Chuẩn hóa phương pháp xác định hàm lượng vitamin d (d2 và d3) trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

  • 59 trang
  • file .pdf
ViÖn Dinh D−ìng
Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP
*****************
B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu
ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm
l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc
phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng
hiÖu n¨ng cao (HPLC)
Chñ nhiÖm ®Ò tµi : Ks. §oµn ThÞ H−êng
6544
20/9/2007
Hµ néi, 2007
ViÖn Dinh D−ìng
Trung t©m kiÓm nghiÖm vsATTP
*****************
B¸o c¸o kÕt qu¶ nghiªn cøu
ChuÈn hãa ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm
l−îng vitamin D (D2 vµ D3) trong thùc
phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p s¾c ký láng
hiÖu n¨ng cao (HPLC)
Chñ nhiÖm ®Ò tµi: Ks. §oµn ThÞ H−êng
C¸c c¸n bé tham gia: C n. NguyÔn Thu H»ng
C¬ quan chñ tr×: Trung t©m kiÓm nghiÖm VSATTP
C¬ quan chñ qu¶n: ViÖn dinh d−ìng
Kinh phÝ: 20 triÖu ®ång (Nguån NNS)
Hµ n«i, 2007
Môc lôc
TT Néi dung Trang
1 Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t
2 Danh môc c¸c b¶ng
3 Danh môc c¸c h×nh
4 PhÇn 1: Më ®Çu 1
5 PhÇn 2: Tæng quan 3
6 PhÇn 3: Môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8
1. Môc tiªu 8
2. §èi t−îng 8
3. Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 8
4. Kü thuËt ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao ¸p 9
5. C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng HPLC 11
6. Quy tr×nh ph©n tÝch thö nghiÖm 13
7 PhÇn 4: KÕt qu¶ nghiªn cøu 17
1. Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y s¾c ký 17
2. X¸c ®Þnh LOD 28
3. X¸c ®Þnh LOQ 28
4. X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh 29
5. X¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn vµ hÖ sè biÕn thiªn 32
6. X¸c ®Þnh ®é thu håi 35
7. Mét sè s¾c ®å ch¹y s¾c ký cña mÉu ph©n tÝch 37
8 PhÇn 5: NhËn xÐt vµ bµn luËn kÕt qu¶ 39
9 PhÇn 6: Quy tr×nh ph©n tÝch x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D 41
trong thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC
10 PhÇn 7: Tµi liÖu tham kh¶o 45
11 PhÇn phô lôc: C¸c s¾c ®å cña dung dÞch chuÈn vitamin D2
vµ D3 x©y dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh
c¸c ch÷ viÕt t¾t
TT C¸c ch÷ viÕt t¾t NghÜa tiÕng ViÖt
1 HPLC S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao
2 DAD Detector m¶ng di«t
3 UV-VIS Quang phæ tö ngo¹i - kh¶ kiÕn
4 RDA Nhu cÇu ¨n khuyÕn c¸o
5 TCVN Tiªu chuÈn ViÖt nam
6 AOAC HiÖp héi ph©n tÝch ho¸ häc
7 LOD Giíi h¹n ph¸t hiÖn
8 LOQ Giíi h¹n ®Þnh l−îng
9 SD §é lÖch chuÈn
10 Cv HÖ sè biÕn thiªn
11 MeOH Methanol
12 THF Tetra hydrofuran
13 ACN Acetonitril
14 SPE Cét chiÕt pha r¾n
15 TBHQ Tert butyl hydroquinol
Danh môc c¸c b¶ng
TT Néi dung b¶ng
B¶ng 1 Thêi gian l−u cña vitamin D2 vµ D3 ®èi víi ®iÒu kiÖn ch¹y cét
Waters RP- 18, detector DAD, b−íc sãng 265nm, pha ®éng
MeOH: H2O = 98: 2, tèc ®é dßng 1ml/phót
B¶ng 2 Thêi gian l−u cña vitamin D2 ch¹y cét Inertsil ODS 3 vµ cét
Waters RP18, detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN :
MeOH =75:25, tèc ®é dßng 1ml/phót.
B¶ng 3 NhËn xÐt c¸c s¾c ®å cña hai chÊt chuÈn ®èi víi cét Inertsil ODS 3
detector DAD b−íc sãng 265nm, Pha ®éng ACN : H2O =75:25,
tèc ®é dßng 1ml/phót
B¶ng 4 NhËn xÐt kÕt qu¶ ch¹y s¾c ký hai chuÈn trªn cét Inertsil ODS 3
pha ®éng ACN : MeOH = 50: 50, detector DAD b−íc sãng
265nm, tèc ®é dßng 1ml/phót.
B¶ng 5 Thêi gian l−u cña hai chÊt chuÈn t−¬ng øng víi pha ®éng kh¸c
nhau tèc ®é 1ml/ phót, cét Inertsil ODS 3, detector DAD 265nm
B¶ng 6 Thêi gian l−u cña hai chÊt øng víi tèc ®é dßng kh¸c nhau trªn hÖ
pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5, detector DAD 265nm,
cét Inertsil ODS 3
B¶ng 7 Tæng kÕt ®iÒu kiÖn ch¹y HPLC ph©n tÝch vitamin D
B¶ng 8 T−¬ng quan gi÷a diÖn tÝch pic vµ nång ®é chuÈn cña vitamin D2
B¶ng 9 T−¬ng quan gi÷a diÖn tÝch vµ nång ®é chuÈn vitamin D3
B¶ng 10 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D2 mÉu s÷a bét XO
B¶ng 11 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a Sunny grow baby
B¶ng 12 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a chua nestlÐ cã ®−êng
B¶ng 13 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a Kappi hép 100ml
B¶ng 14 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D3 trong s÷a bét giÇu n¨ng l−îng
B¶ng 15 X¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a ®Æc cã ®−êng
B¶ng 16 KÕt qu¶ hµm l−îng vitamin D trong mét sè mÉu kh¸c
B¶ng 17 §é thu håi cña vitamin D3
B¶ng 18 §é thu håi cña vitamin D2
B¶ng 19 KÕt qu¶ ph©n tÝch mÉu s÷a bét mÉu DDP4 vËt liÖu chuÈn
B¶ng 20 Tæng hîp c¸c th«ng sè thÈm ®Þnh
Danh môc c¸c h×nh
TT Néi dung c¸c h×nh
PhÇn tæng quan
H×nh 1 C«ng thøc ho¸ häc, c«ng thøc cÊu t¹o cña vitamin D2 vµ D3
H×nh 2 S¬ ®å chuyÓn ho¸ cña vitamin D trong c¬ thÓ
PhÇn môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p
H×nh 3 M« t¶ qu¸ tr×nh ch¹y s¾c ký
H×nh 4 S¬ ®å m« t¶ hÖ thèng HPLC
H×nh 5 §å thÞ phô thuéc diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic víi nång ®é
PhÇn kÕt qu¶ nghiªn cøu
* Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y
H×nh 6 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 7 D¹ng phæ hÊp thô cña vitamin D2
H×nh 8 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,08ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: H2O = 98:2, tèc ®é 1ml/
phót
H×nh 9 D¹ng phæ hÊp thô cña vitamin D3
H×nh 10 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Waters, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é
dßng 1ml/ phót
H×nh 11 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,04ppm, cét Inertsil ODS 3,
detector DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25,
tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 12 S¾c ®å chuÈn vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 13 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 75: 25, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 14 S¾c ®å chuÈn vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 15 S¾c ®å chuÈn vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc
sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50: 50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 16 S¾c ®å hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 50:50, tèc ®é 1ml/ phót
H×nh 17 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10, tèc ®é
1ml/ phót
H×nh 18 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é
dßng 1,2 ml/ phót
H×nh 19 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng ACN: MeOH = 90:10 tèc ®é
dßng 1,5 ml/ phót
H×nh 20 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc
®é dßng 1 ml/ phót
H×nh 21 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector
DAD b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc
®é dßng 1,2 ml/ phót
H×nh 22 S¾c ®å chuÈn hçn hîp vitamin D3 vµ D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD
b−íc sãng 265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 93:2:5 tèc ®é dßng 1,5
ml/ phót.
H×nh 23 S¾c ®å vitamin D2, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng
265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót
H×nh 24 S¾c ®å vitamin D3, cét Inertsil ODS 3, detector DAD b−íc sãng
265nm, pha ®éng MeOH: THF: H2O = 92:3:5, tèc ®é dßng 1,5 ml/ phót
* X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh
H×nh 25 §−êng chuÈn vitamin D2
H×nh 26 §−êng chuÈn vitamin D3
* S¾c ®å ch¹y mÉu
H×nh 27 S¾c ®å x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong s÷a tu¬i Kapi
H×nh 28 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a t−¬i x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D2
H×nh 29 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a bét x¸c ®Þnh vitamin D3
H×nh 30 S¾c ®å ch¹y mÉu s÷a bét x¸c ®Þnh vitamin D3
PhÇn phô lôc:
C¸c s¾c ®å dung dÞch chuÈn x©y dùng kho¶ng tuyÕn tÝnh
H×nh 31 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,0022ppm
H×nh 32 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,02ppm
H×nh 33 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,041ppm
H×nh 34 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,082ppm
H×nh 35 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,165ppm
H×nh 36 S¾c ®å chuÈn vitamin D2 nång ®é 0,33ppm
H×nh 37 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,0068ppm
H×nh 38 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,068ppm
H×nh 39 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,137ppm
H×nh 40 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,274ppm
H×nh 41 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,392ppm
H×nh 42 S¾c ®å chuÈn vitamin D3 nång ®é 0,5ppm
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
PhÇn 1: Më ®Çu
§Ó tån t¹i, ph¸t triÓn vµ c¶i thiÖn nßi gièng, c¬ thÓ chóng ta lu«n cÇn
®−îc cung cÊp ®ñ c¸c chÊt dinh d−ìng, nguån cung cÊp c¸c chÊt nµy cã
nhiÒu trong thùc phÈm ¨n vµo hµng ngµy. C¸c chÊt dinh d−ìng chÝnh lµ c¸c
nhãm cung cÊp n¨ng l−îng cho c¬ thÓ nh− glucid, lipid, protein, nhãm cung
cÊp muèi kho¸ng, nhãm cung cÊp c¸c lo¹i vitamin vµ n−íc. Theo quan
®iÓm cña c¸c chuyªn gia dinh d−ìng hiÖn nay trªn thÕ giíi mµ chóng ta
®ang sèng tån t¹i hai th¸i cùc kh¸c nhau, mét bªn lµ vùc th¼m cña sù thiÕu
¨n vµ mét bªn lµ vùc th¼m cña sù thõa ¨n. Sù thiÕu ¨n ®· dÉn ®Õn t×nh tr¹ng
suy dinh d−ìng do thiÕu n¨ng l−îng protein, tuy nhiªn víi sù ph¸t triÓn cña
nÒn khoa häc tiÕn tiÕn trªn thÕ giíi ®êi sèng cña ng−êi d©n ë hÇu hÕt c¸c
n−íc ®· ®−îc c¶i thiÖn, kh«ng ngõng n©ng cao. ë ViÖt nam víi sù hç trî
cña c¸c ch−¬ng tr×nh phßng chèng suy dinh d−ìng, ch−¬ng tr×nh VAC vµ
cuéc c¸ch m¹ng xanh trong ngµnh n«ng nghiÖp ®· gãp phÇn to lín trong
viÖc t¨ng c−êng an ninh thùc phÈm quèc gia, vÊn ®Ò ®ãi ¨n kh«ng cßn lµ
®iÒu bøc xóc. Hµng n¨m tû lÖ suy dinh d−ìng ®· gi¶m ®i mét c¸ch ®¸ng
kÓ..... Tuy nhiªn vÊn ®Ò dinh d−ìng míi n¶y sinh ®ã lµ c¸c bÖnh m·n tÝnh
liªn quan ®Õn dinh d−ìng ®ang lµ mèi quan t©m cña nhiÒu ng−êi. Kh¸i
niÖm thùc phÈm chøc n¨ng (thùc phÈm ch÷a bÖnh) ®· trë nªn quen thuéc
dÇn víi mäi ng−êi d©n. HiÖn nay ®Ó gi¶i quyÕt vÊn ®Ò nµy trªn thÕ giíi còng
nh− trong n−íc ®· xuÊt hiÖn nhiÒu lo¹i thùc phÈm ch÷a bÖnh, thùc phÈm bæ
sung vi chÊt dinh d−ìng phôc vô cho bÖnh nh©n liªn quan. Cã thÓ coi thùc
phÈm chøc n¨ng, vai trß cña thùc phÈm ®èi víi bÖnh m·n tÝnh lµ h−íng tiÕp
cËn rÊt míi trong ngµnh dinh d−ìng, thøc ¨n lµ thuèc, thuèc lµ thøc ¨n [16].
ë NhËt b¶n cho ®Õn nay ®· cã kho¶ng h¬n 192 s¶n phÈm ®−îc gäi lµ thùc
phÈm chøc n¨ng nh»m gãp phÇn vµo duy tr×, c¶i thiÖn chÕ ®é ¨n vµ søc
Trang 1/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
khoÎ [16]. Mét trong sè c¸c vi chÊt rÊt quan träng ®· ®−îc bæ sung vµo thùc
phÈm ®ã lµ c¸c lo¹i vitamin.
Vitamin lµ nh÷ng chÊt kh«ng sinh n¨ng l−îng nh−ng kh«ng thÓ thiÕu
®−îc ®èi víi sù tån t¹i, ph¸t triÓn cña mçi c¬ thÓ sèng. Vitamin cã vai trß
t¹o ra c¸c coenzim cÇn thiÕt trong c¸c ph¶n øng chuyÓn ho¸ kh¸c nhau. TÊt
c¶ c¸c qu¸ tr×nh sèng g¾n liÒn víi sù trao ®æi chÊt trong c¬ thÓ ®Òu cã sù
tham gia trùc tiÕp cña vitamin [14]. Nguån cung cÊp vitamin chñ yÕu lµ tõ
thøc ¨n. Khi thiÕu vitamin c¬ thÓ sÏ m¾c ph¶i mét sè bÖnh lý, nh− thiÕu
vitamin A dÔ dÉn tíi bÖnh mï loµ, thiÕu vitamin B1 dÔ bÞ bÖnh tª phï, thiÕu
vitamin PP bÞ bÖnh pellagra, thiÕu vitamin D bÞ bÖnh vÒ x−¬ng [17]. HiÖn
nay mét thùc tÕ kh¾c nghiÖt ®· x¶y ra ë c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn lµ ph¶i
®−¬ng ®Çu víi g¸nh nÆng kÐp gi−· bÖnh nhiÔm trïng, tö vong trÎ em vµ
thiÕu dinh d−ìng víi c¸c bÖnh m·n tÝnh kh«ng l©y liªn quan ®Õn dinh
d−ìng [16]. Thùc tÕ ®· cho thÊy thiÕu vi chÊt dinh d−ìng ®· gãp phÇn
kh«ng Ýt trong g¸nh nÆng kÐp nµy. V× vËy vai trß thùc phÈm ®−îc ®¸nh gi¸
v« cïng quan träng, viÖc nghiªn cøu øng dông thùc phÈm chøc n¨ng ®·
®ang trë thµnh trµo l−u mang tÝnh toµn cÇu. Nãi ®Õn thùc phÈm chøc n¨ng
chóng ta kh«ng thÓ nãi ®Õn thùc phÈm bæ sung vitamin D, mét lo¹i vitamin
kh¸ quan träng ®Ó phßng chèng bÖnh cßi x−¬ng ë trÎ em, lo·ng x−¬ng ë
ng−êi lín, h¹ calci m¸u vµ mét sè bÖnh ngoµi da...
HiÖn nay trªn thÞ tr−êng cã rÊt nhiÒu lo¹i s÷a, bét dinh d−ìng, b¸nh
quy... cã bæ sung viatmin D. Víi lý do trªn, ®Ò tµi nµy chóng t«i hy väng
chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D b»ng ph−¬ng ph¸p
s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao (HPLC) trong mét sè lo¹i thùc phÈm nh− s÷a
chua, s÷a bét, s÷a n−íc, b¸nh quy, bét dinh d−ìng ®Ó ®−a ra quy tr×nh ph©n
tÝch phï hîp, nh»m ®¸nh gi¸ ®óng chÊt l−îng, gi¸ trÞ dinh d−ìng thùc cña
c¸c s¶n phÈm thùc phÈm.
Trang 2/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
PhÇn 2: Tæng quan
1. Nguån gèc vµ tÝnh chÊt cña vitamin D
VitaminD lµ chÊt tinh thÓ h×nh kim kh«ng mµu, kh«ng mïi, kh«ng
tan trong n−íc, hoµ tan trong dÇu mì, tan trong dung m«i h÷u c¬ nh−
ethanol, chlorofoc, methanol. Tªn gäi kh¸c cña vitamin D lµ calciferol.
Vitamin D lµ mét nhãm gåm tõ D2 ®Õn D7 song cã hai ho¹t tÝnh m¹nh nhÊt
lµ vitamin D2 cßn gäi Ergocalciferol vµ vitamin D3 cßn gäi Cholecalciferol.
Cholecalciferol - C27H44O Ergocalciferol - C28H44O
Vitamin D3 Vitamin D2
H×nh 1: C«ng thøc ho¸ häc, c«ng thøc cÊu t¹o cña vitamin D2 vµ D3
Vitamin D cã chñ yÕu trong thøc ¨n nguån gèc ®éng vËt nh− trøng,
c¸, ®Æc biÖt dÞch chiÕt tõ gan c¸, b¬, s÷a, thÞt...
Trong c¬ thÓ ng−êi vitamin D3 (Cholecalciferol) ®−îc tæng hîp tõ 7
dehydrocholesterol ë d−íi da nhê ¸nh s¸ng tö ngo¹i.
Vitamin D2(Ergocalciferol) ®−îc tæng hîp tõ ergosterol cã trong nÊm vµ
men bia.
Nãi chung, ho¹t tÝnh sinh häc cña hai lo¹i vitamin D2 vµ vitamin D3
kh«ng cã sù kh¸c nhau nhiÒu. Trong c¬ thÓ vitamin D chuyÓn ho¸ ë gan vµ
Trang 3/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
thËn t¹o ra chÊt chuyÓn ho¸ cã ho¹t tÝnh lµ 1,25- dihydroxycholecalciferol
nhê enzim hydroxylase [14].
Trong da
Trong gan
Trong thËn
D¹ng ho¹t ®éng
H×nh 2: S¬ ®å chuyÓn ho¸ cña vitamin D trong c¬ thÓ ng−êi
Trang 4/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
2. T¸c dông cña vitamin D
- Vitamin D tham gia vµo qu¸ tr×nh t¹o x−¬ng nhê t¸c dông chuyÓn ho¸ c¸c
chÊt v« c¬ chñ yÕu lµ calci vµ phosphat, lµm t¨ng hÊp thu calci vµ phosphat
ë ruét, tham gia vµo qu¸ tr×nh calci ho¸ sôn nªn nã rÊt cÇn cho sù ph¸t triÓn
x−¬ng ë trÎ em.
- Lµm ®iÒu hoµ calci trong m¸u, øc chÕ tÕ bµo sinh ung th−.
- Khi thiÕu vitamin D ruét kh«ng hÊp thu ®ñ calci vµ phospho lµm calci
m¸u gi¶m g©y hËu qu¶ trÎ em chËm lín, cßi x−¬ng ch©n vßng kiÒng, chËm
biÕt ®i, chËm kÝn thãp, nguêi lín bÞ lo·ng x−¬ng, xèp x−¬ng, x−¬ng th−a dÔ
gÉy, phô n÷ cã thai thiÕu vitamin D dÔ sinh ra trÎ khuyÕt tËt ë x−¬ng [14].
- Nguyªn nh©n cña sù thiÕu vitamin D lµ do c¬ thÓ hÊp thu thøc ¨n kÐm, do
Ýt tiÕp xóc víi ¸nh n¾ng mÆt trêi, do rèi lo¹n chuyÓn ho¸, do nhu cÇu cao ë
phô n÷ cã thai vµ cho con bó...
-Tuy nhiªn dïng vitamin D qu¸ liÒu còng g©y ra chøng t¨ng calci m¸u, t¨ng
calci niÖu, ®au nhøc x−¬ng khíp, t¹o sái thËn, t¨ng huyÕt ¸p, cã thÓ g©y suy
nh−îc, mÖt mái, ®au ®Çu, buån n«n, tiªu ch¶y, gißn x−¬ng... [14].
Theo c«ng tr×nh nghiªn cøu kh¶o s¸t t¸c dông cña vitamin D ®èi víi
bÖnh ung th− ë bang Chicago trong 19 n¨m c¸c t¸c gi¶ nhËn thÊy tû lÖ ung
th− kÕt trµng ë nam gi¶m 55% nÕu hµng ngµy ®−îc bæ sung vitamin D lµ
3,75mcg [18]. Theo nghiªn cøu cña Danson - Hughes vµ c¸c céng sù tiÕn
hµnh trªn ®èi t−îng phô n÷ ®−îc bæ sung vitamin D 400 IU/ ngµy vµ nhãm
phô n÷ kh¸c kh«ng ®−îc bæ sung, c¶ hai nhãm ®Òu cã l−îng vitamin D ¨n
vµo hµng ngµy lµ 100 IU. NhËn thÊy nhãm ®èi chøng bÞ gi¶m ®¸ng kÓ mËt
®é kho¸ng trong x−¬ng so víi nhãm ®−îc bæ sung [18]. N¨m 1989 theo
khuyÕn c¸o cña uû ban dinh d−ìng Hoa kú (RDA) vitamin D cÇn bæ sung
lµ 10mcg/ ngµy ë tuæi tõ 51- 70 vµ 15mcg / ngµy ë tuæi cao h¬n [18]. Theo
Trang 5/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
nghiªn cøu cña tr−êng Y Harvard ®−îc ®¨ng trªn t¹p chÝ cña hiÖp héi y häc
Mü cho thÊy vitamin D cã thÓ gióp gi¶m nguy c¬ m¾c bÖnh ®a x¬ cøng.
C¸c nhµ nghiªn cøu ®· so s¸nh l−îng vitamin D ë 257 mÉu huyÕt t−¬ng
trong sè h¬n 7 triÖu mÉu cña nh©n viªn qu©n ®éi Mü, hä ph¸t hiÖn r»ng
ng−êi da tr¾ng nhãm cã hµm l−îng vitamin D cao nhÊt cã nguy c¬ m¾c
bÖnh ®a x¬ cøng thÊp nhÊt. BÖnh ®a x¬ cøng lµ bÖnh m·n tÝnh cña hÖ thÇn
kinh, b¾t ®Çu víi c¸c triÖu chøng nh− mÊt trÝ nhí, suy nh−îc, mÖt mái, ®au
®ín hoÆc liÖt, chãng mÆt...vµ sau ®ã ¶nh h−ëng tíi tim m¹ch.
3. T×nh h×nh nghiªn cøu trong n−íc vµ trªn thÕ giíi
Cïng víi sù ph¸t triÓn cña nÒn khoa häc kü thuËt tiªn tiÕn, víi sù
bïng næ cña ngµnh c«ng nghÖ th«ng tin, hiÖn nay hµng lo¹t c¸c hÖ thèng
m¸y ph©n tÝch ho¸ häc ®· ®−îc c¶i tiÕn n©ng cÊp, nh»m x¸c ®Þnh nhiÒu lo¹i
chÊt ho¸ häc vµ ®ång thêi n©ng cao ®é nh¹y cña phÐp ph©n tÝch còng nh−
®é lÆp l¹i cña kÕt qu¶ kiÓm nghiÖm. Trªn thÕ giíi nhiÒu nhµ ph©n tÝch ho¸
häc ®· cã nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong
thùc phÈm nh− thÞt, c¸, s÷a, trong m¸u... §ã lµ nghiªn cøu hµm l−îng
vitamin hoµ tan trong chÊt bÐo cña mÉu s÷a chua b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC
víi detector PDA cña M.M Delgado Zamarreno, A. Sanchez Perez cña
tr−êng ®¹i häc Salamanca T©y ban nha ®· ®−a ra c¸c yÕu tè ¶nh h−ëng ®Õn
qu¸ tr×nh ph©n tÝch vitamin A, E, D nh− ®iÒu kiÖn thuû ph©n, t¸ch c¸c chÊt
trong khi xö lý mÉu, kÕt qu¶ cña nghiªn cøu nµy ®−a ra ®é thu håi vitamin
D3 lµ 91 ± 5% víi hµm l−îng vitamin D3 trong mÉu lµ 0,09 mcg/100g ±
5% [11]. Theo nghiªn cøu c«ng bè trªn Food Chemistry Vol.57, No.1. 95-
99, 1996 ë Anh c¸c nhµ nghiªn cøu ®−a ra c¸ch xö lý mÉu, ®iÒu ph©n tÝch
x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm, kÕt qu¶ nghiªn cøu nµy
cho thÊy hÖ sè biÕn thiªn sau khi lµm lÆp l¹i ba lÇn ®èi víi vitamin D3 vµ D2
lµ <10%, ®é thu håi cña ph−¬ng ph¸p lµ 90 -110% víi D2 vµ D3, giíi h¹n
Trang 6/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
ph¸t hiÖn lµ 1,5-2 ng [12]. Trong c«ng tr×nh nghiªn cøu ®¨ng trªn t¹p chÝ
Chromatography A cña bé m«n thùc phÈm, dinh d−ìng §¹i häc Georgia
Athens Mü, bé m«n Dinh d−ìng trªn ng−êi vµ khoa häc thùc phÈm tr−êng
B¸ch khoa Virginia ngµy 26 th¸ng 1 n¨m 1998 ®· ®−a ra ®iÒu kiÖn vµ yÕu
tè ¶nh h−ëng qu¸ tr×nh ph©n tÝch hµm l−îng vitamin A, E, D trong thøc ¨n
®éng vËt b»ng s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao. Nghiªn cøu nµy cho thÊy ®é thu
håi cña ph−¬ng ph¸p lµ 93-107% [19]. Trong bµi b¸o cña t¹p chÝ Food
composition and analysis 16 (2003) cã c«ng tr×nh nghiªn cøu hµm l−îng
vitamin D3 vµ 25 hydroxyvitamin D3 trong thÞt lîn t−¬i vµ thÞt lîn chÝn, ®·
®−a ra kÕt qu¶ nång ®é vitamin D3 ®èi víi thÞt t−¬i lµ tõ 0,05 ®Õn 0,21
mcg/100g víi thÞt chÝn lµ 0,07-0,14 mcg/100g. Sau khi lµm 49 thÝ nghiÖm
lÆp l¹i hä ®· ®−a ra hÖ sè biÕn thiªn lµ 7,0%, lµm 51 thÝ nghiÖm kh¸c hÖ sè
biÕn thiªn lµ 7,3% [7]. Ngoµi ra cßn nhiÒu c«ng tr×nh nghiªn cøu x¸c ®Þnh
hµm l−îng vitamin D trong m¸u vµ huyÕt thanh, trong thùc vËt ... Mét sè
nghiªn cøu ®· ®−a ra hµm l−îng vitamin D trong c¸ thu lµ 15mcg/100g,
trong gan bß 1mcg/100g, trong trøng gµ 2mcg/100g, trong nÊm r¬m lµ
2mcg/100g [8].
HiÖn nay ë ViÖt nam chóng t«i nhËn thÊy viÖc nghiªn cøu vitamin D
trong thùc phÈm ch−a ®−îc lµm nhiÒu, trong b¶ng thµnh phÇn thøc ¨n ViÖt
nam ch−a ®Ò cËp ®Õn hµm l−îng vitamin D. Trong danh môc tiªu chuÈn
ViÖt nam (TCVN) chóng t«i còng ch−a thÊy mét quy tr×nh chuÈn nµo ®Ó
x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D b»ng HPLC, v× vËy sau khi tham kh¶o c¸c
tµi liÖu cïng víi ®iÒu kiÖn hiÖn cã cña phßng thÝ nghiÖm chóng t«i ®· tiÕn
hµnh nghiªn cøu chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D
trong mét sè lo¹i thùc phÈm b»ng HPLC.
Trang 7/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
PhÇn 3
Môc tiªu, ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu.
1. Môc tiªu
Nh− ®· ®Ò cËp trong phÇn tæng quan môc tiªu ®Ò tµi chóng t«i chän
lµ “ chuÈn ho¸ ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh hµm l−îng vitamin D (D2vµ D3) trong
thùc phÈm b»ng ph−¬ng ph¸p HPLC’’
2. §èi t−îng
Trong khu«n khæ tæng kinh phÝ cña ®Ò tµi lµ 20 triÖu ®ång, chóng t«i
chØ cã kh¶ n¨ng tiÕn hµnh trªn ®èi t−îng thùc phÈm lµ mÉu s÷a bét, s÷a
chua, s÷a ®Æc, b¸nh quy vµ siro
3. Néi dung vµ ph−¬ng ph¸p
§Ó ®¸p øng víi môc tiªu nãi trªn chóng t«i thùc hiÖn c¸c néi dung sau ®©y:
- Kh¶o s¸t ®iÒu kiÖn ch¹y dung dÞch chuÈn vitamin D2 vµ vitamin D3
- X¸c ®Þnh giíi h¹n ph¸t hiÖn (LOD)
- X¸c ®Þnh giíi h¹n ®Þnh l−îng (LOQ)
- X¸c ®Þnh kho¶ng tuyÕn tÝnh
- X¸c ®Þnh ®é lÖch chuÈn (SD) vµ hÖ sè biÕn thiªn (Cv %)
- X¸c ®Þnh ®é thu håi (R %)
Sau khi tham kh¶o c¸c tµi liÖu [1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 13] chóng t«i nhËn
thÊy ®Ó ph©n tÝch hµm l−îng vitamin D trong thùc phÈm cã nhiÒu ph−¬ng
ph¸p kh¸c nhau. Tr−íc ®©y th−êng sö dông ph−¬ng ph¸p sinh häc, ph−¬ng
ph¸p ho¸ häc t¹o ph¶n øng lªn mµu råi tiÕn hµnh ®o quang, song ngµy nay
víi sù ph¸t triÓn cña hÖ thèng s¾c ký th× hÇu nh− c¸c n−íc trªn thÕ giíi ®·
chän ph−¬ng ph¸p HPLC ®Ó x¸c ®Þnh. HiÖn nay phßng thÝ nghiÖm chóng
t«i cã hai hÖ thèng HPLC víi c¸c detector huúnh quang, detector UV,
Trang 8/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
detector PDA vµ c¸c thiÕt bÞ phô trî kh¸c nh− m¸y cÊt quay, m¸y läc hót
ch©n kh«ng... ®¸p øng tèt cho viÖc ph©n tÝch nªn chóng t«i ®· chän ph−¬ng
ph¸p nµy ®Ó nghiªn cøu. §©y lµ ph−¬ng ph¸p cã nhiÒu −u ®iÓm vµ hiÖn nay
®−îc nhiÒu nhµ ph©n tÝch lùa chän.
4. Kü thuËt ph©n tÝch s¾c ký láng hiÖu n¨ng cao
4.1 Nguyªn lý:
S¾c ký láng hiÖu n¨ng cao hay cßn gäi lµ s¾c ký láng cao ¸p, kü thuËt
ph©n tÝch dùa trªn c¬ së sù t¸ch c¸c chÊt trªn pha tÜnh chøa trong cét nhê
dßng chuyÓn ®éng cña chÊt láng (pha ®éng) d−íi ¸p suÊt cao. Pha tÜnh cã
thÓ lµ chÊt r¾n hoÆc chÊt láng ®−îc phñ trªn chÊt mang. ChÊt ph©n tÝch ®−îc
ghi nhËn bëi bé phËn ph¸t hiÖn d−íi d¹ng c¸c pic trªn s¾c ®å.
Qu¸ tr×nh s¾c ký Pha ®éng
Pha tÜnh
Röa gi¶i qua cét S¾c ®å
H×nh 3: M« t¶ qu¸ tr×nh ch¹y s¾c ký
4.2 HÖ thèng HPLC:
HÖ thèng HPLC bao gåm c¸c bé phËn chÝnh ®−îc m« t¶ d−íi ®©y.
Trang 9/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
4
7
3
1 5
2
6
H×nh 4: S¬ ®å m« t¶ hÖ thèng HPLC
Trong ®ã:
1: B×nh chøa pha ®éng.
2: B¬m cao ¸p
3: Van b¬m mÉu.
4: Cét s¾c ký
5: Bé phËn ph¸t hiÖn Detector
6: B×nh chøa dung m«i th¶i
7: HÖ thèng m¸y tÝnh ghi d÷ liÖu ph©n tÝch.
Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i sö dông detector m¶ng diod (DAD) vµ
ch¹y s¾c ký pha ng−îc (pha ®éng ph©n cùc, pha tÜnh Ýt ph©n cùc) ®Ó x¸c
®Þnh hµm l−îng vitamin D.
Trang 10/46
B¸o c¸o ®Ò tµi nghiªn cøu Hµ néi 2007
5. C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng HPLC
C¸c ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng b»ng s¾c ký ®Òu dùa trªn nguyªn t¾c
nång ®é cña chÊt tû lÖ víi diÖn tÝch hay chiÒu cao pic.
* Cã 4 ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng th−êng ®−îc lùa chän ®ã lµ
- Ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i
- Ph−¬ng ph¸p chuÈn néi
- Ph−¬ng ph¸p thªm chuÈn
- Ph−¬ng ph¸p chuÈn ho¸ diÖn tÝch
Trong ®Ò tµi nµy chóng t«i sö dông ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i ®Ó ph©n tÝch.
Ph−¬ng ph¸p chuÈn ngo¹i lµ ph−¬ng ph¸p ®Þnh l−îng c¬ b¶n trong ®ã
dung dÞch chÊt chuÈn vµ mÉu thö ®−îc tiÕn hµnh s¾c ký trong cïng ®iÒu
kiÖn. Sau ®ã so s¸nh diÖn tÝch pic hoÆc chiÒu cao cña mÉu thö víi diÖn tÝch
pic hoÆc chiÒu cao dung dÞch chÊt chuÈn ®Ó tÝnh nång ®é chÊt cã trong mÉu.
Cã thÓ dïng ph−¬ng ph¸p chuÈn ho¸ mét ®iÓm hoÆc nhiÒu ®iÓm.
* ChuÈn ho¸ mét ®iÓm (ph−¬ng ph¸p so s¸nh):
Chän nång ®é dung dÞch chÊt chuÈn gÇn b»ng nång ®é mÉu thö, tÝnh theo
c«ng thøc sau.
C x
= SxCs
S s
Trong ®ã: Cx nång ®é mÉu thö.
Cs nång ®é dung dÞch chÊt chuÈn
Sx diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic mÉu thö
Ss diÖn tÝch hoÆc chiÒu cao pic dung dÞch mÉu chuÈn
Trang 11/46