Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào

  • 23 trang
  • file .pdf
Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ môn Công nghệ sinh học
Lớp DH06SH
Bài tiểu luận:
CHẨN ĐOÁN VIRUS LỞ MỒM
LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT
NUÔI CẤY TẾ BÀO
Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Duy Lan
MSSV: 06126067
_Tháng 10/2009
1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngành chăn nuôi được coi là một trong những ngành hàng quan trọng để chuyển đổi cơ cấu
và thúc đẩy tăng trưởng nông nghiệp. Tuy nhiên, điều quan trọng hàng đầu là trong quá trình
chọn giống và nuôi dưỡng chăm sóc, đàn gia súc phải luôn luôn khỏe mạnh, sức đề kháng
cao và thành phần các chất dinh dưỡng tích lũy vào thịt có chất lượng tốt và có giá
trị sinh học.
Bệnh lở mồm long móng (tiếng Anh: Foot-and-mouth disease, viết tắt FMD; tiếng Latin:
Aphtae epizooticae), là một loại bệnh rất nguy hiểm do virus gây ra trên động vật móng
guốc chẵn như heo, bò, trâu, hươu, dê... Bệnh này rất nguy hiểm vì bệnh lây lan rất nhanh
trên diện rộng qua nhiều con đường khác nhau như tiếp xúc trực tiếp giữa động vật với
nhau, truyền qua không khí... Mặc dù tỷ lệ gây chết chỉ cao trên heo con, bê nghé; còn trên
các gia súc lứa và trưởng thành nếu được điều trị tốt thú có thể phục hồi sau 1-2 tuần, song
thiệt hại về kinh tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh. (8)
Chính vì vậy mà Tổ chức Y tế Thế giới xếp bệnh lở mồm long móng đứng đầu các bệnh
truyền nhiễm của động vật trong danh mục kiểm dịch quốc tế.
Vì hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất hạn chế nhập khẩu gia súc, hoặc các
sản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy
hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó.
2
2. TỔNG QUAN
2.1 Bệnh lở mồm long móng
2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh
Mô tả đầu tiên bằng văn bản về dịch có lẽ vào năm 1514, khi Fracastorius mô tả một căn
bệnh tương tự trên gia súc tại Italy. Gần 400 năm sau, vào năm 1897 Friedrich Loeffler và
Frosch đã chứng minh được tác nhân gây nên bệnh lở mồm long móng có thể qua lọc.
Hình: Friedrich Loeffler
Đây là minh chứng đầu tiên cho thấy một bệnh trên động vật do tác nhân qua lọc gọi là
virus gây ra, mở ra một kỷ nguyên mới cho ngành virus học (Virology).
1929: Những trường hợp cuối cùng ở Mỹ
1953: Những trường hợp cuối cùng ở Canada và Mexico
1993: Italy
1997: Đài Loan (Taiwan)
2001: Anh (United Kingdom)
Vài đợt dịch khác trong những năm 1967-1968 and 1981. Dịch bệnh lở mồm long móng đã
xảy ra ở nhiều châu lục như châu Á, châu Phi, châu Âu và Nam Mỹ. (7)
Ở châu Âu, bệnh đã bùng phát tại Anh, Hà Lan và Pháp vào năm 2001. Hàng triệu gia
súc bị thiêu hủy gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế các quốc gia
này nói chung.
Cùng năm đó, dịch cũng đã xảy ra tại Hàn Quốc, Nhật Bản và Đài Loan.
3
Đến cuối năm 2003, dịch xảy ra ở vùng Đông Nam Á (Thái Lan, Lào, Campuchia,
Malaysia, Myanma, Philippines và Việt Nam. Một năm sau, dịch lan tới Trung Quốc, Nga,
Mông Cổ và tiếp tục ở Myanma.
Hình: Các đợt dịch FMD năm 2003
Trong 2 năm 2005 và 2006, dịch tràn tới Nam Mỹ ở các quốc gia như Brasil, Argentina và
Paraquay cũng như ở châu Phi (Nam Phi). (1)
Việt Nam
Năm 2006 là năm bệnh dịch lở mồm long móng xảy ra rất mạnh ở hầu hết các tỉnh thành
của Việt Nam với hàng chục nghìn gia sục bị nhiễm bệnh. Tuy nhiên, do điều kiện cũng
như ý thức của người dân, trình độ và sự thiếu trách nhiệm của cán bộ thú y và chính quyền
địa phương mà dịch bệnh không thể khống chế dễ dàng. Một số nơi, còn sử dụng các con
vật đã chết làm thức ăn.
2.1.2 Phân bố bệnh trên thế giới
Các type huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới. Type huyết thanh O, A được
nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới. Trái lại các type huyết thanh SAT1, SAT2,
SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi. Typ huyết thanh Asia 1 được tìm thấy
ở nhiều nước thuộc châu Á. Riêng type huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như
Philippines.
4
Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng virus gây bệnh LMLM trên gia súc ở Việt Nam thuộc
type O, gần đây có xuất hiện virus type A ở miền Trung và virus type Asia 1 ở các tỉnh
miền núi phía bắc. (5)
5
Hình: FMD type O virus từ phía Bắc Việt Nam
Tính tới ngày 1/11/2009:
Ở Tuyên Quang: Ngày 25/10/2009, dịch Lở mồm đã xảy ra trên địa bàn xã Công Đa của
huyện Yên Sơn làm 17 con trâu mắc bệnh. Kết quả xét nghiệm bệnh phẩm dương tính với chủng vi
rút Lở mồm long móng type O. Hiện tại, địa phương đang tiến hành các biện pháp phòng, chống
dịch theo quy định.
Hiện nay, cả nước còn 10 tỉnh là: Quảng Nam, Đăk Lăk, Yên Bái, Sơn La, Hà Giang, Quảng Ninh,
Gia Lai, Hòa Bình, Lai Châu và Tuyên Quang có dịch LMLM chưa qua 21 ngày.
2.2 Giới thiệu về virus lở mồm long móng
2.2.1 Đặc điểm cấu trúc, hình thái
Virus lở mồm long móng ( Foot and Mouth Desease Virus) được phát hiện bao gồm một
sợi đơn RNA, kích thước khoảng 8500 base, được bao bọc bởi bốn protein cấu trúc (VP1,
VP2, VP3, VP4) tạo thành lớp vỏ capsid có 20 mặt (icosahedral). (1)
VP1, VP2, VP3 tạo nên một bề mặt của khối 20 mặt đối xứng (phân tử 12S) còn VP4 là
protein bên trong capside, kết dính ARN virus với mặt trong của capside.
6
Hình: Cấu trúc FMD Virus
FMD Virus thuộc họ Picorna Viridae có 7 type (O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 và Asia 1,
mỗi type còn có nhiều phụ type, thí dụ như các tiểu type O1, O2, O3 …, A1, A2, A3, C1,
C2, C3 … căn cứ vào sự khác biệt về gen và cấu trúc kháng nguyên). Các type virus phân
bố không đều nhau trên thế giới, type O là type phổ biến trên thế giới hơn cả. Các type khi
giám định huyết thanh đều không có miễn dịch chéo, và trong các ổ dịch, động vật có thể
mắc bệnh do một hoặc cùng một lúc nhiều type huyết thanh. Vì thế, nếu có sự biến đổi về
mặt di truyền dẩn đến biến đổi về mặt kháng nguyên virus ở các ổ dịch thì việc kiểm soát
bệnh bằng vaccine cũ sẽ không có hiệu quả.
Virus type A là nhóm có tính đa dạng kháng nguyên cao nhất. Type A có đến 32 type phụ.
Và hiện nay người ta vẫn chưa thống nhất được với nhau về số lượng kiểu di truyền của
virus type A khi giải trình tự gen VP1. Với virus type C việc giải trình tự gen VP1 cho
phép phân chúng thành 8 nhóm di truyền. Virus type Asia 1 có sự đa dạng di truyền ít nhất,
chỉ có 1 nhóm di truyền. Giải trình tự gen VP1, type SAT1 có 3 nhóm, SAT2 có 2 nhóm và
SAT3 có 3 nhóm di truyền phân bố theo khu vực địa lý rõ ràng.
Sự biến đổi của các type huyết thanh cũng khá phức tạp, đôi khi còn những điều chưa được
hiểu biết rõ. Do đó ngành thú y phải chọn vaccine đúng với type đang gây bệnh để tiêm
phòng.
7
(15)
Sức đề kháng của virus: Virus có sức đề kháng mạnh (8)
+ Ở 600C tồn tại 5-15 phút.
+ Ở 1000C virus chết ngay lập tức.
+ Từ 0-40C tồn tại 425 ngày.
+ Trong đất ẩm virus sống hàng năm, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và gây bệnh.
+ Trong thịt ướp lạnh virus tồn tại khá lâu.
8
+ Trong phân ủ thành đống virus tồn tại 7 ngày.
+ Nước tiểu virus tồn tại 39 ngày.
+ Virus FMDV không có vỏ bọc, nên chúng có sức đề kháng cao đối với các dung môi
hữu cơ ( cồn, ete…).
+ Mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol, …
+ Virus bền vững trong khoảng pH = 7 – 7,7. Nhanh chóng bị vô hoạt ở độ pH cao hoặc
thấp (pH <2 và pH>11). Ở pH = 6, virus mất khả năng gây nhiễm.
2.2.2 Yếu tố độc tính (1)
Function Viral factors Host factors
Adsorption and Integrins, other receptors (?),
Capsid proteins (VP1 to 3)
penetration entry factors (?)
Translation Lpro, IRES elements eIFs, PTBP, ITAF45
S region, poly(C), cre, 2B, 2C, 3A, 3B, Cellular membranes, PCBP,
RNA replication
3Cpro, 3Dpol PABP
Assembly and Capsid proteins (VP0, VP1, and VP3),
Cellular membranes (?)
maturation 3Cpro, 2A, viral RNA
Bảng: Các yếu tố của virus và tế bào chủ có thể quyết định độc lực.
Các nghiên cứu cho thấy virus có trình tự RGD của VP1 G-H loop thì hoặc sẽ đột biến
hoặc không thể nhân lên trong nuôi cấy hoặc không thể gây bệnh ở gia súc được. (11)
Các biến thể virus type O rất thích hợp với các thụ thể HS in vitro, cho thấy tầm quan trọng
của sự tương tác virus-intergrin in vivo (Integrin là họ các protein xuyên màng có trong
màng của tế bào động vật. Chức năng chính của nó là tạo liên kết với extracellular matrix
(ECM) và truyền tín hiệu giữa ECM với tế bào).
Lpro được cho thấy là một yếu tố quyết định độc lực virus, dựa trên cơ sở thí nghiệm trên
động vật với các kỹ thuật di truyền, virus type A12 được xoá bỏ Lpro. Độc lực của virus yếu
hơn so với virus hoang dại (wild virus) vì thiếu Lpro dẫn đến mất khả năng ngừng tổng hợp
protein tế bào (cellular protein).
Vai trò của protein 3A trong độc lực virus được chứng minh qua các nghiên cứu phân lập
virus FMDV đáp ứng với dịch ở Đài Loan năm 1997 (designated O/Taw/97). Đó là đợt
dịch chỉ có heo bị bệnh, gây nên tỷ lệ chết cao, ngoài ra các gia súc khác không bị ảnh
hưởng. Nghiên cứu ở mức độ phân tử đã phát hiện được virus chứa codon 10 delection (10-
codon deletion) ở nửa cuối đầu C của protein 3A. Vị trí đó tương tự với codon 19-20
delection (19- to 20-codon deletion) tìm thấy trên FMDV chuyển trong phôi gà (FMDV
passaged in chicken embryos). Virus này cũng làm giảm độc tính trên bò (12).
9
2.3 Đặc điểm dịch tễ học
2.3.1. Động vật cảm nhiễm (5)
Trong thiên nhiên: trâu bò mẫn cảm với bệnh nhất, rồi mới đến heo, dê, cừu, các loài dã
thú như hươu, nai, heo rừng…Loài ăn thịt và người ít nhạy cảm với bệnh, loài một móng
như ngựa, gia cầm, chim không mắc bệnh.
Ở người, theo tài liệu của Chung Văn Lẫm, 1997 Học viện kỹ thuật quốc gia Bình Đông
Đài Loan, thì người ăn thịt bò mắc bệnh đã nấu chín, công nhân giết mổ gia súc mắc bệnh
lở mồm long móng đều không mắc bệnh. Tuy nhiên, theo tài liệu của BS Nguyễn Vĩnh
Phước, người chăm sóc gia súc bệnh lở mồm long móng có thể mắc bệnh do virus xâm
nhập qua vết thương ở da, đường tiêu hoá, hoặc hô hấp, thời gian nung bệnh khoảng 4-8
ngày, sau đó xuất hiện các triệu chứng: sốt, mụn nước mọc ở đầu ngón tay, bàn chân,
cánh tay và các nơi khác. Đặc biệt, mụn gây ngứa, gây triệu chứng gãi nhiều, đôi khi mụn
có thể mọc ở lợi răng, gây viêm miệng. Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày, sau đó sẽ hết
bệnh.
Chất chứa virus:
- Mụn nước là nơi tập trung nhiều virus nhất, đặc biệt là mụn nước sơ phát mới hình
thành.
- Trên cơ thể thú ngoài mụn nước, các chất bài tiết như nước bọt, nước tiểu, phân, sữa,
nước mắt, nước mũi cũng chưá nhiều virus. Số lượng virus trong chất thải này có thể thay
đổi tuỳ thuộc vào thời gian mắc bệnh, thường rất cao trong ngày đầu và giảm dần. Sau 2
tuần hầu như không còn thấy virus trong các chất bài tiết. Trung bình 1 con heo mắc bệnh
sẽ bài thải khoảng 4 tỉ virus mỗi ngày (gấp 3.000 lần trên bò).
- Trên thú chết hoặc bị giết mổ, virus tập trung nhiều trong máu, bắp cơ và ở các nội tạng.
Lượng virus trong bắp cơ cao hơn trong máu và có mặt đến ngày thứ 7 sau khi mắc bệnh.
2.3.2. Đường xâm nhập và cách truyền bệnh (5)
Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, virus có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm
mạc ống tiêu hoá. Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi virus xâm nhập vào cơ
thể. Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập phụ.
Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:
+ Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn thả chung
gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh.
10
+ Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của
người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc
mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức thịt gia súc mắc bệnh hoặc
vận chuyển gia súc mắc bệnh.
+ Virus có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10km.
2.3.3. Cơ chế gây bệnh (5)
- Thời gian nung bệnh trung bình 2-4 ngày, đôi khi kéo dài đến 7 ngày.
- Đầu tiên virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua
thức ăn, nước uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể. Virus sẽ nhân lên tại các vị trí
xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, da, tạo nên mụn nước sơ
cấp, thường các mụn nước này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do đó
dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện được. Sau 1-2 ngày virus từ mụn nước sơ phát xâm
nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao. Tuy nhiên, máu và phủ tạng
không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do đó virus quay ngược trở về các vị trí
trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát
triển, tạo các mụn nước thứ cấp. Đặc điểm mụn nước
chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp
trung bì và hạ bì, do đó sau khi mụn nước vở sẽ rất
mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng thành mụn mủ
nếu được chăm sóc tốt.
- Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm
thú không nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy ra
đầy ở miệng. Heo con, bê nghé bỏ bú do đó sẽ chết
sau vài ngày mắc bệnh.
- Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do
thú đi đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ
tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây hư hại nặng tổ
chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc.
11
Móng bị bong tróc ra
- Virus có thể tạo các mụn nước ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo
sự phụ nhiễm của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim
làm gia súc chết ngộp.
2.3.4. Triệu chứng bệnh (8)
Thời gian nung bệnh từ 2-7 ngày, trung bình là 3-4 ngày, gồm 3 thể bệnh
Thể thông thường
- Bệnh hay gặp ở vùng nhiệt đới, thú ủ rũ, lông dựng, da mũi khô, thú sốt cao 40-41 0C
kéo dài 3 ngày.
- Xuất hiện các mụn nước ở da, vành móng kẻ chân, lưỡi, vú làm thú kém ăn, nhai khó
khăn.
12
Chảy nước bọt ở góc miệng Thương tổn lưỡi bò
Hình thành mụn nước quanh đầu vú, đầu vú bị thương tổn
- Ở miệng: lưỡi có mụn to ở đầu lưỡi gốc lưỡi ở hai bên lưỡi, xoang trong miệng trong
má, lỗ chân răng, môi có mụn lấm tấm bằng hạt ké, hạt bắp. Sau đó mụn vỡ và tạo thành
các vết loét đáy nhỏ và phủ màu xám. Nước dãi chảy nhiều như bọt xà phòng.
Virus LMLM gây thương tổn vùng miệng và lưỡi
- Ở mũi: niêm mạc có mụn nước, đặt biệt là vành mũi có mụn loét, nước mũi lúc đầu
trong sau đục dần.
13
- Ở chân, kẽ móng có mụn nước từ trước ra sau, mụn vỡ làm long móng.
- Ngoài da: xuất hiện các mụn loét ở vùng da mỏng như bụng, bẹn, vú, ở đầu núm vú …
- Sau khi hàng loạt mụn nước vỡ dần sẽ dẫn đến nhiễm trùng máu, nhiễm trùng da, thú
sốt cao, suy nhược dần rồi chết
Thể biến chứng
- Những biến chứng xảy ra khi điều kiện vệ sinh, chăm sóc kém làm mụn vỡ dẫn đến
nhiễm trùng, chân bị long móng, thối móng, thối xương làm thú què. Vú thì bị viêm tắt sữa.
Các mụn khác vỡ sẽ gây nhiễm vi khuẩn kế phát, bại huyết rồi chết.
Viêm loét gây thối Mụn vỡ gây viêm loét giữa các kẽ móng chân
Viêm loét gây thối móng và sứt móng
- Bệnh lở mồm long móng ghép với các bệnh ký sinh trùng hay vi khuẩn khác có sẵn
trong máu có thể làm con vật mau chóng chết.
Thể ác tính
14
- Đối với heo con: sốt cao 40-41,5oC, trong những ngày đầu thấy toàn thân đỏ ửng cả da
và niêm mạc. Chảy nước mắt và nước dãi, sau 3-4 ngày thấy da nhăn nheo nứt thành từng
vết từ trên xuống và có nước chảy ra. Nhiều con miệng viêm loét không bú được và nhiễm
trùng máu rồi chết. Tốc độ lây nhiễm trong đàn heo con là rất nhanh. Bệnh tích thường gặp
ở bốn chân, mụn loét ở miệng và gây hiện tượng long móng, sau 7-10 ngày thì lây lan sang
toàn đàn.
- Đối với heo nái: bệnh biểu hiện nhẹ hơn, thấy mụn nước ở vú, kẽ móng chân, có con
nhiễm trùng thì sưng móng viêm có mủ, đi cà nhắc, có con long móng.
2.3.5. Bệnh tích (8)
- Chủ yếu ở đường tiêu hóa như miệng có các vết loét ở lưỡi, lỗ chân răng, hầu, thực
quản, dạ dày…
- Ở đường hô hấp gây viêm phế quản. Bên trong phủ tạng: tim bị viêm cấp, van tim bị sùi
hoặc loét (TIM CỌP), lách bị sưng đen, niêm mạc ruột non ruột già xuất huyết điểm, long
móng, thối móng, rụng xương bàn chân. Khi khỏi bệnh thì ở các vết loét sẽ để lại sẹo ở
miệng.
2.4 Chẩn đoán virus lở mồm long móng
2.4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
a. Giới thiệu về kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào là là đơn vị nuôi cấy nhỏ nhất, là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào
ngoài cơ thể sống, các tế bào trong điều kiện phòng thí nghiệm vẫn tự phân chia, thực hiện
đầy đủ các chức năng biến dưỡng và các chức năng chuyên biệt của tế bào. Nuôi cấy tế bào
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được tiến hành lần đầu vào năm 1907 bởi Harrison với những tế
bào thần kinh ếch.
Ngày nay, kỹ thuật nuôi cấy tế bào được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thú y, nhân
y, sinh học trong mục đích nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào (dược học, độc tố
học), chẩn đoán và điều trị ung thư (ung thư học), chẩn đoán các tác nhân gây bệnh, sản
xuất kháng thể đơn dòng, sản xuất vaccine (miễn dịch học, virus học, vi khuẩn học), chẩn
đoán biến đổi gen và sản xuất các sản phẩm sinh học như hormone, enzyme trị liệu (công
nghệ gen, công nghệ sinh học). Việc nuôi cấy tế bào động vật đòi hỏi các điều kiện tiệt
trùng nghiêm ngặt và môi trường nuôi cấy phức tạp, giàu chất dinh dưỡng.
Các loại tế bào nuôi cấy
15
Trong nuôi cấy tế bào động vật, người ta phân biệt hai trường hợp: tế bào bậc một hay tế
bào sơ cấp và tế bào bậc hai hay tế bào thứ cấp.
- Tế bào bậc một (Primary cells) là những tế bào thu được trực tiếp từ các cơ quan hay
mô động vật.
- Khi nuôi cấy chuyển tiếp các tế bào này trong điều kiện phòng thí nghiệm sẽ thu được
tế bào bậc hai (Secondary cells), những tế bào này có thể được nuôi chuyển tiếp nhiều
lần, một số trong đó có khả năng duy trì sự phát triển trong vài tuần hoặc vài tháng,
nhưng một số có thể duy trì sự phát triển không hạn định. Những tế bào này sẽ được
giữ lại làm những dòng tế bào giống phục vụ cho các nghiên cứu trên tế bào.
Các loại tế bào nuôi cấy
- Tế bào biểu mô (Epithelial cells)
- Nguyên sợi bào (Firoblast cells)
- Tế bào cơ (Muscle cells)
- Tế bào thần kinh (Nerve cells)
- Tế bào lympho bào
Tế bào động vật có thể được bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -196oC, ở nhiệt độ này, tế
bào có thể giữ được khả năng sống không hạn định và phát triển trở lại trên môi trường
nuôi cấy tế bào khi được rã đông. (3)
Các loại tế bào khác nhau có khả năng phát triển khác nhau
Dòng tế bào Nguồn gốc Loại tế bào nuôi cấy
BHK Thận chuột Hamster nhỏ Nguyên sợi bào
MDCK Thận chó Tế bào biểu mô
Vero Thận khỉ Nguyên sợi bào
CHO Buồng trứng chuột Hamster Trung Quốc Tế bào biểu mô
(Dòng tế bào: quần thể tế bào giống hệt nhau, bắt nguồn từ một tế bào ban đầu).
Một số phương tiện cần thiết
- Phòng thí nghiệm: sạch, chiếu sáng tốt, ít người qua lại
- Tủ cấy vô trùng chuyên nuôi cấy tế bào (hệ thống vô trùng)
- Tủ ấm thường và tủ ấm CO2
- Tủ lạnh thường và tủ lạnh sâu
- Bình nitơ lỏng để bảo quản tế bào
16
- Hệ thống cất nước hai lần hoặc hệ thống lọc loại trừ chất độc vô cơ và hữu cơ
- Hệ thống lọc vô trùng và hệ thống trypsin hoá
- Dụng cụ thuỷ tinh và nhựa: đựng môi trường và nước cất
- Kính hiển vi soi ngược
- Một số máy móc khác như : autoclave, máy đếm tế bào, máy chụp hình, máy
ly tâm, ...
Kỹ thuật vô trùng
Có tầm quan trọng rất lớn trong nuôi cấy tế bào động vật.
- Xử lý chai nhựa nuôi cấy tế bào
- Xử lý chai thuỷ tinh
- Vô trùng khu vực thao tác
- Vô trùng bề mặt khu vực làm việc : dọn sạch bằng cồn 70o, lau cồn các dụng
cụ, sắp xếp dụng cụ, làm xong dọn dẹp nơi thao tác, sát trùng buồng sấy vô
trùng bằng tia cực tím trước mỗi lần thao tác.
Môi trường và những yếu tố cần thiết cho nuôi cấy
Yêu cầu: tế bào trong ống nghiệp gần giống trong động vật sống
Các yếu tố quan trọng
- Nền: tạo bề mặt đặc biệt để tế bào bám
- Môi trường: đủ dưỡng chất cho tế bào phát triển (Carbonhydrate, Glucose,
Amino acid, muối đẳng trương, Bicarbonate, Vitamin, Hormone, Phenol Red,
...). Chất bổ sung vào môi trường : huyết thanh 10%
Điều kiện nuôi cấy
- Nhiệt độ: 37oC. Nhiệt độ thấp hơn 37oC, tỷ lệ phát triển giảm, tế bào chưa bị tổn
thương. Nhiệt độ từ 39-40oC, tế bào bị phá huỷ.
- pH = 7,4
Sự cấy
- Đưa tế bào vào môi trường nuôi cấy tiệt trùng.
- Mật độ lúc cấy 104- 105 tế bào tb/ml.
- Sau 3 – 4 ngày đạt 106 tế bào hoặc 105 tế bào/ cm2/bề mặt cứng
17
- Sự sinh trưởng ngừng lại do giới hạn chất dinh dưỡng, tích tụ sản phẩm độc,
thiếu bề mặt tăng trưởng (bề mặt cứng). Lúc này ta cần thay thế môi trường
hoàn toàn hay một phần sau 2 ngày để đạt mật độ tối đa cao hơn.
Cách nhận biết sự phát triển của tế bào
- Trực tiếp: đếm tế bào ít nhất một lần trong ngày, tại một thời điểm nhất định.
Dùng buồng đếm hồng cầu, bổ sung Trypan Blue giúp đếm dễ dàng hơn. Ưu
điểm : cùng lúc đếm được nhiều mẫu. Hạn chế : số mẫu ít, sai số khoảng 10%.
- Gián tiếp: xác định một sản phẩm nào đó trong tế bào để xác định sự phát triển
của tế bào. Ví dụ: xác định protein, xác định DNA, xác định Glucose, ...
Cấy chuyển
- Cấy một số tế bào vào môi trường mới ( khi tế bào ngừng tăng trưởng)
- Ủ môi trường trong tủ ấm trước khi cấy chuyển: do môi trường ở nhiệt độ
phòng không hẳn là nhiệt độ thích hợp cho tế bào
- Tách tế bào khỏi bề mặt tăng trưởng bằng trypsin trong 15 phút, hút bỏ môi
trường, rửa lớp tế bào bằng 5ml PBSA
- Cho 3ml trypsin, để lọ tế bào trong tủ ấm 5 phút. Bất hoạt trypsin bằng 5ml môi
trường phát triển, rút cho vào ống ly tâm
- Ly tâm 2000vòng/phút trong 5 phút, đổ bỏ phần nước trên. Cho 3ml môi trường
phát triển, trộn đều, hút vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 4ml môi trường phát triển.
- Đưa lọ vào tủ ấm 37oC / 5% CO2
Thu hoạch tế bào
- Dùng trypsin ở 37oC
- Để bình nuôi cấy vào tủ lạnh.
- Cho trypsin ở 37oC vào, tế bào co tròn, bong ra khỏi bề mặt nuôi cấy.
b. Chẩn đoán virus lở mồm long móng bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào
Chọn mẫu
Lấy mẫu ở đường hô hấp, dịch họng, hay đường tiêu hoá, biểu mô nghi ngờ nhiễm virus.
Thời gian lấy mẫu nên là lúc mới biểu hiện các triệu chứng, hay lúc mới chết, không nên
lấy mẫu lúc con vật đã chết được một thời gian.
Cách bảo quản
18