Đánh giá đặc điểm lý học và sinh học của hệ vi bọt mang gen hsv tk và kháng thể kháng vegfr2
- 71 trang
- file .pdf
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN PHI TOÀN
ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH
HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSV-
TK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN PHI TOÀN
ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH
HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSV-
TK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 8720208
Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thị Lập
Nơi thực hiện nghiên cứu:
1. Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Đại học Quốc gia Thanh Hoa, Đài Loan
HÀ NỘI - 2022
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau
đại học và toàn thể các thầy cô Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội,
đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn
Thị Lập đã tận tình giúp đỡ, tin tưởng và trao cho tôi cơ hội được nghiên cứu một
vấn đề rất mới so với kinh nghiệm của mình. Quãng thời gian làm việc với Cô đã
giúp tôi học được rất nhiều kinh nghiệm trong việc viết và đăng báo.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS. Chih Kuang Yeh – Khoa
Kỹ thuật Y sinh và Khoa học môi trường - Trường Đại học Quốc gia Thanh Hoa (Đài
Loan), là người thầy hỗ trợ chuyên môn để tôi hoàn thành luận văn này.
Cảm ơn các anh chị trong lớp Cao học Khóa 25, lớp chuyên ngành Hóa sinh,
DS. Lê Nguyễn Anh Thư, NCS. Trần Thị Anh Thơ đã luôn là nơi trao đổi kiến
thức về đề tài và là nơi hàn huyên sau những tiết học căng thẳng.
Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn thân của tôi DS. Nguyễn Cao Đức và
các em trong Hội Sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội. Mọi người là những điểm
tựa tinh thần luôn ủng hộ tôi hết mình.
Cuối cùng, tôi gửi một lời cảm ơn nhỏ bé nhất đến chính bản thân mình vì đã
tạm quên đi những lo lắng trong cuộc sống và giữ được một tinh thần lạc quan nhất
trong quá trình học và hoàn thành luận văn thạc sĩ.
Bằng cả trái tim đam mê khoa học và khối óc luôn tò mò những miền kiến
thức mới, xin cảm ơn!
Hà Nội, ngày 9 tháng 4 năm 2022
Học viên
Nguyễn Phi Toàn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ........................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
1.1. Vi bọt và hệ vi bọt mang gen ........................................................................... 3
1.1.1. Vi bọt.......................................................................................................... 3
1.1.1.1. Cấu tạo vi bọt ....................................................................................... 3
1.1.1.2. Khả năng gắn các chất lên bề mặt vi bọt ............................................. 5
1.1.1.3. Một số thông số đánh giá đặc điểm lý học của vi bọt ......................... 6
1.1.2. Hệ vi bọt mang gen .................................................................................... 7
1.1.2.1. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt mang gen ........................................ 7
1.1.2.2. Một số phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang
gen ..................................................................................................................... 9
1.1.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ vi bọt trong chẩn đoán và điều trị ........ 10
1.2. Vài nét về gen herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) ............... 12
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 12
1.2.2. Vai trò của gen HSV-TK trong điều trị ung thư ...................................... 12
1.2.3. Một số nghiên cứu về hệ vi bọt mang gen HSV-TK ............................... 14
1.3. Vài nét về thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 2 (VEGFR2) ......... 16
1.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 16
1.3.2. Con đường truyền tín hiệu và chức năng sinh học của VEGFR2 ........... 16
1.3.3. Vai trò của VEGFR2 trong điều trị ung thư ............................................ 17
1.3.4. Một số nghiên cứu về hệ vi bọt hướng đích VEGFR2 ............................ 18
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................. 21
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ........................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 25
2.3.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của
hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2............................. 25
2.3.1.1. Phương pháp tạo hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng
VEGFR2 ......................................................................................................... 25
2.3.1.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta)
của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2 ................... 28
2.3.2. Phương pháp đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-
TK và kháng thể kháng VEGFR2 ...................................................................... 28
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá mức độ gắn VEGFR2 lên hệ vi bọt .............. 28
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt.......... 29
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của
hệ vi bọt........................................................................................................... 30
2.3.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng kính hiển
vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh (cryo-TEM)... 32
2.3.3. Xử lý số liệu ............................................................................................. 32
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 33
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi bọt
mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2 ............................................... 33
3.1.1. Kết quả về kích cỡ của các loại vi bọt ..................................................... 33
3.1.2. Kết quả về nồng độ của các loại vi bọt .................................................... 35
3.1.3. Kết quả về thế zeta của các loại vi bọt..................................................... 36
3.2. Kết quả đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và
kháng thể kháng VEGFR2 .................................................................................... 37
3.2.1. Kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt.. 37
3.2.2. Kết quả đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt......................... 38
3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của hệ vi bọt
............................................................................................................................ 40
3.2.4. Kết quả xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng bằng kính hiển vi
huỳnh quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh............................... 41
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 44
4.1. Về kết quả đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi
bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2......................................... 44
4.2. Về kết quả đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK
và kháng thể kháng VEGFR2 ............................................................................... 47
4.2.1. Về kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt
............................................................................................................................ 47
4.2.2. Về kết quả đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt .................... 47
4.2.3. Về kết quả đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của hệ vi
bọt....................................................................................................................... 49
4.2.4. Về kết quả xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng kính hiển vi huỳnh
quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh.......................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT VẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT
ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic
BSE Bystander Effect Hiệu ứng người ngoài cuộc
C3F8 Octafluoropropane Octa-floropropan
CMB Cationic microbubble Vi bọt mang điện tích dương
Cryogenic-Transmission Kính hiển vi điện tử truyền qua
cryo-TEM
electron microscope đông lạnh
DNase Deoxyribonuclease Deoxyribonuclease
FITC Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat
FUS Focused ultrasound Siêu âm hội tụ cường độ cao
GCV Ganciclovir Ganciclovir
Glial cell line-derived Yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ
GDNF
neurotrophic factor dòng tế bào thần kinh đệm
Herpes simplex virus - Virus Herpes simplex - thymidine
HSV-TK
thymidine kinase kinase
Herpes simplex virus Gen Virus Herpes simplex
HSV-TK gene
thymidine kinase gene thymidine kinase
Herpes simplex virus
Liệu pháp phối hợp gen HSV-TK
HSV-TK/GCV thymidine
và Ganciclovir
kinase/Ganciclovir
MB Microbubble Vi bọt
ORF Open Reading Frame Khung đọc mở
Plasmid deoxyribonucleic
pADN Plasmid acid deoxyribonucleic
acid
PEG Polyethylen glycol Polyethylen glycol
RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic
siRNA Small interfering RNA ARN can thiệp nhỏ
VEGFR2 cationic Vi bọt điện tích dương mang
VCMB
microbubble kháng thể kháng VEGFR2
Vascular endothelial Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô
VEGF
growth factors mạch máu
Vascular endothelial Thụ thể yếu tố tăng trưởng nội
VEGFR2
growth factors receptor 2 mô mạch máu 2
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
1 Hình 1.1. Cấu tạo vi bọt. tr. 3
2 Hình 1.2. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt kết hợp siêu âm. tr. 8
3 Hình 1.3. Minh họa cơ chế của BSE. tr. 13
4 Hình 1.4. Cấu trúc của VEGFR2. tr. 16
5 Hình 1.5. Con đường truyền tín hiệu của VEGFR2. tr. 17
6 Hình 2.1. Bản đồ plasmid ADN chứa gen HSV-TK. tr. 21
7 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu. tr. 25
8 Hình 2.3. Minh họa các bước chế tạo hệ vi bọt mang gen và kháng tr. 26
thể.
9 Hình 3.1. Phân bố đường kính – số lượng của các loại vi bọt gắn tr. 34
pADN.
10 Hình 3.2. Phân bố đường kính – thể tích của các loại vi bọt gắn tr. 35
pADN.
11 Hình 3.3. Mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 vào hệ vi bọt tr. 38
VCMB-pADN thông qua hiệu quả gắn kết avidin-biotin.
12 Hình 3.4. Hình ảnh điện di thể hiện hiệu quả vi bọt tải gen. tr. 39
13 Hình 3.5. Hình ảnh điện di thể hiện khả năng vi bọt VCMB bảo vệ tr. 40
pADN khỏi sự thủy phân của endonuclease.
14 Hình 3.6. Hình ảnh hiển vi huỳnh quang của phức hợp VCMB – tr. 42
pADN.
15 Hình 3.7. Hình ảnh cấu trúc vi bọt thể hiện gắn kết kháng thể kháng tr. 43
VEGFG2 quan sát bởi kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh
(cryo-TEM).
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1 Bảng 2.1. Hóa chất thí nghiệm. tr. 22
2 Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị. tr. 23
Bảng 2.3. Tỷ lệ khối lượng/khối lượng thành phần lipid tạo màng tr. 27
3
các loại vi bọt.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả năng tải gen của tr. 30
4
hệ vi bọt.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả năng bảo vệ ADN tr. 31
5
khỏi DNase của hệ vi bọt.
6 Bảng 3.1. Đường kính trung bình của các loại vi bọt. tr. 33
7 Bảng 3.2. Nồng độ và tổng thể tích của các loại vi bọt. tr. 36
8 Bảng 3.3. Thế zeta của các loại vi bọt. tr. 37
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gen trị liệu là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư. Hiện nay,
vector có nguồn gốc virus là hệ vận chuyển gen chủ yếu. Tuy nhiên, những vấn đề
về tính an toàn, khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của bệnh nhân chống lại virus,
và khả năng kích thích khối u phát triển của chính virus, đã hạn chế việc ứng dụng
gen trị liệu trên thực tế lâm sàng [27]. Do vậy, phát triển hệ vận chuyển gen trị liệu
không phải virus là một tất yếu cần được nghiên cứu. Thực tế cho thấy các vector
không có nguồn gốc virus đã giúp cải thiện hiệu quả chuyển gen và tính an toàn sinh
học, điển hình là hệ vi bọt mang gen [24], [58]. Vi bọt (microbubble) là các tiểu phân
chứa khí, có thể được bao bọc bởi lớp màng mang điện tích và có khả năng liên kết
với các phân tử acid nucleic. Cấu trúc của vi bọt cho phép gắn thêm nhiều loại phối
tử nhằm chế tạo hệ chuyển gen vi bọt có tác dụng trúng đích [24].
Gen Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) còn được gọi là “gen
tự sát” (suicide gene), mã hóa cho thymidine kinase có tác dụng chuyển hóa tiền chất
ganciclovir (GCV) thành chất có khả năng xen vào sợi ADN đang nhân đôi, ức chế
tổng hợp ADN, ngăn chặn chu kỳ tế bào, và dẫn đến quá trình apoptosis. Một số
nghiên cứu đã chứng minh, liệu pháp gen sử dụng HSV-TK kết hợp GCV có tác dụng
ức chế nhiều loại ung thư trong đó có ung thư não [7], [13], [40], [55]. Thụ thể
vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) là một thụ thể của yếu tố
tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF). Thụ thể này có sự tăng biểu hiện trên màng
tế bào nội mô xung quanh hệ mạch máu nuôi dưỡng khối u và trên màng các tế bào
ung thư như ung thư vú, ung thư phổi, u nguyên bào thần kinh đệm [28], [39], [54].
Hiện nay, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tạo hệ chuyển gen vi bọt
được đăng tải trên các tạp chí khoa học. Với mục đích tạo hệ vận chuyển gen điều trị
ung thư trúng đích, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá đặc điểm lý học và sinh
1
học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2” với hai mục
tiêu sau:
1. Đánh giá được đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi bọt mang
gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2.
2. Đánh giá được một số đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng
thể kháng VEGFR2.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi bọt và hệ vi bọt mang gen
1.1.1. Vi bọt
1.1.1.1. Cấu tạo vi bọt
Vi bọt là những tiểu phân chứa khí có đường kính nhỏ hơn 10 µm, nhưng lớn
hơn xấp xỉ 0,5 micromet. Vi bọt có cấu tạo gồm 2 phần chính là lõi khí và lớp vỏ bao
bên ngoài (Hình 1.1) [44]:
Thành phần lõi khí: gồm một chất khí hoặc hỗn hợp các chất khí. Sự kết hợp
các loại khí để tạo ra chênh lệch về áp suất riêng phần và tạo ra áp suất thẩm thấu
làm ổn định vi bọt. Sử dụng pha khí là không khí (hỗn hợp khí oxy và nitơ) thì vi bọt
tạo thành chỉ tồn tại trong tuần hoàn chưa đến 1 phút. Trong khi đó, các loại khí
không hòa tan như lưu huỳnh hexafluoride, C3F8 (perfluorocarbon), C4F10
(perflubutan), C5F12 (perflenapent) và C6F14 (perflexan) cho thấy khả năng kéo dài
Hình 1.1. Cấu tạo vi bọt [44].
thời gian tuần hoàn trong máu của vi bọt từ vài phút lên vài giờ. Đây cũng là các loại
khí trơ thường được sử dụng cấu tạo nên lõi khí của vi bọt.
Thành phần màng: là lớp bao bọc bên ngoài lõi khí; ba nhóm chất chính hay
được sử dụng để cấu tạo màng là protein, lipid và polymer. Sự khuếch tán khí ra
ngoài vi bọt và các tính chất cơ học của vi bọt phụ thuộc vào bản chất của thành phần
3
lớp màng này. Nếu nguyên liệu cấu tạo màng có độ đàn hồi tăng, năng lượng âm mà
nó có thể chịu được trước khi nở to hoặc vỡ sẽ tăng, từ đó tăng thời gian ổn định của
vi bọt lên nhiều lần. Sau đây là một số ví dụ:
+ Vi bọt có màng protein: OptisonTM (GE Healthcare) là chế phẩm vi bọt có
màng albumin với lõi khí perfluorocarbon. Đặc tính vật lý của perfluorocarbon là có
độ hòa tan thấp nên giúp cho vi bọt có khả năng tồn tại lâu hơn trong cơ thể [37].
Nghiên cứu của Korpanty và cộng sự cũng sử dụng albumin để tạo nên lớp vỏ của vi
bọt. Lớp vỏ protein của vi bọt trong nghiên cứu của nhóm tác giả này được gắn với
avidin cho phép kết hợp với kháng thể qua cầu nối trung gian biotin hướng đến tác
dụng tại đích là các tế bào biểu hiện các kháng nguyên tương ứng [26].
+ Vi bọt có màng lipid: SonoVueTM là chế phẩm vi bọt được ổn định bởi lớp
phospholipid và chứa lõi khí lưu huỳnh hexafluoride (SF6). Hỗn dịch vi bọt ổn định
theo thời gian sau khi hoàn nguyên. Nồng độ vi bọt của SonoVueTM là từ 100 đến 500
triệu vi bọt mỗi ml. Đường kính vi bọt trung bình là 2,5 µm và hơn 90% vi bọt nhỏ
hơn 8 µm. Thời gian bán phân bố khoảng 1 phút và thời gian bán thải khoảng 6 phút
[42]. Lớp vỏ phospholipid có khả năng tự lắp ráp một cách tự nhiên, tạo thành một
lớp có tính định hướng cao tại bề mặt tiếp xúc giữa pha khí và pha nước. Cụ thể, các
chuỗi acyl kỵ nước tiếp xúc với pha khí (kị nước) và các nhóm ưa nước quay ra phía
bên ngoài môi trường tiếp xúc với pha nước. Ngoài ra, lớp màng lipid có sức căng
bề mặt thấp giúp cho vi bọt ổn định hơn. Lớp lipid còn có tính kết dính cao do tương
tác kỵ nước và tương tác Van Der Waals giữa các chuỗi acyl [4]. Như vậy, các phân
tử lipid được liên kết với nhau bằng tương tác vật lý "yếu", không vướng các mắt
xích, làm cho lớp vỏ có thể dễ dàng mở rộng và nén lại khi phối hợp quá trình siêu
âm. Những cơ chế này giúp vi bọt cấu tạo bởi màng lipid ổn định hơn, mà không phụ
thuộc vào sự hình thành cầu nối disulfid như màng protein.
4
+ Vi bọt có màng polymer: vi bọt có màng được cấu tạo từ các đơn phân
poly(L-lactide-co-glycolide), ký hiệu là PLGA, được Cui và cộng sự chế tạo bằng
phương pháp bay hơi dung môi. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy các hạt
hình cầu với bề mặt nhẵn, không có lỗ rỗng. PLGA bao quanh vi bọt chứa không khí
hoặc perfluoropropane có khả năng làm rõ hình ảnh siêu âm tâm thất trái [12].
1.1.1.2. Khả năng gắn các chất lên bề mặt vi bọt
Lớp vỏ lipid tích điện dương của vi bọt có thể tạo phức hợp với acid nucleic
tự do tích điện âm bằng tương tác tĩnh điện. Đây là một phương pháp đơn giản phù
hợp với nhiều loại acid nucleic như plasmid ADN, siRNA và miRNA. Việc tải các
acid nucleic lên bề mặt của các vi bọt tích điện dương có thể làm tăng tính ổn định
của acid nucleic và tăng hiệu quả chuyển gen khi có mặt trong huyết thanh [14], [15].
Do trong huyết thanh tồn tại các endonuclease (enzym phân hủy acid nucleic), khi
phân tử acid nucleic gắn trên vi bọt hoặc được bọc vào trong lõi vi bọt khiến cho
endonuclease không thể tiếp cận hoặc bị hạn chế về mặt không gian nên không thể
phân hủy cơ chất.
Vi bọt có thể tải lên bề mặt các phức hợp acid nucleic – liposome (lipoplex)
hoặc phức hợp acid nucleic – polymer (polyplex). Việc sử dụng lipoplex hoặc
polyplex có thể làm tăng khối lượng tải acid nucleic lên các vi bọt. Hai cách thức này
giúp giải phóng phức hợp từ các vi bọt nhờ sự kích thích của sóng siêu âm có thể
làm tăng thêm hiệu quả chuyển gen hơn so với các phương pháp chuyển acid nucleic
khác. Các dạng bào chế này thường sử dụng polyethylen glycol (PEG) được gắn kết
với biotin để tải các phức hợp lên các vi bọt thông qua tương tác avidin – biotin [34].
Ngoài ra, trên bề mặt vi bọt thường liên hợp với các phối tử có tính đặc hiệu
với mô đích. Điều này giúp tăng cường không chỉ hiệu ứng hình ảnh cản quang khi
siêu âm mà còn cả hiệu quả chuyển gen. Một số loại phối tử phổ biến đã được sử
dụng liên hợp với các vi bọt như các kháng thể, peptid và vitamin. Kháng thể đặc
5
hiệu với mô đích là phối tử được sử dụng liên hợp với vi bọt thông qua cầu nối PEG.
Ví dụ, kháng thể CD105 (endoglin) sử dụng trong hệ vi bọt chuyển gen kháng lại sự
hình thành mạch máu trong điều trị ung thư hay kháng thể protein-2 liên kết vi ống
(MAP-2) có thể nâng cao hiệu quả điều trị tổn thương tủy sống [57]. Để tạo các vi
bọt gắn kết với các kháng thể, người ta cũng thường sử dụng tương tác avidin –
biotin. Peptid liên kết đặc hiệu với các vị trí đích đã được nghiên cứu và gắn kết với
vi bọt thông qua cầu nối PEG. Liên quan đến việc tạo các vi bọt hướng đích, một số
nghiên cứu cho thấy khả năng sử dụng của các peptid liên kết đặc hiệu với thụ thể tế
bào gan sản xuất erythropoietin A2 trên tế bào khối u, VEGFR2 của tế bào nội mô
quanh khối u [36]. Acid folic (vitamin B9) cũng là một phối tử được liên hợp với hệ
vi bọt chuyển gen hướng đích. Kết quả một nghiên cứu cho thấy hệ vi bọt kết hợp
siêu âm đã chuyển gen chỉ thị mã hóa tạo luciferase gắn acid folic, hệ này có khả
năng chuyển và biểu hiện gen cao, hướng đích u não [18]. Ngoài ra, một số loại
protein và đường, như transferrin và mannose, cũng được sử dụng làm phối tử gắn
kết với vi bọt.
1.1.1.3. Một số thông số đánh giá đặc điểm lý học của vi bọt
Khi đánh giá vi bọt, có nhiều tiêu chí cần quan tâm, bao gồm: số lượng hay
nồng độ, kích thước vi bọt, tốc độ hòa tan khí cao, diện tích bề mặt, thế zeta, và khả
năng phá vỡ và xẹp lại của vi bọt. Trong đó, các tiêu chí cơ bản nhất ảnh hưởng đến
khả năng ứng dụng của vi bọt trong chẩn đoán và điều trị bệnh là nồng độ, kích thước
của vi bọt, thế zeta [32].
Nồng độ và kích thước: vi bọt là những bong bóng có đường kính cỡ vài μm,
nhưng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau, quy ước giới hạn đường kính của vi
bọt khác nhau. Ví dụ, trong nghiên cứu về hoạt động sinh lý, vi bọt là những bọt có
đường kính trong phạm vi 10 μm [44]. Trong khi trong lĩnh vực vật lý chất lỏng, các
bọt khí có đường kính khoảng vài trăm μm trở xuống đã được coi là vi bọt. Nồng độ
6
hay số lượng vi bọt trong mẫu thể hiện sức chứa các vật liệu. Nồng độ càng cao khả
năng chứa một lượng nhiều hơn các vật liệu như ADN hoặc ARN.
Thế zeta: là điện thế trong lớp kép phân giới/tiếp xúc tại vị trí của một mặt
phẳng trượt so với một khối chất dịch tách phần tiếp xúc/giao diện. Nói cách khác,
thế zeta là sự chênh lệch về điện thế giữa sự phân tán trung bình và lớp tĩnh của phần
dung dịch bao quanh tiểu phân. Với vi bọt, thế zeta là yếu tố quan trọng cần xem xét
để tối ưu hóa quá trình tạo vi bọt, đồng thời là chỉ số hỗ trợ dự đoán sự ổn định của
vi bọt. Vi bọt có thế zeta âm lớn có xu hướng đẩy những hạt có thế zeta thấp, do đó
quyết định sự tương tác của vi bọt với các thành phần khác trong hệ tuần hoàn [45].
Khả năng phá vỡ và xẹp lại của vi bọt: áp suất bên trong của vi bọt tăng lên
khi bán kính giảm (áp suất tỉ lệ nghịch với bán kính). Do áp suất bên trong vi bọt lớn,
các khí bên trong có xu hướng khuếch tán từ nơi có áp suất cao sang nơi có áp suất
thấp, khiến vi bọt trương xẹp lại và vỡ. Hiện tượng này gây ra tốc độ di chuyển cao
của các hạt khí ra chất lỏng xung quanh [32].
1.1.2. Hệ vi bọt mang gen
1.1.2.1. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt mang gen
Sự kết hợp giữa siêu âm và vi bọt giúp tăng cường tính thấm qua màng tế bào
ngay cả khi sử dụng sóng siêu âm cường độ yếu, dẫn đến tăng cường sự hấp thu
thuốc và gen. Các vi bọt dưới tác động của áp lực âm thanh ổn định sẽ gây ra dao
động tuyến tính và tần số phản xạ bằng tần số truyền đi. Sự gia tăng của áp suất âm
dưới ngưỡng của áp lực quán tính, gây ra sự giãn nở và nén của các vi bọt. Ngoài ra,
sự dao động của vi bọt còn tạo ra vi dòng ổn định và lực cắt lớn. Khi tăng áp suất âm
thanh, hiện tượng áp lực quán tính xuất hiện, dao động của các vi bọt trở nên mạnh
hơn và có thể phá vỡ vi bọt [11]. Khả năng tăng tính thấm màng tế bào và mạch máu
của các vi bọt kết hợp siêu âm được phát triển như một hệ vận chuyển gen không
xâm lấn mô.
7
Cơ chế tăng hiệu quả chuyển gen qua màng tế bào đã được mô tả rõ ràng (Hình
1.2). Ở áp suất âm thanh thấp, các dao động của vi bọt trong áp lực ổn định gần màng
tế bào có thể tạo ra các dòng chảy và lực cắt để làm vỡ màng bao gồm các hiện tượng
đẩy và kéo trên màng tế bào như xoa bóp, tăng hoạt động nội bào khi có mặt các vi
bọt và tạo điều kiện cho việc chuyển gen, trong khi hạn chế bất kì tổn thương nào
cho tế bào [34].
Hình 1.2. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt kết hợp siêu âm [8].
Ở áp suất âm thanh cao, hiện tương vi tiêm xảy ra trong áp lực quán tính sẽ
tạo ra các lỗ hổng tạm thời trên màng tế bào. Diện tích các lỗ hồng gây ra bởi sóng
siêu âm tỉ lệ thuận với tần suất của quá trình tạo lỗ hổng ở áp lực quán tính dưới áp
suất âm. Áp lực quán tính hình thành có thể phá vỡ tính toàn vẹn của nội mô mạch
máu, làm tăng tính thấm qua mạch đối với acid nucleic trong tuần hoàn. Đây là một
8
phương pháp hiệu quả cao để chuyển gen, nhưng có liên quan đến tổn thương mạch
máu và xuất huyết [19]. Để hạn chế nhược điểm này, người ta sử dụng phương pháp
siêu âm tập trung (FUS), tức chỉ tập trung sóng siêu âm tần số cao tại vị trí khối u
mà không tại các mô lành. Đặc biệt, tần số cộng hưởng siêu âm cao khi kết hợp với
siêu âm tập trung có khả năng mở tạm thời hàng rào máu não trong vài giờ, giúp giải
phóng thuốc, tăng khả năng thấm và lưu giữ tại mô u não [49]. Việc phá vỡ hàng rào
này giúp mở ra bước đột phá mới trong điều trị u não, tạo đà phát triển cho việc sử
dụng sóng siêu âm tập trung phối hợp với vi bọt để chuyển gen bằng phương pháp
không xâm lấn đối với bệnh u não [19], [49].
1.1.2.2. Một số phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen
Vi bọt được chế tạo để tải gen điều trị và gắn các phối tử (ví dụ: kháng thể gắn
đặc hiệu với tế bào đích) để tăng tác dụng trúng đích. Đánh giá đặc điểm sinh học
của hệ vi bọt mang gen, trước tiên phải đánh giá hiệu quả gắn phối tử và gắn gen
điều trị lên các vi bọt, đánh giá khả năng bảo vệ gen điều trị của vi bọt khỏi DNase
(hoặc ribonuclease nếu gen trị liệu có bản chất ARN), sau đó đánh giá khả năng tiếp
cận và khả năng chuyển gen của hệ vận chuyển với các tế bào hoặc mô đích, v.v…
Đánh giá mức độ gắn kháng thể vào vi bọt: kháng thể thứ cấp được đánh dấu
bởi fluorescein isothiocyanate (FITC) kết hợp kháng thể đang được gắn trên bề mặt
vi bọt. Kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu (confocal) thu được hình ảnh huỳnh
quang sẽ xác nhận hiệu quả gắn kháng thể hướng đích lên bề mặt vi bọt [57].
Đánh giá mức độ gắn gen vào vi bọt: tương tác tĩnh điện quyết định khả năng
gắn gen lên bề mặt vi bọt. Vi bọt gắn càng nhiều gen thì khả năng chuyển được gen
vào tế bào có tỉ lệ cao hơn. Liên kết ADN với các vi bọt được xác nhận bằng cách
rửa vi bọt ở các thời điểm nối tiếp khác nhau lên đến 8 giờ sau khi gắn ADN và gộp
ADN từ cả hai mẫu liên kết và không liên kết bằng hỗn hợp chloroform/isoamyl
alcohol (24:1) để làm vỡ các vi hạt và loại bỏ lipid các thành phần. Các thể tích mẫu
9
tương đương sau đó được phân tích hàm lượng ADN bằng điện di trên gel agarose,
sau đó nhuộm ethidium bromide hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang không gây đột biến
Novel juice. Độ đậm nhạt và số lượng các băng ADN trên bản gel điện di giữa các
làn sẽ được so sánh để đánh giá mức độ gắn gen lên vi bọt. Băng ADN càng đậm thì
ADN tự do càng nhiều và khả năng gắn ADN lên vi bọt càng thấp [6].
Đánh giá khả năng bảo vệ gen điều trị của vi bọt khỏi DNase: khi vi bọt mang
gen di chuyển trong máu sẽ tiếp xúc với các chất và enzym có hoạt tính phân hủy
deoxyribonucleic. Để xác định liệu ADN trên bề mặt của vi bọt có được bảo vệ khỏi
các DNase có trong tuần hoàn hay không, các vi bọt được nạp ADN được tiếp tục ủ
trong dung dịch đệm phản ứng chứa DNase, sau đó các mẫu được điện di và nhuộm
để xác định sự có mặt của ADN trên gel [6]. Ở các mẫu vi bọt gắn ADN, băng ADN
sẽ hiện hình, còn ở các mẫu so sánh chứa ADN tự do (không liên kết với MB) sẽ
không có băng ADN vì bị phân hủy bởi DNase.
Đánh giá khả năng chuyển gen vào tế bào/mô in vitro: sử dụng phương pháp
hóa mô miễn dịch huỳnh quang để quan sát màu của gen chỉ thị; sử dụng hệ thống
flow cytometry để đếm tế bào đã được mang gen chỉ thị; sử dụng Western blot để
bán định lượng protein được mã hóa bởi gen chuyển trong mẫu ly giải tế bào hoặc
mô; sử dụng phương pháp qRT-PCR để định lượng ARN thông tin được mã hóa bởi
gen chuyển trong mẫu ly giải tế bào hoặc mô [6].
1.1.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ vi bọt trong chẩn đoán và điều trị
Hệ vi bọt đã được nghiên cứu trong điều trị các bệnh lý suy giảm chức năng
não bộ. Gen mã hóa cho protein kháng β-amyloid được áp dụng để điều trị bệnh
Alzheimer, và được chuyển thành công vào não bởi hệ vi bọt kết hợp siêu âm. Ngoài
ra, các nhà khoa học cũng sử dụng hệ vi bọt để vận chuyển siRNA hòa hợp vào bộ
gen của tế bào thần kinh ở não bộ mà không gây tổn thương để ức chế biểu hiện của
protein huntington đột biến [5]. Kết quả nghiên cứu sử dụng hệ vi bọt đa chức năng
10
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN PHI TOÀN
ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH
HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSV-
TK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI - 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN PHI TOÀN
ĐÁNH GIÁ ĐẶC ĐIỂM LÝ HỌC VÀ SINH
HỌC CỦA HỆ VI BỌT MANG GEN HSV-
TK VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG VEGFR2
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH DƯỢC
MÃ SỐ: 8720208
Người hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thị Lập
Nơi thực hiện nghiên cứu:
1. Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Đại học Quốc gia Thanh Hoa, Đài Loan
HÀ NỘI - 2022
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, Phòng Sau
đại học và toàn thể các thầy cô Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Dược Hà Nội,
đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn này.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin gửi lời cảm ơn đến PGS. TS. Nguyễn
Thị Lập đã tận tình giúp đỡ, tin tưởng và trao cho tôi cơ hội được nghiên cứu một
vấn đề rất mới so với kinh nghiệm của mình. Quãng thời gian làm việc với Cô đã
giúp tôi học được rất nhiều kinh nghiệm trong việc viết và đăng báo.
Tiếp theo, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến GS. Chih Kuang Yeh – Khoa
Kỹ thuật Y sinh và Khoa học môi trường - Trường Đại học Quốc gia Thanh Hoa (Đài
Loan), là người thầy hỗ trợ chuyên môn để tôi hoàn thành luận văn này.
Cảm ơn các anh chị trong lớp Cao học Khóa 25, lớp chuyên ngành Hóa sinh,
DS. Lê Nguyễn Anh Thư, NCS. Trần Thị Anh Thơ đã luôn là nơi trao đổi kiến
thức về đề tài và là nơi hàn huyên sau những tiết học căng thẳng.
Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn thân của tôi DS. Nguyễn Cao Đức và
các em trong Hội Sinh viên Trường Đại học Dược Hà Nội. Mọi người là những điểm
tựa tinh thần luôn ủng hộ tôi hết mình.
Cuối cùng, tôi gửi một lời cảm ơn nhỏ bé nhất đến chính bản thân mình vì đã
tạm quên đi những lo lắng trong cuộc sống và giữ được một tinh thần lạc quan nhất
trong quá trình học và hoàn thành luận văn thạc sĩ.
Bằng cả trái tim đam mê khoa học và khối óc luôn tò mò những miền kiến
thức mới, xin cảm ơn!
Hà Nội, ngày 9 tháng 4 năm 2022
Học viên
Nguyễn Phi Toàn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ........................................................
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................
DANH MỤC CÁC BẢNG...........................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
1.1. Vi bọt và hệ vi bọt mang gen ........................................................................... 3
1.1.1. Vi bọt.......................................................................................................... 3
1.1.1.1. Cấu tạo vi bọt ....................................................................................... 3
1.1.1.2. Khả năng gắn các chất lên bề mặt vi bọt ............................................. 5
1.1.1.3. Một số thông số đánh giá đặc điểm lý học của vi bọt ......................... 6
1.1.2. Hệ vi bọt mang gen .................................................................................... 7
1.1.2.1. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt mang gen ........................................ 7
1.1.2.2. Một số phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang
gen ..................................................................................................................... 9
1.1.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ vi bọt trong chẩn đoán và điều trị ........ 10
1.2. Vài nét về gen herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) ............... 12
1.2.1. Khái niệm ................................................................................................. 12
1.2.2. Vai trò của gen HSV-TK trong điều trị ung thư ...................................... 12
1.2.3. Một số nghiên cứu về hệ vi bọt mang gen HSV-TK ............................... 14
1.3. Vài nét về thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu 2 (VEGFR2) ......... 16
1.3.1. Khái niệm ................................................................................................. 16
1.3.2. Con đường truyền tín hiệu và chức năng sinh học của VEGFR2 ........... 16
1.3.3. Vai trò của VEGFR2 trong điều trị ung thư ............................................ 17
1.3.4. Một số nghiên cứu về hệ vi bọt hướng đích VEGFR2 ............................ 18
Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 21
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ................................................................................. 21
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ........................................................................... 21
2.1.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu................................................................................ 25
2.3.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của
hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2............................. 25
2.3.1.1. Phương pháp tạo hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng
VEGFR2 ......................................................................................................... 25
2.3.1.2. Phương pháp đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta)
của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2 ................... 28
2.3.2. Phương pháp đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-
TK và kháng thể kháng VEGFR2 ...................................................................... 28
2.3.2.1. Phương pháp đánh giá mức độ gắn VEGFR2 lên hệ vi bọt .............. 28
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt.......... 29
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của
hệ vi bọt........................................................................................................... 30
2.3.2.4. Phương pháp xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng kính hiển
vi huỳnh quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh (cryo-TEM)... 32
2.3.3. Xử lý số liệu ............................................................................................. 32
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 33
3.1. Kết quả đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi bọt
mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2 ............................................... 33
3.1.1. Kết quả về kích cỡ của các loại vi bọt ..................................................... 33
3.1.2. Kết quả về nồng độ của các loại vi bọt .................................................... 35
3.1.3. Kết quả về thế zeta của các loại vi bọt..................................................... 36
3.2. Kết quả đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và
kháng thể kháng VEGFR2 .................................................................................... 37
3.2.1. Kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt.. 37
3.2.2. Kết quả đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt......................... 38
3.2.3. Kết quả đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của hệ vi bọt
............................................................................................................................ 40
3.2.4. Kết quả xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng bằng kính hiển vi
huỳnh quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh............................... 41
Chương 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 44
4.1. Về kết quả đánh giá đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi
bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2......................................... 44
4.2. Về kết quả đánh giá các đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK
và kháng thể kháng VEGFR2 ............................................................................... 47
4.2.1. Về kết quả đánh giá mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 lên hệ vi bọt
............................................................................................................................ 47
4.2.2. Về kết quả đánh giá mức độ tải gen HSV-TK lên hệ vi bọt .................... 47
4.2.3. Về kết quả đánh giá khả năng bảo vệ gen HSV-TK khỏi DNase của hệ vi
bọt....................................................................................................................... 49
4.2.4. Về kết quả xác định cấu trúc sinh học của hệ vi bọt bằng kính hiển vi huỳnh
quang và kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh.......................................... 50
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT VẮT TIẾNG ANH TIẾNG VIỆT
ADN Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic
BSE Bystander Effect Hiệu ứng người ngoài cuộc
C3F8 Octafluoropropane Octa-floropropan
CMB Cationic microbubble Vi bọt mang điện tích dương
Cryogenic-Transmission Kính hiển vi điện tử truyền qua
cryo-TEM
electron microscope đông lạnh
DNase Deoxyribonuclease Deoxyribonuclease
FITC Fluorescein isothiocyanate Fluorescein isothiocyanat
FUS Focused ultrasound Siêu âm hội tụ cường độ cao
GCV Ganciclovir Ganciclovir
Glial cell line-derived Yếu tố thần kinh có nguồn gốc từ
GDNF
neurotrophic factor dòng tế bào thần kinh đệm
Herpes simplex virus - Virus Herpes simplex - thymidine
HSV-TK
thymidine kinase kinase
Herpes simplex virus Gen Virus Herpes simplex
HSV-TK gene
thymidine kinase gene thymidine kinase
Herpes simplex virus
Liệu pháp phối hợp gen HSV-TK
HSV-TK/GCV thymidine
và Ganciclovir
kinase/Ganciclovir
MB Microbubble Vi bọt
ORF Open Reading Frame Khung đọc mở
Plasmid deoxyribonucleic
pADN Plasmid acid deoxyribonucleic
acid
PEG Polyethylen glycol Polyethylen glycol
RNA Ribonucleic acid Acid ribonucleic
siRNA Small interfering RNA ARN can thiệp nhỏ
VEGFR2 cationic Vi bọt điện tích dương mang
VCMB
microbubble kháng thể kháng VEGFR2
Vascular endothelial Yếu tố tăng trưởng tế bào nội mô
VEGF
growth factors mạch máu
Vascular endothelial Thụ thể yếu tố tăng trưởng nội
VEGFR2
growth factors receptor 2 mô mạch máu 2
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Tên hình Trang
1 Hình 1.1. Cấu tạo vi bọt. tr. 3
2 Hình 1.2. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt kết hợp siêu âm. tr. 8
3 Hình 1.3. Minh họa cơ chế của BSE. tr. 13
4 Hình 1.4. Cấu trúc của VEGFR2. tr. 16
5 Hình 1.5. Con đường truyền tín hiệu của VEGFR2. tr. 17
6 Hình 2.1. Bản đồ plasmid ADN chứa gen HSV-TK. tr. 21
7 Hình 2.2. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu. tr. 25
8 Hình 2.3. Minh họa các bước chế tạo hệ vi bọt mang gen và kháng tr. 26
thể.
9 Hình 3.1. Phân bố đường kính – số lượng của các loại vi bọt gắn tr. 34
pADN.
10 Hình 3.2. Phân bố đường kính – thể tích của các loại vi bọt gắn tr. 35
pADN.
11 Hình 3.3. Mức độ gắn kháng thể kháng VEGFR2 vào hệ vi bọt tr. 38
VCMB-pADN thông qua hiệu quả gắn kết avidin-biotin.
12 Hình 3.4. Hình ảnh điện di thể hiện hiệu quả vi bọt tải gen. tr. 39
13 Hình 3.5. Hình ảnh điện di thể hiện khả năng vi bọt VCMB bảo vệ tr. 40
pADN khỏi sự thủy phân của endonuclease.
14 Hình 3.6. Hình ảnh hiển vi huỳnh quang của phức hợp VCMB – tr. 42
pADN.
15 Hình 3.7. Hình ảnh cấu trúc vi bọt thể hiện gắn kết kháng thể kháng tr. 43
VEGFG2 quan sát bởi kính hiển vi điện tử truyền qua đông lạnh
(cryo-TEM).
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1 Bảng 2.1. Hóa chất thí nghiệm. tr. 22
2 Bảng 2.2. Dụng cụ, thiết bị. tr. 23
Bảng 2.3. Tỷ lệ khối lượng/khối lượng thành phần lipid tạo màng tr. 27
3
các loại vi bọt.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả năng tải gen của tr. 30
4
hệ vi bọt.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm điện di đánh giá khả năng bảo vệ ADN tr. 31
5
khỏi DNase của hệ vi bọt.
6 Bảng 3.1. Đường kính trung bình của các loại vi bọt. tr. 33
7 Bảng 3.2. Nồng độ và tổng thể tích của các loại vi bọt. tr. 36
8 Bảng 3.3. Thế zeta của các loại vi bọt. tr. 37
ĐẶT VẤN ĐỀ
Gen trị liệu là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư. Hiện nay,
vector có nguồn gốc virus là hệ vận chuyển gen chủ yếu. Tuy nhiên, những vấn đề
về tính an toàn, khả năng kích hoạt hệ thống miễn dịch của bệnh nhân chống lại virus,
và khả năng kích thích khối u phát triển của chính virus, đã hạn chế việc ứng dụng
gen trị liệu trên thực tế lâm sàng [27]. Do vậy, phát triển hệ vận chuyển gen trị liệu
không phải virus là một tất yếu cần được nghiên cứu. Thực tế cho thấy các vector
không có nguồn gốc virus đã giúp cải thiện hiệu quả chuyển gen và tính an toàn sinh
học, điển hình là hệ vi bọt mang gen [24], [58]. Vi bọt (microbubble) là các tiểu phân
chứa khí, có thể được bao bọc bởi lớp màng mang điện tích và có khả năng liên kết
với các phân tử acid nucleic. Cấu trúc của vi bọt cho phép gắn thêm nhiều loại phối
tử nhằm chế tạo hệ chuyển gen vi bọt có tác dụng trúng đích [24].
Gen Herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) còn được gọi là “gen
tự sát” (suicide gene), mã hóa cho thymidine kinase có tác dụng chuyển hóa tiền chất
ganciclovir (GCV) thành chất có khả năng xen vào sợi ADN đang nhân đôi, ức chế
tổng hợp ADN, ngăn chặn chu kỳ tế bào, và dẫn đến quá trình apoptosis. Một số
nghiên cứu đã chứng minh, liệu pháp gen sử dụng HSV-TK kết hợp GCV có tác dụng
ức chế nhiều loại ung thư trong đó có ung thư não [7], [13], [40], [55]. Thụ thể
vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) là một thụ thể của yếu tố
tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF). Thụ thể này có sự tăng biểu hiện trên màng
tế bào nội mô xung quanh hệ mạch máu nuôi dưỡng khối u và trên màng các tế bào
ung thư như ung thư vú, ung thư phổi, u nguyên bào thần kinh đệm [28], [39], [54].
Hiện nay, tại Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tạo hệ chuyển gen vi bọt
được đăng tải trên các tạp chí khoa học. Với mục đích tạo hệ vận chuyển gen điều trị
ung thư trúng đích, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá đặc điểm lý học và sinh
1
học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2” với hai mục
tiêu sau:
1. Đánh giá được đặc điểm lý học (kích cỡ, nồng độ và thế zeta) của hệ vi bọt mang
gen HSV-TK và kháng thể kháng VEGFR2.
2. Đánh giá được một số đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen HSV-TK và kháng
thể kháng VEGFR2.
2
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Vi bọt và hệ vi bọt mang gen
1.1.1. Vi bọt
1.1.1.1. Cấu tạo vi bọt
Vi bọt là những tiểu phân chứa khí có đường kính nhỏ hơn 10 µm, nhưng lớn
hơn xấp xỉ 0,5 micromet. Vi bọt có cấu tạo gồm 2 phần chính là lõi khí và lớp vỏ bao
bên ngoài (Hình 1.1) [44]:
Thành phần lõi khí: gồm một chất khí hoặc hỗn hợp các chất khí. Sự kết hợp
các loại khí để tạo ra chênh lệch về áp suất riêng phần và tạo ra áp suất thẩm thấu
làm ổn định vi bọt. Sử dụng pha khí là không khí (hỗn hợp khí oxy và nitơ) thì vi bọt
tạo thành chỉ tồn tại trong tuần hoàn chưa đến 1 phút. Trong khi đó, các loại khí
không hòa tan như lưu huỳnh hexafluoride, C3F8 (perfluorocarbon), C4F10
(perflubutan), C5F12 (perflenapent) và C6F14 (perflexan) cho thấy khả năng kéo dài
Hình 1.1. Cấu tạo vi bọt [44].
thời gian tuần hoàn trong máu của vi bọt từ vài phút lên vài giờ. Đây cũng là các loại
khí trơ thường được sử dụng cấu tạo nên lõi khí của vi bọt.
Thành phần màng: là lớp bao bọc bên ngoài lõi khí; ba nhóm chất chính hay
được sử dụng để cấu tạo màng là protein, lipid và polymer. Sự khuếch tán khí ra
ngoài vi bọt và các tính chất cơ học của vi bọt phụ thuộc vào bản chất của thành phần
3
lớp màng này. Nếu nguyên liệu cấu tạo màng có độ đàn hồi tăng, năng lượng âm mà
nó có thể chịu được trước khi nở to hoặc vỡ sẽ tăng, từ đó tăng thời gian ổn định của
vi bọt lên nhiều lần. Sau đây là một số ví dụ:
+ Vi bọt có màng protein: OptisonTM (GE Healthcare) là chế phẩm vi bọt có
màng albumin với lõi khí perfluorocarbon. Đặc tính vật lý của perfluorocarbon là có
độ hòa tan thấp nên giúp cho vi bọt có khả năng tồn tại lâu hơn trong cơ thể [37].
Nghiên cứu của Korpanty và cộng sự cũng sử dụng albumin để tạo nên lớp vỏ của vi
bọt. Lớp vỏ protein của vi bọt trong nghiên cứu của nhóm tác giả này được gắn với
avidin cho phép kết hợp với kháng thể qua cầu nối trung gian biotin hướng đến tác
dụng tại đích là các tế bào biểu hiện các kháng nguyên tương ứng [26].
+ Vi bọt có màng lipid: SonoVueTM là chế phẩm vi bọt được ổn định bởi lớp
phospholipid và chứa lõi khí lưu huỳnh hexafluoride (SF6). Hỗn dịch vi bọt ổn định
theo thời gian sau khi hoàn nguyên. Nồng độ vi bọt của SonoVueTM là từ 100 đến 500
triệu vi bọt mỗi ml. Đường kính vi bọt trung bình là 2,5 µm và hơn 90% vi bọt nhỏ
hơn 8 µm. Thời gian bán phân bố khoảng 1 phút và thời gian bán thải khoảng 6 phút
[42]. Lớp vỏ phospholipid có khả năng tự lắp ráp một cách tự nhiên, tạo thành một
lớp có tính định hướng cao tại bề mặt tiếp xúc giữa pha khí và pha nước. Cụ thể, các
chuỗi acyl kỵ nước tiếp xúc với pha khí (kị nước) và các nhóm ưa nước quay ra phía
bên ngoài môi trường tiếp xúc với pha nước. Ngoài ra, lớp màng lipid có sức căng
bề mặt thấp giúp cho vi bọt ổn định hơn. Lớp lipid còn có tính kết dính cao do tương
tác kỵ nước và tương tác Van Der Waals giữa các chuỗi acyl [4]. Như vậy, các phân
tử lipid được liên kết với nhau bằng tương tác vật lý "yếu", không vướng các mắt
xích, làm cho lớp vỏ có thể dễ dàng mở rộng và nén lại khi phối hợp quá trình siêu
âm. Những cơ chế này giúp vi bọt cấu tạo bởi màng lipid ổn định hơn, mà không phụ
thuộc vào sự hình thành cầu nối disulfid như màng protein.
4
+ Vi bọt có màng polymer: vi bọt có màng được cấu tạo từ các đơn phân
poly(L-lactide-co-glycolide), ký hiệu là PLGA, được Cui và cộng sự chế tạo bằng
phương pháp bay hơi dung môi. Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy các hạt
hình cầu với bề mặt nhẵn, không có lỗ rỗng. PLGA bao quanh vi bọt chứa không khí
hoặc perfluoropropane có khả năng làm rõ hình ảnh siêu âm tâm thất trái [12].
1.1.1.2. Khả năng gắn các chất lên bề mặt vi bọt
Lớp vỏ lipid tích điện dương của vi bọt có thể tạo phức hợp với acid nucleic
tự do tích điện âm bằng tương tác tĩnh điện. Đây là một phương pháp đơn giản phù
hợp với nhiều loại acid nucleic như plasmid ADN, siRNA và miRNA. Việc tải các
acid nucleic lên bề mặt của các vi bọt tích điện dương có thể làm tăng tính ổn định
của acid nucleic và tăng hiệu quả chuyển gen khi có mặt trong huyết thanh [14], [15].
Do trong huyết thanh tồn tại các endonuclease (enzym phân hủy acid nucleic), khi
phân tử acid nucleic gắn trên vi bọt hoặc được bọc vào trong lõi vi bọt khiến cho
endonuclease không thể tiếp cận hoặc bị hạn chế về mặt không gian nên không thể
phân hủy cơ chất.
Vi bọt có thể tải lên bề mặt các phức hợp acid nucleic – liposome (lipoplex)
hoặc phức hợp acid nucleic – polymer (polyplex). Việc sử dụng lipoplex hoặc
polyplex có thể làm tăng khối lượng tải acid nucleic lên các vi bọt. Hai cách thức này
giúp giải phóng phức hợp từ các vi bọt nhờ sự kích thích của sóng siêu âm có thể
làm tăng thêm hiệu quả chuyển gen hơn so với các phương pháp chuyển acid nucleic
khác. Các dạng bào chế này thường sử dụng polyethylen glycol (PEG) được gắn kết
với biotin để tải các phức hợp lên các vi bọt thông qua tương tác avidin – biotin [34].
Ngoài ra, trên bề mặt vi bọt thường liên hợp với các phối tử có tính đặc hiệu
với mô đích. Điều này giúp tăng cường không chỉ hiệu ứng hình ảnh cản quang khi
siêu âm mà còn cả hiệu quả chuyển gen. Một số loại phối tử phổ biến đã được sử
dụng liên hợp với các vi bọt như các kháng thể, peptid và vitamin. Kháng thể đặc
5
hiệu với mô đích là phối tử được sử dụng liên hợp với vi bọt thông qua cầu nối PEG.
Ví dụ, kháng thể CD105 (endoglin) sử dụng trong hệ vi bọt chuyển gen kháng lại sự
hình thành mạch máu trong điều trị ung thư hay kháng thể protein-2 liên kết vi ống
(MAP-2) có thể nâng cao hiệu quả điều trị tổn thương tủy sống [57]. Để tạo các vi
bọt gắn kết với các kháng thể, người ta cũng thường sử dụng tương tác avidin –
biotin. Peptid liên kết đặc hiệu với các vị trí đích đã được nghiên cứu và gắn kết với
vi bọt thông qua cầu nối PEG. Liên quan đến việc tạo các vi bọt hướng đích, một số
nghiên cứu cho thấy khả năng sử dụng của các peptid liên kết đặc hiệu với thụ thể tế
bào gan sản xuất erythropoietin A2 trên tế bào khối u, VEGFR2 của tế bào nội mô
quanh khối u [36]. Acid folic (vitamin B9) cũng là một phối tử được liên hợp với hệ
vi bọt chuyển gen hướng đích. Kết quả một nghiên cứu cho thấy hệ vi bọt kết hợp
siêu âm đã chuyển gen chỉ thị mã hóa tạo luciferase gắn acid folic, hệ này có khả
năng chuyển và biểu hiện gen cao, hướng đích u não [18]. Ngoài ra, một số loại
protein và đường, như transferrin và mannose, cũng được sử dụng làm phối tử gắn
kết với vi bọt.
1.1.1.3. Một số thông số đánh giá đặc điểm lý học của vi bọt
Khi đánh giá vi bọt, có nhiều tiêu chí cần quan tâm, bao gồm: số lượng hay
nồng độ, kích thước vi bọt, tốc độ hòa tan khí cao, diện tích bề mặt, thế zeta, và khả
năng phá vỡ và xẹp lại của vi bọt. Trong đó, các tiêu chí cơ bản nhất ảnh hưởng đến
khả năng ứng dụng của vi bọt trong chẩn đoán và điều trị bệnh là nồng độ, kích thước
của vi bọt, thế zeta [32].
Nồng độ và kích thước: vi bọt là những bong bóng có đường kính cỡ vài μm,
nhưng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau, quy ước giới hạn đường kính của vi
bọt khác nhau. Ví dụ, trong nghiên cứu về hoạt động sinh lý, vi bọt là những bọt có
đường kính trong phạm vi 10 μm [44]. Trong khi trong lĩnh vực vật lý chất lỏng, các
bọt khí có đường kính khoảng vài trăm μm trở xuống đã được coi là vi bọt. Nồng độ
6
hay số lượng vi bọt trong mẫu thể hiện sức chứa các vật liệu. Nồng độ càng cao khả
năng chứa một lượng nhiều hơn các vật liệu như ADN hoặc ARN.
Thế zeta: là điện thế trong lớp kép phân giới/tiếp xúc tại vị trí của một mặt
phẳng trượt so với một khối chất dịch tách phần tiếp xúc/giao diện. Nói cách khác,
thế zeta là sự chênh lệch về điện thế giữa sự phân tán trung bình và lớp tĩnh của phần
dung dịch bao quanh tiểu phân. Với vi bọt, thế zeta là yếu tố quan trọng cần xem xét
để tối ưu hóa quá trình tạo vi bọt, đồng thời là chỉ số hỗ trợ dự đoán sự ổn định của
vi bọt. Vi bọt có thế zeta âm lớn có xu hướng đẩy những hạt có thế zeta thấp, do đó
quyết định sự tương tác của vi bọt với các thành phần khác trong hệ tuần hoàn [45].
Khả năng phá vỡ và xẹp lại của vi bọt: áp suất bên trong của vi bọt tăng lên
khi bán kính giảm (áp suất tỉ lệ nghịch với bán kính). Do áp suất bên trong vi bọt lớn,
các khí bên trong có xu hướng khuếch tán từ nơi có áp suất cao sang nơi có áp suất
thấp, khiến vi bọt trương xẹp lại và vỡ. Hiện tượng này gây ra tốc độ di chuyển cao
của các hạt khí ra chất lỏng xung quanh [32].
1.1.2. Hệ vi bọt mang gen
1.1.2.1. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt mang gen
Sự kết hợp giữa siêu âm và vi bọt giúp tăng cường tính thấm qua màng tế bào
ngay cả khi sử dụng sóng siêu âm cường độ yếu, dẫn đến tăng cường sự hấp thu
thuốc và gen. Các vi bọt dưới tác động của áp lực âm thanh ổn định sẽ gây ra dao
động tuyến tính và tần số phản xạ bằng tần số truyền đi. Sự gia tăng của áp suất âm
dưới ngưỡng của áp lực quán tính, gây ra sự giãn nở và nén của các vi bọt. Ngoài ra,
sự dao động của vi bọt còn tạo ra vi dòng ổn định và lực cắt lớn. Khi tăng áp suất âm
thanh, hiện tượng áp lực quán tính xuất hiện, dao động của các vi bọt trở nên mạnh
hơn và có thể phá vỡ vi bọt [11]. Khả năng tăng tính thấm màng tế bào và mạch máu
của các vi bọt kết hợp siêu âm được phát triển như một hệ vận chuyển gen không
xâm lấn mô.
7
Cơ chế tăng hiệu quả chuyển gen qua màng tế bào đã được mô tả rõ ràng (Hình
1.2). Ở áp suất âm thanh thấp, các dao động của vi bọt trong áp lực ổn định gần màng
tế bào có thể tạo ra các dòng chảy và lực cắt để làm vỡ màng bao gồm các hiện tượng
đẩy và kéo trên màng tế bào như xoa bóp, tăng hoạt động nội bào khi có mặt các vi
bọt và tạo điều kiện cho việc chuyển gen, trong khi hạn chế bất kì tổn thương nào
cho tế bào [34].
Hình 1.2. Cơ chế chuyển gen của hệ vi bọt kết hợp siêu âm [8].
Ở áp suất âm thanh cao, hiện tương vi tiêm xảy ra trong áp lực quán tính sẽ
tạo ra các lỗ hổng tạm thời trên màng tế bào. Diện tích các lỗ hồng gây ra bởi sóng
siêu âm tỉ lệ thuận với tần suất của quá trình tạo lỗ hổng ở áp lực quán tính dưới áp
suất âm. Áp lực quán tính hình thành có thể phá vỡ tính toàn vẹn của nội mô mạch
máu, làm tăng tính thấm qua mạch đối với acid nucleic trong tuần hoàn. Đây là một
8
phương pháp hiệu quả cao để chuyển gen, nhưng có liên quan đến tổn thương mạch
máu và xuất huyết [19]. Để hạn chế nhược điểm này, người ta sử dụng phương pháp
siêu âm tập trung (FUS), tức chỉ tập trung sóng siêu âm tần số cao tại vị trí khối u
mà không tại các mô lành. Đặc biệt, tần số cộng hưởng siêu âm cao khi kết hợp với
siêu âm tập trung có khả năng mở tạm thời hàng rào máu não trong vài giờ, giúp giải
phóng thuốc, tăng khả năng thấm và lưu giữ tại mô u não [49]. Việc phá vỡ hàng rào
này giúp mở ra bước đột phá mới trong điều trị u não, tạo đà phát triển cho việc sử
dụng sóng siêu âm tập trung phối hợp với vi bọt để chuyển gen bằng phương pháp
không xâm lấn đối với bệnh u não [19], [49].
1.1.2.2. Một số phương pháp đánh giá đặc điểm sinh học của hệ vi bọt mang gen
Vi bọt được chế tạo để tải gen điều trị và gắn các phối tử (ví dụ: kháng thể gắn
đặc hiệu với tế bào đích) để tăng tác dụng trúng đích. Đánh giá đặc điểm sinh học
của hệ vi bọt mang gen, trước tiên phải đánh giá hiệu quả gắn phối tử và gắn gen
điều trị lên các vi bọt, đánh giá khả năng bảo vệ gen điều trị của vi bọt khỏi DNase
(hoặc ribonuclease nếu gen trị liệu có bản chất ARN), sau đó đánh giá khả năng tiếp
cận và khả năng chuyển gen của hệ vận chuyển với các tế bào hoặc mô đích, v.v…
Đánh giá mức độ gắn kháng thể vào vi bọt: kháng thể thứ cấp được đánh dấu
bởi fluorescein isothiocyanate (FITC) kết hợp kháng thể đang được gắn trên bề mặt
vi bọt. Kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu (confocal) thu được hình ảnh huỳnh
quang sẽ xác nhận hiệu quả gắn kháng thể hướng đích lên bề mặt vi bọt [57].
Đánh giá mức độ gắn gen vào vi bọt: tương tác tĩnh điện quyết định khả năng
gắn gen lên bề mặt vi bọt. Vi bọt gắn càng nhiều gen thì khả năng chuyển được gen
vào tế bào có tỉ lệ cao hơn. Liên kết ADN với các vi bọt được xác nhận bằng cách
rửa vi bọt ở các thời điểm nối tiếp khác nhau lên đến 8 giờ sau khi gắn ADN và gộp
ADN từ cả hai mẫu liên kết và không liên kết bằng hỗn hợp chloroform/isoamyl
alcohol (24:1) để làm vỡ các vi hạt và loại bỏ lipid các thành phần. Các thể tích mẫu
9
tương đương sau đó được phân tích hàm lượng ADN bằng điện di trên gel agarose,
sau đó nhuộm ethidium bromide hoặc thuốc nhuộm huỳnh quang không gây đột biến
Novel juice. Độ đậm nhạt và số lượng các băng ADN trên bản gel điện di giữa các
làn sẽ được so sánh để đánh giá mức độ gắn gen lên vi bọt. Băng ADN càng đậm thì
ADN tự do càng nhiều và khả năng gắn ADN lên vi bọt càng thấp [6].
Đánh giá khả năng bảo vệ gen điều trị của vi bọt khỏi DNase: khi vi bọt mang
gen di chuyển trong máu sẽ tiếp xúc với các chất và enzym có hoạt tính phân hủy
deoxyribonucleic. Để xác định liệu ADN trên bề mặt của vi bọt có được bảo vệ khỏi
các DNase có trong tuần hoàn hay không, các vi bọt được nạp ADN được tiếp tục ủ
trong dung dịch đệm phản ứng chứa DNase, sau đó các mẫu được điện di và nhuộm
để xác định sự có mặt của ADN trên gel [6]. Ở các mẫu vi bọt gắn ADN, băng ADN
sẽ hiện hình, còn ở các mẫu so sánh chứa ADN tự do (không liên kết với MB) sẽ
không có băng ADN vì bị phân hủy bởi DNase.
Đánh giá khả năng chuyển gen vào tế bào/mô in vitro: sử dụng phương pháp
hóa mô miễn dịch huỳnh quang để quan sát màu của gen chỉ thị; sử dụng hệ thống
flow cytometry để đếm tế bào đã được mang gen chỉ thị; sử dụng Western blot để
bán định lượng protein được mã hóa bởi gen chuyển trong mẫu ly giải tế bào hoặc
mô; sử dụng phương pháp qRT-PCR để định lượng ARN thông tin được mã hóa bởi
gen chuyển trong mẫu ly giải tế bào hoặc mô [6].
1.1.3. Một số nghiên cứu ứng dụng hệ vi bọt trong chẩn đoán và điều trị
Hệ vi bọt đã được nghiên cứu trong điều trị các bệnh lý suy giảm chức năng
não bộ. Gen mã hóa cho protein kháng β-amyloid được áp dụng để điều trị bệnh
Alzheimer, và được chuyển thành công vào não bởi hệ vi bọt kết hợp siêu âm. Ngoài
ra, các nhà khoa học cũng sử dụng hệ vi bọt để vận chuyển siRNA hòa hợp vào bộ
gen của tế bào thần kinh ở não bộ mà không gây tổn thương để ức chế biểu hiện của
protein huntington đột biến [5]. Kết quả nghiên cứu sử dụng hệ vi bọt đa chức năng
10