Chọn lọc và nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

  • 45 trang
  • file .pdf
BỘ CÔNG THƯƠNG
TỔNG CÔNG TY GIẤY VIỆT NAM
VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
……………………*……………………
BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI
CẤP BỘ NĂM 2010
TÊN ĐỀ TÀI:
CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG 6 DÒNG KEO TAI TƯỢNG
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ CÔNG THƯƠNG
CƠ QUAN CHỦ TRÌ: VIỆN NGHIÊN CỨU CÂY NGUYÊN LIỆU GIẤY
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: ThS. PHẠM ĐỨC HUY
8684
PHÚ THỌ 2010
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH
Thứ thự Trang
Hình 1 Ken cây tạo chồi dòng A14 11
Bảng 01 Thời gian và nồng độ chất NaOCl khử trùng. 12
Bảng 02 Nồng độ BAP và NAA ở các công thức thí nghiệm 13
Bảng 03 Nồng độ IBA và ABT ở các công thức thí nghiệm cấy 15
tạo rễ
Bảng 04 Ảnh hưởng của nồng độ NaOCl và thời gian khử trùng 17
mẫu đến hiệu quả quá trình tạo chồi
Biểu đồ 01 Tỷ lệ mẫu nảy chồi ở các công thức khử trùng mẫu 18
Hình 2 Khử trùng mẫu và cấy tạo chồi dòng A14 20
Bảng 05 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả 21
quá trình nhân nhanh chồi dòng A14
Biểu đồ 02 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân 22
chồi dòng A14
Biểu đồ 03 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến tỷ lệ chồi 22
hữu hiệu dòng A14
Bảng 06 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả 23
quá trình nhân nhanh chồi dòng số 1
Biểu đồ 04 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hệ số nhân 23
chồi dòng số 1
Biểu đồ 05 Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến tỷ lệ chồi 23
hữu hiệu dòng số 1
Hình 3 Cấy chuyển mẫu nhân nhanh chồi 25
Bảng 07 Tỷ lệ ra rễ và số rễ trung bình/cây ở các công thức thí 25
nghiệm
Biểu đồ 06 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT đến tỷ lệ ra rễ 25
của chồi cấy
Biểu đồ 07 Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT đến số rễ tạo 27
thành của cây mầm
Hình 4 Cây mầm mô ở giai đoạn cấy tạo rễ và vườn ươm 28
Bảng 08 Tỷ lệ sống của cây con ở giai đoạn vườn ươm 29
Hình 5 Tóm tắt sơ đồ phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2009 30
- 2010
MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ HÌNH ẢNH
TÓM TẮT 1
I. TỔNG QUAN 3
1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài 3
1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài 3
1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài 3
1.2.2. Mục tiêu của đề tài 4
1.3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu 5
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu 5
1.3.2. Nội dung nghiên cứu 5
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu 6
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 6
1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 6
II. THỰC NGHIỆM 9
2.1. Phương pháp nghiên cứu 10
2.1.1. Xử lý cây mẹ tạo chồi 11
2.1.2. Tiêu chuẩn mẫu cấy 11
2.1.3. Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy 11
Ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả quá trình
2.1.4. 12
nhân nhanh chồi
Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến quá
2.1.5. 13
trình tạo rễ
2.1.6. Thử nghiệm thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất lượng 13
cây con ở vườn ươm
2.1.7. Cấy cây mầm mô ra vườn ươm 14
2.1.8. Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy 14
2.1.9. Bố trí thí nghiệm 15
2.1.10. Thu thập và xử lý số liệu 15
2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu 16
2.3. Kết quả thực nghiệm và thảo luận 17
Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng
2.3.1. 17
NaOCl đến tỷ lệ mẫu nảy chồi
Ảnh hưởng phối hợp của BAP đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ
2.3.2. 20
chồi hữu hiệu.
2.3.3. Ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1 đến quá trình tạo rễ 25
Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chất
2.3.4. 28
lượng của cây con ở vườn ươm.
III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31
3.1. Kết luận 31
3.2. Kiến nghị 32
IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
PHẦN PHỤ BIỂU
TÓM TẮT
Đề tài “Chọn lọc và thử nghiệm nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào” được thực hiện trong 2 năm 2009 và 2010.
Qua 2 năm tiến hành các thử nghiệm, đề tài đã chọn được 6 cây trội và xác định
được màu sắc gỗ của cây trội được chọn lọc. Xử lý tạo chồi và đưa mẫu vào
invitro được 6 dòng keo tai tượng và thử nghiệm giai đoạn nhân nhanh cho 6
dòng. Dòng keo tai tượng ưu trội số 1 cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất và dòng
này được chọn thử nghiệm giai đoạn tạo rễ và tạo cây con hoàn chỉnh và cấy cây
ra vườn ươm. Đồng thời đề tài cũng bước đầu thử nghiệm đưa chồi vào invitro
và nghiên cứu nhân nhanh chồi cho dòng keo tai tượng ưu trội A14. Đây là dòng
có triển vọng đã được chọn lọc và trồng rừng khảo nghiệm dòng vô tính tại Hàm
Yên. Kết quả cụ thể đạt được sau 2 năm nghiên cứu và thử nghiệm như sau:
Năm 2009, đề tài tập trung thực hiện 2 nội dung nghiên cứu chính:
Thứ nhất là tiến hành chọn cây trội, xác định màu sắc gỗ của cây trội và
tiến hành xử lý tạo chồi phục vụ nuôi cấy mô tế bào. Đề tài đã chọn được 6 cây
mẹ ưu trội nhất từ 20 cây trội của Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy đã chọn
trước đây. Đã xác định được màu sắc lõi gỗ của 6 cây mẹ cung cấp vật liệu nhân
giống bằng phương pháp khoan tăng trưởng.
Thứ hai là thử nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đưa mẫu
vào in vitro và giai đoạn nhân nhanh chồi. Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro (cấy
mẫu từ tự nhiên vào ống nghiệm) đã xác định được khử trùng bằng HgCl2 0,1%
với thời gian 16 phút cho tỷ lệ sống cao nhất bình quân đạt 15,6%. Thời gian cắt
mẫu vào mùa hè có tỷ lệ mẫu sống cao hơn hẳn khi cắt mẫu vào mùa thu. Môi
trường cơ bản thích hợp nhất là môi trường MS. Giai đoạn nhân nhanh chồi đã
xác định được môi trường cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao nhất
đối với từng dòng là:
- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l
BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%
- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5
g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6. Hệ số nhân chồi của các
1
dòng lần là: 1,5 lần; 1,6 lần; 1,6 lần và 1,4 lần. Tỷ lệ chồi hữu hiệu là
24,8%; 22,7%; 22,0% và 22,4%.
- Dòng 14: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 0,9mg/l
BAP + 0,6mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,7
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 26,7% .
Năm 2010, đề tài tiếp tục nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh chồi và
thử nghiệm giai đoạn tạo rễ cho dòng ưu trội số 1. Đồng thời đề tài bước
đầu nghiên cứu tạo chồi và nhân chồi cho dòng Keo tai tượng ưu trội có
triển vọng đã được chọn lọc A14.
Với dòng Keo tai tượng ưu trội số 1, môi trường thích hợp nhất cho giai
đoạn nhân nhanh chồi là môi trường MS + 1,6mg/l BAP + 1,2mg/l NAA + 30g/l
đường sucarose + 4,7g/l Agar, pH=6. Hệ số nhân chồi đạt được 2,5 lần và tỷ lệ
chồi hữu hiệu là 44,7%. Môi trường thích hợp nhất cho tạo rễ là ½ MS + 2,0mg/l
IBA + 2,0mg/l ABT1 + 15g/l đường sucarose + 5,0g/l Agar, pH=6. Tỷ lệ chồi ra
rễ đạt 78,0% và số rễ trung bình/cây đạt 2,7 rễ/cây. Cây mầm trong ống nghiệm
cần huấn luyện 2 tuần trước khi cấy ra vườn ươm, tỷ lệ cây sống sau 8 tuần kể từ
khi cấy cây mầm ra vườn ươm đạt 60,7% với công thức huấn luyện 2 tuần.
Giai đoạn tạo chồi dòng Keo tai tượng A14, đề tài đã thử nghiệm khử
trùng mẫu bằng NaOCl với các nồng độ và thời gian khác nhau. Công thức cho
tỷ lệ mẫu sống và nảy chồi cao nhất đạt 7,2%. Trong khi đó công thức đối chứng
sử dụng chất khử trùng là HgCl2 0,1% với thời gian khử trùng 16 phút cho tỷ lệ
mẫu sống và nảy chồi đạt 17,2%. trường tạo chồi và nhân nhanh chồi tốt nhất
cho dòng A14 là môi trường MS + 1,6mg/l BAP + 1,2mg/l NAA + 30g/l đường
sucarose + 4,7g/l Agar, pH=6. Hệ số nhân chồi đạt được là 1,3 lần và tỷ lệ chồi
hữu hiệu là 30,2%.
2
I. TỔNG QUAN.
1.1. Cơ sở pháp lý của đề tài.
- Căn cứ quyết định số 6228/QĐ-BCT, ngày 10/12/2009 của Bộ trưởng Bộ
Công thương về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ
năm 2010.
- Căn cứ hợp đồng số 12.10.RD/HĐ-KHCN ngày 01/02/2010 giữa Bộ
Công thương và Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc đặt hàng sản xuất
và cung cấp dịch vụ sự nghiệp công nghiên cứu khoa học và phát triển công
nghệ.
- Căn cứ quyết định số 12/VNC-QĐ.KHTH ngày 04 tháng 02 năm 2010
của Viện trưởng Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy về việc giao nhiệm vụ
nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ năm 2010.
1.2. Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
1.2.1. Tính cấp thiết của đề tài.
Keo tai tượng (Acacia mangium Wild) đã và ngày càng được trồng rộng
rãi ở hầu hết các vùng sinh thái của nước ta và là loài cây ưu tiên trồng rừng ở cả
9 vùng sinh thái trên toàn quốc. Đối với vùng Trung tâm Bắc Bộ hiện nay thì đây
là loài cây được trồng phổ biến và có diện tích rừng trồng lớn nhất trong số các
loài cây trồng rừng kinh tế.
Năm 1996 Trung tâm nghiên cứu cây nguyên liệu giấy nay là Viện nghiên
cứu cây nguyên liệu giấy đã chuyển hóa 10,6 ha rừng trồng khảo nghiệm từ
nguồn hạt nhập nội xuất xứ Carlwell tại Hàm Yên – Tuyên Quang thành rừng
giống. Hiện nay, rừng giống chuyển hóa này đã cho hiệu quả rõ rệt, rừng trồng
từ nguồn hạt của rừng giống sinh trưởng, phát triển và cho năng suất cao hơn rõ
rệt so với rừng trồng đại trà ở Vùng Trung tâm Bắc Bộ. Tuy nhiên, sản lượng hạt
của rừng giống còn thấp, nguồn hạt giống không đủ cung cấp cho trồng rừng của
Tổng công ty giấy nói riêng cũng như trồng rừng trong khu vực. Một số cây sinh
trưởng và phát triển tốt, có thể tích thân cây lớn lại không ra hoa kết quả. Đồng
thời sử dụng hạt giống từ của cây trội còn có những hạn chế do thu phấn mang
lại. Nhân giống vô tính những cây trội này đảm bảo giữ được những đặc tính ưu
trội của chúng và dễ dàng lưu giữ nguồn gen quý.
3
Cũng như các loài cây khác, nhân giống vô tính cây Keo tai tượng vừa
nhân nhanh các dòng đã được chọn lọc, tăng sự đồng đều của rừng trồng từ đó
tăng năng suất và chất lượng rừng. Do vậy, nuôi cấy mô tế bào các dòng Keo tai
tượng ưu trội của rừng giống Hàm Yên vừa đáp ứng được các mục đích nêu trên
vừa đáp ứng bảo tồn và phát triển nguồn gen quý khi rừng giống không còn thu
hái hạt.
Xuất phát từ những đặc điểm nêu trên, để tạo ra số lượng lớn cây con chất
lượng cao phục vụ trồng rừng khảo nghiệm và trồng rừng kinh tế. Về lâu dài là
nâng cao năng suất, chất lượng rừng và phát triển nguồn gen quý được chọn lọc
thì thử nghiệm nhân giống cây Keo tai tượng và tiến tới hoàn thiện công nghệ
nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào là cần thiết.
Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy là một trong những đơn vị đi đầu về
nuôi cấy mô tế bào các loài cây lâm nghiệp, nhiều loài cây đã được nuôi cấy ở
quy mô công nghiệp, đội ngũ cán bộ có nhiều kinh nghiệm, cơ sở vật chất tương
đối đầy đủ. Đây là những yếu tố quan trọng để đề tài đạt được tốt nhất các mục
tiêu đề ra.
1.2.2. Mục tiêu của đề tài.
™ Mục tiêu lâu dài.
Chọn lọc và nhân nhanh cây Keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào. Tạo được cây con Keo tai tượng bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào cho trồng
rừng khảo nghiệm. Góp phần nâng cao năng suất và chất lượng rừng trồng Keo
tai tượng.
™ Mục tiêu cụ thể:
Với dòng số 1:
1. Nâng cao hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu trong giai đoạn nhân chồi.
2. Xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo rễ.
3. Xác định thời gian huấn luyện thích hợp cho tỷ lệ cây sống cao khi cấy cây
mầm từ bình nuôi cấy ra vườn ươm.
4
Với dòng A14:
1. Xác định nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng NaOCl cho tỷ lệ mẫu
sống và nảy chồi cao.
2. Tìm môi trường nhân chồi thích hợp cho giai đoạn nhân chồi
1.3. Đối tượng và nội dung nghiên cứu.
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu.
™ Dòng Keo tai tượng số 1:
Đây là dòng đã được tiến hành thử nghiệm nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào
năm 2009 và cho kết quả có triển vọng nhất. Năm 2010, đề tài tiếp tục thử
nghiệm các bước hoàn thiện hơn cho quá trình nhân chồi và tạo rễ.
™ Dòng Keo tai tượng A14:
Với dòng này, đề tài bước đầu thử nghiệm giai đoạn tạo chồi từ cây mẹ
ngoài tự nhiên và môi trường thích hợp cho tạo chồi và nhân chồi.
1.3.2. Nội dung nghiên cứu.
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài thực hiện các nội dung nghiên cứu sau:
1. Cắt mẫu, khử trùng mẫu cấy và cấy mẫu vào ống nghiệm.
2. Thử nghiệm nồng độ và thời gian khử trùng mẫu bằng NaOCl.
3. Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả của quá
trình nhân chồi.
4. Thử nghiệm ảnh hưởng của IBA và ảnh hưởng phối hợp của IBA và ABT1
đến hiệu quả của quá trình ra rễ.
5. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống khi cấy cây
mầm ở vườn ươm.
6. Cấy chuyển cây mầm từ bình rễ ra vườn ươm và xác định tỷ lệ sống, chất
lượng của cây con .
7. Thu thập, xử lý số liệu và viết báo cáo.
5
1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu.
1.4.1. Trong nước.
Các loài keo nói chung (Acacia) đặc biệt là keo tai tượng (Acacia
mangium) đã trở thành loài cây trồng rừng chính ở nước ta hiện nay. Đây là loài
cây họ đậu có tốc độ phát triển nhanh, thích nghi với nhiều dạng lập địa, chất
lượng gỗ tốt và đa tác dụng. Đặc biệt cây keo có thể phát triển trên những lập địa
thiếu nitơ vì hệ rễ có nốt sần cố định đạm do đó chúng còn được trồng làm cây
cải tạo đất [2].
Trong các chương trình cải tạo giống cây lâm nghiệp thì giai đoạn nhân
giống nhằm tạo ra số lượng lớn cây con có chất lượng di truyền đồng đều từ đó
nâng cao năng suất và chất lượng rừng là vô cùng quan trọng. Tuy nhiên, đối với
cây keo tai tượng thì các nghiên cứu mới tập trung vào giai đoạn chọn tạo giống
và xây dựng vườn giống, rừng giống hữu tính. Việc nghiên cứu và ứng dụng kỹ
thuật nhân giống in vitro còn hạn chế và cho đến nay chưa có những báo cáo về
nhân giống in vitro đối với loài cây này.
Cùng loài với cây keo tai tượng là cây keo lai đã được tiến hành nghiên
cứu và sản xuất thử nghiệm tại nhiều nơi ở nước ta. Hiện nay một số đơn vị đã
sản xuất cây con keo lai bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào. Trong số các
công trình nghiên cứu trong nước thì nổi bật là kết quả nghiên cứu của đề tài
“Nghiên cứu nhân nhanh giống keo lai tự nhiên, keo lai nhân tạo, bạch đàn Uro,
bạch đàn lai nhân tạo và lát hoa mới chọn tạo bằng công nghệ tế bào” do ThS.
Đoàn Thị Mai làm chủ nhiệm. Đề tài đã xác định được phương pháp khử trùng
cho một số dòng keo lai, trong đó các dòng keo lai tự nhiên như BV71, BV73 và
BV75 là HgCl2 0,5% với thời gian khử trùng 10 phút cho tỷ lệ bật chồi 15,4%.
Với các dòng này thì môi trường nhân chồi là MS* + BAP 1,5mg/l + các phụ gia
khác. Môi trường ra rễ thích hợp là: 1/2MS* + IBA 1,5 mg/l + các phụ gia khác,
tỷ lệ ra rễ đạt 77-91%. Ngoài ra công trình cũng đưa ra kết quả về nhân giống
invitro với dòng keo lai nhân tạo MA2 cũng cho kết quả tương tự.
1.4.2. Ngoài nước.
Cùng với một số loài cây thân gỗ khác như bạch đàn, thông, dương...vv,
nhân giống cây keo tai tượng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đã được
6
thực hiện ở nhiều nước trên thế giới và thu được những thành công đáng kể,
nhiều công trình nghiên cứu về loài cây này đã được công bố như:
Tác giả Darus H. Ahmad thuộc Viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia
(Forest Research Institute) đã nuôi cấy in vitro cây keo tai tượng (Acacia
mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% sucrose, 0.6% agar và 0.5 mg/l
BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao >0.5 cm được cấy vào
môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA ở nồng
độ 1000ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% [7].
Với công bố của Marie-Claude Bon [8] về nghiên cứu nhân giống invitro
cây Keo tai tượng với vật liệu nhân giống là hạt. Tác giả đã thử nghiệm 7 công
thức về nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng đối với môi trường nhân nhanh
chồi. Trong điều kiện nhiệt độ nuôi cấy ngày/đêm là 28/22 ± 20C thì môi trường
nhân chồi tốt nhất là môi trường MS + 4,4µM BA + 2,7 µM NAA, pH =5,6-5,8.
Sau 8 tuần nuôi cấy thu được chiều cao trung bình của chồi là 10,5mm.
Năm 2004, Olivier Monteuuis [11] đã công bố kỹ thuật nhân giống in vitro
cây keo tai tượng với cây mẹ là những cây trội tuổi 7. Ở đây mẫu được khử trùng
bằng cồn 70% trong vòng 5 phút sau đó khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 3
phút. Môi trường nhân chồi là môi trường MS có bổ sung 50mg/l Myo-inositol +
200 mg/l casein hydrolyzate + 2mg/l glysin + 2,2 µM BA + 0,1µM NAA + 30g/l
sucarose; pH từ 5,6-5,8.
V.J.Hartney và cộng sự đã tạo cây con keo tai tượng thành công bằng nuôi
cấy in vitro. Ở đây vật liệu nuôi cấy là hạt giống xuất xứ Cardwell, Queensland,
đây cũng là xuất xứ của những cây trội trong đề tài. Hạt được gieo trong ống
nghiệm cho nảy chồi phục vụ các nghiên cứu tiếp theo. Môi trường nuôi cấy
được sử dụng là WPM + 3% sucrose + 0.8% agar + 1µM BAP + 1 µM NAA.
Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C ( ± 40). Giai đoạn khử trùng mẫu
để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypochlorite 4% và khử trùng
trong thời gian 20 phút.
Cùng với cây keo tai tượng, cây keo lá tràm (Acacia auriculiformis) cũng
đã được W.Nitiwattanachai nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào
thành công từ chồi của cây trội. Ở đây tác giả sử dụng môi trường nhân nhanh
7
chồi là MS (1962) + 10 µM BAP + 0.5 µM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ
là môi trường White (1963) + 2 µM IBA + 1 µM NAA [12].
Từ những nghiên cứu trên cho thấy, nhân giống in vitro cây keo tai tượng
thường sử dụng tổ hợp 2 chất điều hòa sinh trưởng là BAP và NAA với ph từ
5,6-5,8. Tuy nhiên các các nghiên cứu khác nhau lại sử dụng nồng độ khác nhau,
điều này cho thấy vật liệu nghiên cứu khác nhau đòi hỏi nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng cũng khác nhau. Vật liệu là hạt gieo trong ống nghiệm thì nồng
độ các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nhân chồi thấp hơn với vật
liệu từ chồi cắt từ cây mẹ. Cây mẹ có tuổi càng cao đòi hỏi nồng độ các chất điều
hòa sinh trưởng càng cao.
8
II. THỰC NGHIỆM.
Đề tài “Chọn lọc và thử nghiệm nhân giống 6 dòng keo tai tượng bằng
phương pháp nuôi cấy mô tế bào” thực hiện 2 năm 2009 và 2010.
Năm 2009 đã chọn được 6 keo tai tượng ưu trội và xác định màu sắc lõi gỗ
của 6 cây trội. Bước đầu thử nghiệm một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đưa
mẫu vào in vitro và giai đoạn nhân nhanh chồi. Giai đoạn đưa mẫu vào in vitro
(cấy mẫu từ tự nhiên vào ống nghiệm) đã xác định được khử trùng bằng HgCl2
0,1% với thời gian 16 phút cho tỷ lệ sống cao nhất bình quân đạt 15,6%. Thời
gian cắt mẫu vào mùa hè có tỷ lệ mẫu sống cao hơn hẳn khi cắt mẫu vào mùa
thu. Môi trường cơ bản thích hợp nhất là môi trường MS. Giai đoạn nhân nhanh
chồi đã xác định được môi trường cho hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu cao
nhất đối với từng dòng là:
- Dòng 1: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 1,5mg/l
BAP + 1,2 mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,6
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 18,9%
- Dòng 2, 3, 6 và dòng số 13: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5
g/l agar + 1,2mg/l BAP + 0,9 mg/l NAA, pH=6. Hệ số nhân chồi của các
dòng lần là: 1,5 lần; 1,6 lần; 1,6 lần và 1,4 lần. Tỷ lệ chồi hữu hiệu là
24,8%; 22,7%; 22,0% và 22,4%.
- Dòng 14: môi trường MS có bổ sung 30g/l đường + 4,5 g/l agar + 0,9mg/l
BAP + 0,6mg/l NAA, pH=6. Với môi trường này, hệ số nhân chồi đạt 1,7
lần và tỷ lệ chồi hữu hiệu là 26,7% .
Năm 2010, đề tài tiến hành chọn ra một dòng làm đối tượng nghiên cứu.
Vì mục tiêu của công tác cải thiện giống công tác cải thiện giống là nhân giống
các dòng có năng suất và chất lượng tốt, hình thái thân cây đẹp thích hợp cho
trồng rừng cung cấp gỗ nguyên liệu giấy. Kết quả năm 2009 cho thấy dòng số 1
có hệ số nhân chồi thấp hơn chút ít so với dòng 14 nhưng thể tích thân cây đứng
lại cao hơn rất nhiều và hình thái thân cây đẹp thích hợp cho trồng rừng nguyên
liệu giấy . Do đó, đề tài chọn dòng số 1 làm đối tượng nghiên cứu của năm 2010.
Đồng thời từ kết quả khảo nghiệm dòng vô tính cây keo tai tượng của để
tài cấp Bộ Công thương: “Chọn và dẫn giống một số dòng bạch đàn và keo tai
9
tượng ở vùng trung tâm Bắc Bộ để thiết lập vườn lưu giữ giống” do Viện nghiên
cứu cây nguyên liệu giấy chủ trì giai đoạn 2007-2009. Tại 25 tháng tuổi chọn
được một số dòng sinh trưởng tốt. Trong các dòng khảo nghiệm của đề tài này,
dòng A14 có sinh trưởng tốt nhất với đường kính D1.3 đạt 7,4cm; Hvn đạt 7,5m
và thể tích thân cây đạt 15,8dm3 tại 25 tháng tuổi. Đây là kết quả tốt có ý nghĩa
về cả về khoa học và thực tiễn. Nhằm rút ngắn thời gian cho chương trình cải
thiện giống, kế thừa những kết quả đã khảo nghiệm và phát triển giống tốt vào
sản xuất, đề tài bước đầu thử nghiệm nuôi cấy mô cho dòng Keo tai tượng A14.
Như vậy năm 2010, đề tài tiến hành các nghiên cứu cho hai đối tượng
chính là dòng ưu trôi số 1 (chọn lọc và nghiên cứu tiếp cho năm 2009) và bước
đầu nghiên cứu cho dòng keo tai tượng có triển vọng đã được chọn lọc là dòng
A14.
2.1. Phương pháp nghiên cứu.
Sơ đồ phương pháp nghiên cứu của đề tài năm 2010
10
2.1.1. Xử lý cây mẹ tạo chồi.
Cây trội dòng A14 được xử lý tạo chồi từ khoảng độ cao cách mặt đất từ
1-2m. Tạo chồi bằng phương pháp ken cây (bóc toàn bộ lớp vỏ ½ chu vi thân
cây với chiều dài 4-5cm). Sau khi ken cây, dùng bông thấm đều trên bề mặt vết
cắt bằng dung dịch BAP 1%.
Hình 01. Ken cây tạo chồi dòng A14
2.1.2. Tiêu chuẩn mẫu cấy.
Mẫu được cắt vào buổi sáng (8h-9h) vào những ngày nắng ráo và trước
ngày cắt từ 2-3 ngày cũng nắng, không mưa nhằm hạn chế tỷ lệ mẫu nhiễm
khuẩn. Mẫu n uôi cấy (explants) được lấy ở những chồi sinh trưởng tốt, không
sâu bệnh, cắt bỏ phần ngọn non, toàn bộ phiến lá và gần hết phần cuống lá
(cuống lá được cắt sát với chồi) . Mẫu cấy có chiều dài từ 4-7 cm, chứa 2-3 nách
lá từ lá thứ 3 đến lá thứ 6.
2.1.3. Thử nghiệm thời gian khử trùng mẫu cấy.
Do mẫu sống nên không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản
chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực vật phải được khử trùng bằng các
dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường dùng là hypoclorit
calcium, hypoclorit sodium, chlorua thủy ngân, oxi già…vv. Tỉ lệ vô trùng thành
công phụ thuộc thời gian khử trùng và nồng độ các chất khử trùng và khả năng
11
xâm nhập của chúng vào các kẽ lách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy, khả năng
đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô nuôi cấy. Các dung dịch dùng để khử
trùng mẫu phải bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng phải đủ để
tiêu diệt nguồn gây nhiễm là nấm và vi khuẩn.
Bảng 01. Thời gian và nồng độ chất khử trùng mẫu NaOCl ở các công thức
Nồng độ NaOCl (%) Thời gian khử trùng (phút) Công thức
10 CT1
5 20 CT2
30 CT3
10 CT4
10 20 CT5
30 CT6
10 CT7
15 20 CT8
30 CT9
HgCl2 0,1% 16 phút CT10 (ĐC)
Mẫu sau khi cắt được ngâm ngay vào nước. Sau đó rửa mẫu bằng nước 3
lần, tiếp tục rửa bằng xà phòng (xà phòng bột) và rửa lại 4 lần bằng nước cất.
Đưa mẫu vào phòng cấy vô trùng, rửa lại 2 lần bằng nước cất vô trùng. Khử
trùng bằng cồn 750 khoảng 2 giây, sau đó rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng.
Cuối cùng khử trùng mẫu bằng NaOCl cuối cùng rửa lại bằng nước cất vô trùng.
Các khoảng thời gian khử trùng mẫu cấy bằng NaOCl được thể hiện ở bảng 01.
2.1.4. Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến hiệu quả quá
trình nhân nhanh chồi.
Các chất điều hoà sinh trưởng tuy chiếm hàm lượng rất nhỏ trong môi
trường nuôi cấy nhưng có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá
trình nhân giống. Chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng mạnh mẽ và quan
trọng nhất trong giai đoạn nhân nhanh chồi đó là các chất thuộc nhóm cytokinin,
hầu hết các nghiên cứu nuôi cấy mô đều có sử dụng các chất thuộc nhóm này,
cytokinin thường được sử dụng là BAP. Tỷ lệ cân đối giữa cytokinin /auxin có
12
ảnh hưởng đến chất lượng của chồi và hệ số nhân chồi [1]. Nồng độ các chất
điều hòa sinh trưởng được bố trí theo các công thức ở bảng 02.
Bảng 02. Nồng độ BAP và NAA ở các công thức thí nghiệm
Nồng độ BAP Nồng độ NAA Ký hiệu
(mg/l) (mg/l)
1,1 CT11
1,4 1,2 CT12
1,3 CT13
1,1 CT14
1,5 1,2 CT15 (ĐC)
1,3 CT16
1,1 CT17
1,6 1,2 CT18
1,3 CT19
2.1.5. Thử nghiệm ảnh hưởng phối hợp của ABT1 và IBA đến hiệu quả của quá
trình tạo rễ.
Trong nuôi cấy invitro, giai đoạn này không đòi hỏi cây trong ống nghiệm
sinh trưởng nhan mà chỉ nhằm cung cấp đủ chất dinh dưỡng thích hợp cho quá
trình tạo rễ. Do đó, ở giai đoạn này hầu hết các loài cây chỉ sử dụng môi trường
khoáng ½MS và nồng độ đường giảm ½ so với môi trường nhân chồi. Vì thế ở
đây đề tài cũng sử dụng môi trường khoáng ½ MS và nồng độ đường là 15g/l và
bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng ở bảng 03.
Các công thức ở bảng 02 sử dụng môi trường cấy tạo rễ cây bạch đàn
dòng U6 làm đối chứng.
2.1.6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
chất lượng của cây con ở vườn ươm.
Trong giai đoạn ống nghiệm, cây mô được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu
về nhiệt độ, ánh sáng và môi trường dinh dưỡng. Do đó, để cấy cây ra bầu có tỷ
lệ sống cao, chất lượng cây con tốt cần có khoảng thời gian để cây thích nghi dần
với ánh sáng và nhiệt độ của môi trường tự nhiên nên cần thiết phải huấn luyện
trong điều kiện ánh sánh và nhiệt độ tự nhiên.
13
Khi cây con đã ra rễ trong bình trụ được đưa ra nhà huấn luyện với mái
nhựa trong, không để ánh sáng trực tiếp chiếu vào bình cây. Thử nghiệm huấn
luyện ở 3 khoảng thời gian 1 tuần (ký hiệu CT32), 2 tuần (CT33) và 3 tuần
(CT34).
Bảng 03. Nồng độ ABT1 và IBA ở các công thức thí nghiệm cấy ra rễ
Nồng độ IBA (mg/l) Nồng độ ABT1 (mg/l) Ký hiệu
0,0 CT20
1,0 CT21
1,0
2,0 CT22
3,0 CT23
0,0 CT24
1,0 CT25
2,0
2,0 CT26
3,0 CT27
0,0 CT28
1,0 CT29
3,0
2,0 CT30
3,0 CT31
2.1.7. Cấy cây mầm ra vườn ươm.
Cây con được cấy ra vườn ươm theo quy trình kỹ thuật chăm sóc cấy cây
mầm mô Bạch đàn với bầu 7x11cm, giá thể là đất tầng B. Đánh giá tỷ lệ sống ở
các công thức thử nghiệm thời gian huấn luyện ở 8 tuần sau khi cấy.
2.1.8. Điều kiện vật lý của quá trình nuôi cấy.
- Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C ( ± 30).
- Độ ẩm trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 55% ( ± 5%).
- Cường độ chiếu sáng từ 1000-3000 lux (mỗi thời điểm khác nhau sử dụng
cường độ chiếu sáng khác nhau).
- Thời gian chiếu sáng từ 10-11h/ngày.
- pH môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng =6,0.
14
2.1.9. Bố trí thí nghiệm
Các bình cây được bố trí ngẫu nhiên đầy đủ. Mỗi công thức lặp lại 3 lần
theo không gian và thời gian, mỗi lần10 bình và mỗi bình 10 mẫu.
- Đo đếm, tính toán hệ số nhân chồi, tỷ lệ chồi hữu hiệu, và tỷ lệ sống của ở
các thí nghiệm về nhân chồi sau 8 tuần cấy.
- Đo đếm, tính toán tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành ở 3 tuần sau khi cấy
- Với các thí nghiệm về khử trùng mẫu cấy thì mẫu được cấy trong ống
nghiệm. Đánh giá qua số mẫu sống và nảy chồi. Mỗi công thức thí nghiệm
cấy 60 mẫu (mỗi mẫu cấy vào 1 ống nghiệm).
- Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mẫu được cấy trong
bình tam giác 500ml. Các thí nghiệm về môi trường tạo rễ, mẫu được cấy
trong bình trụ, mỗi công thức theo dõi thử nghiệm 10 bình, mỗi bình 10
chồi.
2.1.10. Thu thập và xử lý số liệu.
• Thu thập các chỉ tiêu.
- Khử trùng mẫu.
∑ Mẫu sống
Tỷ lệ mẫu sống (%) = ---------------------x 100
∑ Mẫu đưa vào
∑ Mẫu chết
Tỷ lệ mẫu chết (%) = ----------------- ----x 100
∑ Mẫu đưa vào
∑ Mẫu bị nhiễm
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = -------------------- x 100
∑ Mẫu đưa vào
- Chỉ tiêu về chồi.
∑ Số chồi tạo thành
Hệ số nhân chồi (lần) = -----------------------
∑ Số chồi cấy
15
∑ Chồi hữu hiệu
Tỷ lệ chồi hữu hiệu (%) = -------------------- x 100
∑ Chồi tạo thành
- Chỉ tiêu về rễ.
∑ Chồi ra rễ
Tỷ lệ chồi ra rễ (%) = ---------------- x 100
∑ Chồi cấy
∑ Số rễ tạo thành
Số rễ trung bình/cây (Rễ) = ---------------------
∑ Số cây
Chồi hữu hiệu là những chồi có chiều cao từ 1,0 cm trở lên, thân, lá và
ngọn rõ ràng, có nhiều hơn 2 cặp lá, không bị callus. Ghi tình trạng phát triển
của chồi ở cả hai giai đoạn nhân chồi và ra rễ bao gồm: hình thái của chồi, những
chồi chết, chồi bị đen.
Cây ra rễ là những cây có rễ với chiều dài rễ >2 mm, cây có rễ <2mm
được coi là không ra rễ.
• Xử lý số liệu.
- Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần
mềm Excel.
- Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố đến chỉ tiêu nghiên cứu, đề tài
sử dụng phương pháp phân tích phương sai hai nhân tố với độ tin cậy
95%. Với các thí nghiệm không thảo mãn điều kiện phân tích phương
sai, sử dụng phương pháp kiểm định phi tham số cho K mẫu độc lập.
Dùng chỉ tiêu phân hạng Duncan để tìm ra công thức tốt nhất.
2.2. Thiết bị, dụng cụ và nguyên vật liệu.
- Panh, kéo nuôi cấy mô.
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy mô và các trang thiết bị phụ trợ khác.
16