Chẩn đoán virus gumboro (infectiuos bursal disease) bằng kỹ thuật gen

  • 22 trang
  • file .pdf
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP DH06SH
SERMINA
CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO
(INFECTIUOS BURSAL DISEASE)
BẰNG KỸ THUẬT GEN
Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện
TS. Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Thu Thanh
MSSV: 06126133
10/2009
1
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
I. MỤC LỤC
II. ĐẶT VẤN ĐỀ......................................................................................3
III. TỔNG
QUAN………………………………………………………...4
III.1. Virus Gumboro (IBDV)……………………………………..7
III.2. Bệnh Gumboro………………………………………………7
III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius…………………………………8
III.2.2. Lịch sử phát hiện………………………………………..9
III.2.3. Cơ chế……………………………………………….......9
III.2.4. Triệu chứng……………………………………………....11
III.2.5. Bệnh tích……………………………………………….11
III.3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro………………14
III.3.1. RT-PCR………………………………………………...14
III.3.2. RFLP…………………………………………………...17
IV. KẾT LUẬN…………………………………………………..20
V. TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………...20
2
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
II. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức
độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các
ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học
phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu
trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình
tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối
tương tác này.
Kỹ thuật gen ngày càng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và y
học bảo vệ sức khoẻ con người. Nguyên lí kỹ thuật gen và các phương pháp
nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh học phân tử là những kiến thức cần
thiết cho các nhà sinh học và kỹ sư công nghệ sinh học. Các thành tựu
nghiên cứu bộ gen người, bộ gen cây lúa, và nhân bản động vật … đã mở ra
một thời kỳ mới trong sinh học, giúp con người hiểu biết rõ bản chất của
nhiều loại bệnh di truyền, bệnh truyền nhiễm, chẩn đoán bệnh sớm, góp
phần điều trị có hiệu quả và bảo vệ sức khoẻ con người cũng như gia súc và
gia cầm.
Kỹ thuật gen đã được áp dụng nhiều trong chẩn đoán virus, cho phép
xác định kết quả chỉ trong vòng 24 giờ. Những phương pháp chẩn đoán này
có những ưu điểm cơ bản như: nhanh chóng, đơn giản, nhạy, chính xác và
chi phí thấp…
Hiện nay, việc chăn nuôi gia cầm ở nước ta đang gặp nhiều khó khăn.
Nguyên nhân là do có nhiều dịch bệnh xuất hiện trên gia cầm gây thiệt hại
nặng nề cho nhà chăn nuôi như H5N1, bệnh Gumboro…
Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật gen vào việc chẩn đoán, điều trị
bệnh trên gia cầm hiện nay là một tất yếu.
3
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
III. TỔNG QUAN
III.1. Virus Gumboro (IBDV)
Virus Gumboro hay còn gọi là Infectious Bursal Disease Virus
(IBDV).
IBDV có dạng hình khối, nhiều góc cạnh, kích thước: 55-65 nm, phân
6
tử khối: 2.10 Dalton (Nick, 1976).
IBDV là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài.
IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA cuộn tròn và được phân thành 2
đoạn riêng biệt, nó thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae (Leong et
al., 2000). Quanh nhân là vỏ protein (vỏ capsid). Lớp capsid này được hợp
thành bởi 32 capsomer (đơn vị hình thái). Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại
protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral ProteinVP).
4
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
IBDV genome chứa hai mạch, A và B. Mạch B (2.9kb) mã hóa cho
VP1 (VP1: 95kDa), người ta vẫn cho nó là một enzyme RNA polimerase
phụ thuộc RNA (RNA dependent RNA polimerase-RdRp) (Bruenn, 1991;
Macreadie & Azad, 1993; Spies et al., 1987). Polipeptide này hiện diện dưới
dạng virus nghỉ ở ngoài tế bào chủ (virion), mang bản chất của một protein
tự do và của một protein liên kết genome (còn được gọi là VPg). VPg được
cố định vào đuôi 5’ của sợi dương của 2 mạch trong genome (Dobos, 1993;
Spies & Muller, 1990). Mạch A lớn hơn (3.2kb) chứa hai khung đọc mở
thành phần (overlapping open reading frame-ORF). ORF nhỏ sẽ mã hóa cho
protein không cấu trúc VP5, không cần thiết cho quá trình sao chép virus in
vitro nhưng lại quan trọng đối với khả năng gây bệnh của virus (Mundt et
al., 1997; Yao et al., 1998). ORF lớn hơn mã hóa cho 1 polyprotein 110
kDa, tự xúc tác phân cắt hình thành 3 loại polipeptide: pVP2 (48 kDa), VP3
(32 kDa) và VP4 (28 kDa). VP4, một loại enzyme protease phân cắt serine-
lysine (Birghan et al., 2000), nó còn tham gia quá trình tự tách RNA dư thừa
(Lejal et al., 2000; Sanchez & Rodriguez, 1999). pVP2 sẽ được tách thêm
những RNA dư thừa tại những Carbon cuối cùng để trở thành VP2 (40 kDa)
(Da Costa et al., 2002; Lejal et al., 2000). VP2 và VP3 là những protein cấu
trúc. Trong đó, VP2 chứa những vị trí kháng nguyên quan trọng và hệ thống
đáp ứng miễn dịch (Heine and Boyle, 1993).
5
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
Về miễn dịch: IBDV có hai serotype khác biệt rõ ràng, nhưng chỉ có
loại serotype 1 mới có khả năng gây bệnh trên gia cầm.
Serotype 1: gồm nhiều chủng gây bệnh cho gà. Có ít nhất khoảng 6
loại kháng nguyên phụ của serotype 1 được xác định bằng các thử nghiệm
trung hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng
nguyên phụ này thường được biết dưới dạng những biến thể, nguyên nhân
gây tỉ lệ tử vong trên gà từ 60-100%. Có sự khác nhau về kháng nguyên giữa
các chủng cổ điển và biến thể. Miễn dịch chéo giữa những biến chủng rất
nhỏ (Mc Ferran và Cs 1980).
Serotype 2: gồm có chủng virus gây bệnh cho gà tây. Về phương diện
miễn dịch, giữa hai serotype không có khả năng miễn dịch chéo với nhau.
Tuy nhiên gà và gà tây có thể bị nhiễm các chủng virus của nhau mà không
phát bệnh.
Sức đề kháng:
IBDV có sức đề kháng cao với các tác nhân lý, hóa và môi trường.
o
Chịu đựng được pH từ 2-12 (Benton và cs, 1967). Ở 56 C, IBDV tồn tại
o o
trong 5h, ở 70 C thì bị tiêu diệt sau 30 phút, ở -50 C trong 18 tháng độc lực
không suy giảm (Landgraf và cs, 1967).
6
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
Trong chất thải, phân, nước tiểu,... IBDV vẫn giữ nguyên tính gây
nhiễm và gây bệnh trong vòng ít nhất là 52 ngày.
IBDV đề kháng hoàn toàn với ether, chloroform. Trong phenol 0.5%
o
và timerosal 1.125% ở 50 C trong 1h, formalin 0.5% trong 6h, chloramin
% trong 10 phút. Các hợp chất như: dẫn suất phenol, phức hợp iode,
formol nồng độ cao, có thể diệt được IBDV.
Chất chứa mầm bệnh: thận và túi Fabricius, nơi chứa nhiều virus nhất.
Ngoài ra, trong các chất tiết, thức ăn, nước uống, chất độn chuồng... cũng
chứa virus.
Đường xâm nhiễm: trong tự nhiên, lây truyền qua đường tiêu hóa là
phổ biến nhất, việc lây nhiễm qua không khí ít quan trọng. Trong phòng thí
nghiệm, có thể dùng đường mũi và mắt.
Sự lan truyền:
Bệnh có thể truyền ngang từ gà ốm sang gà khỏe qua thức ăn, nước
uống, dụng cụ chăn nuôi,...
Bệnh mang tính phức tạp trong đường lây lan do sức chịu đựng của
virus trong môi trường ở nhiệt độ cao, cũng như với một số hóa chất sát
trùng.
III.2. Bệnh Gumboro
Bệnh Gumboro là bệnh cấp tính của gà, virus gây bệnh Gumboro
(IBDV) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả năng miễn dịch của gà.
Animated view of IBDV VP2 fit using 12
modes
Mầm bệnh có thể sống hàng tháng trong chuồng trại, thức ăn, nước
uống, phân...
Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là 3 – 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể
mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng nhưng ảnh hưởng rất
lớn vì nó làm ức chế quá trình sinh miễn dịch.
7
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
III.2.1. Sơ lược về túi Fabricius
Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho, nằm gần hậu môn. Trong quá
trình phát triển của bào thai, nó xuất hiện sau tuyến ức và giống như tuyến
ức, túi Fabricius có cấu trúc lympho biểu mô.
Túi Fabricius là cơ quan dạng lympho trung ương, quá trình biệt hóa
trong túi diễn ra không bị ảnh hưởng bởi kích thích kháng nguyên từ bên
ngoài.
Túi Fabricius nhỏ đi rất sớm: gà khoảng tháng thứ 4 (tuổi dậy thì), nó
bắt đầu teo và tới tháng 11-12 thì mất hẳn.
Fig. 1. Normal size bursa of Fabricius (top left) and abnormally smaller size
bursa (top right). Normal proventriculus (lower left) and abnormal proventriculus
(lower right). Abnormal proventriculus has thickened lining with viscous white
material over glands.
Chia túi ra thành các đơn vị cấu trúc gọi là các nang (Foliculum). Mỗi
nang gồm có một vùng vỏ giàu lympho bào và một vùng tủy ít tế bào hơn
nhưng có chứa tương bào.
Đây còn là nơi biệt hóa dòng lympho B.
8
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
III.2.2. Lịch sử phát hiện
Năm 1962, Cosgrove đã phát hiện và mô tả một bệnh mới, xuất hiện ở
thành phố Gumboro, vùng Dalaware ở Hoa Kỳ. Bệnh thường thấy trên gà con
với bệnh tích thường gặp chủ yếu ở thận và túi Fabricius.
Lúc đầu, người ta cho rằng, bệnh là biến thể của bệnh viêm phế quản
truyền nhiễm (Infectious Bronchitis, IB) vì bệnh tích ở thận tương đối giống
nhau.
Sau này, Winterfield và Hitchner đã chứng minh rằng những con gà
đã miễn dịch với IB rồi vẫn nhiễm bệnh viêm túi Fabricius.
Cuối năm 1962, Winterfield đã phân lập được từ phôi trứng tác nhân
gây bệnh truyền nhiễm ở gà (bệnh tích ở túi Fabricius và thận).
Năm 1986-1987, lần đầu tiên những dòng biến thể của IBDV được
công bố.
Năm 1987, sự nguy hiểm của IBDV lần đầu tiên được công bố tại
Belgium và The Netherlands.
Năm 1970, Hitchner đề nghị tên chính thức cho bệnh này là Infectious
Bursal Disease (IBD) hay còn gọi là Gumboro. Virus gây bệnh là Infectious
Bursal Disease Virus (IBDV).
III.2.3. Cơ chế
IBDV tấn công chủ yếu vào mô lympho. Tế bào lympho B của túi
Fabricius bị phá hủy. Tế bào lympho T của tuyến Thymus bị tổn thương.
Sau 2 ngày xâm nhập vào cơ thể, thấy xuất hiện những biến đổi viêm túi
Fabricius. Đặc biệt đến ngày 3-4 ở túi Fabricius, thấy xung huyết, xuất
huyết, phù thủng và sự thâm nhiễm của các tế bào viêm đạt ở độ cực đại.
Cùng với sự phóng virus, thân nhiệt cũng tăng đột ngột; sau đó, gây hoại tử
tiến triển ở các nang (Foliculu) của túi, phá hủy tất cả các mô lympho và
cuối cùng sau 5-7 ngày túi teo nhanh. Những thay đổi suy thoái phát triển ở
những nơi tế bào lympho B hay tụ tập.
9
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
10
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
III.2.4. Triệu chứng
Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày.
- Sau khi nhiễm bệnh gà biểu hiện triệu chứng đầu tiên là cắn mổ vào hậu
môn của nhau, giảm ăn, lông xù, lờ đờ, đi run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy
màu trắng, loãng còn nhiều chất nhầy sau đó chuyển sang màu nâu, phân
dính đầy xung quanh hậu môn.
Hình 3.1: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông.
Hình 3.2: Gà bệnh tiêu chảy phân loãng trắng.
III.2.5. Bệnh tích
- Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô.
- Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen.
- Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết tấm tấm hoặc cả đám,
thận sưng nhạt màu. Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp
giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên trong.
11
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
- Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày
thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu.
Hình 3.3: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm
Hình 3.4: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt.
Hình 3.5: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và
tiền mề).
12
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
13
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
III.3. Các phương pháp chẩn đoán virus Gumboro
III.3.1. RT-PCR
Kỹ thuật sinh học phân tử phát triển cho phép ta có thể xác định IBDV
một cách nhanh hơn bằng cách phân lập virus. Trong số những phương pháp
sinh học phân tử thường được sử dụng để phát hiện bộ gene, thì phương
pháp RT-PCR được sử dụng khá phổ biến. Phương pháp này có thể phát
hiện bộ gene IBDV mà không cần phải tăng sinh trong môi trường nuôi cấy
trước khi khuyếch đại. RT-PCR được tiến hành trong 3 bước:
B1: Ly trích acid nucleic từ mẫu nghiên cứu.
B2: thực hiện phiên mã ngược RNA IBDV thành cDNA.
B3: khuyếch đại cDNA thu được bằng PCR. Chọn những mồi
oligonucleotide trình tự ngắn bổ sung với trình tự nucleotide đặc hiệu virus.
Những vùng khác nhau của bộ gen sẽ được khuyếch đại phụ thuộc vào sự
định vị từ những primer được chọn.
Sự khuyếch đại gen mã hoá protein vỏ bên ngoài (protein capsid
outer).
Ly trích acid nucleic:
Trong khi RNA chuỗi đơn rất dễ bị phân huỷ bởi enzyme Rnase, thì
bộ gene RNA IBDV chuỗi đôi (dsRNA) kháng sự phân huỷ bởi enzyme
RNase.
Trong thực tế, những tế bào nhiễm (dương tính với IBDV) chứa các
chủng RNA chuỗi đơn có thể được sử dụng như một mẫu ở bước RT. Sự ly
trích RNA được tiến hành một cách cẩn thận: sử dụng găng tay, những tác
nhân không có RNase và phòng thí nghiệm nhân tạo.
RNA IBDV có thể được ly trích từ những mô nhiễm bằng cách sử
dụng một vài bộ kit có sẵn. Bằng cách khác RNA IBDV có thể được ly trích
bằng cách bổ sung 1% SDS (sodium dodecyl sulphate) và 1mg/ml protein K
đối với 700 μl dịch huyền phù virus (như dịch đồng nhất bìu). Ủ ấm khoảng
0
60 phút ở 37 C. Acid nucleic được thu bằng cách sử dụng protocol chuẩn
cho việc ly trích phenol/chloroform ( chú ý: phenol là một chất độc và nên
được xử lý và loại bỏ sau đó). Acid nucleic được thu hoạch từ giai đoạn dịch
cuối cùng bằng việc kết tủa ethanol và được giữ ở trong nước cất không có
RNase hoặc dung dịch đệm bền. RNA pha loãng nước nên được giữ lạnh ở
0
nhiệt độ dưới -20 C cho đến khi sử dụng.
14
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
15
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
Sự phiên mã ngược ( Reverse transscription)
Sử dụng mồi PCR “lower” ( bổ sung với mạch dương của bộ gen
IBDV) có thể tổng hợp cDNA từ cả dsRNA IBDV cũng như từ những RNA
chuỗi đơn lấy từ IBDV được lấy từ những tế bào nhiễm.
Hỗn hợp RNA IBDV phải được biến tính trước khi chuyển vào hỗn
hợp phản ứng RT. Thêm 20% (bằng thể tích) dimethylsulphoxide vào dung
0
dịch RNA IBDV giải lạnh. Đun nóng khoảng 3 phút ở 92 C và làm lạnh trên
đá; một phương pháp khác là đun nóng khoảng 5 phút và ủ ấm hỗn hợp tức
thì trong nitơ lỏng. Chuyển thể tích hỗn hợp biến tính vào trong hỗn hợp
phản ứng. Ủ ấm theo sự chỉ dẫn của nhà cung cấp enzyme.
o
Dung dịch cDNA thu được sau bước RT nên được giữ lạnh ở < -20 C.
Việc trì hoãn bước PCR vài tuần sau khi tổng hợp cDNA có thể là nguyên
nhân gây ra kết quả PCR âm tính giả.
PCR
Enzyme DNA polymerase dùng cho phản ứng PCR nay đã được
thương mại hóa. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR theo hướng dẫn của nhà
sản xuất.
Cặp mồi U3/L3 được dùng để khuyếch đại gen VP2 thuộc dòng IBDV
serotype 1 đã được thiết kế:
Upper U3: 5'-TGT-AAA-ACG-ACG-GCC-AGT-GCA-
TGC-GGT-ATG-TGA-GGC-TTG-GTG-AC-3'
Lower L3: 5'-CAG-GAA-ACA-GCT-ATG-ACC-GAA-
TTC-GAT-CCT-GTT-GCC-ACT-CTT-TC-3'
.
Những mồi U3 và L3 là những mồi lai dài 44 nucleotide. Chúng bao
gồm một đầu tận cùng 3’ đặc hiệu IBDV (ở những chỗ nghiêng trong trình
tự chỉ ở trên) bắt cặp tại vị trí nucleotide 657 đến 676 hoặc 1193 đến 1212
của đoạn IBDV. Đầu tận cùng đặc hiệu IBDV được ghép với đầu tận cùng
5’ không đặc hiệu (loại bôi đen trong trình tự ở trên), sản phẩm PCR được
tinh sạch từ quá trình khuếch đại với cặp mồi U3/L3 thì thuận lợi cho quá
giải trình tự. Trong mồi U3 và L3 có những vị trí cắt giới hạn của enzyme
endonuclease restriction (gạch dưới trong trình tự ở trên), kết quả sản phẩm
PCR này có thể được ứng dụng trong việc tạo dòng. Cặp mồi U3/L3 tạo sản
phẩm 743 bp chúng đặc hiệu cho trình tự IBDV được khuyếch đại.
Sau đó, ta tiến hành bước biến tính lần cuối với 35 chu kỳ (mỗi một
chu kỳ gồm một bước biến tính, một bước bắt cặp và một bước kéo dài). Đối
16
Semina Ch n đoán virus Gumboro b ng k thu t gen
0
với cặp mồi U3/L3, trong một chu kỳ, biến tính ở 95 C/30 giây và bắt cặp ở
0
64 C/ 45 giây (nhiệt độ biến tính được điều chỉnh thích ứng nếu những mồi
khác được sử dụng). Những thông số đối với bước kéo dài nên được thiết lập
theo lời chỉ dẫn của nhà cung cấp.
Sự phát hiện có thể được tiến hành bằng điện di với sản phẩm PCR và
marker trọng lượng phân tử DNA trong gel agarose 1% nhuộm với ethidium
bromide ( chú ý: EB là độc chất và là tác nhân gây ung thư. Nên xử lý và
loại bỏ sau đó).
Ưu điểm:
Phát hiện nhanh, sớm, lượng mẫu dùng để phát hiện đòi hỏi không
nhiều.
Nhược điểm:
Ba bước phản ứng PCR phải được tiến hành đối với từng mẫu cDNA
(tinh sạch, cDNA pha loãng 10-100 fold) để tránh những kết quả âm tính.
Mỗi phản ứng PCR phải có phản ứng đối chứng âm và dương.
Việc trì hoãn PCR khoảng một vài tuần sau bước RT có thể gây ra kết
quả PCR âm tính giả.
IV.4. RFLP
Những năm gần đây, những kĩ thuật phân tử được sử dụng để kiểm tra
những thay đổi di truyền trên IBDV đã tăng nhanh ( Wu và cộng sự,1992;
Stram và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1997; Akin và cộng sự,
1998). Kĩ thuật thông dụng cho định dạng IBDV bao gồm những phương
pháp phân tử để khuếch đại những đoạn đặc trưng của bộ gen IBDV bằng
RT/PCR tiếp sau đó là bằng RFLP (Dybing và Jackwood, 1996; Jackwood
và Niselsen, 1997; Jackwood và Sommer, 1997; Ture và cộng sự, 1998).
Những nghiên cứu phân tích chuỗi nucleotide của VP2 giúp ta có thể phân
tích được gen mã hoá cho nhóm kháng nguyên xác định của virus
(Schnitzler, 1993). Phân tích RT/PCR-RFLP đã cho thấy nhạy hơn những
phương pháp khác bao gồm AC-ELISA.. Sử dụng RT/PCR và RFLP cho
phép ta xác định được những đặc trưng kháng nguyên phụ cũng như cho
phép phân lập mầm bệnh khác từ virus vaccine (Lin và cộng sự, 1993; Liu
và cộng sự, 1994; Jackwood và Jackwood, 1994, 1997; Jackwood và
Nielsen, 1997).
Những enzyme cắt giới hạn khác nhau đã được sử dụng cho RFLP của
IBDV như BstNI hoặc EcoRII, Sty1, DraI, SspI, SacI, SauAI hoặc NboI,
StuI HaeIII, TaqI và BspMI, là tất cả hiện nay được sử dụng kết hợp hoặc sử
dụng riêng rẽ ( Jackwood và Jackwood, 1997; Jackwood và Neilsen, 1997;
17