Bước đầu nghiên cứu tổng hợp interleukin 33 người tái tổ hợp trên escherichia coli
- 91 trang
- file .pdf
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN KIM HƯNG
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022
.
. ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN KIM HƯNG
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUỐC THÁI
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022
.
. iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn “Nghiên cứu tạo Interleukin-33 người tái tổ hợp
trên Escherichia coli” là bài viết của riêng tôi, với các thông tin được được trích dẫn
trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Nguyễn Kim Hưng
.
. iv
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa: 2019-2021
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
Nguyễn Kim Hưng
Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Thái
TÓM TẮT
Mở đầu: Interleukin-33 (IL-33) là một thành viên trong họ Interleukin-1. Có
vai trò quan trọng trong các bệnh tự miễn và gần đây nhất thì cũng có nghiên cứu cho
thấy có sự tăng cao IL-33 của các bệnh nhân nhiễm covid trẻ tuổi liên quan đến cơn
bão cytokine. Cho thấy hướng nghiên cứu về IL-33 và thụ thể của nó là một mục tiêu
tiềm năng. Để thực hiện nghiên cứu cần chủ động nguồn IL-33 cho nghiên cứu vì IL-
33 chưa được sản xuất thương mại và giá thành đặt mua rất đắt. Nên đó là lí do đề tài
này được thực hiện với mong muốn tạo nguồn IL-33 với độ tinh khiết cao phục vụ
cho nghiên cứu.
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Chủng vi khuẩn sử dụng là E. coli
mang vector biểu hiện pET-SUMO-IL-33. Biểu hiện trong môi trường ZYP-5052 ở
25 °C, thu nhận và tinh chế IL-33 dạng tan bằng phương pháp sắc kí ái lực trên cột
Ni-Sepharose. IL-33 dạng nguyên thể được định lượng bằng phương pháp Bradford
và bộ kit ELISA. Khảo sát in silico tiềm năng của IL-33 ở dạng gắn kết với SUMO
và dạng tự nhiên trong nghiên cứu tương tác với thụ thể ST2.
Kết quả: Vi khuẩn được nuôi cấy 40 giờ trong môi trường ZYP-5052 nhiệt độ
25 °C. Loại bỏ đoạn dung hợp SUMO thu IL-33 nguyên thể là 38,56 mg hiệu suất
17,4% . Xây dựng mô Hình 3D của SUMO-IL33 và IL-33, đánh giá khả năng gắn kết
với thụ thể ST của IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO.
Kết luận: Nghiên cứu tạo thành công IL-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4%.
Đánh giá được IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO không thể sử dụng trong các thử
nghiệm có mặt thụ thể ST2.
.
. v
Final esay for the degree of M.Sc in Pharm. - Academic year: 2019-2021
FIRST STEP TO RESEARCH EXPRESSION OF
RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN-33
IN ESCHERICHIA COLI
Kim-Hung Nguyen
Supervisor: Dr. Nguyen Quoc Thai
ABSTRACT
Background: Interleukin-33 (IL-33) is a member of the Interleukin-1 family.
They play an important role in autoimmune diseases and most recently there was also a
study showing elevated IL-33 in young covid patients associated with a cytokine storm.
Shows the direction of research on IL-33 and its receptor as a potential target. To conduct
research, it is necessary to actively source IL-33 for research because IL-33 has not been
produced commercially and the purchase price is very expensive. So that's why this study
was carried out with the desire to create a source of IL-33 with high purity for research
purposes.
Method: E. coli containing the pET-SUMO-IL-33 construction expressing
recombinant in ZYP-5052 at 25 °C. Recomninant IL-33 was purified by IMAC with
Ni-Sepharose. IL-33 native were quantified by Bradford method and kit ELISA.
Investigation of the potential in silico of IL-33 in SUMO-binding and native form
in ST2 receptor interaction studies.
Results: E.coli were cultured for 40 h in ZYP-5052 medium at 25 °C. Removal
of the SUMO fusion fragment yielded native IL-33 of 38,56 mg with a 17,4% yield.
Building 3D models of SUMO-IL33 and IL-33, assessing the ability to bind to ST2
receptor of IL-33 containing the SUMO fusion fragment.
Conclusion: Research to create native IL-33 with 17,4% efficiency. Evaluation
of IL-33 containing the SUMO fusion fragment could not be used in assays for the
presence of the ST2 receptor.
.
. vi
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Quốc Thái đã tạo cơ hội
cho em tiếp cận với mảng nghiên cứu protein. Cảm ơn thầy đã tận tình hướng dẫn,
luôn động viên cũng như định hướng, tháo gỡ những khó khăn vướng mắc cho em
trong thời gian thực hiện nghiên cứu. Cám ơn Thầy về tất cả những gì Thầy đã chỉ
dạy.
Cảm ơn dược sĩ Tôn Thảo Vy đã luôn đồng hành trong suốt khoảng thời gian qua,
luôn chia sẻ khó khăn, luôn động viên và đưa ra lời khuyên hữu ích.
Cảm ơn anh chị kỹ thuật viên bộ môn Sinh hóa, cô TS Vũ Thanh Thảo Trung tâm
Sapharcen đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như đã chỉ dạy em trong thời gian em thực
hiện đề tài.
Cảm ơn anh chị nghiên cứu sinh Mai Thành Tấn, Trần Quế Hương, Trần Thị Thúy
Nga, các tân dược sĩ Lê Nhật Hạ, Nguyễn Minh Thư, Nguyễn Duy Thạch lớp D16 đã
đồng hành và cùng nhau nghiên cứu.
Cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện cho con có thể học tập, luôn động viên con có thể
vượt qua khó khăn thử thách.
Trân trọng,
Nguyễn Kim Hưng
.
. vii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................ ix
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xi
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... xii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1 Tổng quan về Interleukin ........................................................................................... 3
1.2 Tổng quan về Interleukin-33...................................................................................... 3
1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli ...................................... 7
1.4 Vector biểu hiện pET-SUMO .................................................................................... 9
1.5 Tinh chế protein ....................................................................................................... 10
1.6 Tạo protein dạng nguyên thể bằng phản ứng thuỷ phân với SUMO Protease......... 12
1.7 Kiểm định protein .................................................................................................... 13
1.8 Xây dựng mô hình tương đồng mô phỏng cấu trúc protein ..................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19
2.1 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 19
2.2 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 37
3.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 37
3.2 Tinh chế SUMO-IL-33 ............................................................................................ 42
3.3 Khảo sát điều kiện thủy phân SUMO-IL33 để thu IL-33 nguyên thể (native) ........ 44
3.4 Tinh chế IL-33 nguyên thể với cột Ni Sepharose .................................................... 47
3.5 Định lượng IL-33 bằng bộ KIT ELISA ................................................................... 49
3.6 Mô hình cấu trúc 3D của IL-33 dạng gắn với SUMO xây dựng bằng kỹ thuật
homology ............................................................................................................................. 49
3.7 Kết quả docking protein-protein khảo sát sự gắn kết của SUMO-IL-33 với thụ thể
ST2 ........................................................................................................................... 58
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 63
4.1 Nhận xét về kết quả nuôi cấy và tinh chế ................................................................ 63
4.2 So sánh với các nghiên cứu khác ............................................................................. 66
.
. viii
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
. ix
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Việt, tiếng Anh
3D Cấu trúc không gian ba chiều
APS Ammonium persulfat
bp Base pait
Co2+ - CMA Cobalt - carboxylmethylaspartate
DDT Dithiotheitol
EIA Enzym immunoassay
ELISA Enzym-linked immunosorbent assay
IDA Acid iminodiacetic
hIL-33 Interleukin-33 người
IL-33 Interleukin-33
IL Interleukin
IL-1RAcP Đồng thụ thể của IL-33 (Interleukin-1 Receptor accessory
Protein)
IMAC Immobilized metal ion affinity chromatography
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
LB Luria-Bertani Broth
NF-HEV Nuclear factor − high endothelial venule
Ni2+ - NTA Nickel – nitriloacetic acid
NPS Hỗn hợp Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4
SDS Sodium dodecyl sulfat
SDS-PAGE Phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfat trên
polyacrylamid (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide
Gel Electrophoresis)
SOC Super Optimal broth with Catabolite repression
SUMO Small ubiquitin-like modifier
.
. x
TB Terrific Broth
SEC Sắc ký rây phân tử (Size Exclusion Chromatography)
ST2 Thụ thể của IL-33, trước đây còn gọi là IL1RL1 – thụ thể
giống thụ thể Interleukin-1 1 (Interleukin-1 receptor-like1)
TEMED Tetramethylethylenediamin
GST Glutathion-S-transerase
PDIa’b’ b’a’ domain of human protein dusulfide isomerase
MBP Maltose Binding Protein
MCS Multiple cloning site
β-ME Beta-mercaptoethanol
His8 8 Histidin
LOMETS Local Meta Threading Server
ZYP Môi trường tự cảm ứng
.
. xi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Hóa chất dùng trong nghiên cứu ....................................................23
Bảng 2.2 Thiết bị, dụng cụ trong thí nghiệm .................................................23
Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamid .......................................................26
Bảng 2.4 Xây dựng đường chuẩn Bradford...................................................29
Bảng 2.5 Tỷ lệ pha dung dịch đệm rửa..........................................................31
Bảng 2.6 Tỷ lệ pha dung dịch đệm thử nghiệm.............................................31
Bảng 2.7 Tỷ lệ pha loãng Biotin-Conjugate ..................................................32
Bảng 2.8 Tỷ lệ pha loãng Streptavidin- HRP ................................................32
Bảng 3.1 Sinh khối thu được trong ba môi trường LB; TB và ZYP-5052 ....39
Bảng 3.2 Kết quả quả đánh giá chất lượng mô hình SUMO-IL-33 bằng
MolProbity .....................................................................................................54
.
. xii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc NMR IL-33 .................................................................................. 4
Hình 1.2 Quá trình gắn kết của IL-33 vào ST2 và IL-1RacP ................................... 6
Hình 1.3 Chất nền Ni2+- NTA và Co2+- CMA ........................................................ 11
Hình 1.4 Mô tả nguyên tắc của sắc ký rây phân tử ................................................. 12
Hình 1.5 Sơ đồ điện di polyacrylamid với SDS ...................................................... 14
Hình 2.1 Plasmid pET24a ....................................................................................... 19
Hình 2.2 Plasmid pET-SUMO-IL-33 chứa gen mã hoá cho IL-33 sau khi được tối
ưu hóa ....................................................................................................................... 20
Hình 2.3 Tỷ lệ pha loãng chuẩn..................................................................... 33
Hình 3.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG trong môi trường LB ................... 37
Hình 3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG trong môi trường TB ................... 38
Hình 3.3 Khảo sát biểu hiện trong môi trường ZYP-5052...................................... 38
Hình 3.4 So sánh biểu hiện SUMO-IL-33 trong các môi trường ..................39
Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng vi khuẩn E. coli BL21(DE3)/pET-SUMO-IL33
................................................................................................................................. 40
Hình 3.6 Protein thu được trong các mốc thời gian khảo sát .................................. 41
Hình 3.7 Tinh chế SUMO-IL33 qua cột Ni-Sepharose........................................... 42
Hình 3.8 Tinh chế SUMO-IL33 qua cột HiTrap Desalting .................................... 43
Hình 3.9 Thủy phân SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 0,1% ........................ 44
Hình 3.10 Thủy phân pET-SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 1%; 4 °C ....... 45
Hình 3.11 Thủy phân pET-SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 1%................. 46
Hình 3.12 IL-33 sau khi thủy phân bằng SUMO Protease 1% 4 °C trong 1 giờ .... 47
Hình 3.13 Tinh chế thu IL-33 dạng nguyên thể ...................................................... 48
Hình 3.14 Đường chuẩn ELISA .............................................................................. 49
Hình 3.15 Mô hình cấu trúc 3D tốt nhất của IL-33-SUMO được dự đoán bởi chương
trình (A) I-TASSER, (B) C-I-TASSER, (C) RoseTTAFold. IL-33 được minh họa
dưới dạng ruy-băng màu hồng nhạt, phần SUMO có màu xanh. ............................ 51
Hình 3.16 So sánh cấu trúc IL-33 trong mô hình IL-33-SUMO với cấu trúc IL-33
chụp bằng phương pháp nhiễu xạ tinh thể (mã PDB: 4KC3). ................................. 53
.
. xiii
Hình 3.17 Bản đồ Ramachandra của các cấu trúc homology tốt nhất xây dựng bởi I-
TASSER, C-I-TASSER, RoseTTAFold .................................................................. 55
Hình 3.18 Minh họa 2 vị trí gắn kết của IL-33 với thụ thể ST2 trong dạng gắn với
SUMO ...................................................................................................................... 57
Hình 3.19 Các cấu dạng docking tốt nhất giữa IL-33 dạng tự như và thụ thể ST2
bằng ClusPro ............................................................................................................ 58
Hình 3.20 (A) Mô hình docking IL-33 dạng tự nhiên với thụ thể ST2 bằng chương
trình ClusPro (model 0); (B) Cấu trúc thực nghiệm của IL-33 và thụ thể ST2 xác định
bằng phương pháp nhiễu xạ tinh thể tia X bởi Liu X. và cộng sự (2013). .............. 59
Hình 3.21 Kết quả docking mô hình IL-33-SUMO (xây dựng với I-TASSER) với
thụ thể ST2 ............................................................................................................... 60
Hình 3.22 Mô hình docking IL-33-SUMO (xây dựng bằng I-TASSER) với thụ thể
ST2 bằng chương trình ClusPro .............................................................................. 61
Hình 3.23 Các mô hình docking tốt nhất của cấu trúc homology IL-33-SUMO xây
dựng bằng RoseTTAFold với thụ thể ST2 bằng ClusPro ........................................ 62
.
. 1
MỞ ĐẦU
Trong hơn một thập kỷ qua, Interleukin (IL)-33, là một cytokin mới thuộc họ
IL-1 đã được chứng minh có liên quan rõ rệt đến các bệnh viêm (hen suyễn, bệnh
phổi tắc nghẽn mạn tính, viêm ruột) và các bệnh tự miễn (viêm khớp dạng thấp, lupus
ban đỏ hệ thống, đa xơ cứng) [31]. IL-33 được xem là đích tác động tiềm năng trong
điều trị nhiễm trùng đường hô hấp, đặc biệt là hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và
bệnh xơ cứng cơ xương [40]. IL-33 cũng được đánh giá là một mục tiêu trong điều
trị bệnh Alzheimer với bằng chứng về sự tăng biểu hiện của IL-33 và thụ thể ST2 ở
não của bệnh nhân mắc bệnh này [50].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế hoạt tính của IL-33
làm thuốc nhưng đến nay trên thế giới vẫn chưa có thuốc nào được chính thức chấp
nhận cho tác dụng điều trị theo cơ chế này. Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu phát
triển thuốc tập trung vào IL-33 đang được quan tâm. Nghiên cứu của tác giả Mai
Thành Tấn và cộng sự (2016) đã thiết kế thành công các cấu trúc phân tử nhỏ có khả
năng ức chế hoạt tính IL-33 in silico [1]. Tuy nhiên, nguồn IL-33 cung ứng cho thử
nghiệm hoạt tính các chất này in vitro không sẵn có do IL-33 chưa được thương mại
hoá. Giá thành của IL-33 đặt gia công tổng hợp lại rất cao dẫn đến việc nghiên cứu
thuốc trở nên vô cùng khó khăn. Vì vậy, nhu cầu tạo được nguồn IL-33 tái tổ hợp sẵn
có dùng cho mục đích nghiên cứu trong nước là vô cùng cần thiết.
Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu tiến hành tạo nguồn IL-33 tái tổ hợp
như nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Thảo và cộng sự (2015) tuy nhiên nghiên cứu
chỉ sản xuất IL-33 chuột dạng hòa tan trên nấm men Pichia pastoris [36]. Cho đến
nay trong nước vẫn chưa có công trình khác nghiên cứu tái tổ hợp IL-33 của người
và sử dụng biểu hiện trên Escherichia coli. Gần đây, nhóm nghiên cứu Hoá sinh tại
khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã tạo dòng thành công chủng
E. coli biểu hiện IL-33 dạng dung hợp với SUMO ở quy mô 50 mL dịch nuôi cấy.
Trong đề tài “ Bước đầu nghiên cứu tổng hợp Interleukin-33 người tái tổ hợp
trên Escherichia coli” này, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu trên với mục tiêu
.
. 2
tổng quát là tạo IL-33 tái tổ hợp dạng nguyên thể (native) với quy mô lớn hơn. Các
mục tiêu cụ thể bao gồm:
- Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy E. coli mang plasmid tái tổ hợp để thu tối đa
sinh khối ở quy mô nuôi cấy lớn.
- Tinh chế IL-33 dạng dung hợp với SUMO
- Khảo sát các điều kiện thuỷ giải IL-33 dạng dung hợp bằng SUMO protease để
thu IL-33 dạng nguyên thể
- Tinh chế IL-33 dạng nguyên thể
- Khảo sát in silico tiềm năng của IL-33 ở dạng gắn kết với SUMO và dạng tự nhiên
trong nghiên cứu tương tác với thụ thể ST2
.
. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Interleukin
Cytokin là một loại protein giúp truyền tín hiệu giữa các tế bào. Ban đầu
cytokin được cho là được sản xuất bởi một mình tế bào bạch cầu nhưng sau đó được
phát hiện là cũng được sản xuất bởi những tế bào khác nhau trong cơ thể. Và chỉ với
một lượng picomol cũng có thể gây ra các biến đổi lớn trong chuyển hóa của tế bào
đích [3]. Interleukin (IL) là những cytokin truyền tin giữa các tế bào bạch cầu với
nhau, có khối lượng phân tử tương đối nhỏ (khoảng vài chục kDa) và có hoạt tính cao
[14]. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt và biệt hóa các tế bào miễn
dịch, có hoạt tính chống viêm và chống sưng tấy. Do đó, chức năng chính của
Interleukin là điều chỉnh sự phát triển, biệt hóa và hoạt hóa trong các phản ứng viêm
và miễn dịch [3].
1.2 Tổng quan về Interleukin-33
1.2.1 Cấu trúc của Interleukin-33
IL-33 ban đầu được biết đến như là một protein biểu hiện trong tế bào nội mô
của hạch bạch huyết và có tên là NF-HEV (nuclear factor - high endothelial venule).
Nó cũng là một protein thuộc họ IL-1 (một họ cytokin đóng vai trò quan trọng trong
phản ứng miễn dịch của cơ thể, điều hòa miễn dịch, phản ứng dị ứng và viêm) [3],
[6], [26]. IL-33 được xác định có trình tự acid amin tương đồng cao với IL-18 và cấu
trúc phiến β giống với các thành viên trong họ IL-1 [46].
IL-33 là một chuỗi polypeptid gồm 270 acid amin, với khối lượng khoảng 30
kDa. IL-33 bị phân cắt bởi protease elastase, cathespin G, proteinase 3 và caspase-1
tạo thành các dạng trưởng thành IL-3395–270, IL-33 99–270, IL-33 109–270 và IL-33 112–270.
IL-33 có cấu trúc gấp cuộn β-trefoil tương tự IL-1α, IL-1 β và IL-18 (gồm 12 sợi β,
được đánh số từ 1 – 12) [27] được minh họa như Hình 1.1.
.
. 4
Hình 1.1 Cấu trúc NMR IL-33
Nguồn: Liu X. (2013) [27]
IL-33 có hai vùng được bảo tồn: một đoạn motif ngắn ở đầu tận N (N-terminal
nuclear domain) và vùng cytokin khoảng 18 kD ở đầu tận C (C-terminal IL-1-like
cytokine domain). Dựa trên các dự đoán về cấu trúc, vùng đầu tận N của IL-33 (acid
amin 1-65) được cho là chứa miền liên kết DNA dạng chuỗi xoắn, có vai trò điều hòa
phiên mã do mang cấu trúc helix-turn-helix. Vùng đầu tận C từ vị trí acid amin 112-
270 chứa cấu trúc β-trefoil, là vùng quyết định đặc tính cytokin ngoại bào của IL-33
[12]. Vùng này thể hiện chức năng như một cytokin thúc đẩy viêm bằng cách tác
động lên tế bào đích thông qua thụ thể ST2 hiện diện trên bề mặt tế bào [46]. Cấu
trúc 3D của vùng này cũng đã được mô tả bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR) và tinh thể học tia X. Cấu trúc tinh thể của phức hợp IL-33/ ST2 cho
thấy IL-33 tương tác với ST2 thông qua một giao diện liên kết lớn gồm hai vị trí liên
kết. Vị trí 1 được hình thành bởi các tương tác cầu muối giữa Glu144, Glu148,
Asp149 và Asp244 của IL-3 và Arg38, Lys22, Arg198 và Arg35 của ST2. Còn tại vị
trí 2, Glu165 của IL-33 tạo tương tác cầu muối với Arg313 của ST2, và các tương tác
kỵ nước được tạo bởi Tyr163 và Leu182 của IL-33 và Leu246, Leu306 và Leu311
của ST2 [12].
.
. 5
1.2.2 Sinh tổng hợp Interleukin-33
Tên ban đầu của IL-33 là NF-HEV có nghĩa là yếu tố nhân của tế bào nội mô
thành mạch vì được tìm thấy trong nhân của tế bào này [6]. Tế bào nội mô thành mạch
là tế bào được biệt hóa từ các mô hạch bạch huyết thứ cấp. Chúng biểu hiện các phân
thử bám dính cho phép các tế bào bạch cầu đi từ máu vào mô bạch huyết. Gần đây
IL-33 cũng được tìm thấy trong nhân của các tế bào biểu mô, đặc biệt là là da, dạ dày,
hạch amydal và tuyến nước bọt [35].
Các IL-33 sau khi được sản xuất bởi các tế bào nội mô và biểu mô sẽ được tiết
ra ngoài tế bào và chuyển thành dạng có hoạt tính sinh học như một cytokin, hoặc có
thể vào nhân tế bào để thực hiện chức năng như một yếu tố điều hòa phiên mã [9].
Tuy nhiên ngày nay người ta vẫn chưa biết rõ được cơ chế tiết của IL-33. Vì trong
cấu trúc của IL-33 không chứa trình tự tiết nên IL-33 sẽ không tiết theo trình tự thông
thường qua lưới nội chất nhám và thể Golgi. IL-33 có thể được tiết theo cơ chế hoại
tử của tế bào dưới dạng tiền phân tử sau đó biến đổi và tác động lên tế bào đích thông
qua thụ thể của nó [29].
Quá trình phiên mã tạo ra IL-33 dạng tiền chất (preform) hay còn được gọi là
dạng đầy đủ (full-length) bao gồm 270 acid amin (khối lượng 30 kDa) như thường
thấy của các thành viên thuộc họ IL-1. Ngoài dạng đầy đủ IL-33 còn có dạng tồn tại
khác là dạng trưởng thành (IL-33 mature) hay còn được gọi là dạng hoạt động (IL-33
active), có khối lượng 18 kDa được phân cắt từ dạng đầy đủ bởi caspase-3. Cả 2 dạng
đều có hoạt tính sinh học; trong đó dạng trưởng thành có hoạt tính sinh học mạnh gấp
10 lần dạng đầy đủ [31].
1.2.3 Cấu trúc thụ thể ST2 của Interleukin-33
Thụ thể chính và đặc hiệu của IL-33 là ST2 (còn gọi là Interleukin-1 receptor-
like 1 hoặc IL-1R4). Thụ thể ST2 tồn tại trong cơ thể với 3 dạng: dạng xuyên màng
(dạng truyền tín hiệu), dạng hòa tan và dạng cố định trên màng tế bào (không có phần
nội bào) [11]. Tương tự các thành viên khác trong họ thụ thể IL-1, phần ngoại bào
bao gồm 3 domain IgG-like (lần lượt là D1, D2, D3). Phần D1 và D2 là phần cứng
của thụ thể ST2 nối với nhau qua cầu nối disulfid, D3 nối với phức hợp D1D2 bằng
.
. 6
một cầu nối linh động. ST2 chịu sự thay đổi về mặt cấu trúc (chủ yếu nằm ở vùng
D3) khi liên kết với IL-33 [27].
IL-33 gây ra tác dụng sinh học bằng cách gắn vào thụ thể ST2 và một đồng
thụ thể (coreceptor) IL-1RAcP (Interleukin-1 receptor accessory protein) còn có tên
gọi khác là IL-1R3 và sự hiện diện của c-kit (gắn kết phần ngoại bào của IL-1RAcP
và phần nội bào của ST2) để khuếch đại tín hiệu. Cả ST2 và IL-1RacP đều thuộc họ
IL-1. Tương tác của IL-33 và thụ thể ST2 tương tự các cặp khác tương tự như IL-
1β/IL-1RI (Hình 1.2) [27].
Hình 1.2 Quá trình gắn kết của IL-33 vào ST2 và IL-1RacP
Nguồn: Liu X. (2013) [27]
Phần màu đỏ: IL-33; màu xanh dương: thụ thể ST2; xanh lá thụ thể IL-1RAcP
1.2.4 Vai trò sinh học của Interleukin-33
Interleukin-33 là một protein quan trọng thuộc họ IL-1, có vai trò trong các
phản ứng miễn dịch và được coi như một yếu tố thúc đẩy viêm [25]. IL-33 gắn lên
thụ thể của nó là ST2, ảnh hưởng tới nhiều loại tế bào miễn dịch khác nhau như tế
bào mast, tế bào lympho T CD4, bạch cầu ưa base, bạch cầu ưa acid, bạch cầu đơn
nhân, đại thực bào, diệt bào tự nhiên và bạch cầu đa nhân trung tính [41]. Trong các
nghiên cứu gần đây, IL-33 được chứng minh là có liên quan đến các bệnh nhiễm trùng
đường hô hấp, đặc biệt là hen suyễn và việc ức chế IL-33 được đề nghị như một
phương pháp điều trị tiềm năng [39]. Ngoài ra, nồng độ của IL-33 và ST2 cũng được
chứng minh là tăng lên trong các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp, bệnh đa xơ
cứng, bệnh viêm ruột tự miễn, lupus ban đỏ hệ thống [41].
.
. 7
1.2.5 Các thuốc ức chế Interleukin-33 hiện nay
Hiện nay, chưa có thuốc nào chính thức được phê duyệt cho tác dụng điều trị
các bệnh theo cơ chế ức chế IL-33. Một số tác nhân sinh học như kháng thể kháng
IL-33 và protein bẫy IL-33 đang được nghiên cứu [19], [22], [36]. Nghiên cứu của
Kim và cộng sự (2016) báo cáo một phân tử nhỏ gắn kết với IL-33 nhưng chỉ dừng
lại ở việc docking và đánh giá bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân [22].
1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli
1.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Escherichia coli
E. coli là một trong số các vi sinh vật được hiểu rõ nhất, là vi khuẩn Gram âm
hiếu khí. Các chủng E. coli được sử dụng cho nghiên cứu, trong chế biến công nghiệp
được đánh giá khá an toàn, không gây bệnh, có bộ máy di truyền đơn giản và được
nghiên cứu khá đầy đủ. Do đó FDA chấp thuận để sản xuất protein tái tổ hợp [51].
Các ưu điểm khi lựa E. coli làm vật chủ biểu hiện protein: tốc độ tăng sinh
nhanh, thời gian tăng sinh của E. coli là khoảng 20 phút; khả năng dung hợp vector
biểu hiện plasmid là khá nhanh và đơn giản; có thể nuôi cấy E. coli ở mật độ tế bào
cao, quy mô lớn nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp; hiệu suất sản xuất protein tái
tổ hợp có thể lên đến 50% lượng sinh khối thu được [51].
1.3.2 Các chủng Escherichia coli sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp
Có nhiều chủng E. coli được sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp. Sự lựa
chọn của các chủng được sử dụng để thể hiện protein tái tổ hợp cũng đóng một vai
trò chính trong biểu hiện protein, độ hòa tan và năng suất.
- Chủng BL21(DE3) chứa gen T7, mã hoá cho T7 RNA polymerase được kiểm soát
bởi protomoter lac UV5 (cảm ứng bởi isopropyl -D-1-thiogalactopyranosid
IPTG).
- Chủng BL21Star(DE3) chứa đột biến ở rne, gen mã hóa cho RNase E do đó việc
sử dụng BL21Star(DE3) làm tăng tính ổn định của mRNA và biểu hiện protein.
BL21trxB, một dẫn xuất của BL21(DE3), chứa một đột biến reductase thioredoxin
.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN KIM HƯNG
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022
.
. ii
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH
NGUYỄN KIM HƯNG
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 8720210
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUỐC THÁI
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, 2022
.
. iii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn “Nghiên cứu tạo Interleukin-33 người tái tổ hợp
trên Escherichia coli” là bài viết của riêng tôi, với các thông tin được được trích dẫn
trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Nguyễn Kim Hưng
.
. iv
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Dược học khóa: 2019-2021
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP
INTERLEUKIN-33 NGƯỜI TÁI TỔ HỢP
TRÊN ESCHERICHIA COLI
Nguyễn Kim Hưng
Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Quốc Thái
TÓM TẮT
Mở đầu: Interleukin-33 (IL-33) là một thành viên trong họ Interleukin-1. Có
vai trò quan trọng trong các bệnh tự miễn và gần đây nhất thì cũng có nghiên cứu cho
thấy có sự tăng cao IL-33 của các bệnh nhân nhiễm covid trẻ tuổi liên quan đến cơn
bão cytokine. Cho thấy hướng nghiên cứu về IL-33 và thụ thể của nó là một mục tiêu
tiềm năng. Để thực hiện nghiên cứu cần chủ động nguồn IL-33 cho nghiên cứu vì IL-
33 chưa được sản xuất thương mại và giá thành đặt mua rất đắt. Nên đó là lí do đề tài
này được thực hiện với mong muốn tạo nguồn IL-33 với độ tinh khiết cao phục vụ
cho nghiên cứu.
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Chủng vi khuẩn sử dụng là E. coli
mang vector biểu hiện pET-SUMO-IL-33. Biểu hiện trong môi trường ZYP-5052 ở
25 °C, thu nhận và tinh chế IL-33 dạng tan bằng phương pháp sắc kí ái lực trên cột
Ni-Sepharose. IL-33 dạng nguyên thể được định lượng bằng phương pháp Bradford
và bộ kit ELISA. Khảo sát in silico tiềm năng của IL-33 ở dạng gắn kết với SUMO
và dạng tự nhiên trong nghiên cứu tương tác với thụ thể ST2.
Kết quả: Vi khuẩn được nuôi cấy 40 giờ trong môi trường ZYP-5052 nhiệt độ
25 °C. Loại bỏ đoạn dung hợp SUMO thu IL-33 nguyên thể là 38,56 mg hiệu suất
17,4% . Xây dựng mô Hình 3D của SUMO-IL33 và IL-33, đánh giá khả năng gắn kết
với thụ thể ST của IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO.
Kết luận: Nghiên cứu tạo thành công IL-33 nguyên thể với hiệu suất 17,4%.
Đánh giá được IL-33 chứa đoạn dung hợp SUMO không thể sử dụng trong các thử
nghiệm có mặt thụ thể ST2.
.
. v
Final esay for the degree of M.Sc in Pharm. - Academic year: 2019-2021
FIRST STEP TO RESEARCH EXPRESSION OF
RECOMBINANT HUMAN INTERLEUKIN-33
IN ESCHERICHIA COLI
Kim-Hung Nguyen
Supervisor: Dr. Nguyen Quoc Thai
ABSTRACT
Background: Interleukin-33 (IL-33) is a member of the Interleukin-1 family.
They play an important role in autoimmune diseases and most recently there was also a
study showing elevated IL-33 in young covid patients associated with a cytokine storm.
Shows the direction of research on IL-33 and its receptor as a potential target. To conduct
research, it is necessary to actively source IL-33 for research because IL-33 has not been
produced commercially and the purchase price is very expensive. So that's why this study
was carried out with the desire to create a source of IL-33 with high purity for research
purposes.
Method: E. coli containing the pET-SUMO-IL-33 construction expressing
recombinant in ZYP-5052 at 25 °C. Recomninant IL-33 was purified by IMAC with
Ni-Sepharose. IL-33 native were quantified by Bradford method and kit ELISA.
Investigation of the potential in silico of IL-33 in SUMO-binding and native form
in ST2 receptor interaction studies.
Results: E.coli were cultured for 40 h in ZYP-5052 medium at 25 °C. Removal
of the SUMO fusion fragment yielded native IL-33 of 38,56 mg with a 17,4% yield.
Building 3D models of SUMO-IL33 and IL-33, assessing the ability to bind to ST2
receptor of IL-33 containing the SUMO fusion fragment.
Conclusion: Research to create native IL-33 with 17,4% efficiency. Evaluation
of IL-33 containing the SUMO fusion fragment could not be used in assays for the
presence of the ST2 receptor.
.
. vi
LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Quốc Thái đã tạo cơ hội
cho em tiếp cận với mảng nghiên cứu protein. Cảm ơn thầy đã tận tình hướng dẫn,
luôn động viên cũng như định hướng, tháo gỡ những khó khăn vướng mắc cho em
trong thời gian thực hiện nghiên cứu. Cám ơn Thầy về tất cả những gì Thầy đã chỉ
dạy.
Cảm ơn dược sĩ Tôn Thảo Vy đã luôn đồng hành trong suốt khoảng thời gian qua,
luôn chia sẻ khó khăn, luôn động viên và đưa ra lời khuyên hữu ích.
Cảm ơn anh chị kỹ thuật viên bộ môn Sinh hóa, cô TS Vũ Thanh Thảo Trung tâm
Sapharcen đã tạo điều kiện tốt nhất cũng như đã chỉ dạy em trong thời gian em thực
hiện đề tài.
Cảm ơn anh chị nghiên cứu sinh Mai Thành Tấn, Trần Quế Hương, Trần Thị Thúy
Nga, các tân dược sĩ Lê Nhật Hạ, Nguyễn Minh Thư, Nguyễn Duy Thạch lớp D16 đã
đồng hành và cùng nhau nghiên cứu.
Cảm ơn gia đình đã tạo điều kiện cho con có thể học tập, luôn động viên con có thể
vượt qua khó khăn thử thách.
Trân trọng,
Nguyễn Kim Hưng
.
. vii
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................................ ix
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xi
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... xii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1 Tổng quan về Interleukin ........................................................................................... 3
1.2 Tổng quan về Interleukin-33...................................................................................... 3
1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli ...................................... 7
1.4 Vector biểu hiện pET-SUMO .................................................................................... 9
1.5 Tinh chế protein ....................................................................................................... 10
1.6 Tạo protein dạng nguyên thể bằng phản ứng thuỷ phân với SUMO Protease......... 12
1.7 Kiểm định protein .................................................................................................... 13
1.8 Xây dựng mô hình tương đồng mô phỏng cấu trúc protein ..................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 19
2.1 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 19
2.2 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 25
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 37
3.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy ..................................................................................... 37
3.2 Tinh chế SUMO-IL-33 ............................................................................................ 42
3.3 Khảo sát điều kiện thủy phân SUMO-IL33 để thu IL-33 nguyên thể (native) ........ 44
3.4 Tinh chế IL-33 nguyên thể với cột Ni Sepharose .................................................... 47
3.5 Định lượng IL-33 bằng bộ KIT ELISA ................................................................... 49
3.6 Mô hình cấu trúc 3D của IL-33 dạng gắn với SUMO xây dựng bằng kỹ thuật
homology ............................................................................................................................. 49
3.7 Kết quả docking protein-protein khảo sát sự gắn kết của SUMO-IL-33 với thụ thể
ST2 ........................................................................................................................... 58
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN............................................................................. 63
4.1 Nhận xét về kết quả nuôi cấy và tinh chế ................................................................ 63
4.2 So sánh với các nghiên cứu khác ............................................................................. 66
.
. viii
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
.
. ix
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Từ viết đầy đủ bằng tiếng Việt, tiếng Anh
3D Cấu trúc không gian ba chiều
APS Ammonium persulfat
bp Base pait
Co2+ - CMA Cobalt - carboxylmethylaspartate
DDT Dithiotheitol
EIA Enzym immunoassay
ELISA Enzym-linked immunosorbent assay
IDA Acid iminodiacetic
hIL-33 Interleukin-33 người
IL-33 Interleukin-33
IL Interleukin
IL-1RAcP Đồng thụ thể của IL-33 (Interleukin-1 Receptor accessory
Protein)
IMAC Immobilized metal ion affinity chromatography
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
LB Luria-Bertani Broth
NF-HEV Nuclear factor − high endothelial venule
Ni2+ - NTA Nickel – nitriloacetic acid
NPS Hỗn hợp Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4
SDS Sodium dodecyl sulfat
SDS-PAGE Phương pháp điện di gel natri dodecyl sulfat trên
polyacrylamid (Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide
Gel Electrophoresis)
SOC Super Optimal broth with Catabolite repression
SUMO Small ubiquitin-like modifier
.
. x
TB Terrific Broth
SEC Sắc ký rây phân tử (Size Exclusion Chromatography)
ST2 Thụ thể của IL-33, trước đây còn gọi là IL1RL1 – thụ thể
giống thụ thể Interleukin-1 1 (Interleukin-1 receptor-like1)
TEMED Tetramethylethylenediamin
GST Glutathion-S-transerase
PDIa’b’ b’a’ domain of human protein dusulfide isomerase
MBP Maltose Binding Protein
MCS Multiple cloning site
β-ME Beta-mercaptoethanol
His8 8 Histidin
LOMETS Local Meta Threading Server
ZYP Môi trường tự cảm ứng
.
. xi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Hóa chất dùng trong nghiên cứu ....................................................23
Bảng 2.2 Thiết bị, dụng cụ trong thí nghiệm .................................................23
Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamid .......................................................26
Bảng 2.4 Xây dựng đường chuẩn Bradford...................................................29
Bảng 2.5 Tỷ lệ pha dung dịch đệm rửa..........................................................31
Bảng 2.6 Tỷ lệ pha dung dịch đệm thử nghiệm.............................................31
Bảng 2.7 Tỷ lệ pha loãng Biotin-Conjugate ..................................................32
Bảng 2.8 Tỷ lệ pha loãng Streptavidin- HRP ................................................32
Bảng 3.1 Sinh khối thu được trong ba môi trường LB; TB và ZYP-5052 ....39
Bảng 3.2 Kết quả quả đánh giá chất lượng mô hình SUMO-IL-33 bằng
MolProbity .....................................................................................................54
.
. xii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc NMR IL-33 .................................................................................. 4
Hình 1.2 Quá trình gắn kết của IL-33 vào ST2 và IL-1RacP ................................... 6
Hình 1.3 Chất nền Ni2+- NTA và Co2+- CMA ........................................................ 11
Hình 1.4 Mô tả nguyên tắc của sắc ký rây phân tử ................................................. 12
Hình 1.5 Sơ đồ điện di polyacrylamid với SDS ...................................................... 14
Hình 2.1 Plasmid pET24a ....................................................................................... 19
Hình 2.2 Plasmid pET-SUMO-IL-33 chứa gen mã hoá cho IL-33 sau khi được tối
ưu hóa ....................................................................................................................... 20
Hình 2.3 Tỷ lệ pha loãng chuẩn..................................................................... 33
Hình 3.1 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG trong môi trường LB ................... 37
Hình 3.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG trong môi trường TB ................... 38
Hình 3.3 Khảo sát biểu hiện trong môi trường ZYP-5052...................................... 38
Hình 3.4 So sánh biểu hiện SUMO-IL-33 trong các môi trường ..................39
Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng vi khuẩn E. coli BL21(DE3)/pET-SUMO-IL33
................................................................................................................................. 40
Hình 3.6 Protein thu được trong các mốc thời gian khảo sát .................................. 41
Hình 3.7 Tinh chế SUMO-IL33 qua cột Ni-Sepharose........................................... 42
Hình 3.8 Tinh chế SUMO-IL33 qua cột HiTrap Desalting .................................... 43
Hình 3.9 Thủy phân SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 0,1% ........................ 44
Hình 3.10 Thủy phân pET-SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 1%; 4 °C ....... 45
Hình 3.11 Thủy phân pET-SUMO-IL-33 với tỉ lệ SUMO Protease 1%................. 46
Hình 3.12 IL-33 sau khi thủy phân bằng SUMO Protease 1% 4 °C trong 1 giờ .... 47
Hình 3.13 Tinh chế thu IL-33 dạng nguyên thể ...................................................... 48
Hình 3.14 Đường chuẩn ELISA .............................................................................. 49
Hình 3.15 Mô hình cấu trúc 3D tốt nhất của IL-33-SUMO được dự đoán bởi chương
trình (A) I-TASSER, (B) C-I-TASSER, (C) RoseTTAFold. IL-33 được minh họa
dưới dạng ruy-băng màu hồng nhạt, phần SUMO có màu xanh. ............................ 51
Hình 3.16 So sánh cấu trúc IL-33 trong mô hình IL-33-SUMO với cấu trúc IL-33
chụp bằng phương pháp nhiễu xạ tinh thể (mã PDB: 4KC3). ................................. 53
.
. xiii
Hình 3.17 Bản đồ Ramachandra của các cấu trúc homology tốt nhất xây dựng bởi I-
TASSER, C-I-TASSER, RoseTTAFold .................................................................. 55
Hình 3.18 Minh họa 2 vị trí gắn kết của IL-33 với thụ thể ST2 trong dạng gắn với
SUMO ...................................................................................................................... 57
Hình 3.19 Các cấu dạng docking tốt nhất giữa IL-33 dạng tự như và thụ thể ST2
bằng ClusPro ............................................................................................................ 58
Hình 3.20 (A) Mô hình docking IL-33 dạng tự nhiên với thụ thể ST2 bằng chương
trình ClusPro (model 0); (B) Cấu trúc thực nghiệm của IL-33 và thụ thể ST2 xác định
bằng phương pháp nhiễu xạ tinh thể tia X bởi Liu X. và cộng sự (2013). .............. 59
Hình 3.21 Kết quả docking mô hình IL-33-SUMO (xây dựng với I-TASSER) với
thụ thể ST2 ............................................................................................................... 60
Hình 3.22 Mô hình docking IL-33-SUMO (xây dựng bằng I-TASSER) với thụ thể
ST2 bằng chương trình ClusPro .............................................................................. 61
Hình 3.23 Các mô hình docking tốt nhất của cấu trúc homology IL-33-SUMO xây
dựng bằng RoseTTAFold với thụ thể ST2 bằng ClusPro ........................................ 62
.
. 1
MỞ ĐẦU
Trong hơn một thập kỷ qua, Interleukin (IL)-33, là một cytokin mới thuộc họ
IL-1 đã được chứng minh có liên quan rõ rệt đến các bệnh viêm (hen suyễn, bệnh
phổi tắc nghẽn mạn tính, viêm ruột) và các bệnh tự miễn (viêm khớp dạng thấp, lupus
ban đỏ hệ thống, đa xơ cứng) [31]. IL-33 được xem là đích tác động tiềm năng trong
điều trị nhiễm trùng đường hô hấp, đặc biệt là hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và
bệnh xơ cứng cơ xương [40]. IL-33 cũng được đánh giá là một mục tiêu trong điều
trị bệnh Alzheimer với bằng chứng về sự tăng biểu hiện của IL-33 và thụ thể ST2 ở
não của bệnh nhân mắc bệnh này [50].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế hoạt tính của IL-33
làm thuốc nhưng đến nay trên thế giới vẫn chưa có thuốc nào được chính thức chấp
nhận cho tác dụng điều trị theo cơ chế này. Tại Việt Nam, hướng nghiên cứu phát
triển thuốc tập trung vào IL-33 đang được quan tâm. Nghiên cứu của tác giả Mai
Thành Tấn và cộng sự (2016) đã thiết kế thành công các cấu trúc phân tử nhỏ có khả
năng ức chế hoạt tính IL-33 in silico [1]. Tuy nhiên, nguồn IL-33 cung ứng cho thử
nghiệm hoạt tính các chất này in vitro không sẵn có do IL-33 chưa được thương mại
hoá. Giá thành của IL-33 đặt gia công tổng hợp lại rất cao dẫn đến việc nghiên cứu
thuốc trở nên vô cùng khó khăn. Vì vậy, nhu cầu tạo được nguồn IL-33 tái tổ hợp sẵn
có dùng cho mục đích nghiên cứu trong nước là vô cùng cần thiết.
Tại Việt Nam đã có những nghiên cứu tiến hành tạo nguồn IL-33 tái tổ hợp
như nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Thảo và cộng sự (2015) tuy nhiên nghiên cứu
chỉ sản xuất IL-33 chuột dạng hòa tan trên nấm men Pichia pastoris [36]. Cho đến
nay trong nước vẫn chưa có công trình khác nghiên cứu tái tổ hợp IL-33 của người
và sử dụng biểu hiện trên Escherichia coli. Gần đây, nhóm nghiên cứu Hoá sinh tại
khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh đã tạo dòng thành công chủng
E. coli biểu hiện IL-33 dạng dung hợp với SUMO ở quy mô 50 mL dịch nuôi cấy.
Trong đề tài “ Bước đầu nghiên cứu tổng hợp Interleukin-33 người tái tổ hợp
trên Escherichia coli” này, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu trên với mục tiêu
.
. 2
tổng quát là tạo IL-33 tái tổ hợp dạng nguyên thể (native) với quy mô lớn hơn. Các
mục tiêu cụ thể bao gồm:
- Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy E. coli mang plasmid tái tổ hợp để thu tối đa
sinh khối ở quy mô nuôi cấy lớn.
- Tinh chế IL-33 dạng dung hợp với SUMO
- Khảo sát các điều kiện thuỷ giải IL-33 dạng dung hợp bằng SUMO protease để
thu IL-33 dạng nguyên thể
- Tinh chế IL-33 dạng nguyên thể
- Khảo sát in silico tiềm năng của IL-33 ở dạng gắn kết với SUMO và dạng tự nhiên
trong nghiên cứu tương tác với thụ thể ST2
.
. 3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về Interleukin
Cytokin là một loại protein giúp truyền tín hiệu giữa các tế bào. Ban đầu
cytokin được cho là được sản xuất bởi một mình tế bào bạch cầu nhưng sau đó được
phát hiện là cũng được sản xuất bởi những tế bào khác nhau trong cơ thể. Và chỉ với
một lượng picomol cũng có thể gây ra các biến đổi lớn trong chuyển hóa của tế bào
đích [3]. Interleukin (IL) là những cytokin truyền tin giữa các tế bào bạch cầu với
nhau, có khối lượng phân tử tương đối nhỏ (khoảng vài chục kDa) và có hoạt tính cao
[14]. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc kích hoạt và biệt hóa các tế bào miễn
dịch, có hoạt tính chống viêm và chống sưng tấy. Do đó, chức năng chính của
Interleukin là điều chỉnh sự phát triển, biệt hóa và hoạt hóa trong các phản ứng viêm
và miễn dịch [3].
1.2 Tổng quan về Interleukin-33
1.2.1 Cấu trúc của Interleukin-33
IL-33 ban đầu được biết đến như là một protein biểu hiện trong tế bào nội mô
của hạch bạch huyết và có tên là NF-HEV (nuclear factor - high endothelial venule).
Nó cũng là một protein thuộc họ IL-1 (một họ cytokin đóng vai trò quan trọng trong
phản ứng miễn dịch của cơ thể, điều hòa miễn dịch, phản ứng dị ứng và viêm) [3],
[6], [26]. IL-33 được xác định có trình tự acid amin tương đồng cao với IL-18 và cấu
trúc phiến β giống với các thành viên trong họ IL-1 [46].
IL-33 là một chuỗi polypeptid gồm 270 acid amin, với khối lượng khoảng 30
kDa. IL-33 bị phân cắt bởi protease elastase, cathespin G, proteinase 3 và caspase-1
tạo thành các dạng trưởng thành IL-3395–270, IL-33 99–270, IL-33 109–270 và IL-33 112–270.
IL-33 có cấu trúc gấp cuộn β-trefoil tương tự IL-1α, IL-1 β và IL-18 (gồm 12 sợi β,
được đánh số từ 1 – 12) [27] được minh họa như Hình 1.1.
.
. 4
Hình 1.1 Cấu trúc NMR IL-33
Nguồn: Liu X. (2013) [27]
IL-33 có hai vùng được bảo tồn: một đoạn motif ngắn ở đầu tận N (N-terminal
nuclear domain) và vùng cytokin khoảng 18 kD ở đầu tận C (C-terminal IL-1-like
cytokine domain). Dựa trên các dự đoán về cấu trúc, vùng đầu tận N của IL-33 (acid
amin 1-65) được cho là chứa miền liên kết DNA dạng chuỗi xoắn, có vai trò điều hòa
phiên mã do mang cấu trúc helix-turn-helix. Vùng đầu tận C từ vị trí acid amin 112-
270 chứa cấu trúc β-trefoil, là vùng quyết định đặc tính cytokin ngoại bào của IL-33
[12]. Vùng này thể hiện chức năng như một cytokin thúc đẩy viêm bằng cách tác
động lên tế bào đích thông qua thụ thể ST2 hiện diện trên bề mặt tế bào [46]. Cấu
trúc 3D của vùng này cũng đã được mô tả bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR) và tinh thể học tia X. Cấu trúc tinh thể của phức hợp IL-33/ ST2 cho
thấy IL-33 tương tác với ST2 thông qua một giao diện liên kết lớn gồm hai vị trí liên
kết. Vị trí 1 được hình thành bởi các tương tác cầu muối giữa Glu144, Glu148,
Asp149 và Asp244 của IL-3 và Arg38, Lys22, Arg198 và Arg35 của ST2. Còn tại vị
trí 2, Glu165 của IL-33 tạo tương tác cầu muối với Arg313 của ST2, và các tương tác
kỵ nước được tạo bởi Tyr163 và Leu182 của IL-33 và Leu246, Leu306 và Leu311
của ST2 [12].
.
. 5
1.2.2 Sinh tổng hợp Interleukin-33
Tên ban đầu của IL-33 là NF-HEV có nghĩa là yếu tố nhân của tế bào nội mô
thành mạch vì được tìm thấy trong nhân của tế bào này [6]. Tế bào nội mô thành mạch
là tế bào được biệt hóa từ các mô hạch bạch huyết thứ cấp. Chúng biểu hiện các phân
thử bám dính cho phép các tế bào bạch cầu đi từ máu vào mô bạch huyết. Gần đây
IL-33 cũng được tìm thấy trong nhân của các tế bào biểu mô, đặc biệt là là da, dạ dày,
hạch amydal và tuyến nước bọt [35].
Các IL-33 sau khi được sản xuất bởi các tế bào nội mô và biểu mô sẽ được tiết
ra ngoài tế bào và chuyển thành dạng có hoạt tính sinh học như một cytokin, hoặc có
thể vào nhân tế bào để thực hiện chức năng như một yếu tố điều hòa phiên mã [9].
Tuy nhiên ngày nay người ta vẫn chưa biết rõ được cơ chế tiết của IL-33. Vì trong
cấu trúc của IL-33 không chứa trình tự tiết nên IL-33 sẽ không tiết theo trình tự thông
thường qua lưới nội chất nhám và thể Golgi. IL-33 có thể được tiết theo cơ chế hoại
tử của tế bào dưới dạng tiền phân tử sau đó biến đổi và tác động lên tế bào đích thông
qua thụ thể của nó [29].
Quá trình phiên mã tạo ra IL-33 dạng tiền chất (preform) hay còn được gọi là
dạng đầy đủ (full-length) bao gồm 270 acid amin (khối lượng 30 kDa) như thường
thấy của các thành viên thuộc họ IL-1. Ngoài dạng đầy đủ IL-33 còn có dạng tồn tại
khác là dạng trưởng thành (IL-33 mature) hay còn được gọi là dạng hoạt động (IL-33
active), có khối lượng 18 kDa được phân cắt từ dạng đầy đủ bởi caspase-3. Cả 2 dạng
đều có hoạt tính sinh học; trong đó dạng trưởng thành có hoạt tính sinh học mạnh gấp
10 lần dạng đầy đủ [31].
1.2.3 Cấu trúc thụ thể ST2 của Interleukin-33
Thụ thể chính và đặc hiệu của IL-33 là ST2 (còn gọi là Interleukin-1 receptor-
like 1 hoặc IL-1R4). Thụ thể ST2 tồn tại trong cơ thể với 3 dạng: dạng xuyên màng
(dạng truyền tín hiệu), dạng hòa tan và dạng cố định trên màng tế bào (không có phần
nội bào) [11]. Tương tự các thành viên khác trong họ thụ thể IL-1, phần ngoại bào
bao gồm 3 domain IgG-like (lần lượt là D1, D2, D3). Phần D1 và D2 là phần cứng
của thụ thể ST2 nối với nhau qua cầu nối disulfid, D3 nối với phức hợp D1D2 bằng
.
. 6
một cầu nối linh động. ST2 chịu sự thay đổi về mặt cấu trúc (chủ yếu nằm ở vùng
D3) khi liên kết với IL-33 [27].
IL-33 gây ra tác dụng sinh học bằng cách gắn vào thụ thể ST2 và một đồng
thụ thể (coreceptor) IL-1RAcP (Interleukin-1 receptor accessory protein) còn có tên
gọi khác là IL-1R3 và sự hiện diện của c-kit (gắn kết phần ngoại bào của IL-1RAcP
và phần nội bào của ST2) để khuếch đại tín hiệu. Cả ST2 và IL-1RacP đều thuộc họ
IL-1. Tương tác của IL-33 và thụ thể ST2 tương tự các cặp khác tương tự như IL-
1β/IL-1RI (Hình 1.2) [27].
Hình 1.2 Quá trình gắn kết của IL-33 vào ST2 và IL-1RacP
Nguồn: Liu X. (2013) [27]
Phần màu đỏ: IL-33; màu xanh dương: thụ thể ST2; xanh lá thụ thể IL-1RAcP
1.2.4 Vai trò sinh học của Interleukin-33
Interleukin-33 là một protein quan trọng thuộc họ IL-1, có vai trò trong các
phản ứng miễn dịch và được coi như một yếu tố thúc đẩy viêm [25]. IL-33 gắn lên
thụ thể của nó là ST2, ảnh hưởng tới nhiều loại tế bào miễn dịch khác nhau như tế
bào mast, tế bào lympho T CD4, bạch cầu ưa base, bạch cầu ưa acid, bạch cầu đơn
nhân, đại thực bào, diệt bào tự nhiên và bạch cầu đa nhân trung tính [41]. Trong các
nghiên cứu gần đây, IL-33 được chứng minh là có liên quan đến các bệnh nhiễm trùng
đường hô hấp, đặc biệt là hen suyễn và việc ức chế IL-33 được đề nghị như một
phương pháp điều trị tiềm năng [39]. Ngoài ra, nồng độ của IL-33 và ST2 cũng được
chứng minh là tăng lên trong các bệnh tự miễn như viêm khớp dạng thấp, bệnh đa xơ
cứng, bệnh viêm ruột tự miễn, lupus ban đỏ hệ thống [41].
.
. 7
1.2.5 Các thuốc ức chế Interleukin-33 hiện nay
Hiện nay, chưa có thuốc nào chính thức được phê duyệt cho tác dụng điều trị
các bệnh theo cơ chế ức chế IL-33. Một số tác nhân sinh học như kháng thể kháng
IL-33 và protein bẫy IL-33 đang được nghiên cứu [19], [22], [36]. Nghiên cứu của
Kim và cộng sự (2016) báo cáo một phân tử nhỏ gắn kết với IL-33 nhưng chỉ dừng
lại ở việc docking và đánh giá bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân [22].
1.3 Sản xuất protein tái tổ hợp bằng vi khuẩn Escherichia coli
1.3.1 Đặc điểm của vi khuẩn Escherichia coli
E. coli là một trong số các vi sinh vật được hiểu rõ nhất, là vi khuẩn Gram âm
hiếu khí. Các chủng E. coli được sử dụng cho nghiên cứu, trong chế biến công nghiệp
được đánh giá khá an toàn, không gây bệnh, có bộ máy di truyền đơn giản và được
nghiên cứu khá đầy đủ. Do đó FDA chấp thuận để sản xuất protein tái tổ hợp [51].
Các ưu điểm khi lựa E. coli làm vật chủ biểu hiện protein: tốc độ tăng sinh
nhanh, thời gian tăng sinh của E. coli là khoảng 20 phút; khả năng dung hợp vector
biểu hiện plasmid là khá nhanh và đơn giản; có thể nuôi cấy E. coli ở mật độ tế bào
cao, quy mô lớn nhanh chóng tạo ra protein tái tổ hợp; hiệu suất sản xuất protein tái
tổ hợp có thể lên đến 50% lượng sinh khối thu được [51].
1.3.2 Các chủng Escherichia coli sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp
Có nhiều chủng E. coli được sử dụng trong sản xuất protein tái tổ hợp. Sự lựa
chọn của các chủng được sử dụng để thể hiện protein tái tổ hợp cũng đóng một vai
trò chính trong biểu hiện protein, độ hòa tan và năng suất.
- Chủng BL21(DE3) chứa gen T7, mã hoá cho T7 RNA polymerase được kiểm soát
bởi protomoter lac UV5 (cảm ứng bởi isopropyl -D-1-thiogalactopyranosid
IPTG).
- Chủng BL21Star(DE3) chứa đột biến ở rne, gen mã hóa cho RNase E do đó việc
sử dụng BL21Star(DE3) làm tăng tính ổn định của mRNA và biểu hiện protein.
BL21trxB, một dẫn xuất của BL21(DE3), chứa một đột biến reductase thioredoxin
.