Cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra

  • 59 trang
  • file .pdf
PHẦN 1
GIỚI THIỆU
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là một trong những vùng kinh tế trọng
điểm nằm ở cực Nam của đất nước. Bên cạnh lúa gạo, ĐBSCL còn là vùng
nuôi trồng thủy sản lớn nhất nước. Với hệ thống sông ngòi chằn chịt, ĐBSCL
là nơi rất thuận lợi cho ngành nuôi trồng thủy sản phát triển, sản lượng thủy
sản của vùng đã đóng góp 1 phần đáng kể vào sản lượng thủy sản xuất khẩu
của cả nước, góp phần tăng thu nhập cho người dân. Sản lượng thủy sản của
ĐBSCL chiếm khoảng 50%, diện tích nuôi trồng khoảng 60% và giá trị xuất
khẩu thủy sản chiếm đến 51% của cả nước (Dương Nhựt Long, 2003).
Chính vì thế phong trào nuôi trồng thủy sản đã và đang rất thu hút người dân,
cùng với chính sách của nhà nước chuyển đổi cơ cấu ngành nghề loại bỏ đất
nông nghiệp lạc hậu để chuyển sang nuôi thủy sản thì các mô hình nuôi: nuôi
thâm canh, bán thâm canh, nuôi ao mươn vườn, nuôi kết hợp cá-lúa…đang
phát triển rầm rộ. Bên cạnh con tôm Sú thì cá Tra cũng là mặt hàng xuất khẩu
rất quan trọng của vùng, được nuôi phổ biến ở Cần Thơ, An Giang, Đồng
Tháp…và được xuất khẩu sang các nước như: EU, Nga, ASEAN, Ucraina,
Trung tâmMỹ,
HọcTrungliệu ĐH CầnsảnThơ
Quốc…Tổng lượng@ liệu
Tàibasa
cá tra, học
xuất khẩutập Nam năm cứu
và nghiên
của Việt
2007 đạt 383.2 nghìn tấn với kim ngạch đạt 974.12 triệu USD, tăng 31% về
lượng và 26.07% so với năm 2006
(http://www.fistenet.gov.vn/details.asp?Object=26125735&News_ID=263852
08).
Tuy nhiên trong nuôi cá tra thâm canh thường nuôi với mật độ dày và sử dụng
thức ăn nhiều nên lâu ngày dẫn đến nguồn nước bị ô nhiễm, mầm bệnh dễ có
cơ hội tấn công và tình trạng dịch bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và khó điều
trị. Để điều trị có hiệu quả cao thì phải chuẩn đoán đúng được bệnh, phương
pháp mô học có vai trò quan trọng trong khâu này. Nếu chỉ dựa vào những
hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ kiện khác có liên quan đến
cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn
thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
Hiện nay có nhiều nghiên cứu về mô bệnh học trên cá tra như: Bước đầu
nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra của Nguyễn
Quốc Thịnh (2002); nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng
cầu trên cá tra bị bệnh vàng da của Phan Thị Hừng (2004); khảo sát mô học cá
tra bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm của Trần Thị Ngọc Hân
1
(2006)…nhưng chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu hoàn thiện cấu trúc mô
của cá tra khỏe làm cơ sở cho nghiên cứu mô bệnh học. Do đó đề tài: “Cấu
trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus)” được thực hiện nhằm:
Mục tiêu:
Xác định đặc điểm, cấu trúc mô của các hệ cơ quan trên cá tra khỏe từ đó làm
thành bộ sưu tập hình ảnh mô học làm cơ sở cho việc chẩn đoán, phát hiện tác
nhân gây bệnh thông qua việc so sánh mô cá tra bệnh với các mô cá tra khỏe.
Nội dung:
Dùng phương pháp mô học để xác định đặc điểm, cấu trúc của các hệ cơ quan
như: da, cơ, dạ dày, ruột, gan, mang, bóng hơi, tim, thận, tỳ tạng.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2
PHẦN 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Đặc điểm sinh học của cá tra
Cá tra có tên khoa học là Pangasianodon hypophthalmus trước đây còn có tên
gọi là Pangasius micronemus, cá tra phân bố ở lưu vực sông Mêkông, có mặt
ở cả 4 nước Lào, Việt Nam, Campuchia và Thái Lan. Trước đây khi chưa có
sinh sản nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Tiền, sông Hậu và
cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong điều kiện tự nhiên địa
phận Việt Nam, do đó cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê-kông để sinh
sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên. Về đặc điểm hình thái cá tra thuộc dạng cá
da trơn, nhẵn, không có vẩy. Cá tra có đầu lớn, thân thon và hẹp dần về phía
đuôi, vây lưng cao có 1 gai cứng và có răng cưa, vây ngực có ngạnh và có độc
tố, cá tra thường có màu xám đen trên lưng và phần bụng màu trắng bạc. Cá
tra là loài sống đáy, ăn tạp. Trong tự nhiên, cá ăn được mùn bã hữu cơ, rễ cây
thủy sinh, rau quả, tôm tép, cua, côn trùng, ốc và cá ... Cá tra không đẻ trong
ao nuôi cũng không có bãi đẻ tự nhiên ở Việt Nam, cá tra đẻ ở Cam-pu-chia,
cá bột theo dòng nước về Việt Nam. Cá tra còn có cơ quan hô hấp phụ là ruột
cá có thể sống được trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất hữu cơ,
Trung tâmnênHọc liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
oxy hoà tan thấp và có thể nuôi với mật độ rất cao. Cá tra có tốc độ tăng
trưởng tương đối nhanh, sau 6 tháng nuôi cá đạt trọng lượng 1-1,2 kg/con. Cá
nuôi trong ao có thể đạt trọng lượng 25 kg ở cá 10 năm tuổi (Dương Nhựt
Long, 2003)
2.2 Lịch sử mô học
Chúng ta đã biết, bệnh trên cá xuất hiện ngày càng nhiều và càng khó điều trị.
Vì cá sống trong môi trường nước nên tốc độ lây lan rất nhanh làm cho cá chết
hàng loạt gây thiệt hại rất nghiêm trọng về kinh tế cho người dân. Dó đó công
tác chữa trị kịp thời là điều rất cần thiết. Để điều trị với chi phí thấp nhất
nhưng hiệu quả cao nhất thì việc quan trọng đầu tiên là phải chẩn đoán đúng
bệnh. Phương pháp mô học là một phương pháp có ý nghĩa đặc biệt quan
trọng trong khâu này.
Người được xem là cha đẻ của ngành tế bào học và mô học là nhà phân loại
học đồng thời cũng là nhà giải phẩu học người pháp Xanvier Bichat. Ông đã
xác định mô là đơn vị cơ bản của sự sống và có 21 loại mô trong cơ thể (Trần
Thị Ngọc Hân, 2006).
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) mô bệnh học là phương pháp xác định các
tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát
3
bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính
chất của các vùng bị tổn thương.
Theo Roberts (1995) phân tích mô bệnh học là nghiên cứu những thay đổi
hiển vi diễn ra trong mô của cơ thể trong suốt quá trình bệnh. Những thay đổi
này thường là những đặc điểm đặc trưng của bệnh và nó cho phép chẩn đoán
chính xác bệnh.
Việc nghiên cứu tế bào học và mô học được tiến hành từ rất sớm từ cuối thế
kỷ XII nhưng mãi đến thế kỷ XIX thì tế bào học và mô học mới được xem là
một môn khoa học. Sau khi học thuyết tế bào ra đời năm 1839, đặc biệt là lĩnh
vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan
và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai
đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtome) cho phép nghiên cứu sâu
hơn về cấu trúc vi thể của tế bào và mô (Nguyễn Quốc Thịnh, 2002).
Ngoài ra theo Phạm Trần Nguyên Thảo (2003) lịch sử mô học bắt đầu từ khi
chiếc kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-
1723) người Hà Lan và đến cuối thế kỷ XVIII nhà khoa học người Anh Robert
Hooke (1635-1703) đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Vào
cuối thế kỷ XIX, Rudolf Virchow (1821-1902) nhà giải phẩu học người Đức
Trung tâmđãHọc định: ĐH
khẳngliệu “ Bệnh tật làThơ
Cần do tổn@ loạnhọc
Tàirốiliệu
thương tế bào”.
tập sở đó mà cứu
vàcơnghiên
Trên
người ta đã hiểu được rằng bệnh tật không chỉ là do tổn thương, rối loạn ở các
cơ quan, nội tạng mà còn ở mức độ mô và tế bào.
Mô học có thể định nghĩa như một hệ thống các tế bào và chất gian bào có
cùng nguồn gốc, cấu tạo và chức năng, chúng được hình thành trong quá trình
tiến hoá sinh học và xuất hiện ở một cơ thể đa bào do quá trình biệt hoá (Phạm
Trần Nguyên Thảo, 2003).
Ở nước ta hiện nay mô học đã trở thành một môn khoa học quan trọng và từ
lâu đã được đưa vào giảng dạy trong các trường Đại học trên cả nước. Và mô
học cũng đã được nghiên cứu nhiều trên người, gia súc, gia cầm, thủy sản …
2.3 Ứng dụng mô bệnh học trong chẩn đoán bệnh thủy sản
Young (1959), Johnson (1980) đã ứng dụng giải phẩu học và mô học trong
việc hệ thống các bệnh thường gặp trên tôm nuôi ở Châu Mỹ, Châu á
(Lightner và ctv, 1992); năm 1997 Wang, Tang và Chen chứng minh sự hiện
diện của vi rút đốm trắng trên tôm Giant tiger shrimp, Penaeus monodon,
Kuruma shrimp, Penaeus japonicus bằng việc quan sát tiêu bản mô học dưới
kính hiển vi quang học và điện tử (trích dẫn bởi Phạm Trần Nguyên Thảo,
2003).
4
Trong quyển “Histopathology of walking catfish” của Chinabut và Limsuwan
(1983) tác giả đã nghiên cứu mô học của cá trê trắng (Clarias batrachus) bị
nhiểm khuẩn Aeromonas hydrophyla. Kết quả thấy được khi cá bị nhiểm
khuẩn Aeromonas hydrophyla thì gan, thận bị thoái hoá và hoại tử; tỳ tạng bị
sung huyết…
Nash và ctv (1986) trong nghiên cứu “bệnh vi khuẩn có liên quan đến dịch
bệnh ở cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bống mú (Epinephalus tauvina)”.
Nghiên cứu cho thấy khi bị vi khuẩn tấn công thì có những thay đổi như: lớp
biểu bì ở da bị thoái hóa, vẩy bị mất, lớp bì và trung tâm các bó cơ xuất huyết
và hoại tử dữ dội, các tế bào bị viêm, sưng, chứa đầy các khuẩn lạc lớn gram
âm. Trên thận và tỳ tạng xuất hiện những vùng mô tạo máu bị hoại tử mất hết
các tế bào máu trưởng thành, viêm cầu thận và có sự xâm nhập của lympho
bào. Gan, tuyến tụy xuất hiện dịch viêm, hoại tử rãi rác và các trung tâm hoại
tử. Ở gan, thận tỳ tạng và tuyến tụy đều có sự gia tăng của các trung tâm đại
thực bào sắc tố. Tắt nghẽn mạch máu ở tim và xuất hiện dịch viêm ở vách
bóng hơi. Rukyani (1990a) nghiên cứu thay đổi mô bệnh học trên mang cá
chép (Cyprius carpio) bị nhiểm thích bào tử trùng (Myxobolus). Nghiên cứu
mô cho thấy mang cá bị túi thích bào tử trùng ký sinh nhiều thì các phiến
mang sẽ bị dính lại, sưng viêm, xung huyết và hoại tử (trích dẫn bởi Bùi Châu
Trung tâmTrúc
HọcĐan,liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2003).
Angka (1990) đã nghiên cứu bệnh trên cá trê trắng (Clarias batrachus) bị
nhiễm vi khuẩn Aeromonas hydrophyla. Tác giả đã nghiên cứu mô tả về đặc
điểm bệnh lý, LD50 và mô bệnh học. Kết quả cho thấy khi cá bị nhiễm vi
khuẩn Aeromonas hydrophyla thấy xuất hiện những vùng xuất huyết, hoại tử
trên gan, thận, tỳ tạng và cơ quan sinh dục. Tác giả còn cho rằng nguyên nhân
có thể là do chất Cytoxin do vi khuẩn tiết ra.
Sisi Hla Bu và Leong Tak Seng (1997) nghiên cứu mô bệnh học trên cá bống
mú bị bệnh “Sleepy Gouper Desease” mỗi điểm cá bệnh lấy 3 mẫu cá khoẻ và
6 mẫu cá bệnh và khảo sát trên 9 cơ quan: mang, tim, thận, tỳ tạng, não, da, dạ
dày và ruột. các cơ quan này được cố định, xữ lý nhuộm và quan sát dưới kính
hiển vi quang học kết quả có 5 cơ quan có sự thay đổi cấu trúc hiển vi khi so
sánh giữa cá khoẻ và cá bệnh là gan, mang, tim, thận và tỳ tạng (trích dẫn bởi
Nguyễn Quốc Thịnh, 2002).
Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đã nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong
nội tạng cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tác giả đã khảo sát mô bệnh
học trên các cơ quan: gan, thận, tim, tỳ tạng, da và cơ của cá khỏe lẫn cá bệnh
và kết quả cho thấy khi cá bị bệnh trắng gan thì các cơ quan bị huỷ hoại nhiều
5
nhất là gan, thận và tỳ tạng và kế đến là mang và cuối cùng bị ảnh hưởng nhẹ
nhất là tim và cơ. Nguyên nhân làm cho cá chết có thể là do gan, thận, tỳ tạng,
mang bị hư hại dẫn đến mất chức năng của các cơ quan này.
Bùi Châu Trúc Đan (2003) đã nghiên cứu đặc điểm mô học bệnh phù mắt trên
cá tra. Tác giả đã nghiên cứu trên 10 cơ quan gồm: gan, thận, tỳ tạng, tim,
mang, ruột, dạ dày, bóng hơi, mắt, da và cơ. Kết quả về đại thể đặc điểm đặc
trưng của bệnh là: một hoặc hai mắt phù to, ổ mắt chứa đầy chất dịch màu
trắng đục, xuất huyết trong và ngoài cơ thể, về vi thể tổn thương chủ yếu là
sung huyết, xuất huyết. Nguyên nhân làm cá chết là do những thay đổi cấu
trúc mô của gan, thận, tỳ tạng với các vùng hoại tử và cấu trúc thay đổi và do
tổn thương ở mắt dẫn đến rối loạn các hoạt động sinh lý, sinh hóa trong cơ thể.
Các cơ quan khác thì bình thường.
Trần Hồng Ửng (2003) bước đầu xác định sự thay đổi của tế bào bạch cầu và
mô tỳ tạng trên cá tra bị bệnh trắng gan. Kết quả cho thấy khi cá tra bị bệnh
trắng gan thì thành phần bạch cầu thay đổi, tế bào lymphocyte thấp hơn so với
cá khỏe, neutrophil và monocyte tăng cao hơn. Cấu trúc tỳ tạng biến đổi và
thành phần tủy trắng nhiều hơn tủy đỏ.
“Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị
Trung tâmbệnh
Họcvàng của Phan
da” ĐH
liệu Cần Hừng @
ThịThơ giả đã
Tàitácliệu
(2004), học sát cấu
khảotập vàtrúc mô của cứu
nghiên
3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Kết quả khi cá bị bệnh vàng da thì cấu trúc mô
của 3 cơ quan này không thay đổi so với cá khỏe và số lượng tế bào hồng cầu
giảm đi hơn 50% so với cá khỏe.
Nguyễn Quốc Thanh (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của Aflatoxin lên tốc độ
tăng trưởng và tỉ lệ sống trên cá tra và cá basa. Kết quả cho thấy khi cá bị
nhiểm độc tố Aflatoxin thì cấu trúc gan, thận bị sung huyết, xuất huyết, nhân
tế bào bị hoại tử…
Phạm Thị Như Sang (2006) đã khảo sát mô học trên một số cơ quan của cá tra
nuôi ao và bè thâm canh. Tác giả đã phân tích mô học trên 3 cơ quan: gan,
thận và tỳ tạng. Kết quả cho thấy cả 3 cơ quan trên đều có trùng bào tử sợi ký
sinh. Ngoài ra còn phát hiện giun tròn ở mô gan cá. Cùng thời gian này, Trần
Thị Ngọc Hân (2006) cũng đã khảo sát mô học cá tra bị bệnh mủ gan trong
điều kiện gây cảm nhiễm. Kết quả phân tích mô bệnh học trên 9 cơ quan: gan,
thận, tỳ tạng, dạ dày, bóng hơi, cơ, mang, tim, ruột cho thấy khi cá bị bệnh mũ
gan thì thận và tỳ tạng là cơ quan biến đổi đầu tiên, gan biến đổi chậm hơn
thận và tỳ tạng. Các cơ quan tim và dạ dày, bóng hơi, ruột ít biến đổi.
Tung et al. (1999) nghiên cứu mô học và quan sát bằng kính hiển vi điện tử
trên tôm càng xanh bị bệnh vi rút trên cơ Macrobrachium muscle virus
6
(MMV) ở Đài Loan. Dấu hiệu bệnh lý tôm có màu trắng đục ở phần bụng, ăn
yếu, bơi lờ đờ. Mô bệnh học tương tự bệnh hoại tử cơ (IMP) và tác giả đã tìm
thấy thể vùi trong cơ bị hoại tử ; Bhavan and Geraldine (2002) nghiên cứu mô
bệnh học trên gan tuỵ và mang tôm Macrobrachium malcolmsonii khi tiếp xúc
với endosulfan. Kết quả có nhiều biến đổi về mô học trên gan tụy và mang
tôm. Những biến đổi bao gồm: sự tích tụ của các tế bào hồng cầu trong khe
của các xoang, ống gan tụy bị hoại tử, tấm mang không bình thường và phát
triển quá mức, bị hoại tử; Andersen et al. (2000) nghiên cứu bệnh mới trên vỏ
cua (Sylla serrata) ở Queensland (Australia). Dấu hiệu mô bệnh học của
những ống bị hư bên trong thấy có sự lây nhiễm ký sinh trùng và cho rằng đây
là nguyên nhân gây ra đốm nâu trên vỏ cua (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Cương,
2006).
Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006), Hibiya (1982) đã mô tả quá trình biến đổi
mô bệnh học trên tất cả các cơ quan trên cơ thể cá bệnh như cá chình, cá chép,
cá hồi.
Nghiên cứu về mô bệnh học trên cá thơm (Plecoglossus altivelis) bị bệnh xuất
huyết do vi khuẩn. Nghiên cứu mô học đã phát hiện những tổn thương ở tỳ
tạng, thận, gan, ruột , tim và mang. Những tổn thương ở tỳ tạng và mô tạo máu
thì dễ nhận biết do bị tấn công bởi vi khuẩn trên. Những vết hoại tử đi kèm với
Trung tâmxuất
Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
huyết, đông máu và trương phòng xuất hiện ở phần tủy của tỳ tạng, biểu
bì mô và trong thận. Trên gan cũng có hiện tượng hoại tử và sự hình thành
vùng áp-xe. Tuy nhiên ruột, tim và mang chỉ bị vi khuẩn P. altivelis tấn công
ở mức không đáng kể. Tuy nhiên không có sự tổn thương và vi khuẩn không
xuất hiện ở não
(http://www.mekongfish.net.vn/modules/news/article.php?storyid=102).
Ngoài ra còn có các nghiên cứu mô học chỉ nghiên cứu trên cá khỏe như:
Chinabut và ctv (1991) đã nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả chỉ
khảo sát ở mô khỏe trên các cơ quan thuộc hệ tiêu hoá, hệ tuần hoàn, hệ sinh
dục…mục đích chủ yếu là làm cơ sở để so sánh trong nghiên cứu mô học.
Grizzle et al. (1976) giải phẩu và nghiên cứu mô học trên cá nheo. Tác giả đã
mô tả đặc điểm về mô trên nhiều cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ,
hệ tiêu hoá...
Groman (1982) đã nghiên cứu mô học trên cá chẽm. Ông đã quan sát cấu trúc
mô khỏe của hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục,
hệ bài tiết… ở nhiều giai đoạn của cá từ cá giống đến cá 3 năm tuổi.
Nghiên cứu tiếp theo trên cá khỏe là nghiên cứu của Herrera (1996) trên cá rô
phi (Oreochromis niloticus). Ông đã dùng phương pháp mô học để tiến hành
7
nghiên cứu trên các cơ quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần
hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh…
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
8
PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Đối tượng nghiên cứu
Cá tra khoẻ ở giai đoạn cá thịt, thu khoảng 30 con, mỗi con khoảng 500 gram.
3.2 Địa điểm và thời gian thực hiện
Địa điểm thu mẫu: Cần Thơ
Địa điểm phân tích mẫu: phòng mô học, khoa Thủy Sản, trường Đại Học
Cần Thơ
Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 2/2008 đến tháng 6/2008
3.3 Vật liệu nghiên cứu
3.3.1 Dụng cụ: gồm có bộ đồ tiểu phẩu, khay nhựa, kính hiển vi, lame, lamell,
keo nhựa, cốc thủy tinh (lớn, nhỏ), máy cắt lát mỏng (Microtome), khuôn đúc
mẫu, cassette, máy nhuộm mẫu tự động, máy Slide warmer, máy đúc khối, tủ
lạnh, tủ hút, viết chì, máy ảnh và một số vật dụng khác.
3.3.2 Hóa chất: gồm có nước cất, cồn tuyệt đối, formol thương mại, Bouin.
Xylem, paraffin, sáp ong, dung dịch nhuộm Haematocyline và Eosin, keo dán
Trung tâmEnterlan
Học liệu ĐHsốCần
cùng một Thơ
hóa chất khác.@ Tài liệu học tập và nghiên cứu
3.4 Phương pháp nghiên cứu.
3.4.1 Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu mô.
Thu mẫu: cá tra khỏe.
Về đặc điểm bên ngoài:
Cá khỏe là cá bơi lội linh hoạt, nhanh nhẹn, bắt mồi nhanh, phản ứng nhanh
với các tiếng động. Màu sắc cá bình thường, lưng có màu xám đen, bụng có
màu trắng bạc. Hình dạng bên ngoài bình thường, các vây không bị rách hay
bị xuất huyết, không có những vết lỡ loét, xuất huyết trên da cũng như ở các
gốc vây Không có dấu hiệu như bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước (hình 3.1).
9
Hình 3.1: Đặc điểm bên ngoài của cá tra khỏe.
Về đặc điểm bên trong:
Khi mổ cá ra thì bên trong cơ thể không có chất dịch lạ, các cơ quan nội tạng
phải có màu sắc bình thường, đồng nhất trên từng cơ quan, các cơ quan không
bị sưng hay bị nhũn.
Lấy mẫu mô
Mẫu mô được lấy ở các cơ quan: da, cơ, hệ tiêu hoá (dạ dày, ruột), mang, bóng
hơi, tim gan, thận, tỳ tạng.
 Gan, thận, bóng hơi: dùng dao, kéo cắt nguyên cơ quan, sau đó cắt nhỏ
ra làm 2 phần và bỏ vào dung dịch cố định.
 Da, cơ: dùng lưỡi dao bén cắt dứt khoát, lưỡi dao thẳng góc với bề mặt
Trung tâm Họccơliệu quan.ĐH
Mẫu Cần
cắt dàyThơ
khoảng@ Tài
2cm, liệukhoảng
bề dày học 1cm.
tập và nghiên cứu
 Tỳ tạng, tim: dùng kéo cắt nguyên cơ quan.
 Mang: dùng kéo cắt đứt 2 gốc xương cung mang và lấy toàn bộ cung
mang.
 Dạ dày, ruột: dùng kéo cắt lấy nguyên cơ quan, sau đó cắt ra làm 2
đoạn.
Đối với các cơ quan có kích thướt lớn khi lấy mẫu mô nên cắt ra làm nhiều
phần nhỏ để dung dịch cố định có thể ngấm tốt vào mẫu.
3.4.2 Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô
 Cố định mẫu
Mẫu được cố định bằng Formol 10% hoặc Bouin. Mẫu sau khi được lấy cho
vào keo nhựa có chứa dung dịch Bouin để cố định (tỉ lệ 1:10). Riêng mẫu da,
cơ và bóng hơi cố định trong Formol 10% cho mẫu mềm hơn. Thời gian cố
định 24-48 giờ.
10
 Rửa nước
Sau khi mẫu được cố định 24 giờ ta tiến hành rửa Bouin bằng nước và cồn
500. Để mẫu dưới vòi nước chảy liên tục 1-2 giờ, rửa mẫu cho đến khi hết
dung dịch màu vàng sau đó chuyển mẫu ngâm trong 24 giờ trong cồn 600 .
 Cắt tỉa định hướng
Sau khi mẫu được ngâm trong cồn 600, lấy mẫu ra và cắt tỉa định hướng mẫu
với kích thướt rộng khoảng 0,5-1cm và chiều dày từ 0,3-0,5cm, sau đó cho
mẫu vào cassete và ngâm trong cồn 700 1 ngày trước khi tiến hành xử lý mẫu.
 Xử lý mẫu
Loại nước
Sau khi mẫu được rửa sạch Bouin bằng nước máy, loại bỏ nước bằng cách
ngâm mẫu trong dung dịch cồn với các nồng độ tăng dần từ 800, 95 0, 1000 để
loại sạch hoàn toàn nước trong mẫu.
Tẩm dung môi trung gian
Paraffin là chất nền giúp cho tế bào vẫn giữ nguyên hình dạng sau khi cắt,
nhưng vì paraffin và ethanol không hòa tan vào nhau được nên phải dùng dung
môi trung gian là xylen có khả năng hòa tan được cả paraffin và ethanol.
Trung tâmTẩm
Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
paraffin: Paraffin phải được tẩm hoàn toàn vào mẫu, khi tẩm paraffin
phải ở trạng thái nóng chảy (khoảng 65 0C)
11
Quy trình xữ lý mẫu (máy xử lý: Sproceeding tissue (MICROM, STP 120-
2))
STT Hóa chất sử dụng Thời gian
1 Cồn 80% 1h
2 Cồn 90% 1h
3 Cồn 95% 1h
4 Cồn 100% 1h
5 Cồn 100% 1h
6 Cồn 100% 1h
7 Xylen 2h
8 Xylen 2h
Trung tâm Học liệu
9 ĐH Cần Thơ @Xylen
Tài liệu học tập và nghiên
2h cứu
10 Parafin + sáp ong + xylen (3:2:5) 2h
11 Parafin + sáp ong (3:7) 2h
12 Parafin + sáp ong (5:5) 2h
 Đúc khối: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1)
Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy
trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc
khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành
đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C.
Đổ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp mẫu bỏ vào khuôn sau đó đặt mẫu
ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chổ làm lạnh
trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khuôn
Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox.
Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó
tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu.
12
 Cắt mẫu (máy cắt mẫu:Yamato-PR-50)
Trước khi mẫu đưa vào máy cắt, dùng lưỡi dao cắt tỉa khối paraffin sao cho
khối paraffin có hình tháp (hình 3.3). Mục đích của cách làm này là để dễ cắt
mẫu và khi cắt ra, mẫu sẽ đẹp.
a
b
Hình 3.2: Khối paraffin trước khi cắt: (a) Khối paraffin có chứa mẫu mô (b)
Cassette dùng để giữ khối paraffin
Chuẩn bị máy cắt:
Đặt dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao so với mặt cắt của
khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-300. Khối mẫu sẽ được cắt thành các
lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lắt cắt
được hình thành.
Trung tâmTiến
Học cắt mẫu:
hànhliệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Gắn mẫu vào máy cắt mỏng (Microtome) theo chiều ngang của cassette sao
cho khối mẫu ngang và thẳng đứng sau đó điều chỉnh độ dày của lát cắt. Bắt
đầu bằng những lát cắt 12-16  m. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu và đạt
đến vị trí mẫu mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt về vạch 1-2  m và
tiến hành cắt mẫu.
 Dán mẫu
Mẫu được cắt ra thành những băng dài, sau đó dùng dao thái hoặc kim mũi
giáo trải mẫu lên một cốc thủy tinh lớn đựng nước ấm để cho mẫu được căng
ra.
Sau khi đã chọn được đoạn mẫu đạt yêu cầu, dùng lame để vớt mẫu lên. Cầm
1 đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thuỷ tinh phía dưới mẫu, sau đó từ
từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame.
Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide
warmer ủ ở nhiệt độ 450 sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame. Sau khi dán mẫu
và cố định mẫu trên lame xong ta tiến hành nhuộm mẫu.
13
 Nhuộm mẫu
Mẫu được nhuộm bằng tay, nhuộm mẫu bằng tay có thể tự điều chỉnh thời
gian lại ở bất cứ giai đoạn nào trong khi nhuộm nếu nhuộm không được tốt.
Nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình của
Harris (1900) (có điều chỉnh) như sau:
Xylen Xylen Xylen Cồn 1000 Cồn 1000
10 phút 10 phút 10 phút 1 phút 1 phút
Cồn 65 Cồn 95 Cồn 90 Cồn 1000
1 phút 1 phút 1 phút 1 phút
Haematoxylin Nước máy 1% acid acohol Nước máy
10 phút 1 phút Nhúng 3 lần 1 phút
Cồn 65 Nước máy Eosin 2% potassium
1 phút 1 phút 3 phút acetate 5 phút
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Cồn 95 Cồn 90 Cồn 1000 Cồn 1000
1 phút 1 phút 1 phút 1 phút
Xylen Xylen Xylen Cồn 1000
5 phút 5 phút 5 phút 1 phút
 Dán lamelle vào lame
Để bảo quản mẫu được lâu và tăng tính chiết quang cần dùng keo dán Enterlan
để dán tiêu bản vĩnh viễn. Nhỏ một giọt keo lên vùng có miếng mô, đặt
lamelle nghiêng 450 và tiếp xúc với giọt keo, dùng kim mũi giáo hạ lamelle
xuống từ từ để tránh tạo bọt khí. Để lame khô 24 giờ sau đó đọc kết quả. Thao
tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào
miếng mô.
14
 Đọc kết quả (kính hiển vi: Carl Zeiss)
Sau khi có được tiêu bản hoàn chỉnh ta tiến hành đọc kết quả, tiêu bản được
quan sát dưới kính hiển vi lần lượt ở các độ phóng đại 10X, 40X, 100X. Lựa
chọn ra các tiêu bản mô đẹp, đạt yêu cầu và chụp ảnh lại các tiêu bản đó. Bằng
phương pháp nhuộm H&E có thể quan sát rõ được cấu trúc mô của các cơ
quan trên cá tra. Tiêu bản đẹp phải có nhân bắt màu tím xanh của
Haematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng của Eosin.
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
15
PHẦN 4
KẾT QUẢ & THẢO LUẬN
4.1. Da và cơ
 Da:
Da là cơ quan bao phủ toàn bộ bề mặt cơ thể cá do đó nó tiếp xúc trực tiếp với
các điều kiên môi trường bên ngoài cũng như với các loại mầm bệnh. Ngoài
chức năng là hàng rào vật lý chống lại mầm bệnh, da còn tham gia quá trình
hô hấp và bài tiết, tham gia điều hòa áp suất thẩm thấu và tạo ra tuyến đơn
bào, tuyến đa bào, tuyến độc và tạo vẩy ở cá có vẩy (Nguyễn Bạch Loan,
2004).
Khi quan sát dưới kính hiển vi, từ ngoài vào trong cấu tạo của da gồm 2 lớp:
lớp ngoài cùng là lớp biểu bì, lớp kế tiếp là lớp hạ bì (hay lớp da dưới biểu bì)
(hình 4.1). Lớp biểu bì được cấu tạo chủ yếu là các tế bào hình vẩy, theo
Roberts (1989) các tế bào này phân tầng với số lượng tế bào thay đổi theo loài,
lứa tuổi, vị trí trên cơ thể cá và các giai đoạn của chu kì sinh sản.
Lớp giữa của biểu bì là các tế bào chùy có kích thướt lớn, các tế bào này có
hình tròn hoặc oval và có 1 nhân hoặc 2 nhân bên trong (hình 4.2). Lớp hạ bì
Trung tâmnằm
Họcbên liệu ĐHbiểu
dưới lớp Cần bì vàThơ @ tạo
được cấu Tàibởiliệu học
các mô kết, và
liêntập trong biểu cứu
bên nghiên
bì phân bố nhiều mạch máu và dây thần kinh (hình 4.3). Ngoài ra trên da cá tra
còn có các tế bào sắc tố (melamin), các tế bào này tạo nên màu sắc của da cá
và thường phân bố ở nơi tiếp giáp giữa biểu bì và lớp hạ bì và một phần nằm ở
bên dưới lớp hạ bì.
Theo Chinabut và ctv (1991) lớp biểu bì của cá tra có thể chia làm 2 lớp, lớp
mặt là các tế bào hình thoi có thể sắp xếp 2-3 tầng ở bề mặt vùng lưng và 5-6
tầng ở vùng bụng của cơ thể, đây là tầng biểu mô hình vẩy. Ở giữa các tế bào
này còn tìm thấy các tế bào tiết dịch nhờn hình tròn hoặc oval. Lớp giữa của
biểu bì là các tế bào chùy (Club cells) được bao quanh bởi các tế bào biểu bì
khác.
Theo Harris và ctv (1973) khi phân tích thành phần hóa học của nhớt cá cho
thấy chúng được cấu tạo từ protein và carbohydrate (trích dẫn bởi Chinabut và
ctv, 1991). Tác dụng của nhớt cá như là rào cản vật lý bảo vệ cơ thể chống lại
sự xâm nhập của vi khuẩn, làm giảm tính độc của các vết thương, giảm bớt ma
sát của cá khi chúng di chuyển… (Harder, 1975 trích dẫn bởi Groman, 1982).
Ngoài ra theo Nguyễn Bạch Loan (2004) các tuyến dịch nhờn có tác dụng tiết
dịch nhờn làm trơn bề mặt cơ thể, lắp đầy các chỗ lõm trên cơ thể để giảm ma
sát khi di chuyển. Ngoài ra tuyến dịch nhờn còn có tác dụng điều hòa áp suất
16
thẩm thấu và bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của mầm bệnh bên ngoài
môi trường.
B C
A
D
Hình 4.1: Mặt cắt dọc da cá tra (H&E, 10X). A: lớp cơ; B: lớp hạ bì; C: lớp
biểu bì; D: các tế bào sắc tố (melanin)
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
C
B
A
Hình 4.2: Mặt cắt dọc lớp biểu bì da cá tra (H&E, 100X). A: tế bào biểu mô;
B: tế bào chùy; C: các tế bào sắc tố (melanin)
17
B
A
Hình 4.3: Mặt cắt dọc lớp hạ bì (H&E, 100X). A: mô liên kết; B các dây thần
kinh
 Cơ
Cơ thường nằm dọc 2 bên thân cá và ở vách của các nội tạng. Đơn vị của cơ là
các tế bào cơ. Cơ cá có chức năng phối hợp với các xương trong sự vận động,
Trung tâmsựHọc liệucủa
di chuyển ĐH cácCần
khớp Thơ
xương,@ Tài
sự co thắtliệu họctạng
của nội tập vànhư
cũng sự bơm cứu
nghiên
máu (ở cơ tim).
Có 3 loại cơ: cơ trơn, cơ vân và cơ tim.
Cơ trơn được tìm thấy chủ yếu ở vách nội tạng, các tuyến, các ống dẫn, các
mạch máu,... cơ trơn có dạng hình thoi, ngắn, thô và chịu sự điều khiển của hệ
thần kinh giao cảm nên phản ứng chậm chạp (cơ trơn sẽ được mô tả chi tiết ở
phần các cơ quan nội tạng). Cơ vân thường liên kết với xương, giúp xương cử
động nhịp nhàng. Cơ vân chịu sự điều khiển của hệ thần kinh trung ương
thuộc não và tủy sống nên phản ứng nhanh nhẹn. Cơ vân có dạng hình thoi,
thon dài và thường phân bố ở 2 vách thân, thực quản ... nên nó chiếm tỉ lệ cao
trong cơ thể cá (Chinabut và ctv,1991)
Cơ tim phân bố ở tim cá, nó có đặc tính trung gian giữa cơ vân và cơ trơn. Tế
bào cơ tim rộng, ngắn, thô như cơ trơn, mỗi tế bào chỉ có 1 nhân. Cơ tim chịu
sự chi phối của hệ thần kinh giao cảm nhưng cơ tim co giãn nhanh hơn cơ trơn
nhưng chậm hơn cơ vân ( Nguyễn Bạch Loan, 2004) (cơ tim sẽ được mô tả chi
tiết ở phần tim)
Đơn vị nhỏ nhất của cơ là các sợi cơ (tế bào cơ), trong sợi cơ có hàng trăm dây
tơ prôtêin nhỏ được tách ra thành 2 sợi: sợi actin (mõng) và mioxin (dày). Khi
18
cơ cá cử động hay co rút là kết của của sự đan xen giữa 2 sợi này vào nhau
(Chinabut và ctv, 1991).
Cơ cá tra được quan sát ở đây là cơ vân dọc 2 bên thân cá, cơ nằm dưới lớp hạ
bì của da. Khi quan sát mặt cắt dọc của lớp da cơ từ ngoài vào trong ta thấy
đầu tiên là lớp biểu bì của da kế đến là lớp hạ bì và trong cùng là lớp cơ (hình
4.1). Ở mặt cắt dọc ta thấy các sợi cơ chạy dọc và bên trong có 1 nhân (hình
4.4)
B
A
Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Hình 4.4: Mặt cắt dọc cơ vân cá tra (H&E, 100X). A: tế bào cơ; B: nhân
Ở mặt cắt ngang ra thấy các bó cơ có hình đa giác hoặc hình tròn nhưng không
nhìn thấy nhân, giữa các bó cơ này là các mô liên kết (hình 4.5).
A
19
Hình 4.5: Mặt cắt ngang cơ vân cá tra (H&E, 40X). A: các bó cơ
4.2. Dạ dày và ruột
 Dạ dày
Dạ dày nằm nối tiếp sau thực quản và kết thúc ở cơ co thắt môn vị ở phần ruột
trước. Chức năng chính của dạ dày là chứa thức ăn và tiết ra các men tiêu hóa
thức ăn. Dạ dày có cấu trúc giống như thực quản nhưng lớp cơ bên ngoài của
thực quản là lớp cơ vân còn ở dạ dày là cơ trơn.
Dạ dày cá tra có hình chử J bao gồm 2 phần: phần thân vị và phần môn vị.
Khi quan sát ở mặt cắt ngang của phần thân vị ta thấy từ ngoài vào là lớp
thanh mạc được cấu tạo bởi mô liên kết sợi, kế đến là lớp cơ trơn bao gồm lớp
cơ dọc bao bên ngoài và lớp cơ vòng bao bên trong, đây là lớp cơ có chức
năng co bóp giúp chon quá trình tiêu hóa thức ăn, tiếp theo là lớp dưới niêm
mạc được cấu tạo bởi các mô liên kết và có nhiều mạch máu phân bố và trong
cùng là lớp niêm mạc dạ dày được cấu tạo bởi các tế bào biểu mô trụ đơn với
các tuyến thuộc dạ dày (hình 4.6). Theo chinabut và ctv, 1991 lớp dưới niêm
mạc cấu tạo bởi lớp mô liên kết có chứa các lympho bào nhỏ và các tế bào hạt
ưa eosin.
Trung tâmPhần
Học mônliệu ĐHgiống
vị cũng Cần nhưThơ @ Tài
phần thân liệukhông
vị nhưng họccótập dạ nghiên
tuyếnvà dày và lớp cứu
cơ trơn bên ngoài thì dày hơn (Grizzle & Rogers , 1976).
F
B C D
A
E
Hình 4.6: Mặt cắt ngang của dạ dày (H&E, 10X). A: lớp thanh mạc; B: lớp cơ
dọc; C: lớp cơ vòng; D: lớp dưới niêm mạc; E: mạch máu; F: tuyến thuộc dạ
dày.
20