Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử linh chi và sản phẩm viên nang từ bào tử linh chi
- 100 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN MINH ĐĂNG
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA
NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN MINH ĐĂNG
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA
NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
Mã ngành: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022
.
.
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Nguyễn Minh Đăng
.
.
i
Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2019 – 2021
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
Nguyễn Minh Đăng
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
Mở đầu: với sự phát triển của các phương pháp chiết, tách và phá vỡ vách tế bào, các nhà khoa học
đã chứng minh rằng ,bào tử Linh chi cũng mang các công dụng như thể quả như hạ đường huyết,
ổn định huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng, bảo vệ gan, chống các gốc oxy hóa tự do.
Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị nào xây dựng chuẩn cơ sở đối với bào tử Linh chi cũng như viên
nang có hoạt chất là bào tử Linh chi. Vì vậy, việc bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên
liệu bào tử Linh chi cũng như viên nang có chứa bào tử Linh chi là vô cùng cần thiết cần thiết.
Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: nguyên liệu bào tử Linh chi và viên nang chứa bào tử Linh chi đã phá vách.
Phương pháp nghiên cứu: acid ganoderic A được định lượng bằng phương pháp HPLC với kỹ
thuật rửa giải gradient. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bào tử nấm Linh chi và viên nang chứa bào
tử Linh chi dựa vào các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V và USP 44.
Kết quả: nguyên liệu: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính
(2,6 – 52,5 ppm, R2 = 1,00), độ chính xác (RSD = 1,92 %), độ đúng (tỷ lệ phục hồi 98,56 %),
khoảng nồng độ xác định (10,60 – 13,00 µg/ml), giới hạn phát hiện 0,40 µg/ml, giới hạn định
lượng 1,21 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A trong nguyên liệu ≥ 60 µg/g. Xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở gồm các chỉ tiêu: tính chất, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất
chiết được trong dược liệu, giới hạn kim loại nặng (pb), định tính, định lượng acid ganoderic A,
giới hạn nhiễm khuẩn. Viên nang: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính
tuyến tính (2,6 – 52,5 ppm, R2 = 0,999), độ chính xác (RSD = 4,58 %), độ đúng (tỷ lệ phục hồi
93,71 %), khoảng nồng độ xác định (8,90 – 11,00 µg/ml), giới hạn phát hiện 0,58 µg/ml, giới hạn
định lượng 1,77 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A trong viên nang ≥ 10 µg/g. Xây dựng
tiêu chuẩn cơ sở gồm các chỉ tiêu: tính chất, độ rã, độ ẩm, độ đồng đều khối lượng, định tính, định
lượng acid ganoderic A, giới hạn nhiễm khuẩn.
Kết luận: Bước đầu xây đựng được tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi và viên nang
có chứa bào tử Linh chi đã phá vách.
.
.
v
Master’s Thesis – Academic course: 2019- 2021
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
ESTABLISHING THE STANDARD OF GANODERMA LUCIDUM SPORES AND
CAPSULE CONTAINING GANODERMA LUCIUDM SPORES
Nguyen Minh Dang
Supervisor: Dr. NGUYEN HUU LAC THUY
Introduction: With the development of extracting, separating and walls breaking methods, scientists
have proved that Ganoderma lucidum spores also have effects like fruiting body such as lowering
blood sugar, stabilizing blood pressure, and anti-inflammatory, anti-histamine and anti-infection,
liver protection, anti-oxidant free radicals. However, at present, we do not have standard for
Ganoderma lucidum spores as well as capsules with active ingredients being Ganoderma lucidum
spores. Therefore, it is extremely necessary to develop standards for Ganoderman lucidum spores
and capsules containing wall - broken Ganoderma lucidum spores.
Materials and methods:
Research object: Ganoderma lucidum sprores and capsules containing wall - broken Ganoderma
lucidum spores.
Research method: ganoderic acid A was quantified by HPLC with gradient elution technique.
Develop tandards of Ganoderma lucidum spores and capsules containing Ganoderma lucidum spores
based on monographs in Vietnam Pharmacopoeia V and USP 44.
Results: materials: the method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity
(2.6 – 52.5 ppm, R2 = 1.00), accuracy (RSD = 1.92%) ), precision (recovery rate 98,56 %), defined
concentration range (10.60 – 13.00 µg/ml), limit of detection 0.40 µg/ml, limit of quantitation 1, 21
µg/ml, recommended content of ganoderic acid A in raw materials ≥ 60 µg/g. Basic standards
includes : properties, powder detection, moisture, total ash, acid-insoluble ash, extractable substances
in medicinal herbs, limit of heavy metals (pb), qualitative and quantitative determination of ganoderic
acid A, limiting of bacterial contamination. Capsules: the method was validated in terms of system
suitability, selectivity, linearity (2.6 – 52.5 ppm, R2 = 0.999), accuracy (RSD = 4.58 %). precision
(recovery rate 93.71%), defined concentration range (8.90 – 11.00 µg/ml), detection limit 0.58 µg/ml,
limit of quantitation 1.77 µg /ml, recommended concentration of ganoderic acid A in capsules ≥ 10
µg/g. Basic standards includes: properties, disintegration, moisture, uniformity of mass, qualitative
and quantitative analysis of ganoderic acid A, limit of bacterial contamination.
Conclusion: Initially, the standards for Ganoderma lucidum spores and capsules containing wall-
broken Ganoderma lucidum spores were established.
.
.
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH.................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ x
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2
1.1. Tổng quan về thực vật học của bào tử Linh chi ............................................. 3
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học của Bào tử Linh chi.................................. 9
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học của bào tử Linh chi ........................................ 15
1.4. Tổng quan về acid ganoderic A ................................................................... 18
1.5. Tổng quan về tiêu chuẩn của nấm Linh chi ................................................. 21
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 23
Chương 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 33
3.1. Xác định đặc điểm thực vật của nguyên liệu bào tử Linh chi ....................... 33
3.2. Kết quả thẩm định tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu bào tử Linh chi ................. 36
3.3. Kết quả thẩm định tiêu chuẩn cơ sở viên nang bào tử Linh chi .................... 43
3.4. Dự thảo xây dựng TCCS của nguyên liệu BTLC (Đính kèm phụ lục 6) ....... 51
3.5. Dự thảo xây dựng TCCS của viên nang BTLC (đính kèm phụ luc 12) ......... 53
Chương 4. BÀN LUẬN........................................................................................ 54
4.1. Xác định đặc điểm thực vật bào tử Linh chi ................................................ 54
4.2. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử Linh chi ......... 54
4.3. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của viên nang bào tử Linh chi ............ 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 57
.
.
i
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst .............................................. 2
Hình 1.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử của BTLC ...................................... 3
Hình 1.3 Thu thập BTLC theo phương pháp Kraft – Paper ................................... 4
Hình 1.4 (A) BTLC trên nấm, (B) BTLC sau và trước khi được phá vỡ vách ........ 5
Hình 1.5 Hình ảnh BTLC dưới kính hiển vi SEM ................................................. 6
Hình 1.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của dòng CO2 với polysaccharid............. 7
Hình 1.7 Ảnh SEM của BTLC dưới các áp suất và thời gian hoạt động ................ 7
Hình 1.8 Hình ảnh SEM BTLC với các điều kiện nghiền ...................................... 8
Hình 1.9 Hình ảnh BTLC không ảnh hưởng bởi môi trường ................................. 8
Hình 1.10 Hình ảnh SEM của BTLC lên men với Lactobacillus plantarum .......... 9
Hình 1.11 Lucidumol A (Trái), các hợp chất từ (2) – (6) ..................................... 11
Hình 1.12 Công thức từ (7) - (19) ....................................................................... 11
Hình 1.13 Cấu trúc chung của nhóm sterol trong BTLC ...................................... 14
Hình 1.14 Công thức cấu tạo của acid ganoderic A ............................................. 18
Hình 3.1 Bột bào tử của loài nấm Linh chi .......................................................... 33
Hình 3.2 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) ............................ 33 - 34
Hình 3.3 Cấu tạo BTLC - Ganoderma lucidum (x1.000) .............................. 34 - 35
Hình 3.4 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) ................................... 35
Hình 3.5 Bào tử Linh chi dưới KHV SEM (x2.000) và (x5.000 và x15.000) ....... 36
Hình 3.6 SKĐ của mẫu đối chiếu acid ganoderic A ............................................ 37
Hình 3.7 SKĐ mẫu thử nguyên liệu BTLC ......................................................... 37
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng ............................................................................. 39
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn acid ganoderic A ................................................ 39
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thử .............................................................................. 39
Hình 3.11 Đồ thị tương quan nồng độ acid ganoderic A và Spic ganoderic A ....... 40
.
.
ii
Hình 3.12 Bột BTLC đã phá vách (x 5000) ......................................................... 43
Hình 3.13 SKĐ mẫu đối chiếu acid ganoderic A ................................................. 45
Hình 3.14 SKĐ mẫu thử ..................................................................................... 45
Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng ........................................................................... 46
Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu acid ganoderic A ......................................... 47
Hình 3.17 Sắc kỳ đồ mẫu thử viên nang BTLC ................................................... 47
Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu placebo ....................................................................... 47
Hình 3.19 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic ganoderic A ...................... 48
.
.
x
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các nhóm thế của công thức (7) - (19) ................................................. 12
Bảng 1.2 Các nhóm thế của công thức (2) - (6) ................................................... 13
Bảng 1.3 Các nhóm polysaccharid của BTLC và phương pháp phân lập ............. 14
Bảng 1.4 So sáng giữa USP 44 và DĐVN V ....................................................... 21
Bảng 2.1 Chương trình dung môi ........................................................................ 25
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm, độ tro, chất chiết trong dược liệu.................... 37
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống ................................................ 38
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử .................... 38 - 39
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ chính xác ........................................................ 40- 41
Bảng 3.5 Tỷ lệ phục hồi của phương pháp ................................................... 41 - 42
Bảng 3.6 Kết quả xác định độ rã của viên nang BTLC ........................................ 43
Bảng 3.7 Kết quả xác định độ đồng đều khối lượng của viên nang BTLC .... 44 - 45
Bảng 3.8 Kết quả 6 lần tiêm lặp lại dung dịch acid ganoderic A ................... 45 - 46
Bảng 3.9 Kết quả 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử viên nang ............................... 46
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chính xác ..................................................... 48 - 49
Bảng 3.11 Tỷ lệ phục hồi của phương pháp......................................................... 49
.
.
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian học tập và thực hiện luận văn với nhiều nỗ lực, thời điểm hoàn
thành luận văn là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người Cô đã dạy
dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS. NGUYỄN HỮU LẠC
THỦY - người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành
luận văn Thạc sĩ này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Hóa Phân tích – Kiểm nghiệm đã
tận tình truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên
cứu.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình và đặc biệt là
các bạn Bích Phương (Dược 13), Thanh Long, Tuyết Anh, Ngọc Thành (Dược 16)
và Minh Nhật, Minh Tấn (Dược 17) đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện
đề tài này
.
.
LỜI MỞ ĐẦU
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Ganodermataceae) được liệt kê trong
“Thần Nông bản thảo” như là một dược thảo mang nhiều công hiệu và không gây độc
hại. Trước đây, bộ phận sử dụng chủ yếu của nấm Linh chi là thể quả sấy khô, tuy
nhiên các nghiên cứu hiện đại cũng cho thấy rằng các hoạt chất đặc trưng cho tác
dụng dược lý trong thể quả như polysaccharid, triterpenoid, acid amin và vitamin
cũng có mặt trong bào tử [34]. Cũng như thể quả, bào tử cũng có các công dụng như
hạ đường huyết, chống tăng huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng, bảo vệ
gan, chống các gốc oxy hóa tự do [11][13][30]. Vì vậy, bào tử Linh chi cũng là sản phẩm
được thu hoạch đồng thời và có giá thành cao hơn so với nấm (dao động từ 0,5 đến
1,2 triệu đồng/100 g).
Khi đề cập đến phương pháp định tính và định lượng của thể quả nấm Linh
chi trong chuyên luận, USP 44 đã chọn acid ganoderic A làm chuẩn để định tính và
xác định hàm lượng triterpenoid [32]. Những phương pháp định lượng GAA đã được
công bố phần lớn sử dung sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với kỹ thuật rửa giải
gradient, thời gian phân tích thường kéo dài.
Hiện nay, chưa có đơn vị nào xây dựng chuẩn cơ sở đối với bào tử Linh chi
cũng như viên nang có hoạt chất là bào tử Linh chi. Vì vậy, việc bước đầu xây dựng
tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi cũng như viên nang có chứa bào tử
Linh chi là vô cùng cần thiết cần thiết.
Đề tài:
“Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử Linh chi
và sản phẩm viên nang từ bào tử Linh chi”
được thực hiện với các nội dung chính sau đây:
- Xác định đặc điểm thực vật học của bào tử Linh chi.
- Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi.
- Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang bào tử Linh chi.
.
.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr) Karst, còn có
tên nấm lim, nấm trường thọ, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae). Bộ phận dùng
là thể quả hóa gỗ đã phơi hay sấy khô của Linh chi.
- Tác dụng của nấm Linh chi còn được được mô tả chi tiết trong “Những cây thuốc
và vị thuốc Việt Nam” (Đỗ Tất Lợi) bao gồm: đau thắt cơ tim, bệnh ở mạch vành của
tim, huyết áp không ổn định, viêm phế quản, hen, thấp khớp, viêm gan mạn, bệnh
phụ nữ vào thời kỳ mãn kinh, bệnh đường tiêu hóa, v.v… [1][2].
- Các công trình khoa học cũng chứng minh tác dụng chống oxy hóa, tăng cường
miễn dịch, hạ đường huyết, kháng ung thư của nấm Linh chi.
Hình 1.1 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst (a) Nấm Linh chi trồng trong
nhà kính ; (b) Thể quả nấm Linh chi chưa trưởng thành; (c) Thể quả nấm Linh chi
trưởng thành; (d) Thể quả được phủ bào tử Linh chi [24]
.
.
1.1. Tổng quan về thực vật học của bào tử Linh chi
Đặc điểm hình thái của bào tử Linh chi (BTLC)
BTLC là cơ quan sinh sản hữu tính của nấm Linh chi (hình 1.2 a). BTLC màu
nâu, hình trứng, thuôn ở đỉnh, có 1 lớp vỏ kép bao bên ngoài, kích thước khoảng
8,5 – 11,2 (μm) × 5,2 – 6,9 (μm), lỗ nẩy nầm hình gai nhọn (hình 1.2a, b). BTLC có
lớp vỏ bào tử kiểu kép, vỏ ngoài vàng nhạt dày 0,8 – 1,1 μm. Quan sát dưới kính hiển
vi thấy lỗ thủng trên bề mặt lớp ngoài. (hình 1.2 c, d).
Lớp vỏ này có thành phần là hỗn hợp 𝛽-1,3, 𝛽-1,6-glucan và 𝛼-glucan dưới
dạng amylopectin, amylose, amylodextrin và glycogen. Các glucan này liên kết với
nhau, liên kết với chitin tạo thành lớp vỏ vững chắc và đàn hồi nên hoạt chất trong
BTLC được bảo vệ vững chắc [28] .Trong giai đoạn phát triển BTLC được bao bọc
thêm bởi một lớp màng mỏng. Lớp màng này có các lỗ có đường kính 0,2 – 0,6 (µm).
Khi trưởng thành lớp màng nứt và tróc ra. Các thí nghiệm trong điều kiện khắc nghiệt
như đun sôi, ngâm trong acid, dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phòng đều không thể phá
vỡ lớp vỏ bào tử. Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy những lỗ thủng trên bề mặt lớp
vỏ ngoài và mấu lồi nhỏ ở đầu đối diện với lỗ nảy mầm [14].
Hình 1.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử của BTLC (a) BTLC (x 1000) ; (b)
Hình phóng to một BT (x 10000) (c) Bề mặt bên ngoài của BT (x 1000); (d) Hình
hiển thị mặt cắt hai lớp của BT(x 10000) [26]
.
.
Các phương pháp thu hoạch bào tử Linh chi
Thời điểm thu hoạch BTLC có thể được xác định bằng cách quan sát sự biến
mất của vòng sinh trưởng. Nhiệt độ môi trường được khuyến nghị ở 25 – 33 (°C).
Phương pháp Kraft – Paper: Dùng lớp màng mỏng được đặt trên mặt đất để tránh
tiếp xúc. Một màng nhựa sạch có kích thước phù hợp khác được đặt trên đế của nấm.
Một tờ giấy trắng hoặc giấy được cuộn thành hình trụ và đặt trên lớp màng mỏng.
Sau khi quấn giấy vào thân nấm Linh chi, phủ các tông vuông để ngăn không cho bột
bào tử thoát ra. Khoảng cách giữa tấm bìa và nấm phải là 5 cm. Tạo các lỗ nhỏ để
tăng tính thấm khí và duy trì độ ẩm tương đối của không khí ở 75 – 80 (%). Sau khi
bỏ giấy, bột bào tử ở bên trong tờ giấy và trên nấm được thu thập đầu tiên. Sau đó
bột bào tử trên phim được lấy ra bằng thìa. BTLC được thu thập cứ sau 15 ngày cho
đến 45 ngày.
Phương pháp phủ màng nhựa: hai lớp màng được đặt ở giữa mỗi hai hàng nấm trưởng
thành để thu hoạch BTLC. Các bào tử trên bề mặt của nấm được đưa vào một vật
chứa đặc biệt bằng bàn chải mềm, sau đó bột bào tử trên màng được thu hoạch.
Khi thu hoạch, chỉ có bột BT ở lớp trên của màng được thu thập, còn bột BT ở lớp
dưới bị loại.
Hình 1.3 Thu thập BTLC theo phương pháp Kraft – Paper [34]
.
.
Các phương pháp phá vỡ bào tử
Việc phá vỡ vách bào tử cho thấy hàm lượng hoạt chất trong BTLC được tăng
lên đáng kể và cao hơn cả thể quả [26].
Phương pháp phá vỡ vách bào tử của BTLC có thể là vật lý, hóa học, cơ học, hay sinh
học (sử dụng enzym, lên men...).
Hình 1.4 (A) BTLC trên nấm, (B) BTLC sau và trước khi được phá vỡ vách [34]
Phương pháp vật lý: Phương pháp siêu âm trên nguyên tắc các bọt khí được tao thành
do sự tương tác giữa sóng siêu âm và môi trường. Những bọt khí này khi bị phá vỡ
tạo ra các hiêu ứng như lực cắt hay sóng xung kích. Các hiệu ứng làm tăng cường sự
thẩm thấu của các tác nhân phản ứng vào sâu trong BTLC, làm tăng tốc phản ứng hóa
học giữa các tác nhân và BTLC. Ngoài ra, siêu âm còn phá vỡ bề mặt BTLC do gây
ra sự thay đổi về cấu trúc.
Trong nghiên cứu[38], kỹ thuật phá vỡ vách tế bào bằng phương pháp siêu âm đã dược
tác giả tìm hiểu một cách chi tiết. Các thông số như công suất siêu âm, thời gian, chu
kỳ nhiệm vụ được đánh giá có ảnh hưởng đến sự phá vỡ vách bào tử. Những thay đổi
hình thái đáng kể của bào tử chẳng hạn như nứt, gãy và phân huỷ, được quan sát thấy
sau khi xử lý bằng sóng siêu âm. Bằng cách trang bị thêm bồn nước đá, hiệu suất
chiết có thể được nâng cao lên xấp xỉ 75%, gần gấp đôi lượng không làm torng nước
đá. Hiệu suất phá vỡ vách tối ưu ở mức công suất siêu âm 27,3 W/cm2, chu kỳ nhiệm
vụ 100% và thời lượng xử lý 90 phút. Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy rằng quá trình
siêu âm không chỉ bảo vệ các thành phần hoạt tính sinh học chính của bào tử Lonh
chi, mà còn tăng cường giải phóng polysaccharid, protein và acid béo khi so sánh với
.
.
bào tử không phá vách. Các kết quả hiện tại chỉ ra rằng phương pháp siêu âm hiệu
quả hơn trong việc chiết các hoạt chất của BTLC và có thể là một kỹ thuật mang lại
hiêu quả kinh tế để chiết trên lượng lớn BTLC [38].
Hình 1.5 Hình ảnh BTLC dưới kính hiển vi SEM (x1000)
BTLC không siêu âm (A, B, C) có siêu âm (D, E, F); sử dụng bồn nước đá với công
suất 3.9 W/cm2 (A, D); 7.9 W/cm2 (B, E); 23.7 W/cm2 (C, F) [38].
Phương pháp hóa học: Dùng CO2 siêu tới hạn, với chương trình trong 4 giờ, nhiệt
độ 25 oC, áp suất 35 MPa, tốc độ dòng của CO2 10 kg/giờ. Ảnh hưởng của tốc độ
dòng CO2 đến hiệu suất phá vỡ được khảo sát trong các điều kiện sau: 200 g BTLC
được chiết trong 1, 2, 3 và 4 giờ, với tốc độ dòng CO2 lần lượt là 4, 6, 8, 10, 12, 14
kg/giờ. Lượng polysaccharid chiết được thể hiện trong hình 1.6. Dùng SEM đánh giá
hiệu quả phá vỡ, ghi nhận phần trăm của polysaccharid đã tăng từ 0,94 % khi sử dụng
bào tử nguyên vách lên 2,98 % khi dùng bào tử bị phá vỡ vách tế bào. Các BTLC đã
phá vách kiểm tra bằng kính hiển vi quét (SEM) để điều tra những thay đổi hình thái
trên bề mặt của BTLC trong quá trình phá vỡ. Hình ảnh SEM của BTLC ban đầu và
sau khi phá vách dược miêu tả ở hình 1.7. Các bào tử đã phá vách cho thấy hình thái
những thay đổi. Một số bào tử có các đường nứt trên ống bào tử, một số có một
khoảng trống và một số đã hoàn toàn bị phá vỡ. So sánh các hình ảnh SEM của bào
tử nguyên vẹn và đã xử lý thấy các lỗ nhỏ trên bào tử đã xử lý lớn hơn các lỗ nhỏ
.
.
trong những cái còn nguyên vẹn. Với thời gian phá vỡ lâu hơn, lỗ càng to hơn. Hình
1.7 a, d, e và f cho thấy ảnh SEM của các BTLC ban đầu và các bào tử được phá vách
trong 4 giờ dưới các áp suất khác nhau. Có thể quan sát thấy rằng BTLC đã phá vách
có các đường nứt và lỗ rỗng và ảnh hưởng rõ ràng đối với các bào tử được xử lý ở áp
suất cao. Mặc dù tổng số bào tử bị phá vỡ bởi phương pháp không cao nhưng năng
suất chiết xuất polysaccharid của bào tử đã xử lý cao hơn nhiều so với những BTLC
ban đầu. Lý do là phương pháp xử lý với CO2 siêu tới hạn đã cải thiện tính thấm của
bào tử và mở rộng các lỗ nhỏ trên BTLC. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc
chiết xuất các polysaccharid từ các bào tử [17].
Hình 1.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tốc độ dòng CO2 với lượng
polysaccharid chiết được [17]
Hình 1.7 Ảnh SEM của BTLC dưới các áp suất và thời gian hoạt động khác nhau,
bar = 6 lm: (a) nguyên vẹn; (b) 35 MPa, 2 giờ; (c) 35 MPa, 3 giờ; (d) 30 MPa, 4
giờ; (e) 33 MPa, 4 giờ; và (f) 35 MPa, 4 giờ [17]
.
.
Phương pháp cơ học: BTLC được nghiền thành các hạt siêu mịn nhờ máy nghiền ly
tâm tốc độ cao. Dùng SEM để đánh giá hiệu quả của việc phá vỡ. Kết quả định lượng
bằng phương pháp UV – Vis dùng để so sánh giữa tỷ lệ chiết polysaccharid từ các tế
bào đã qua phá vỡ vách và các BTLC chưa qua xử lý. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết
polysaccharid sau khi phá vỡ vách bào tử đã tăng lên 40,08 % và hiệu quả sinh học
lớn hơn cũng được ghi nhận [27].
a b c d
Hình 1.8 Hình SEM BTLC với các điều kiện nghiền (a) BTLC chưa phá vách (x
5000); (b) BTLC chưa phá vách (x 15000); (c) BTLC được nghiền với tốc độ 1500
vòng/ phút (d) BTLC được nghiền với tốc độ 1600 vòng/ phút [27].
Phương pháp sinh học: Ở hình 1.9 không quan sát thấy bào tử bị vỡ của BTLC khi
được ủ với môi trường MRS hình a, acid lactic, acid acetic và sự kết hợp của cả hai
acit ở nồng độ nghiên cứu không cho thấy bất kỳ bào tử bị hỏng nào trong thời gian
nghiên cứu (Hình 1.9 b - d). Qua đó, tác giả thấy rằng các acid này không thể phá
vỡ các bào tử. Lý do là trong lớp vỏ của BTLC bao gồm silica (19,01%), canxi
(19,01%) và kitin (52,08 - 57,64%).
Hình 1.9 Hình ảnh dưới kính SEM (x 5000) BTLC không bị ảnh hưởng bởi môi
trường MRS và các acid [8].
.
.
Qua khảo sát, tác giả thẩy rằng rong quá trình lên men L. plantarum (hình 1.10) đã
góp phần vào sự phá vách của BTLC. Giá trị pH, trong phạm vi 3,5 -7,0, không làm
phân hủy acid ganoderic và polysaccharid của BTLC. Do đó, pH lên men trong thí
nghiệm sẽ thực hiện trong phạm vi 4,0 - 5,8 để ít ảnh hưởng hơn đến độ ổn định của
acid ganoderic và polysaccharid, là những hoạt chất sinh học chính của BTLC. Lên
men với vi khuẩn acid lactic, L. plantarum, đã cho thấy hiệu quả trong việc làm
vách bào tử phân hủy trong vòng 3 đến 7 ngày ở 37 °C. Lên men là một quá trình
đơn giản với chi phí thấp [8].
Hình 1.10 Hình ảnh SEM (x 5000) của BTLC lên men với Lactobacillus plantarum
(a) ngày 0; (b) ngày 3; (c) ngày 5; (d) ngày 7[8]
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học của Bào tử Linh chi
Mặc dù nấm Linh chi đã được sử dụng rộng rãi, nhưng các nghiên cứu sâu về
thành phần có hoạt chất của BTLC chỉ có thể được tìm thấy từ năm 1988 [21]. Tương
tự như thể quả, thành phần hóa học của BTLC bao gồm triterpenoid, polysaccharid,
acid amin, vitamin, … như đã trình bày ở phần “Phương pháp phá vỡ vỏ bào tử”, tác
dụng của BTLC cao hơn thể quả khi phá vỡ vách tế bào.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN MINH ĐĂNG
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA
NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022
.
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN MINH ĐĂNG
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA
NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
Mã ngành: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS.DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022
.
.
i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được
ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Nguyễn Minh Đăng
.
.
i
Luận văn Thạc sĩ – Khóa: 2019 – 2021
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất – Mã số: 8720210
BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CỦA NGUYÊN LIỆU BÀO TỬ LINH CHI
VÀ SẢN PHẨM VIÊN NANG TỪ BÀO TỬ LINH CHI
Nguyễn Minh Đăng
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN HỮU LẠC THỦY
Mở đầu: với sự phát triển của các phương pháp chiết, tách và phá vỡ vách tế bào, các nhà khoa học
đã chứng minh rằng ,bào tử Linh chi cũng mang các công dụng như thể quả như hạ đường huyết,
ổn định huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng, bảo vệ gan, chống các gốc oxy hóa tự do.
Tuy nhiên, hiện nay chưa có đơn vị nào xây dựng chuẩn cơ sở đối với bào tử Linh chi cũng như viên
nang có hoạt chất là bào tử Linh chi. Vì vậy, việc bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên
liệu bào tử Linh chi cũng như viên nang có chứa bào tử Linh chi là vô cùng cần thiết cần thiết.
Đối tượng & Phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: nguyên liệu bào tử Linh chi và viên nang chứa bào tử Linh chi đã phá vách.
Phương pháp nghiên cứu: acid ganoderic A được định lượng bằng phương pháp HPLC với kỹ
thuật rửa giải gradient. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của bào tử nấm Linh chi và viên nang chứa bào
tử Linh chi dựa vào các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V và USP 44.
Kết quả: nguyên liệu: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính tuyến tính
(2,6 – 52,5 ppm, R2 = 1,00), độ chính xác (RSD = 1,92 %), độ đúng (tỷ lệ phục hồi 98,56 %),
khoảng nồng độ xác định (10,60 – 13,00 µg/ml), giới hạn phát hiện 0,40 µg/ml, giới hạn định
lượng 1,21 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A trong nguyên liệu ≥ 60 µg/g. Xây dựng tiêu
chuẩn cơ sở gồm các chỉ tiêu: tính chất, soi bột, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất
chiết được trong dược liệu, giới hạn kim loại nặng (pb), định tính, định lượng acid ganoderic A,
giới hạn nhiễm khuẩn. Viên nang: quy trình định lượng đạt tính phù hợp hệ thống, độ đặc hiệu, tính
tuyến tính (2,6 – 52,5 ppm, R2 = 0,999), độ chính xác (RSD = 4,58 %), độ đúng (tỷ lệ phục hồi
93,71 %), khoảng nồng độ xác định (8,90 – 11,00 µg/ml), giới hạn phát hiện 0,58 µg/ml, giới hạn
định lượng 1,77 µg/ml, đề nghị hàm lượng acid ganoderic A trong viên nang ≥ 10 µg/g. Xây dựng
tiêu chuẩn cơ sở gồm các chỉ tiêu: tính chất, độ rã, độ ẩm, độ đồng đều khối lượng, định tính, định
lượng acid ganoderic A, giới hạn nhiễm khuẩn.
Kết luận: Bước đầu xây đựng được tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi và viên nang
có chứa bào tử Linh chi đã phá vách.
.
.
v
Master’s Thesis – Academic course: 2019- 2021
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
ESTABLISHING THE STANDARD OF GANODERMA LUCIDUM SPORES AND
CAPSULE CONTAINING GANODERMA LUCIUDM SPORES
Nguyen Minh Dang
Supervisor: Dr. NGUYEN HUU LAC THUY
Introduction: With the development of extracting, separating and walls breaking methods, scientists
have proved that Ganoderma lucidum spores also have effects like fruiting body such as lowering
blood sugar, stabilizing blood pressure, and anti-inflammatory, anti-histamine and anti-infection,
liver protection, anti-oxidant free radicals. However, at present, we do not have standard for
Ganoderma lucidum spores as well as capsules with active ingredients being Ganoderma lucidum
spores. Therefore, it is extremely necessary to develop standards for Ganoderman lucidum spores
and capsules containing wall - broken Ganoderma lucidum spores.
Materials and methods:
Research object: Ganoderma lucidum sprores and capsules containing wall - broken Ganoderma
lucidum spores.
Research method: ganoderic acid A was quantified by HPLC with gradient elution technique.
Develop tandards of Ganoderma lucidum spores and capsules containing Ganoderma lucidum spores
based on monographs in Vietnam Pharmacopoeia V and USP 44.
Results: materials: the method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity
(2.6 – 52.5 ppm, R2 = 1.00), accuracy (RSD = 1.92%) ), precision (recovery rate 98,56 %), defined
concentration range (10.60 – 13.00 µg/ml), limit of detection 0.40 µg/ml, limit of quantitation 1, 21
µg/ml, recommended content of ganoderic acid A in raw materials ≥ 60 µg/g. Basic standards
includes : properties, powder detection, moisture, total ash, acid-insoluble ash, extractable substances
in medicinal herbs, limit of heavy metals (pb), qualitative and quantitative determination of ganoderic
acid A, limiting of bacterial contamination. Capsules: the method was validated in terms of system
suitability, selectivity, linearity (2.6 – 52.5 ppm, R2 = 0.999), accuracy (RSD = 4.58 %). precision
(recovery rate 93.71%), defined concentration range (8.90 – 11.00 µg/ml), detection limit 0.58 µg/ml,
limit of quantitation 1.77 µg /ml, recommended concentration of ganoderic acid A in capsules ≥ 10
µg/g. Basic standards includes: properties, disintegration, moisture, uniformity of mass, qualitative
and quantitative analysis of ganoderic acid A, limit of bacterial contamination.
Conclusion: Initially, the standards for Ganoderma lucidum spores and capsules containing wall-
broken Ganoderma lucidum spores were established.
.
.
MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH.................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... ix
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ x
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2
1.1. Tổng quan về thực vật học của bào tử Linh chi ............................................. 3
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học của Bào tử Linh chi.................................. 9
1.3. Tổng quan tác dụng sinh học của bào tử Linh chi ........................................ 15
1.4. Tổng quan về acid ganoderic A ................................................................... 18
1.5. Tổng quan về tiêu chuẩn của nấm Linh chi ................................................. 21
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 22
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 22
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 23
Chương 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 33
3.1. Xác định đặc điểm thực vật của nguyên liệu bào tử Linh chi ....................... 33
3.2. Kết quả thẩm định tiêu chuẩn cơ sở nguyên liệu bào tử Linh chi ................. 36
3.3. Kết quả thẩm định tiêu chuẩn cơ sở viên nang bào tử Linh chi .................... 43
3.4. Dự thảo xây dựng TCCS của nguyên liệu BTLC (Đính kèm phụ lục 6) ....... 51
3.5. Dự thảo xây dựng TCCS của viên nang BTLC (đính kèm phụ luc 12) ......... 53
Chương 4. BÀN LUẬN........................................................................................ 54
4.1. Xác định đặc điểm thực vật bào tử Linh chi ................................................ 54
4.2. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử Linh chi ......... 54
4.3. Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của viên nang bào tử Linh chi ............ 55
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 57
.
.
i
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
.
ii
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst .............................................. 2
Hình 1.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử của BTLC ...................................... 3
Hình 1.3 Thu thập BTLC theo phương pháp Kraft – Paper ................................... 4
Hình 1.4 (A) BTLC trên nấm, (B) BTLC sau và trước khi được phá vỡ vách ........ 5
Hình 1.5 Hình ảnh BTLC dưới kính hiển vi SEM ................................................. 6
Hình 1.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của dòng CO2 với polysaccharid............. 7
Hình 1.7 Ảnh SEM của BTLC dưới các áp suất và thời gian hoạt động ................ 7
Hình 1.8 Hình ảnh SEM BTLC với các điều kiện nghiền ...................................... 8
Hình 1.9 Hình ảnh BTLC không ảnh hưởng bởi môi trường ................................. 8
Hình 1.10 Hình ảnh SEM của BTLC lên men với Lactobacillus plantarum .......... 9
Hình 1.11 Lucidumol A (Trái), các hợp chất từ (2) – (6) ..................................... 11
Hình 1.12 Công thức từ (7) - (19) ....................................................................... 11
Hình 1.13 Cấu trúc chung của nhóm sterol trong BTLC ...................................... 14
Hình 1.14 Công thức cấu tạo của acid ganoderic A ............................................. 18
Hình 3.1 Bột bào tử của loài nấm Linh chi .......................................................... 33
Hình 3.2 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) ............................ 33 - 34
Hình 3.3 Cấu tạo BTLC - Ganoderma lucidum (x1.000) .............................. 34 - 35
Hình 3.4 Bào tử Linh chi - Ganoderma lucidum (x1.000) ................................... 35
Hình 3.5 Bào tử Linh chi dưới KHV SEM (x2.000) và (x5.000 và x15.000) ....... 36
Hình 3.6 SKĐ của mẫu đối chiếu acid ganoderic A ............................................ 37
Hình 3.7 SKĐ mẫu thử nguyên liệu BTLC ......................................................... 37
Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng ............................................................................. 39
Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn acid ganoderic A ................................................ 39
Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu thử .............................................................................. 39
Hình 3.11 Đồ thị tương quan nồng độ acid ganoderic A và Spic ganoderic A ....... 40
.
.
ii
Hình 3.12 Bột BTLC đã phá vách (x 5000) ......................................................... 43
Hình 3.13 SKĐ mẫu đối chiếu acid ganoderic A ................................................. 45
Hình 3.14 SKĐ mẫu thử ..................................................................................... 45
Hình 3.15 Sắc ký đồ mẫu trắng ........................................................................... 46
Hình 3.16 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu acid ganoderic A ......................................... 47
Hình 3.17 Sắc kỳ đồ mẫu thử viên nang BTLC ................................................... 47
Hình 3.18 Sắc ký đồ mẫu placebo ....................................................................... 47
Hình 3.19 Tương quan giữa nồng độ và diện tích pic ganoderic A ...................... 48
.
.
x
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Các nhóm thế của công thức (7) - (19) ................................................. 12
Bảng 1.2 Các nhóm thế của công thức (2) - (6) ................................................... 13
Bảng 1.3 Các nhóm polysaccharid của BTLC và phương pháp phân lập ............. 14
Bảng 1.4 So sáng giữa USP 44 và DĐVN V ....................................................... 21
Bảng 2.1 Chương trình dung môi ........................................................................ 25
Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm, độ tro, chất chiết trong dược liệu.................... 37
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống ................................................ 38
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu thử .................... 38 - 39
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ chính xác ........................................................ 40- 41
Bảng 3.5 Tỷ lệ phục hồi của phương pháp ................................................... 41 - 42
Bảng 3.6 Kết quả xác định độ rã của viên nang BTLC ........................................ 43
Bảng 3.7 Kết quả xác định độ đồng đều khối lượng của viên nang BTLC .... 44 - 45
Bảng 3.8 Kết quả 6 lần tiêm lặp lại dung dịch acid ganoderic A ................... 45 - 46
Bảng 3.9 Kết quả 6 lần tiêm lặp lại dung dịch thử viên nang ............................... 46
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát độ chính xác ..................................................... 48 - 49
Bảng 3.11 Tỷ lệ phục hồi của phương pháp......................................................... 49
.
.
LỜI CẢM ƠN
Sau một thời gian học tập và thực hiện luận văn với nhiều nỗ lực, thời điểm hoàn
thành luận văn là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người Cô đã dạy
dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS. NGUYỄN HỮU LẠC
THỦY - người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành
luận văn Thạc sĩ này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Hóa Phân tích – Kiểm nghiệm đã
tận tình truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên
cứu.
Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến gia đình và đặc biệt là
các bạn Bích Phương (Dược 13), Thanh Long, Tuyết Anh, Ngọc Thành (Dược 16)
và Minh Nhật, Minh Tấn (Dược 17) đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện
đề tài này
.
.
LỜI MỞ ĐẦU
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Ganodermataceae) được liệt kê trong
“Thần Nông bản thảo” như là một dược thảo mang nhiều công hiệu và không gây độc
hại. Trước đây, bộ phận sử dụng chủ yếu của nấm Linh chi là thể quả sấy khô, tuy
nhiên các nghiên cứu hiện đại cũng cho thấy rằng các hoạt chất đặc trưng cho tác
dụng dược lý trong thể quả như polysaccharid, triterpenoid, acid amin và vitamin
cũng có mặt trong bào tử [34]. Cũng như thể quả, bào tử cũng có các công dụng như
hạ đường huyết, chống tăng huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng, bảo vệ
gan, chống các gốc oxy hóa tự do [11][13][30]. Vì vậy, bào tử Linh chi cũng là sản phẩm
được thu hoạch đồng thời và có giá thành cao hơn so với nấm (dao động từ 0,5 đến
1,2 triệu đồng/100 g).
Khi đề cập đến phương pháp định tính và định lượng của thể quả nấm Linh
chi trong chuyên luận, USP 44 đã chọn acid ganoderic A làm chuẩn để định tính và
xác định hàm lượng triterpenoid [32]. Những phương pháp định lượng GAA đã được
công bố phần lớn sử dung sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với kỹ thuật rửa giải
gradient, thời gian phân tích thường kéo dài.
Hiện nay, chưa có đơn vị nào xây dựng chuẩn cơ sở đối với bào tử Linh chi
cũng như viên nang có hoạt chất là bào tử Linh chi. Vì vậy, việc bước đầu xây dựng
tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi cũng như viên nang có chứa bào tử
Linh chi là vô cùng cần thiết cần thiết.
Đề tài:
“Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở của nguyên liệu bào tử Linh chi
và sản phẩm viên nang từ bào tử Linh chi”
được thực hiện với các nội dung chính sau đây:
- Xác định đặc điểm thực vật học của bào tử Linh chi.
- Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu bào tử Linh chi.
- Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang bào tử Linh chi.
.
.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
- Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss. Ex Fr) Karst, còn có
tên nấm lim, nấm trường thọ, thuộc họ Nấm lim (Ganodermataceae). Bộ phận dùng
là thể quả hóa gỗ đã phơi hay sấy khô của Linh chi.
- Tác dụng của nấm Linh chi còn được được mô tả chi tiết trong “Những cây thuốc
và vị thuốc Việt Nam” (Đỗ Tất Lợi) bao gồm: đau thắt cơ tim, bệnh ở mạch vành của
tim, huyết áp không ổn định, viêm phế quản, hen, thấp khớp, viêm gan mạn, bệnh
phụ nữ vào thời kỳ mãn kinh, bệnh đường tiêu hóa, v.v… [1][2].
- Các công trình khoa học cũng chứng minh tác dụng chống oxy hóa, tăng cường
miễn dịch, hạ đường huyết, kháng ung thư của nấm Linh chi.
Hình 1.1 Ganoderma lucidum (Leyss. ex Fr.) Karst (a) Nấm Linh chi trồng trong
nhà kính ; (b) Thể quả nấm Linh chi chưa trưởng thành; (c) Thể quả nấm Linh chi
trưởng thành; (d) Thể quả được phủ bào tử Linh chi [24]
.
.
1.1. Tổng quan về thực vật học của bào tử Linh chi
Đặc điểm hình thái của bào tử Linh chi (BTLC)
BTLC là cơ quan sinh sản hữu tính của nấm Linh chi (hình 1.2 a). BTLC màu
nâu, hình trứng, thuôn ở đỉnh, có 1 lớp vỏ kép bao bên ngoài, kích thước khoảng
8,5 – 11,2 (μm) × 5,2 – 6,9 (μm), lỗ nẩy nầm hình gai nhọn (hình 1.2a, b). BTLC có
lớp vỏ bào tử kiểu kép, vỏ ngoài vàng nhạt dày 0,8 – 1,1 μm. Quan sát dưới kính hiển
vi thấy lỗ thủng trên bề mặt lớp ngoài. (hình 1.2 c, d).
Lớp vỏ này có thành phần là hỗn hợp 𝛽-1,3, 𝛽-1,6-glucan và 𝛼-glucan dưới
dạng amylopectin, amylose, amylodextrin và glycogen. Các glucan này liên kết với
nhau, liên kết với chitin tạo thành lớp vỏ vững chắc và đàn hồi nên hoạt chất trong
BTLC được bảo vệ vững chắc [28] .Trong giai đoạn phát triển BTLC được bao bọc
thêm bởi một lớp màng mỏng. Lớp màng này có các lỗ có đường kính 0,2 – 0,6 (µm).
Khi trưởng thành lớp màng nứt và tróc ra. Các thí nghiệm trong điều kiện khắc nghiệt
như đun sôi, ngâm trong acid, dung môi hữu cơ ở nhiệt độ phòng đều không thể phá
vỡ lớp vỏ bào tử. Quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy những lỗ thủng trên bề mặt lớp
vỏ ngoài và mấu lồi nhỏ ở đầu đối diện với lỗ nảy mầm [14].
Hình 1.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử của BTLC (a) BTLC (x 1000) ; (b)
Hình phóng to một BT (x 10000) (c) Bề mặt bên ngoài của BT (x 1000); (d) Hình
hiển thị mặt cắt hai lớp của BT(x 10000) [26]
.
.
Các phương pháp thu hoạch bào tử Linh chi
Thời điểm thu hoạch BTLC có thể được xác định bằng cách quan sát sự biến
mất của vòng sinh trưởng. Nhiệt độ môi trường được khuyến nghị ở 25 – 33 (°C).
Phương pháp Kraft – Paper: Dùng lớp màng mỏng được đặt trên mặt đất để tránh
tiếp xúc. Một màng nhựa sạch có kích thước phù hợp khác được đặt trên đế của nấm.
Một tờ giấy trắng hoặc giấy được cuộn thành hình trụ và đặt trên lớp màng mỏng.
Sau khi quấn giấy vào thân nấm Linh chi, phủ các tông vuông để ngăn không cho bột
bào tử thoát ra. Khoảng cách giữa tấm bìa và nấm phải là 5 cm. Tạo các lỗ nhỏ để
tăng tính thấm khí và duy trì độ ẩm tương đối của không khí ở 75 – 80 (%). Sau khi
bỏ giấy, bột bào tử ở bên trong tờ giấy và trên nấm được thu thập đầu tiên. Sau đó
bột bào tử trên phim được lấy ra bằng thìa. BTLC được thu thập cứ sau 15 ngày cho
đến 45 ngày.
Phương pháp phủ màng nhựa: hai lớp màng được đặt ở giữa mỗi hai hàng nấm trưởng
thành để thu hoạch BTLC. Các bào tử trên bề mặt của nấm được đưa vào một vật
chứa đặc biệt bằng bàn chải mềm, sau đó bột bào tử trên màng được thu hoạch.
Khi thu hoạch, chỉ có bột BT ở lớp trên của màng được thu thập, còn bột BT ở lớp
dưới bị loại.
Hình 1.3 Thu thập BTLC theo phương pháp Kraft – Paper [34]
.
.
Các phương pháp phá vỡ bào tử
Việc phá vỡ vách bào tử cho thấy hàm lượng hoạt chất trong BTLC được tăng
lên đáng kể và cao hơn cả thể quả [26].
Phương pháp phá vỡ vách bào tử của BTLC có thể là vật lý, hóa học, cơ học, hay sinh
học (sử dụng enzym, lên men...).
Hình 1.4 (A) BTLC trên nấm, (B) BTLC sau và trước khi được phá vỡ vách [34]
Phương pháp vật lý: Phương pháp siêu âm trên nguyên tắc các bọt khí được tao thành
do sự tương tác giữa sóng siêu âm và môi trường. Những bọt khí này khi bị phá vỡ
tạo ra các hiêu ứng như lực cắt hay sóng xung kích. Các hiệu ứng làm tăng cường sự
thẩm thấu của các tác nhân phản ứng vào sâu trong BTLC, làm tăng tốc phản ứng hóa
học giữa các tác nhân và BTLC. Ngoài ra, siêu âm còn phá vỡ bề mặt BTLC do gây
ra sự thay đổi về cấu trúc.
Trong nghiên cứu[38], kỹ thuật phá vỡ vách tế bào bằng phương pháp siêu âm đã dược
tác giả tìm hiểu một cách chi tiết. Các thông số như công suất siêu âm, thời gian, chu
kỳ nhiệm vụ được đánh giá có ảnh hưởng đến sự phá vỡ vách bào tử. Những thay đổi
hình thái đáng kể của bào tử chẳng hạn như nứt, gãy và phân huỷ, được quan sát thấy
sau khi xử lý bằng sóng siêu âm. Bằng cách trang bị thêm bồn nước đá, hiệu suất
chiết có thể được nâng cao lên xấp xỉ 75%, gần gấp đôi lượng không làm torng nước
đá. Hiệu suất phá vỡ vách tối ưu ở mức công suất siêu âm 27,3 W/cm2, chu kỳ nhiệm
vụ 100% và thời lượng xử lý 90 phút. Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy rằng quá trình
siêu âm không chỉ bảo vệ các thành phần hoạt tính sinh học chính của bào tử Lonh
chi, mà còn tăng cường giải phóng polysaccharid, protein và acid béo khi so sánh với
.
.
bào tử không phá vách. Các kết quả hiện tại chỉ ra rằng phương pháp siêu âm hiệu
quả hơn trong việc chiết các hoạt chất của BTLC và có thể là một kỹ thuật mang lại
hiêu quả kinh tế để chiết trên lượng lớn BTLC [38].
Hình 1.5 Hình ảnh BTLC dưới kính hiển vi SEM (x1000)
BTLC không siêu âm (A, B, C) có siêu âm (D, E, F); sử dụng bồn nước đá với công
suất 3.9 W/cm2 (A, D); 7.9 W/cm2 (B, E); 23.7 W/cm2 (C, F) [38].
Phương pháp hóa học: Dùng CO2 siêu tới hạn, với chương trình trong 4 giờ, nhiệt
độ 25 oC, áp suất 35 MPa, tốc độ dòng của CO2 10 kg/giờ. Ảnh hưởng của tốc độ
dòng CO2 đến hiệu suất phá vỡ được khảo sát trong các điều kiện sau: 200 g BTLC
được chiết trong 1, 2, 3 và 4 giờ, với tốc độ dòng CO2 lần lượt là 4, 6, 8, 10, 12, 14
kg/giờ. Lượng polysaccharid chiết được thể hiện trong hình 1.6. Dùng SEM đánh giá
hiệu quả phá vỡ, ghi nhận phần trăm của polysaccharid đã tăng từ 0,94 % khi sử dụng
bào tử nguyên vách lên 2,98 % khi dùng bào tử bị phá vỡ vách tế bào. Các BTLC đã
phá vách kiểm tra bằng kính hiển vi quét (SEM) để điều tra những thay đổi hình thái
trên bề mặt của BTLC trong quá trình phá vỡ. Hình ảnh SEM của BTLC ban đầu và
sau khi phá vách dược miêu tả ở hình 1.7. Các bào tử đã phá vách cho thấy hình thái
những thay đổi. Một số bào tử có các đường nứt trên ống bào tử, một số có một
khoảng trống và một số đã hoàn toàn bị phá vỡ. So sánh các hình ảnh SEM của bào
tử nguyên vẹn và đã xử lý thấy các lỗ nhỏ trên bào tử đã xử lý lớn hơn các lỗ nhỏ
.
.
trong những cái còn nguyên vẹn. Với thời gian phá vỡ lâu hơn, lỗ càng to hơn. Hình
1.7 a, d, e và f cho thấy ảnh SEM của các BTLC ban đầu và các bào tử được phá vách
trong 4 giờ dưới các áp suất khác nhau. Có thể quan sát thấy rằng BTLC đã phá vách
có các đường nứt và lỗ rỗng và ảnh hưởng rõ ràng đối với các bào tử được xử lý ở áp
suất cao. Mặc dù tổng số bào tử bị phá vỡ bởi phương pháp không cao nhưng năng
suất chiết xuất polysaccharid của bào tử đã xử lý cao hơn nhiều so với những BTLC
ban đầu. Lý do là phương pháp xử lý với CO2 siêu tới hạn đã cải thiện tính thấm của
bào tử và mở rộng các lỗ nhỏ trên BTLC. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc
chiết xuất các polysaccharid từ các bào tử [17].
Hình 1.6 Biểu đồ thể hiện sự ảnh hưởng của tốc độ dòng CO2 với lượng
polysaccharid chiết được [17]
Hình 1.7 Ảnh SEM của BTLC dưới các áp suất và thời gian hoạt động khác nhau,
bar = 6 lm: (a) nguyên vẹn; (b) 35 MPa, 2 giờ; (c) 35 MPa, 3 giờ; (d) 30 MPa, 4
giờ; (e) 33 MPa, 4 giờ; và (f) 35 MPa, 4 giờ [17]
.
.
Phương pháp cơ học: BTLC được nghiền thành các hạt siêu mịn nhờ máy nghiền ly
tâm tốc độ cao. Dùng SEM để đánh giá hiệu quả của việc phá vỡ. Kết quả định lượng
bằng phương pháp UV – Vis dùng để so sánh giữa tỷ lệ chiết polysaccharid từ các tế
bào đã qua phá vỡ vách và các BTLC chưa qua xử lý. Kết quả cho thấy hiệu suất chiết
polysaccharid sau khi phá vỡ vách bào tử đã tăng lên 40,08 % và hiệu quả sinh học
lớn hơn cũng được ghi nhận [27].
a b c d
Hình 1.8 Hình SEM BTLC với các điều kiện nghiền (a) BTLC chưa phá vách (x
5000); (b) BTLC chưa phá vách (x 15000); (c) BTLC được nghiền với tốc độ 1500
vòng/ phút (d) BTLC được nghiền với tốc độ 1600 vòng/ phút [27].
Phương pháp sinh học: Ở hình 1.9 không quan sát thấy bào tử bị vỡ của BTLC khi
được ủ với môi trường MRS hình a, acid lactic, acid acetic và sự kết hợp của cả hai
acit ở nồng độ nghiên cứu không cho thấy bất kỳ bào tử bị hỏng nào trong thời gian
nghiên cứu (Hình 1.9 b - d). Qua đó, tác giả thấy rằng các acid này không thể phá
vỡ các bào tử. Lý do là trong lớp vỏ của BTLC bao gồm silica (19,01%), canxi
(19,01%) và kitin (52,08 - 57,64%).
Hình 1.9 Hình ảnh dưới kính SEM (x 5000) BTLC không bị ảnh hưởng bởi môi
trường MRS và các acid [8].
.
.
Qua khảo sát, tác giả thẩy rằng rong quá trình lên men L. plantarum (hình 1.10) đã
góp phần vào sự phá vách của BTLC. Giá trị pH, trong phạm vi 3,5 -7,0, không làm
phân hủy acid ganoderic và polysaccharid của BTLC. Do đó, pH lên men trong thí
nghiệm sẽ thực hiện trong phạm vi 4,0 - 5,8 để ít ảnh hưởng hơn đến độ ổn định của
acid ganoderic và polysaccharid, là những hoạt chất sinh học chính của BTLC. Lên
men với vi khuẩn acid lactic, L. plantarum, đã cho thấy hiệu quả trong việc làm
vách bào tử phân hủy trong vòng 3 đến 7 ngày ở 37 °C. Lên men là một quá trình
đơn giản với chi phí thấp [8].
Hình 1.10 Hình ảnh SEM (x 5000) của BTLC lên men với Lactobacillus plantarum
(a) ngày 0; (b) ngày 3; (c) ngày 5; (d) ngày 7[8]
1.2. Tổng quan về thành phần hóa học của Bào tử Linh chi
Mặc dù nấm Linh chi đã được sử dụng rộng rãi, nhưng các nghiên cứu sâu về
thành phần có hoạt chất của BTLC chỉ có thể được tìm thấy từ năm 1988 [21]. Tương
tự như thể quả, thành phần hóa học của BTLC bao gồm triterpenoid, polysaccharid,
acid amin, vitamin, … như đã trình bày ở phần “Phương pháp phá vỡ vỏ bào tử”, tác
dụng của BTLC cao hơn thể quả khi phá vỡ vách tế bào.
.