bone resorption) được thực hiện bởi các huỷ cốt bào tiết ra các
enzyme (như acid phosphatase) phân huỷ chất căn bản xương. Sự sinh xương mới
(osteogenesis) do các tạo cốt bào thực hiện, các tế bào này tổng hợp ra các thành
phần của chất nền và gây lắng đọng muối calci lên đó, tạo thành chất căn bản
xương.
Quá trình sinh xương mới được thực hiện dọc theo các đường hầm do hủy cốt
bào tạo ra khi hủy xương ho c các khoảng trống của tủy xương và các kênh Havers
sẵn có trong xương. Do đ c điểm này, quá trình này được gọi là sự thay thế bò
trườn (creeping substitution). Quá trình xây dựng xương mới thay thế xương ghép
có hai quá trình chính là sự kích ứng xương và sự dẫn nhập xương.
.
0.
Kích ứng xương (osteoinduction) là quá trình biệt hoá các tế bào trung mô
dạng tương tự như nguyên bào sợi thành các hủy cốt bào, tạo cốt bào và các nguyên
bào sụn, dưới tác dụng của các cytokine như BMP trong chất nền của xương ghép.
Dẫn nhập xương (osteoconduction) là quá trình di cư của các tế bào đầu dòng
xương (osteoprogenitors) từ mô xương chủ vào các khoảng trống trong mảnh ghép.
Quá trình dẫn nhập xương xảy ra tương đối thụ động, phụ thuộc vào cấu trúc xốp
của mảnh ghép, sự cung cấp chất dinh dưỡng của xương chủ tại nền ghép và sự tiếp
xúc ch t chẽ của mảnh ghép với nền ghép. Ngoài ra, trong trường hợp ghép xương
có cuống (kèm theo mạch máu nuôi), nguyên bào xương còn sống sót trong mảnh
ghép có thể đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng xương mới, cơ chế này có
thể gọi là cơ chế tạo xương (osteoproduction).
Mô xương mới hình thành sẽ được tái cấu trúc và tự nắn chỉnh (remodelling)
thông qua các quá trình hủy xương và sinh xương thứ cấp. Quá trình tự nắn chỉnh
xương được thực hiện theo định luật Wolf, sau thời gian dài sẽ dẫn đến hình thái
của xương hài hoà với tổng hợp các lực cơ học tác dụng lên xương.
1.2.2. Vật li u g p ng t n iên
1.2.2.1. Ghép xương t thân
Một mẫu xương ghép được thu nhận từ một vị trí trên cơ thể và được cấy ghép
vào một vị trí khác trên cùng cơ thể người bệnh được gọi là ghép xương tự
thân [87 . Với việc sở hữu các đ c tính tương hợp sinh học, khả năng dẫn tạo
xương, cảm ứng và kích ứng tạo xương nên xương ghép tự thân có thể tích hợp vào
xương chủ nhanh và hoàn toàn. Do đó, mô xương ghép tự thân được coi là tiêu
chu n vàng trong điều trị khuyết tật xương và làm mẫu xương chu n trong việc
đánh giá các mảnh ghép xương khác và vật liệu thay thế. Tuy nhiên, những nhược
điểm của ghép xương tự thân đ được báo cáo rộng r i liên quan nhiều đến quá
trình lấy mảnh ghép, bao gồm biến chứng và đau tại chỗ lấy xương, gây mất máu,
tăng thời gian phẫu thuật, khả năng nhiễm khu n tại chỗ lấy xương và khối lượng
xương lấy được hạn chế [24,60,88].
.
1.
G p ng ốp t t n là hình thức ghép xương tự thân được sử dụng phổ
biến nhất. Xương xốp chứa ít tạo cốt bào và tế bào xương nhưng lại có rất nhiều tế
bào gốc trung mô giúp duy trì khả năng tạo xương mới mạnh mẽ từ mảnh
ghép [12,102 . Ngoài ra, diện tích bề m t lớn của mảnh ghép tạo điều kiện thuận lợi
cho quá trình tái tạo mạch máu và kết hợp mảnh ghép với xương chủ. Các protein
có nguồn gốc từ mảnh ghép cũng được bảo tồn và hiện diện khi các mảnh ghép
được xử l thích hợp [60 . Trong giai đoạn đầu ghép xương tự thân, khối máu tụ và
viêm được hình thành nhanh chóng, các tế bào gốc trung mô tạo thành mô
hạt. Trong khi đó, các mô ghép hoại tử đang dần bị loại bỏ bởi các đại thực bào và
quá trình tân tạo mạch máu cũng xảy ra. Tiếp theo, các đường nối của xương được
tạo ra bởi tạo cốt bào xung quanh mô hoại tử, điều này xảy ra đồng thời với sự hình
thành xương mới bởi các tế bào tích lũy trong xương được cấy ghép [60,88]. Quá
trình này, dẫn đến việc tái hấp thu và thay thế hoàn toàn mảnh ghép, thường mất
khoảng 6 - 12 tháng [15].
G p ng c t thân sở hữu tính toàn vẹn cấu trúc tuyệt vời và hỗ trợ cơ
học tốt nhưng số lượng tiền tạo cốt bào hạn chế [88]. Không giống như mô xương
xốp tự thân, sự thay thế mảnh ghép xương đ c chủ yếu được điều hòa bởi các hủy
cốt bào sau khi hình thành khối máu tụ và phản ứng viêm trong giai đoạn đầu tái tạo
xương, quá trình phân huỷ sinh học và tái cấu trúc bị cản trở bởi kết cấu dày
đ c. Do đó, sự phát triển xương trên lõi hoại tử là phương tiện chủ yếu kết hợp với
mảnh xương ghép [50]. Quá trình này có thể mất nhiều năm, t y thuộc vào kích
thước mảnh ghép và vị trí cấy ghép [60 .
1.2.2.2. Ghép xương ng oài
Ghép xương đồng loài là thu nhận mô xương ghép từ người hiến, mẫu xương
này sau đó được xử l để tạo ra mô ghép xương và ghép lại cho người bệnh
[88 . Xương đồng loài được coi là phương pháp thay thế tốt nhất cho xương ghép tự
thân và đ được sử dụng hiệu quả trên lâm sàng, đ c biệt là đối với những bệnh
nhân chậm lành xương, không lành xương sau khi g y xương [12 . Xương đồng loài
được xử l , tạo hình ph hợp do đó có sẵn ở nhiều hình dạng khác nhau, bao gồm
.
2.
các dẫn xuất xương đ c, xương xốp và xương hạt (như xương khử khoáng) [88] do
đó rất đa dạng, phong phú và có tính sẵn có để tiến hành ghép xương. So với xương
tự thân, xương đồng loài được xem là vật lạ và tỷ lệ đào thải ghép cao hơn vì có thể
kích hoạt các phức hợp kháng nguyên tương hợp mô (MHC) [98 dẫn đến các phản
ứng thải loại mảnh ghép. Cơ chế chính xác của phản ứng miễn dịch trong việc ghép
xương đồng loài chưa được hiểu một cách rõ ràng. Các nghiên cứu đ phát hiện ra
rằng có thể hạn chế phản ứng thải ghép xương đồng loài, giảm khả năng tạo đáp
ứng miễn dịch bằng cách chọn lựa các mẫu xương ghép đồng loại có ít khác biệt về
kháng nguyên tương hợp mô. Một vấn đề khác là nguy cơ lây truyền virus từ mảnh
ghép, nguy cơ này đ được cải thiện đáng kể nhờ sự phát triển của các ngân hàng
mô hiện đại [60] và cải tiến công nghệ xử l [112 . Do những đ c điểm trên, việc áp
dụng xương tươi đồng loài bị hạn chế hơn so với xương khô đồng loài sau quá trình
xử l và bảo quản trước khi cung cấp để ứng dụng ghép trên lâm sàng.
X ng k ử k oáng là một loại xương đồng loài được sử dụng rất phổ biến
sau khi tr i qua quá trình xử l để loại bỏ đi ít nhất 40% hàm lượng chất khoáng của
xương bằng một số loại hóa chất như dung dịch acid (nồng độ thấp), trong khi các
thành phần khác như collagen, protein không collagen và các yếu tố tăng trưởng
vẫn còn lại trong sản ph m xương khử khoáng [13,74,106]. Tính toàn vẹn cấu trúc
và tính chất cơ học của xương khử khoáng kém do đó sản ph m xương khử khoáng
chủ yếu được áp dụng trên lâm sàng để lấp đầy các khuyết hổng xương [35 . Khả
năng tái tạo xương của xương khử khoáng là tạo ra khung xương để dẫn tạo xương
và kích thích tạo xương mới [60 . Đ c tính kích thích tạo xương của xương khử
khoáng chủ yếu là do các yếu tố tăng trưởng còn giữ lại sau quá trình khử
khoáng. Phần lớn xương khử khoáng trên thị trường thường sử dụng acid
chlohydric (nồng độ trong khoảng 0,5 - 0,6 M) làm dung dịch khử khoáng. Ghép
xương khử khoáng tương tự như ghép xương tự thân với các yếu tố tăng trưởng
kích hoạt sự tạo xương dẫn đến sự hình thành xương mới tại vị trí ghép xương [60].
.